_助溶剂甲苯和二甲基亚砜对斑马鱼胚胎发育的复合毒性效应
第28卷 第6期
2009年 11月环 境 化 学E NV I RONMENTAL C H E M I STRY V o.l 28,N o .6N ove m ber 2009
2009年2月10日收稿.
*湖北省科技攻关计划(N o .2006AA301C35)和国家科技支撑计划(N o 2007BAC27B01)资助.**通讯联系人.
助溶剂甲苯和二甲基亚砜对斑马鱼胚胎发育的
复合毒性效应
*李 佳1 周 珍1 胡 芹2 王 玥1 梁 勇
1,3**(1 江汉大学医学院,武汉,430056;2 华中农业大学资源与环境学院,武汉,430070;3 中国科学院生态环境研究中心,环境化学与生态毒理学国家重点实验室,北京,100085)
摘 要 研究了甲苯和二甲基亚砜(DM S O )对斑马鱼胚胎生长、发育的毒性效应.实验结果表明:低剂量
的甲苯(0 05%)单一暴露对斑马鱼胚胎发育有一定毒性,DM S O (0 45%)对斑马鱼胚胎无明显毒性;但甲
苯与D M SO 具有较强的复合毒性效应,随着D M S O 含量的增加,与甲苯单一暴露组相比,斑马鱼胚胎死亡
率显著增加、胚胎孵化率下降、胚胎发育迟缓并生成大量畸形;但甲苯以及甲苯和DM SO 复合物对人胚肾
HEK 293细胞株和人胃癌SGC 7901细胞株的活力均没有明显效应.
D M S O 可通过提高甲苯在水中的分散性,增加甲苯的神经毒性,但对离体实验模型无显著效应,故在选择不同生物模型评估有机污染物毒性效
应时,需考虑不同类型助溶剂所产生的复合效应,以减少实验误差.
关键词 甲苯,二甲基亚砜,斑马鱼,毒性. 常用的助溶剂二甲基亚砜(DM SO)、丙酮、乙醇等在常用的浓度下,对环境毒理学常用的模式动物如鱼类、两栖类等没有明显的毒性效应
[1].为评估二英、多氯联苯、多溴联苯醚中某些高氯代、高溴代异构体的生物效应,在常规的D M SO 溶剂中,会适当添加少量的甲苯、正己烷等极性低的有机溶剂,以增加其溶解性[2 5],但这些已知具有较高毒性的溶剂与其它助溶剂之间是否存在相互作用,
并对实验结果造成偏差,需要加以评估.
甲苯作为一种常见的有机溶剂,其脂溶性高,挥发性较强,可通过鳃、体表进入鱼体,能轻易透过血脑屏障,进而抑制乙酰胆碱酯酶活性,并造成神经系统功能损伤、影响神经系统发育,具有明显的神经毒性效应
[6,7].斑马鱼胚胎发育毒性技术是国际认可的评价化学品毒性效应的标准方法[1,8 10].
在本研究中,选取低剂量的甲苯(0 05%)和不高于0 45%的DM SO,研究助溶剂单一、复合暴露后,对斑马鱼胚胎发育的毒性效应;同时,为进一步验证斑马鱼胚胎毒性实验结果,选择人胚肾293细胞株和人胃癌7901细胞株,研究助溶剂对离体细胞活力的影响,以综合评价其毒性效应.
1 实验方法
1 1实验材料
将性成熟斑马鱼(Danio rerio ,AB 系)雌雄分缸,饲养于流水养殖系统.水温保持在26 2 左右,光照/黑暗周期控制在12h /12h .暴露实验开始前两天将雌雄以1 2配对,自然交配产卵.取受精1hpf(hour post fertilization)以内受精卵进行暴露实验.
1 2暴露实验
挑选正常发育的受精卵,3hpf 开始染毒进行暴露实验.实验于直径为7c m 的玻璃表面皿中进行,所用水均取自系统曝气水.试验浓度为:0(对照组)、0 05%甲苯、0 45%DM SO 、0 1%(D M SO +甲苯)、0 3%(DMSO+甲苯)和0 5%(D M SO +甲苯)(V /V ).其中,3种助溶剂复合物(DM SO +甲苯)分别由甲苯与D M SO 按不同体积比(1 1,1 5,1 9)混合配制而成,各助溶剂复合物试验组中甲
834
环 境 化 学28卷苯的浓度均为0 05%,D M SO浓度分别为0 05%,0 25%,0 45%.每个试验浓度均设3个平行组,每个平行组含25粒卵.同样的暴露实验重复两次.暴露实验每天定时更新一半染毒溶液,同时挑出死亡个体.水温保持在26 2 左右,光照/黑暗周期控制在12h/12h.
在特定时间段(受精后12h,36h,60h,84h,108h,132h,156h等)对染毒斑马鱼胚胎死亡数、孵化数进行统计.观察胚胎的形态变化,如:发育停滞、心包水肿、卵黄水肿、脊柱卷曲等畸形状况.
1 3 细胞毒性实验
MTT比色法测定细胞活力.人胚肾HEK 293细胞株和人胃癌SGC 7901细胞株分别使用DME M 培养基和RP M I1640培养基进行培养.用0 25%胰蛋白酶消化处于对数生长期的细胞,加入新鲜培养基轻轻吹打制成细胞悬液,用血细胞记数板计算细胞密度,用培养基稀释到1 105个 m l-1,然后以每孔5 103个接种到96孔板,每孔含200 l培养基.37 培养箱中培养12h,细胞贴壁后,吸去培养基,分别加入含0(对照组)、0 05%甲苯、0 45%D M SO、0 1%(DM SO+甲苯)、0 3%(D M SO+甲苯)和0 5%(D M SO+甲苯)(V/V)的含1%胎牛血清的无酚红培养基180 ,l分别暴露24h和48h.暴露结束后每孔加入5m g m l-1MTT溶液20 l继续培养4h.小心吸尽孔内培养液,然后每孔加入150 lDM SO,轻轻振荡5m i n,使结晶物充分溶解,在酶标仪上于490nm波长处测定各孔吸光度值(A).每个试验组设置8个平行孔.
采用SPSS10 0分析全部数据,实验结果用平均值 标准误差表示.
2 结果与讨论
2 1 甲苯和D M SO对斑马鱼胚胎发育的影响
甲苯和D M SO复合暴露对斑马鱼胚胎的致死效应如图1A所示.与对照组相比,随着暴露时间的延长,0 45%DM SO单一暴露组对斑马鱼胚胎没有显著致死效应,0 05%甲苯单一暴露组的胚胎死亡率为12%(156hpf),0 1%(D M SO+甲苯)助溶剂复合物对斑马鱼胚胎的死亡率无明显效应;但0 3% (D M SO+甲苯)和0 5%(DM SO+甲苯)助溶剂复合物可明显提高斑马鱼胚胎的死亡率,暴露到156hpf时,0 3%(DM SO+甲苯)助溶剂复合物可造成39%的斑马鱼胚胎死亡,而0 5%(D M SO+甲苯)暴露组斑马鱼胚胎死亡率为74%,这表明,随着助溶剂复合物中D M SO含量的增加,斑马鱼胚胎的死亡率显著上升.
图1 甲苯和DM SO复合暴露对斑马鱼胚胎死亡率(A)和孵化率(B)的影响
Fig 1 E ffec ts o f to l uene and DM SO co m bined exposure on m orta liti es(A)and ha tch i ng rate(B)o f zebra fi sh e m bryos
甲苯和D M SO各暴露组对斑马鱼胚胎孵化率的影响如图1B所示.对照组斑马鱼胚胎48hpf时开始出膜,胚胎发育到60hp f时,80%的胚胎均已正常孵化出膜,84hpf时,所有对照组胚胎均已孵化出膜,胚胎孵化率为100%.与对照组相比,DM SO单一暴露组、0 1%(DM SO+甲苯)助溶剂复合物
6期李佳等:助溶剂甲苯和二甲基亚砜对斑马鱼胚胎发育的复合毒性效应835
暴露组的斑马鱼胚胎总孵化率均无显著差异,0 05%甲苯暴露组的胚胎孵化率为92%,但各暴露组斑马鱼胚胎在60hpf和84hpf时的孵化率均显著低于对照组,说明D M SO和甲苯均可阻碍斑马鱼正常胚胎发育.另外,与对照组以及甲苯、D M SO单一暴露组相比,0 3%(DM SO+甲苯)和0 5%(D M SO +甲苯)助溶剂复合物暴露组的胚胎孵化率显著降低,暴露到108hp f时,0 5%(DM SO+甲苯)暴露组的胚胎孵化率仅为37%.
上述结果说明,DM SO和甲苯对斑马鱼胚胎发育存在明显的复合毒性效应,随着助溶剂复合物中D M SO比例的增加,DM SO和甲苯复合物可显著降低斑马鱼胚胎孵化率并造成大量斑马鱼胚胎死亡.
在实验过程中,我们还发现甲苯以及甲苯和DM SO复合物可造成斑马鱼胚胎发育迟缓并造成大量的畸形.如图2所示,与对照组(图2A、C)相比,0 05%甲苯、0 1%(DM SO+甲苯)、0 3%(D M SO +甲苯)和0 5%(D M SO+甲苯)实验组的斑马鱼胚胎均出现不同程度的发育停滞(图2B),并可观察到心包、卵黄水肿(图2D、E)、尾巴弯曲(图2F)等畸形现象.甲苯、DM SO阻碍斑马鱼胚胎发育并造成斑马鱼胚胎发育畸形的具体数据如表1所列.与DM SO、甲苯复合物对斑马鱼胚胎孵化率、死亡率的结果相同,随着助溶剂复合物中DMSO比例的增加,DM SO、甲苯复合物可显著阻滞斑马鱼胚胎的正常发育,并造成大量的胚胎畸形.
图2 甲苯和D M S O复合暴露组斑马鱼胚胎畸形现象
A 正常鱼卵
B 发育停滞
C 正常鱼体
D 心包水肿
E 心包、卵黄水肿
F 尾巴弯曲
Fig 2 M orpho log i ca l develop ment o f nor m a l and m a lf o r m ed embryo s i n to l uene and DM S O comb i ned exposure groups
表1 甲苯和DM SO复合暴露对斑马鱼胚胎发育的影响(n=75)(单位:个)
T ab le1 Comb i ned e ffect o f to l uene and DM SO exposure on dev elopment o f zebra fi sh e m bryos(n=75)发育畸形0 45%DM SO0 05%甲苯0 1%(D M SO+甲苯)0 3%(DM SO+甲苯)0 5%(DM SO+甲苯)发育停滞0802327
心包水肿0802112
卵黄水肿010111
尾巴弯曲0501626
注:1个斑马鱼胚胎可同时具有几种畸形现象.
甲苯以及甲苯和D M SO复合物对斑马鱼胚胎发育的毒性结果表明,低剂量的甲苯(0 05%)单一暴露对斑马鱼胚胎具有较小毒性,但甲苯与DM SO混合物对斑马鱼胚胎具有很强的复合毒性效应.甲苯的神经毒性效应主要表现为抑制生物体内乙酰胆碱酯酶活性,并干扰神经系统的正常发育,但其急性毒性较低,大鼠经口LD50为5500m g kg-1,LC50为17020m g m-3,小鼠经口LD50为8000 m g kg-1,LC50为25900m g m-3[11],而D M SO在低于0 5%的浓度下基本没有毒性效应,被认为是适用于生物分析的有机溶剂[12].实验结果也表明,低剂量的甲苯(0 05%)可降低斑马鱼胚胎的孵化率,并可造成胚胎发育畸形,这与甲苯可干扰斑马鱼胚胎神经系统发育相关.由于甲苯在水中的分散性差,静置一段时间后,在液面表层聚集形成一些小的油滴,而未出膜和刚出膜的斑马鱼胚胎不能在水中自由游泳,故甲苯进入斑马鱼胚胎体内的途径主要是吸附在斑马鱼胚胎卵壳上,并进一步渗透进入斑马鱼体内,结果造成部分斑马鱼胚胎发育迟缓并出现严重的畸形.DM SO作为一种水溶性的化合
836
环 境 化 学28卷物,同时能溶解甲苯,显著提高甲苯在水中的分散性.甲苯和DMSO复合暴露实验中,当DM SO和甲苯的比例为1 1时,助溶剂混合物对斑马鱼胚胎的死亡率、孵化率均无明显作用,也未观察到斑马鱼胚胎发育畸形,在表面皿表层无甲苯油滴的形成.但与之相对应的是,进一步增加DM SO和甲苯复合暴露中D M SO的比例(5 1和9 1),斑马鱼胚胎的孵化率下降,出膜时间延迟,发育停滞,并出现多种严重的畸形,胚胎的死亡率显著升高.可能的原因是:尽管甲苯对鱼类的毒性较大,但在单一暴露条件下,由于甲苯在水中的分散性很差,低浓度的甲苯较少进入胚胎或幼鱼体内,相应产生的毒性较低,但随着溶液中DM SO含量的升高,甲苯在水溶液中的分散性增加,进而促进了斑马鱼胚胎及幼鱼通过卵壳、体表、鳃等对甲苯的吸收,最终产生非常明显的毒性效应.
2 2 甲苯和D M SO对体外培养细胞活力的影响
甲苯和D M SO对人胚肾HEK 293细胞和人胃癌SGC 7901细胞的活力影响如图3所示.与斑马鱼胚胎发育毒性实验结果不同的是,甲苯和DM SO单一、复合暴露24h和48h后,对人胚肾H E K 293细胞和人胃癌SGC 7901细胞的活力均未造成显著影响,这说明甲苯以及甲苯、DMSO复合物对体外培养的细胞株没有明显的毒性效应.
甲苯作为一种脂溶性的毒物,主要作用位点是神经系统,对神经细胞如海马细胞等具有一定的毒性效应,但对其它种类的细胞株影响较小[10].实验结果表明,D M SO和甲苯复合暴露可显著抑制斑马鱼胚胎发育,但甲苯、DMSO单一、复合暴露对人胚肾HEK 293细胞以及人胃癌SGC 7901细胞的细胞活力均无明显效应,这也从侧面反映了甲苯主要通过干扰神经系统发育而造成斑马鱼胚胎发育异常及死亡.
图3 甲苯和D M S O对H E K 293(A)和SGC 7901(B)细胞活力的影响S1:0 05%甲苯,S2:0 45%D M SO,S3:0 1%(D M SO+甲苯),S4:0 3%(DM SO+甲苯),S5:0 5%(D M SO+甲苯)
Fig 3 E ff ec ts o f to l uene and DM SO co m bined exposure on ce ll acti va ti on o fHEK293(A)and S G C7901(B)
3 结论
实验结果证实DM SO可通过增加甲苯在水中的分散性,显著提高低浓度甲苯(0 05%)对斑马鱼胚胎的毒性效应,DM SO和甲苯存在明显的复合毒性效应.利用离体实验模型评估D M SO和甲苯的毒性效应时,因助溶剂本身的靶分子、致毒机制不同,对人胚肾HEK 293细胞和人胃癌SGC 7901细胞两种细胞株的毒性较低,并不影响最终的实验结果及分析.故在选择不同生物模型评估有机污染物毒性效应时,需考虑不同类型助溶剂所产生的复合效应.
参 考 文 献
[1] H allare A,NagelK,K h l erH et al ,Co m parative Em bryot oxici ty and Proteotox i cit y of Three Carri er Solven ts to Zeb rafis h(Dan i o reri o)
Em bryos E cot ox i cology and Env i ronm e n t a l Safet y,2006,63(3) 378 388
[2] A sariM,T akats uk iH,Ya m azak iM et al ,W asteW ood Recycli ng as An i m alB edding and Devel op m en t of B i o m on it ori ng ToolU s i ng t h e
CALUX Assay Env ironm ent In t erna tional,2004,30(5) 639 649
[3] S ci ppoM,E pp e G,D e P E et al ,DR CALUX Screen i ng of Food Sa m p l es:Eval uati on of theQu antit ati ve Approac h toM eas u re D i ox i n,
Furans and D ioxi n Li k e PCB s Ta l an t a,2004,63(5) 1193 1202
6期李佳等:助溶剂甲苯和二甲基亚砜对斑马鱼胚胎发育的复合毒性效应837
[4] V an W N,W i ndal I,Vand erperren H et al ,Vali dati on of t he CALUX B ioass ay for PCDD/F Analyses i n Hum an B lood P l as m a and Co m
p ari on w it h GC HR M S Talanta,2004,63(5) 1157 1167
[5] H a m ers T,Van Schaard enbu rg M D,Felzel E C et al ,The App licati on of R eporter Gen e A ss ays for t he Deter m i nati on of the Tox i
Potency of D iff use A ir Polluti on Th e Science o f the Tot a lE nviro m e n t,2000,262(1 2) 159 174
[6] 颜士勇,印木泉,韦毅等,甲苯对原代培养海马神经细胞的毒性研究 卫生研究,2004,33(1) 18 22
[7] Dange A ji t D,M asurek ar Vasant B,Tol uen e Toxicit y:E ffects of Sublet hal Level s on Enzy m e Activities i n Sea w ater Adapted T il ap ia
(Sarotherodon M oss a m b i cu s Peters) Journa l o f B ioscie n ces,1981,3(2) 129 134
[8] M c G rat h P,L iC Q,Zeb rafis h:A Pred i ctiveM odel f or Assess i ng Drug Induced Tox i cit y Drug D isc overy Today,2008,13(9 10)
394 401
[9] Par ng C,In vivo Zeb rafis h Assays for T oxicit y Testi ng Curre n tOpinion in Drug D iscovery and Developm e n t,2005,8(1) 100 106
[10] Zod ro w J M,S tege m an J J,Tanguay R L,H i s t ologicalAnal ys i s ofAcu teT oxicit y of2,3,7,8 Tetrach l orod i ben z o p d i oxin(TCDD)i n Ze
b rafis h A qua ti
c Toxicolo gy,2004,66(1) 25 38
[11] 颜士勇,甲苯神经毒性的生物学机制研究进展 海军医学杂志,1999,20(1) 22 27
[12] J ay A,E ffects ofO rgan ic Solven ts and Sol vent A traz i ne In t eracti on s on Tw o A l gae,Ch l orella Vu l gari s and Selenastrum Caprico mu t um
Arc h ives of E nvironmen t a lC on t am ina tion and T oxicology,1996,31(1) 84 90
CO M B INED TOXICITY OF DM S O AND TOLUENE ON DEVELOPM ENT OF ZEBRAFIS H(DAN I O RER IO)EMBRYOS LI J ia1 Z HOU Zhen1 H U qin2 WANG Yue1 LI ANG Yong1,3
(1 School ofM ed i ci n e,Jianghan Un i vers i ty,W uhan,430056,C hina; 2 C ollege of Res ou rces and Environm en t,
H uaz hong Agri cu lt u ralUn i versity,W uhan,430070,Ch i na; 3 S tate K ey Laboratory of Environm en talCh e m istry
and E cotoxicol ogy,R esearch Cen ter f or E co Environm en t al S ci en ces,Ch i n ese Acade m y of Sciences,Beiji ng,100085,Ch i na)
ABSTRACT
The present study exa m ines the effects o f coso lvent to l u ene and d i m ethy l su l p hox i d e(DM SO)on zebrafish e mbryos The resu lts showed that sing le exposure w ith lo w dose toluene(0 05%V/V)had lo w tox icity to the zebrafish e mbryon ic developm en,t wh ile DM SO(0 45%V/V)by itself pr oduced no observable effect But t h e t w o solvents together sho w ed strong synergistic tox ic ity Co m pared to t h e to l u ene sing le expo sure con tro l group,w ith the i n crease o fDMSO concentration,the e m bryos sho w ed sign ificant reduction in sur vival and hatch i n g rate,retarded e mbryon ic develop m ent and pronounced abnor m aliti e s On t h e contrary,no such effectw as recor ded w it h hum an e m br yon ic k i d ney(H EK 293)ce ll li n e and hu m an gastric cancer(SGC 7901)cell li n e The resu lts suggested that D M SO could enhance the neurotox i c ity o f to l u ene by increasing the dispersi o n in w ater,but there is no re m ar kable effect on the in vitro m odel B ased on t h e study,w hen using of different b i o log ica lm odels to assay the tox ic ity of o r gan ic co m pounds,the co m b i n ed effects of coso lvents shou l d be consi d ered to m i n i m ize experi m ental error
K eyw ords:toluene,D M SO,zebrafish,tox icity.
DMSO
二甲基亚砜 科技名词定义 中文名称： 二甲基亚砜 英文名称： dimethyl sulfoxide;DMSO 定义： 一种氢键破坏剂。因其抗冻作用，可用于细胞的冻存；因其对大分子的变性作用，用于变性凝胶电泳等。 所属学科： 生物化学与分子生物学（一级学科）；方法与技术（二级学科） 本内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布 百科名片 二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide或DMSO），无色液体，重要的极性非质子溶剂。它可与许多有机溶剂及水互溶。二甲基亚砜具有极易渗透皮肤的特殊性质，造成使用人员感觉类似牡蛎般的味道。 [编辑本段] 基本资料 结构式 产品名称：二甲基亚砜 结构简式：(CH3)2-S-O 英文名：Dimethyl sulfoxide 别名：Dimethylsulfoxide; Methyl sulfoxide; Sulfinylbis (methane); DMSO 分子式：C2H6OS 分子量：78.12 CAS：登录号67-68-5 EINECS：登录号200-664-3 FEMA：登录号3875 物理化学性质密度：1.1 熔点：18.4-19.0°C 沸点：189°C
折射率：1.477-1.48 闪点：95°C [编辑本段] 简介 二甲基亚砜（DMSO）是一种含硫有机化合物，分子式为（CH3）2SO，常温下为无色无臭的透明液体，具有吸湿性的可燃液体，既有高极性，高沸点，非质子，于水混溶的特性，毒性极低，热稳定性好，能溶于乙醇，丙醇，苯和氯仿等大多数有机物，被誉为“万能溶剂”。 二甲基亚砜广泛用作溶剂和反应试剂，特别是丙烯腈聚合反应中作加工溶剂和抽丝溶剂，作聚氨酯合成及抽丝溶剂，作聚酰胺，聚酰亚胺和聚砜树脂的合成溶剂，以及芳烃，丁二烯抽提溶剂和合成氯氟苯胺的溶剂等。除此之外，在医药工业中二甲基亚砜还有直接用作某些药物的原料及载体。二甲基亚砜本身有消炎止痛，利尿，镇静等作用，亦誉为“万灵药”，常作为止痛药物的活性组分添加于药物之中。 [编辑本段] 生产情况 生产目前世界上仅有美国，日本，法国和中国四个国家拥有二甲基亚砜的生产装置，截止1997年底美国，法国和日本三国现有的二甲基亚砜装置的生产能力已达3万吨/年。我国约1万吨年。 [编辑本段] 我国情况 生产情况 我国二甲基亚砜生产能力和产量增长很快。据统计，1992年我国二甲基亚砜生产能力已达4.5千吨/年，产量为2.6千吨；1995年创历史最高水平，生产能力达到8.7千吨/年（开车能力），生产量6千吨。1996年盘锦，太谷，榆茨，宜城等厂家共生产二甲基亚砜产品5千吨，外贸出口1.6千吨，国内销售量3.34千吨。我国二甲基亚砜生产装置均采用甲醇与二硫化碳为原料合成二甲基硫醚，温度380度，常压，同时可副产10%以上的甲硫醇等副产品。二甲基硫醚生产二甲基亚砜采用氧化和精制两个工序。 在氧化工序中，二甲基硫醚与二氧化氮（NO2）在液相中反应生成二甲基亚砜，同时二氧化氮被还原成氧化氮，采用逆流塔式液相氧化反应器，塔底温度60度，塔顶温度25度。二氧化氮由亚硝酸钠和浓硫酸反应制备，被还原后生成的NO用氧气氧化重新制得二氧化氮。未反应的二甲基硫醚经闪蒸从产物中分离，再循环使用，二甲基亚砜粗产品用氢氧化钠进行中和处理。
硫酸铜对斑马鱼胚胎发育的影响
中国海洋大学实验报告 年月日姓名：专业年级：同组者： 课程：发育生物学实验题目：硫酸铜对斑马鱼胚胎发育的影响 一．【实验目的】 1、锻炼独立开展科学实验、分析和解决实际问题的能力； 2、加深环境对动物受精及早期发育影响的理解 二.【实验原理】 重金属污染是近年渔业环境污染的公害之一。随着工农业的发展，浓度严重超标的一些重金属离子被排入水体而造成污染，对鱼类有毒害作用。目前水体中的重金属主要有Cd、Cu、Pb、Zn等。其中Cu离子就具有较强的毒性，可以和蛋白质中游离的羧基形成不溶性的盐，使蛋白质变性，因此常被用作杀菌剂。 斑马鱼（Danio rerio）是常见的暖水性（21~32℃）观赏鱼，鲤科,个体小（4~5㎝），常年产卵，鱼卵易收集，性成熟周期短且胚胎透明，便于观察药物对其体内器官的影响。雌性斑马鱼可产卵200枚，胚胎在24小时内就可发育成形，繁殖水温24℃时，受精卵经2~3天孵出仔鱼；水温28℃时，受精卵经36小时孵出仔鱼，这使得生物学家可以在同一代鱼身上进行不同的实验，进而研究病理演化过程并找到病因。由于斑马鱼基因与人类基因的相似度达到87%，这意味着在其身上做药物实验所得到的结果在多数情况下也适用于人体，因此它受到生物学家的重视。 在斑马鱼的整个生活周期中，胚胎期和仔稚幼鱼早期发育阶段对重金属污染最为敏感。据报道，波罗的海春天产卵的鲱鱼，在10 ppb 的Cu2+，水的盐度为5.7条件下即对它的受精和发育有影响。30 ppb的Cu2+引起大西洋鲱鱼（Clupea harengus）卵的死亡，而35 ppb 的Cu2+也使太平洋鲱鱼（C.pallasi）的胚胎发生大量死亡[1]。吴玉霖等1990年依据不同金属对褐牙鲆胚胎的滞育、致畸、成活率及孵化率的综合影响指际，得出5种金属对褐牙鲆胚胎的毒性大小顺序为：Cu2+>Zn2+>Cd2+>Pb2+>Cr3+,对仔鱼的毒性大小顺序为Cu2+>Cd2+>Zn2+>Pb2+>Cr3+ [2]。 三.【实验步骤】 1、实验材料 斑马鱼囊胚、CuSO4为分析纯，充分曝气的去离子水、24孔细胞培养板、恒温培养箱、用充分曝气的蒸馏水配置成浓度为5 mg/L 的CuSO4母液，用时稀释。. 2、实验方法 1）硫酸铜浓度梯度的设定 经查阅文献，确定斑马鱼胚胎发育从受精到孵化出幼鱼过程中的CuSO4半致死浓度和安全浓度范围，设定5个浓度梯度和和1个对照组。 研究表明，Cu2+对大银鱼受精卵的安全浓度为0.00112 mg/L[3]，对鮸状黄姑鱼仔鱼的安全浓度为0.006mg/L[4]，所以设定对照组CuSO4的浓度梯度分别为0（空白对照），0.001 mg/L，0.01 mg/L，0.1 mg/L，1.0 mg/L，2.0 mg/L。每个浓度组设定4个平行组。使用暴晒后的
斑马鱼动物模型的应用介绍
斑马鱼动物模型的应用 斑马鱼（Danio rerio）属于辐鳍亚纲（Actinopterygii）鲤科（Cyprinidae）短担尼鱼属（Danio）的一种硬骨鱼，原产于南亚，是一种常见的热带观赏鱼，因其体侧具有斑马一样暗蓝与银色相间的纹条而得名。 斑马鱼个体小，易于饲养，成体长4-5cm，雄鱼体修长，雌鱼体肥大。可在有限空间里养殖相当大的群体，可满足样本需求量大的研究。斑马鱼发育迅速，在28.5℃培养条件下受精后约40min完成第一次有丝分裂，之后大约每隔15min分裂一次，24h后主要器官原基形成，相当于28d的人类胚胎，幼鱼孵出后约3个月达到性成熟。雌雄鱼通过调控光周期控制14:10（光照:黑暗）产卵时间，成熟鱼每周可产卵一次，一尾雌鱼每次可产卵100-300枚。胚胎体外受精，体外发育，胚体透明，易于观察。受精卵直径约1mm，易于进行显微注射和细胞移植等操作。 一、斑马鱼的品系 经过30多年的研究应用和系统发展，已有约20个斑马鱼品系，斑马鱼基因数据库-ZFIN （http://zfin/org）里有相关的资料可供查询和下载。目前研究中常用的斑马鱼野生型品系主要为AB 品系、Tuebingen（Tu）品系、WIK 品系，斑马鱼基因组计划所用品系是Tu。AB 品系是实验室常用的斑马鱼品系，由单倍体细胞经早期加压法获得。Tu品系斑马鱼具有胚胎致死突变基因，用于基因组测序前敲除该致死突变基因。WIK品系较Tu品系具有更多的形态多样性。此外，还保存有3000多个突变品系和100多个转基因品系。这些品系资源对于利用斑马鱼开展各种科学研究起着很大的推动作用。 二、斑马鱼突变品系的筛选 斑马鱼突变的方法主要有三种：已基亚硝脲（ENU）化学诱导、γ或χ射线照射和插入诱变。ENU是一种DNA烃基化试剂，在生殖细胞减数分裂前诱导碱基对的替换，诱导产生的突变率为0.1%-0.2%，涉及单个基因的突变。射线照射导致染色体大片段的缺失或染色体重排，产生突变率达1%。插入诱变是以逆转录病毒为载体，用显微注射法将目的基因片段导入斑马鱼受精卵，整合到基因组中，干扰正常基因表达。射线照射产生的突变率是ENU 化学诱导的10倍，但由于突变涉及多个基因，突变的表型是受若干基因调控的结果，不利于基因功能的分析，因此，ENU化学诱导法是斑马鱼突变的主要方法。研究含有纯合致死
二甲基亚砜说明书
二甲基亚砜说明书中文名称：二甲基亚砜（DMSO） 英文名 :Dimethyl sulfoxide（DMSO） 别称：二甲亚砜 化学式： C2H6OS 分子量： 78.13 CAS登录号： 67-68-5 EINECS登录号： 200-664-3 熔点： 18.4 °C 沸点： 189°C 水溶性：能溶 密度： 1.100g/mL 外观：无色液体 闪点： 95°C 应用：有机高分子合成稳定溶剂 安全性描述：避光低温稳定 危险性符号：36/37/38 危险性描述：不可食用，接触就医 相对分子量： 78.078 供应商：乔羽生物 储存条件：2-8°C 低温避光保存
二甲基亚砜（DMSO）简介: 二甲基亚砜（DMSO）是一种含硫有机化合物，常温下为无色无臭的透明液体，是一种吸湿性的可燃液体。具有高极性、高沸点、热稳定性好、非质子、与水混溶的特性，能溶于乙醇、丙醇、苯和氯仿等大多数有机物，被誉为“万能溶剂”。在酸存在时加热会产生少量甲基硫醇、甲醛、二甲基硫、甲磺酸等化合物。在高温下有分解现象,遇氯能发生剧烈反应,在空气中燃烧发出淡蓝色火焰。可作有机溶剂、反应介质和有机合成中间体。也可用作合成纤维的染色溶剂、去染剂、染色载体,以及回收乙炔、二氧化硫的吸收剂。 二甲基亚砜（DMSO）物理性质: 无色粘稠液体。可燃，几乎无臭，带有苦味，有吸湿性。除石油醚外,可溶解一般有机溶剂。能与水、乙醇、丙酮、乙醛、吡啶、乙酸乙酯、苯二甲酸二丁酯、二恶烷和芳烃化合物等任意互溶，不溶于乙炔以外的脂肪烃类化合物。 [1] 有强烈吸湿性，在20℃，当相对湿度为60%时，可从空气吸收相当于自身重量70%的水分。该品是弱氧化剂，不含水的二甲基亚砜对金属无腐蚀性。含水时对铁；铜等金属有腐蚀性，但对铝不腐蚀。对碱稳定。在酸存在时加热会产生少量的甲基硫醇；甲醛；二甲基硫；甲磺酸等化合物。在高温下有分解现象，遇氯能发生激烈反应，在空气中燃烧发出淡蓝色火焰。 二甲基亚砜（DMSO）化学性质: 二甲亚砜还原生成甲硫醚。受强氧化剂作用氧化成二甲砜； 2．二甲基亚砜与酰氯类物质如氰尿酰氯、苯酰氯、乙酰氯、苯碘酰氯、亚硫酰氯、硫酰氯、三氯化磷等接触时，发生激烈的放热分解反应。与硝酸结合，生成（CH3）2SO·NHO3。与碳酸钡作用可使二甲基亚砜再生。与浓氢碘酸作用，生成二甲硫磺化合物。 3．二甲基亚砜有吸水性，用前需要进行干燥处理。 二甲基亚砜（DMSO）物性数据: 1、性状：无色黏稠透明油状液体或结晶体。具弱碱性，几乎无臭，稍带苦味，常用的有机溶剂。 2、相对密度（g/mL,20/4℃）：1.100 3、相对蒸汽密度（g/L,空气=1）：2.7 4、熔点（℃）：18.45 5、沸点（℃）：189 6、折射率：1.4795 7、黏度（mPa·s）：1.987（25℃）；2.2（20℃）；1.290（50℃） 8、闪点（℃，开口）：95 9、燃点：300~302℃ 10、蒸发热（KJ/mol，℃）：52.92 11、熔化热（KJ/mol）：13.94 12、生成热（KJ/mol）：-197.66 13、燃烧热（KJ/mol，定容）：1793.16 14、比热容（KJ/(kg·K)，℃，定压）：1.95 15、电导率（S/m，℃）：3×10-8 16、蒸气压（kPa，℃）：0.049 17、蒸气压（kPa，℃）：0.101 18、蒸气压（kPa，℃）：0.376
_助溶剂甲苯和二甲基亚砜对斑马鱼胚胎发育的复合毒性效应
第28卷 第6期 2009年 11月环 境 化 学E NV I RONMENTAL C H E M I STRY V o.l 28,N o .6N ove m ber 2009 2009年2月10日收稿. *湖北省科技攻关计划(N o .2006AA301C35)和国家科技支撑计划(N o 2007BAC27B01)资助.**通讯联系人. 助溶剂甲苯和二甲基亚砜对斑马鱼胚胎发育的 复合毒性效应 *李 佳1 周 珍1 胡 芹2 王 玥1 梁 勇 1,3**(1 江汉大学医学院,武汉,430056;2 华中农业大学资源与环境学院,武汉,430070;3 中国科学院生态环境研究中心,环境化学与生态毒理学国家重点实验室,北京,100085) 摘 要 研究了甲苯和二甲基亚砜(DM S O )对斑马鱼胚胎生长、发育的毒性效应.实验结果表明:低剂量 的甲苯(0 05%)单一暴露对斑马鱼胚胎发育有一定毒性,DM S O (0 45%)对斑马鱼胚胎无明显毒性;但甲 苯与D M SO 具有较强的复合毒性效应,随着D M S O 含量的增加,与甲苯单一暴露组相比,斑马鱼胚胎死亡 率显著增加、胚胎孵化率下降、胚胎发育迟缓并生成大量畸形;但甲苯以及甲苯和DM SO 复合物对人胚肾 HEK 293细胞株和人胃癌SGC 7901细胞株的活力均没有明显效应. D M S O 可通过提高甲苯在水中的分散性,增加甲苯的神经毒性,但对离体实验模型无显著效应,故在选择不同生物模型评估有机污染物毒性效 应时,需考虑不同类型助溶剂所产生的复合效应,以减少实验误差. 关键词 甲苯,二甲基亚砜,斑马鱼,毒性. 常用的助溶剂二甲基亚砜(DM SO)、丙酮、乙醇等在常用的浓度下,对环境毒理学常用的模式动物如鱼类、两栖类等没有明显的毒性效应 [1].为评估二英、多氯联苯、多溴联苯醚中某些高氯代、高溴代异构体的生物效应,在常规的D M SO 溶剂中,会适当添加少量的甲苯、正己烷等极性低的有机溶剂,以增加其溶解性[2 5],但这些已知具有较高毒性的溶剂与其它助溶剂之间是否存在相互作用, 并对实验结果造成偏差,需要加以评估. 甲苯作为一种常见的有机溶剂,其脂溶性高,挥发性较强,可通过鳃、体表进入鱼体,能轻易透过血脑屏障,进而抑制乙酰胆碱酯酶活性,并造成神经系统功能损伤、影响神经系统发育,具有明显的神经毒性效应 [6,7].斑马鱼胚胎发育毒性技术是国际认可的评价化学品毒性效应的标准方法[1,8 10]. 在本研究中,选取低剂量的甲苯(0 05%)和不高于0 45%的DM SO,研究助溶剂单一、复合暴露后,对斑马鱼胚胎发育的毒性效应;同时,为进一步验证斑马鱼胚胎毒性实验结果,选择人胚肾293细胞株和人胃癌7901细胞株,研究助溶剂对离体细胞活力的影响,以综合评价其毒性效应. 1 实验方法 1 1实验材料 将性成熟斑马鱼(Danio rerio ,AB 系)雌雄分缸,饲养于流水养殖系统.水温保持在26 2 左右,光照/黑暗周期控制在12h /12h .暴露实验开始前两天将雌雄以1 2配对,自然交配产卵.取受精1hpf(hour post fertilization)以内受精卵进行暴露实验. 1 2暴露实验 挑选正常发育的受精卵,3hpf 开始染毒进行暴露实验.实验于直径为7c m 的玻璃表面皿中进行,所用水均取自系统曝气水.试验浓度为:0(对照组)、0 05%甲苯、0 45%DM SO 、0 1%(D M SO +甲苯)、0 3%(DMSO+甲苯)和0 5%(D M SO +甲苯)(V /V ).其中,3种助溶剂复合物(DM SO +甲苯)分别由甲苯与D M SO 按不同体积比(1 1,1 5,1 9)混合配制而成,各助溶剂复合物试验组中甲
goosecoid在斑马鱼早期发育中的作用.doc
goosecoid在斑马鱼早期发育中的作用 Wnt/β catenin信号通路在早期胚胎发育中起到非常重要作用,它调控胚胎背腹图式发生。goosecoid(gsc)基因是经典Wnt信号通路的下游靶基因之一,同时对Wnt信号起负反馈抑制作用。之前报道中,gsc在小鼠和人中突变之后都会产生骨骼发育不全等症状,而目前关于gsc在斑马鱼中的具体生理功能还不是很清楚。 之前研究表明,用吗啡基-吗啉基技术(Morpholino,MO)敲低斑马鱼gsc,无明显缺陷。MO由于其作用时间短的限制,不能很好的研究基因在后期发育中的功能。而近年来的出现的基因编辑技术如TALENs,有着靶向高,操作方便的优点,成为可以用于基因功能的研究的新工具。 为了研究gsc在斑马鱼中的具体功能,我们利用TALENs技术,构建了斑马鱼gsc突变体模型,用于研究gsc在斑马鱼中的早期发育中的作用。得到的结果如下:(1)利用TLANEs技术敲除斑马鱼gsc,筛选得到移码缺失7bp的突变体。(2)gsc杂合突变体自交结果显示,突变体早期无明显背腹缺陷,但发育至受精后第五天(5 dpf)时,鱼鳔发育缺陷。 测序表明鱼鳔缺失个体为纯合突变体,经统计其占全部胚胎的21%。表明gsc 突变与鱼鳔缺陷是相关的。(3)对gsc突变体进行石蜡切片及苏木精伊红(HE)染色,结果显示,突变体鱼鳔结构存在。 (4)gsc突变体中,鱼鳔标记基因hb9原位杂交结果显示,鱼鳔发生未受到影响。表明突变体鱼鳔结构正常,但未充气。(5)充气由口、咽、鳔管等多个器官协调完成,而gsc后期特异表达在咽部。 gsc突变体咽部软骨阿尔新蓝染色,及石蜡切片,苏木精伊红染色,结果均表
斑马鱼-全胚胎免疫组织化学染色
斑马鱼-全胚胎免疫组织化学染色 斑马鱼胚胎的全组织免疫化学染色被广泛应用，这一技术需要额外的步骤来固定和通透以确保卵膜能够完全被溶液渗透。固定、封闭、抗体孵育、洗脱、通透以及底物显色过程都需要比正常的免疫细胞化学/免疫组化更长的时间，以使得溶液可以渗透到达样品的中心。 实验步骤： 1. 将胚胎置于5ml的器皿中固定1h。固定液的选择要谨慎，取决于两点：一是对于同一 种抗体，在冰冻切片中成功使用的固定液，可用来做全胚胎染色实验，二是根据目的蛋白。可用4%的多聚甲醛或者预混合的固定液来固定，预混合的固定液十分适合于神经蛋白。 使用Pasteur移液管来移动胚胎、吸取溶液，这有利于防止来自于移液管窄末端对胚胎的损坏。 2. 用含1%Triton的PBS清洗胚胎至少四次，每次5分钟。 3. 将胚胎置于冰丙酮/PBS混合液中8分钟。 丙酮可用帮助通透坚固的卵膜，对于其他样品如鸡和鼠这一步可省略。 4. 用含1%Triton的PBS清洗胚胎至少四次，每次5分钟。 5. 用封闭液（含1%Triton、10%胎牛血清的PBS）室温孵育胚胎1h。 6. 阻断过氧化物酶：将胚胎置于含0.1%H2O2的封闭液中4°C过夜。 7. 用封闭液清洗胚胎2次。 8. 将Pasteur移液管末端剪掉形成2ml的管子，用其转移胚胎。加入合适浓度的一抗。 一般在全胚胎染色中抗体孵育的时间比较久，为了防止微生物的生长，在稀释一抗的封闭液中会加入0.02%的叠氮化钠。 9. 样品在混合器上4°C缓慢旋转孵育1-4天。 根据不同的抗体以及胚胎的大小，孵育的时间需要进行一些优化。 10. 用含1%Triton、10%胎牛血清的PBS清洗胚胎3次，每次1h。 11. 用含1%Triton的PBS清洗3次，每次10分钟。 12. 用DAB底物室温孵育胚胎2-3h。 13. 将胚胎转移到一个碟子中，加入新鲜的配制的显示底物（每1mlDAB加5ul的过氧化氢）。 14. 用PBS清洗3次，使得样品达到理想的染色强度。 15. 爬片观察胚胎：观察分析前样品于4°C避光储存。 爬片：用融化的含1%琼脂糖的PBS爬片。一旦加入琼脂糖后，用含70%甘油的PBS 覆盖琼脂糖，再在样品上放置一个盖玻片。
二甲基亚砜
二甲基亚砜MSDS 第一部分化学品及企业标识 化学品中文名：二甲基亚砜 第二部分成分/组成信息 主要成分：纯品 第三部分危险性概述 侵入途径：吸入、食入、经皮吸收 健康危害：本品引起的中毒少见。常见症状有恶心、头痛和呼吸有大蒜味。对眼和呼吸道有刺激性。对皮肤有原发性刺激作用，引起皮肤发红、痒、表皮脱落。对皮肤有致敏性，可 引起荨麻疹。 环境危害：对环境有害。 燃爆危险：可燃，其蒸气与空气混合，能形成爆炸性混合物。 第四部分急救措施 皮肤接触：立即脱去污染的衣着，用肥皂水和清水彻底冲洗皮肤。如有不适感，就医。 眼睛接触：提起眼睑，用流动清水或生理盐水冲洗。如有不适感，就医。 吸入：脱离现场至空气新鲜处。如呼吸困难，给输氧。就医。 食入：饮足量温水，催吐。就医。 第五部分消防措施 危险特性：遇明火、高热可燃。受热分解产生有毒的硫化物烟气。能与酰氯、三氯硅烷、三氯化磷等卤化物发生剧烈的化学反应。 有害燃烧产物：一氧化碳、氧化硫。 灭火方法：用雾状水、泡沫、干粉、二氧化碳、砂土灭火。 灭火注意事项及措施：消防人员须佩戴防毒面具、穿全身消防服，在上风向灭火。尽可能将容器从火场移至空旷处。喷水保持火场容器冷却，直至灭火结束。处在火场中的容器若已变色或从安 全泄压装置中产生声音，必须马上撤离。 第六部分泄漏应急处理 应急行动：根据液体流动和蒸气扩散的影响区域划定警戒区，无关人员从侧风、上风向撤离至安全区。消除所有点火源。建议应急处理人员戴防毒面具,穿防毒服。穿上适当的防护 服前严禁接触破裂的容器和泄漏物。尽可能切断泄漏源。防止泄漏物进入水体、下水 道、地下室或密闭性空间。小量泄漏：用干燥的砂土或其它不燃材料吸收或覆盖，收 集于容器中。大量泄漏：构筑围堤或挖坑收容。用飞尘或石灰粉吸收大量液体。用泵 转移至槽车或专用收集器内。 第七部分操作处置与储存
斑马鱼的胚胎发育与影响因素
鲁东大学生命科学学院学院20 10 －20 11 学年第 二 学期 《 发育生物学 》课程论文 课程号：2522080 任课教师 刘泽隆 成绩 论文题目：（可指定题目，也可说明题目范围。） 斑马鱼的发育及其发育的影响因素 论文要求：（对论文题目、内容、行文、字数等作出判分规定。） 1. 论文题目：准确得体，简短精炼，醒目 2. 摘要：文字简练，字数不超过正文的5%；关键词不少于三个，关键词之间用分号间隔 3. 正文：内容充实，论据充分、可靠，论证有力，主题明确语言流畅，条理清晰，字数不少于3000字 4.字体：摘要、关键词宋体5号字；题目黑体三号字；正文宋体四号字 10分 教师评语： 教师签字： 年 月 日 斑马鱼的发育及其发育的影响因素 摘要：斑马鱼(zebra fish)，又名蓝条鱼、花条鱼、斑马担尼。斑马鱼由于个体小，养殖花费少，能大规模繁育，且具许多优点，经过30多年的研究应用和系统发展，已有约20个斑马鱼品系，斑马鱼基因数据库里有相关斑马鱼的资料可供查询和下载，方便了研究。本文主要介绍了斑马鱼的发育过程以及葡萄糖溶液的浓度，温度，TCDD 对胚胎发育的影响。 Abstract ：Zebra fish because of the individual small, breeding cost less, can breed, and with many large scale advantage, after 30 DuoNian of research and application and development of the system already had about 20 zebra fish strain, zebra fish genes related data in the material available for inquires zebra fish and download, convenient research. This paper mainly introduces the development process and zebra fish glucose solution concentration, temperature, the influence of TCDD for embryonic development .关键词：斑马鱼；发育；葡萄糖；溶液浓度；温度；TCDD 一、斑马鱼简介 斑马鱼(zebra fish)，又名蓝条鱼、花条鱼、斑马担尼鱼。 斑马鱼是一种常见的热带鱼。斑马鱼体型纤细，成体长3-4cm ，对水质要求不高。孵出后约3个月达到性成熟，成熟鱼每隔几天可产卵一次。卵子体外受精，体外发育，胚胎发育同步且速度快，胚体透明。发育温度要求在25-31℃之间。斑马鱼由于个体小，养殖花费少，能大规模繁育，且具许多优点，吸引了众多研究者的注意。经过30多年的研究应用和系统发展，已有约20个斑马鱼品系，斑马鱼基因数据库里有相关 斑马鱼的资料可供查询和下载，方便了研究。斑马鱼的细胞标记技术、组织移植技术、突变技术、单倍体育种技术、转基因技术、基因活性抑制技术等已经成熟，且有数以千计的斑马鱼胚胎突变体， 学院______________ 专业_____________ 年级________ 班________ 学号_____________姓名______________ 密封线 学生须将文字写在此线以下
斑马鱼胚胎发育过程中Mef2c的表达
万方数据
复旦学报（医学版）２００６年１月，３３（１） 脏的发生与发育过程中的作用提供依据。 材料和方法 斑马鱼胚胎固定收集不同发育时期的ＡＢ野 生型斑马鱼（购自俄勒冈大学，斑马鱼养殖系统从美国ＡｑｕａｔｉｃＨａｂｉｔａｔｓ公司引进）胚胎：６ｈｐｆ（ｈｏｕｒｓｐｏｓｔ—ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ，受精后６ｈ）、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１７、２０、２４、３６、４８ｈｐｆ，用４％多聚甲醛溶液固定过夜（至少固定１２ｈ），保存于甲醇溶液中，置一２０℃备用。 引物设计与合成首先根据Ｇｅｎｂａｎｋ数据库查得斑马鱼Ｍｅｆ２ｃｃＤＮＡ序列（Ｇｅｎｂａｎｋ：３０５７５），以包含密码子１３１９～２３８５位的基因序列为ＲＮＡ探针序列，探针序列总长１０６６ｂｐ。ＲＮＡ探针的引物序列（由上海赛百盛生物有限公司合成）为：Ｆｏｒ—ｗａｒｄ：５＇－ＣＴＣＡＡＡＴＡＣＧＧＡＡＡＡＧＣＴＡＣ一３ ７Ｒｅｖｅｒｓｅ：５＇－ＣＧＣＣＣＧＴＧＧＧＡＣＴＧＡＴＧＡ ＧＡＧ一３ ７。 ＰＣＲ扩增以斑马鱼基因组总ＤＮＡ为模板，用以上两条引物特异扩增ＲＮＡ探针序列。扩增条件为：９５℃预变性２ｍｉｎ，９５℃变性４５Ｓ，５７℃复性４５Ｓ，７２℃延伸２ｍｉｎ，重复３０个循环，最后７２℃延伸７ｍｉｎ。１％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。 合成反义ＲＮＡ探针将纯化的扩增产物连接到ｐＧＥＭ—Ｔ载体（Ｐｒｏｍｅｇａ）中，然后转化到ＤＨ５ａ感受态菌株（博大泰克）中进行克隆。根据Ｈａｒｌａｎｄ的方法［４３抽提转染后的连接载体质粒（测序验证质粒中插入序列是否正确），ＮｏｔＩ内切酶（ＮＥＢ）酶切完全，以其为模板转录合成反义ＲＮＡ探针。 整体原位杂交取不同发育时期的胚胎，用１×ＰＢＳＴ溶液洗去多余的甲醇溶液，将胚胎置于６５℃水浴进行预杂交３ｈ，然后加入所合成的反义ＲＮＡ探针６５℃水浴杂交过夜。多余的探针用０．２×ＳＳＣ溶液洗去，加入ａｎｔｉ—Ｄｉｇ—ＡＰ（Ｒｏｃｈｅ）与反义ＲＮＡ探针结合过夜。未结合的抗体用１ＸＰＢＳＴ溶液洗去，再加入ＢＣＩＰ／ＮＢＴ／ＮＴＭＴ溶液显色３０ｍｉｎ，迅速用１ＸＰＢＳＴ溶液洗去多余的显色液，在显微镜下观察并记录结果。 结果 探针合成效果琼脂糖凝胶电泳检测结果表明，本实验中设计的引物能够特异性地扩增目标基因片段。图１Ａ为特异扩增的ＲＮＡ探针序列电泳检测结果，扩增的ＲＮＡ探针序列大小约１０６６ｂｐ。图１Ｂ为酶切后电泳迁移率的改变，２、３泳道是未被酶切的质粒序列，４、５泳道是酶切后的质粒序列。酶切后质粒电泳速率要比未酶切质粒的速率要快。同时，我们将该序列测序后进一步验证（由上海赛百盛生物有限公司测序），连接至ｐＧＥＭ—Ｔ载体中的ＲＮＡ探针的序列是正确的。 图ｌ凝胶分析ＰＣＲ结果（Ａ）和质粒酶切结果（Ｂ）Ｆｉｇ１ＧｅｌａｎａｌｙｓｉｓＰＣＲ（Ａ）ａｎｄｐｌａｓｍｉｄ（Ｂ） Ａ：１：ｍａｒｋｅｒ；２－５；ＲＮＡｐｒｏｂｅ．Ｂ：１：ｍａｒｋｅｒ；２－３：Ｍｅｆ２ｃＲＮＡ—ｐＧＥＭＴ； ４－５：Ｍｅｆ２ｃＲＮＡ－ｐＧＥＭＴｃｕｔｂｙＮｏｔ－１ 斑马鱼整体原位杂交在斑马鱼胚胎发育早期，Ｍｅｆ２ｃ在胚体中没有自身的转录产物，仅少许从母体自带的Ｍｅｆ２ｃｍＲＮＡ存在，胚体染色呈现为弥散均染状态（图２：ａ，ｂ见封二）。当胚胎逐步发育到１３ｈｐｆ，Ｍｅｆ２ｃ在体节中开始表达，此时约已形成８个体节，表现为在背侧出现两条条带状的深染部位；同时，在心脏中的表达也开始出现，在靠近头侧部出现有深染的片状区域，代表早期的生心区的细胞中有Ｍｅｆ２ｃ表达（图２：ｃｌ，ｃ２见封二）。当胚胎发育至１５ｈｐｆ时，体节以及心脏中Ｍｅｆ２ｃ的表达更加明显，Ｍｅｆ２ｃ在体节的表达表现为各个体节之间能清晰区分，并表现为典型的Ｖ型结构；同时，心脏中的表达表现为生心区细胞开始集中，逐步靠近体轴开始形成心管结构，体现出染色更为集中，由片状染色转变成为线状（图２：ｄｌ，ｄ２见封二）。随着胚胎进一步发育，体节逐步完善，心管逐步形成，Ｍｅｆ２ｃ仍然保持较高的转录水平，体节中表现为随着体节的增多，Ｖ型染色的体节也随之增多；在心脏的表达呈现出明显的线管状结构（图２：ｅ，ｆ见封 －－）。斑马鱼的胚胎发育随着时间的进展而逐步完 万方数据
DMSO
二甲基亚砜 中文名称： 二甲基亚砜 英文名称： dimethyl sulfoxide;DMSO 定义： 一种氢键破坏剂。因其抗冻作用，可用于细胞的冻存；因其对大分子的变性作用，用于变性凝胶电泳等。 应用学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；方法与技术（二级学科） 本内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布 结构式 产品名称：二甲基亚砜 结构简式：(CH3)2-S-O 英文名：Dimethyl sulfoxide 别名：Dimethylsulfoxide; Methyl sulfoxide; Sulfinylbis (methane); DMSO；Me2SO 分子式：C2H6OS 分子量：78.12 CAS：登录号 67-68-5 EINECS：登录号 200-664-3 FEMA：登录号 3875 物理化学性质密度：1.1 熔点：18.4-19.0°C 沸点：189°C 折射率：1.477-1.48 闪点：95°C
燃点：300℃ 粘度:1．996mPa·s(25℃) 编辑本段简介 二甲基亚砜（DMSO）是一种含硫有机化合物，分子式为（CH3）2SO，常温下为无色无臭的透明液体，是一种吸湿性的可燃液体。具有高极性、高沸点、热稳定性好、非质子、与水混溶的特性，能溶于乙醇、丙醇、苯和氯仿等大多数有机物，被誉为“万能溶剂”。 二甲基亚砜广泛用作溶剂和反应试剂，特别是丙烯腈聚合反应中作加工溶剂和抽丝溶剂，作聚氨酯合成及抽丝溶剂，作聚酰胺，聚酰亚胺和聚砜树脂的合成溶剂，以及芳烃，丁二烯抽提溶剂和合成氯氟苯胺的溶剂等。除此之外，在医药工业中二甲基亚砜还有直接用作某些药物的原料及载体。二甲基亚砜本身有消炎止痛，利尿，镇静等作用，亦誉为“万灵药”，常作为止痛药物的活性组分添加于药物之中。 DMSO是二甲基亚砜，用途广泛。用作乙炔、芳烃、二氧化硫及其他气体的溶剂以及腈纶纤维纺丝溶剂。是一种即溶于水又溶于有机溶剂的极为重要的非质子极性溶剂。对皮肤有极强的渗透性，有助于药物向人体渗透。也可作为农药的添加剂。也是一种十分重要的化学试剂。 DMSO也是一种渗透性保护剂，能够降低细胞冰点，减少冰晶的形成，减轻自由基对细胞损害，改变生物膜对电解质、药物、毒物和代谢产物的通透性。 但研究表明，DMSO存在一定的毒性作用，与蛋白质疏水集团发生作用，导致蛋白质变性,具有血管毒性和肝肾毒性。 DMSO存在一定的毒性作用，用的时候要避免其挥发，要准备1%-5%的氨水备用，皮肤沾上之后要用大量的水洗以及稀氨水洗涤. 最为常见的为恶心、呕吐、皮疹及在皮肤、和呼出的气体中发出大蒜、洋葱、牡蛎味。 吸入：高挥发浓度可能导致头痛，晕眩和镇静。 皮肤：能够灼伤皮肤并使皮肤有刺痛感，如同所见的皮疹及水泡一样。若二甲基亚砜与含水的皮肤接触会产生热反应。要避免接触含有毒性原料或物质的二甲基亚砜溶液，因其毒性不为人所知，而二甲基亚砜却可能会渗入肌肤，在一定条件下会将有毒物质代入肌肤。 吸收：吸收危险性很低。
斑马鱼性腺促熟及早期发育模式
斑马鱼性腺促熟和早期发育模式 XXX,YYY,ZZZ 一、目的与要求： 1、掌握斑马鱼性腺促熟和产卵调控技术。 2、加深硬骨鱼早期形态发育模式的理解。 二、实验内容： （一）斑马鱼性腺促熟和产卵调控。 1、斑马鱼特性： 斑马鱼一般4月龄性成熟，5月龄鱼繁殖较好；繁殖周期短，一般7天左右。 雌雄分辨：雌性（偏银灰色，体形丰满，腹部膨大、松软，仰腹可见有明显的卵巢轮廓，手摸富有弹性）；雄性（偏柠檬色，腹部扁平，身材显得修长）。【如图一、图二】 图一：雄鱼图二：雌鱼 精、卵体外受精，体外发育，且速度快。发育速度与温度密切相关：在25℃的培养条件下，从受精卵到孵化约需36h；在28℃的培养条件下，从受精卵到孵化约需24h，即胚胎发育成熟。 2、斑马鱼繁殖准备： 将亲鱼雌、雄分开饲喂2～3天（要在饲养箱中加一玻璃隔板，将雌、雄分开，但同时相互之间又要能够看到），繁殖时将雌、雄按1：1或2∶1比例放入产卵池中进行产卵受精。在此过程中一般采用10h光照，14h黑暗的光周期。斑马鱼一般在混合的次日凌晨产卵，为防止亲鱼吞噬鱼卵，可用网孔2～3mm的网将亲鱼限制在产卵池的上半部活动，以防止亲鱼吞吃鱼卵。每条雌鱼可产卵300～1000粒。 （二）斑马鱼早期发育观察： 斑马鱼早期胚胎发育主要有以下七个时期（附有相应的时间）： （1）合子期Zygote Period(0-0.75h) （2）卵裂期Cleavage Period(0.75-2.2h) （3）囊胚期Blastula Period(2.25-5.25h) （4）原肠胚期Gastrula Period(5.3-10h) （5）体节期Segmentation Period(10-24h) （6）咽期Pharyngula Period(24-48h) （7）孵化期Hatching Period(48-72h)
斑马鱼性腺促熟及早期发育模式
年月日姓名：专业年级：同组者 科目：发育生物学实验题目：斑马鱼性腺促熟及早期发育模式 一【目的要求】 1、通过实验操作掌握斑马鱼性腺促熟和产卵调控技术 2、通过斑马鱼早期发育的观察，巩固对硬骨鱼胚胎发生的认识 二【实验材料】 （一）器材 培养缸、控温棒、解剖镜、显微镜 (二)试剂 经太阳晒过至少一天的自来水 （三）动物 斑马鱼（Danio sp.） 三【实验内容】 （一）亲鱼培育和性腺促熟 挑选体长大于4厘米的斑马鱼放养于鱼缸中，水温保持在28℃左右，放养数量根据鱼缸中水体体积而定，密度5尾\L左右。饲喂亲鱼用的饲料有活性饲料和配合饲料两种，直接购自于观赏鱼市场，要求每天投喂4次，及时清除残饵，隔天换水，快到繁殖季节时将雌雄分养，加强管理。 （三）繁殖 繁殖前一天中午，将雌雄合养于繁殖缸里，要求雌雄比例为2:1。由于斑马鱼有食卵的习性，为防止亲鱼吞噬鱼卵，可用网孔为2-3毫米的网将亲鱼限制在繁殖缸的上半部活动，以防止亲鱼吞吃鱼卵。一般次日凌晨到中午可以产卵和受精，受精卵便沉降于缸底，将繁殖后的亲鱼及时转移至别的培养缸中，吸取缸底受精卵，剔除异物以及眼观有白色小斑点、畸形异常卵。 （三）斑马鱼胚胎发育模式 孵化期间，培养用水温度控制在25-28℃，每天要及时清除败育卵，并换水1-2次。按时观察记录斑马鱼胚胎的早期发育过程，绘制斑马鱼的胚胎发育模式图。 1、受精卵：斑马鱼的卵呈圆球形，橙黄色、微透明，直径0.8-0.9 mm。在水中，受精卵卵膜(壳膜)迅速膨胀，出现透明的卵周隙，在壳膜上可以看到呈漏斗状的卵膜孔。 2、卵裂：卵子受精后，细胞质迅速向动物极流动，并集中形成帽状的胚盘。卵裂即在胚盘范围内进行，卵裂属于不全裂，盘状卵裂。第一次分裂为经裂，分裂沟自上而下，但不到达底部，结果分为两个相等的不完整分裂球。第二次分裂仍为经裂，分裂面与第一次垂直，仍是不完全分裂，于是分成大小相似的四个分裂球。第三次分裂亦为经裂，两个分裂面在第一次分裂面两侧，并与第一次分裂面平行，形成两排，每排四个，共八个分裂球。第四次分裂仍为经裂，两个分裂面在第二次分裂面的两侧，并与第二次分裂面平行，分裂为四排每排有四个分裂球，共形成十六个分裂球。第五次分裂，有经裂也有纬裂，分裂面己不整齐，分裂球大小也不一致。以后几次分裂，分裂球愈分愈小。 3、囊胚期：由于细胞不断分裂，数目增多，细胞体积逐渐变小，分裂球层次增加，同时在胚盘与卵黄之间产生一空腔，即为胚盘下腔，此时称囊胚期，又分为囊胚早期、中期和晚期，也称高囊胚、中囊胚和低囊胚。 4、原肠胚期：囊胚晚期后，细胞逐渐向植物半球下包，胚盘变扁，开始进入原肠期。当胚盘下包到卵黄的一半时，胚环最大，背唇呈新月状，此即胚盾开始，即原肠早期。胚盘继续下包到胚胎的三分之二时，由于细胞不断集中于胚环的一处，致使该处呈一盾状隆起即
斑马鱼胚胎整体原位杂交_6.22
斑马鱼胚胎整体原位杂交 (Whole-mount in situ hybridizations in zebrafish embryos) 北京大学遗传与发育生物学实验室 整理者：肖安版本：V6.22 Build 2006-8-17 说明：小号宋体文字为操作提示，其中下划线标记者为以下数步均需注意的内容；小号楷体文字为影响结果的重要步骤提示，注意控制记录其操作处理的条件和时间，以在重复实验探索最适条件时进行适当调整。 在整个实验中应当注意： (1) 由于环境中存在大量RNA酶，RNA在常温下极易降解。因此，涉及RNA的操作，在探针去除之前，以及探针的合成与纯化过程，必须严格防止污染。操作需要要戴乳胶手套进行，使用专用枪头、离心管、电泳槽等，尽量缩短RNA 在常温或37℃放置时间，电泳使用高电压短时间的程序，每次必须更换新电泳液。实验间隙中RNA放置在-20℃，过夜或更长时间保存在-80℃。 (2)如同时对多管进行吸去溶液和加入溶液工作，应当按照同样的顺序依次操作，以保证其处理时间基本一致。避免漏加溶液。 (3)注意所加溶液与胚胎温度的差异，应当先预热再使用。一般溶液加入量为1mL左右，管平放以使胚胎分散与溶液充分接触，但探针杂交一步溶液过少可竖直放置。 (4)吸取胚胎的枪头应剪去尖端以扩大开口。吸时动作要轻。任何时候都要防止丢失胚胎，可在换前一管溶液时将后一管竖直放置让胚胎沉降一会以免吸走。 (5)注意保护标签，并且易混淆标签必须设法分辨(如6和9)。 第一天 以下操作需戴乳胶手套。 1 水溶液体系重新处理 (Rehydration)。 1.1吸去恢复到室温的胚胎中的甲醇(MeOH)，用70%, 50%, 30%的 MeOH的PBST溶液依次处理5分钟。 梯度稀释的目的是防止胚胎收缩，可适当多添加几个浓度梯度。稀释时间宁长勿短。 特别注意保护标签，MeOH为有机溶剂，易腐蚀油性笔书写的标签。 1.2 PBST处理5分钟，两次。 2 蛋白酶消化和随后的固定(Proteinase digestion and post fixation)。 2.1用蛋白酶K的PBST溶液(在管中原有的约1mLPBST中加入1uL10mg/mL的蛋白酶K，终浓度 消化的目的是使探针更容易进入组织中。应根据胚胎质量、以前原位杂交结果适当增减时间。注意双氧水脱色的胚胎受损害较大，蛋白酶K处理时间应大大短于培育时加入PTU阻止色素生长的胚胎。 理论上换新的酶和新胚胎都应该重试处理时间。 以下操作室温进行，注意溶液预热。 2.2消化时间到后，先尽快用PBST暂时漂洗，然后PBST洗5分钟，一到两次。 在PBST洗后或下一步多聚甲醛固定后可以按照探针将胚胎分管和混合，注意同一管中的胚胎发育时期不宜相隔过近，以免最后观察结果时难以分辨。但若相隔过远，后面的染色时间可能会有很大差异，并且处于发育较早期的胚胎破裂时卵黄可能污染发育较晚期的胚胎。 每一时期每一探针需15枚左右(发育早期的胚胎在实验中容易损坏，宜多取一些)。 若做正负对照，正对照用已明确的Marker基因探针(反义RNA链)，或者对胚胎进行双染。负对照使用正义RNA链，或者不加探针(如粗略筛选时)。注意及时写上新的标签编号并记录下每个编号对应的各胚胎时期。 2.3 4%多聚甲醛(paraformaldehyde, para)固定20分钟。 提前解冻，每次实验都尽量用一管新的多聚甲醛，避免RNase污染。未使用完部分可用于固定胚胎。 用于原位杂交的胚胎都使用多聚甲醛固定。甲醛苦味酸混合液固定胚胎虽然能更好的保持形态，但将破坏胚胎抗原性，导致零结果。 2.4 PBST洗5分钟，两次。
DMSO(二甲基亚砜),msds
二甲基亚砜化学品安全技术说明书 第一部分：化学品名称回目录 化学品中文名称：二甲基亚砜 化学品英文名称：dimethyl sulfoxide 中文名称2：二甲亚砜 英文名称2：methyl sulfoxide 技术说明书编码：2023 CAS No.：67-68-5 分子式：C2H6OS 分子量：78.13 第二部分：成分组成信息回目录 有害物成分含量CAS No. 有害物成分含量CAS No. 二甲基亚砜67-68-5 第三部分：危险性概述回目录 健康危害：吸入、摄入或经皮肤吸收后对身体有害。对眼睛、皮肤、粘膜和上呼吸道有刺激作用。可引起肺和皮肤的过敏反应。 燃爆危险：本品可燃，具刺激性，具致敏性。 第四部分：急救措施回目录 皮肤接触：脱去污染的衣着，用大量流动清水冲洗。 眼睛接触：提起眼睑，用流动清水或生理盐水冲洗。就医。 吸入：脱离现场至空气新鲜处。如呼吸困难，给输氧。就医。 食入：饮足量温水，催吐。就医。 第五部分：消防措施回目录 危险特性：遇明火、高热可燃。受热分解产生有毒的硫化物烟气。能与酰氯、三氯硅烷、三氯化磷等卤化物发生剧烈的化学反应。 有害燃烧产物：一氧化碳、二氧化碳、氧化硫。 灭火方法：消防人员须戴好防毒面具，在安全距离以外，在上风向灭火。尽可能将容器从火场移至空旷处。喷水保持火场容器冷却，直至灭火结束。处在火场中的容器若已变色或从安全泄压装置中产生声音，必须马上撤离。灭火剂：雾状水、泡沫、干粉、二氧化碳、砂土。 第六部分：泄漏应急处理回目录 应急处理：迅速撤离泄漏污染区人员至安全区，并进行隔离，严格限制出入。切断火源。建议应急处理人员戴自给正压式呼吸器，穿防毒服。尽可能切断泄漏源。防止流入下水道、排洪沟等限制性空间。小量泄漏：用砂土、蛭石或其它惰性材料吸收。也可以用大量水冲洗，洗水稀释后放入废水系统。大量泄漏：构筑围堤或挖坑收容。用泵转移至槽车或专用收集器内，回收或运至废物处理场所处置。 第七部分：操作处置与储存回目录 操作注意事项：密闭操作，全面排风。操作人员必须经过专门培训，严格遵守操作规程。建议操作人员佩戴自吸过滤式防毒面具（半面罩），戴化学安全防护
二甲基亚砜物化性质
二甲基亚砜 本文由南通润丰石油化工收集整理二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide，简称DMSO），是分子式为(CH3)2SO的化学物质。其为一无色液体，并为重要的极性非质子溶剂。它可与许多有机溶剂及水互溶。二甲基亚砜具有极易渗透皮肤的特殊性质，造成使用人员感觉类似牡蛎般的味道。
危险性 欧盟危险性符号 刺激性Xi
制造 二甲基亚砜是纸浆制造过程的副产物。 用途 二甲基亚砜是许多化学反应的常用溶剂，尤其在S N2烷基化反应中是极佳的溶剂：若使用氢氧化钾为硷将吲哚烷基化，能得到极高产率；亦可使用苯酚取代吲哚进行相似的反应。二甲基亚砜可与碘甲烷反应而生成锍离子，并与氢化钠反应而生成硫叶立德。因为硫氧基对其共轭硷的稳定化作用，二甲基亚砜中的甲基略具酸性（p K a=35）。 二甲基亚砜早在1867年即已发现，但在第二次世界大战之后才开始在商业上使用。除作为有机合成及工业应用(聚合物化学、制药及农业化学品)的溶剂之外，也是优良的油漆清除剂，可在短时间内去除木材和金属上的涂料。相对于许多其他油漆清除剂，如硝基甲烷及二氯甲烷，二甲基亚砜被认为是比较安全的。在有机合成中，二甲基亚砜亦可用于许多氧化反应中，例如Pfitzner-Moffatt氧化反应和斯文氧化反应。 二甲基亚砜亦用于电子工业上的清洗剂，而其重氢取代物（DMSO-d6）则是核磁共振的优良溶剂，因它可广泛溶解多种化合物，并几乎不会对样品的讯号造成影响。在低温生物学中，二
甲基亚砜则作为抗冻剂使用，并仍是用来保存器官、组织与细胞悬浮液的抗冻剂玻璃化混合物的主要成分之一。尤其在冷冻与长期储存胚胎干细胞与造血干细胞方面更为重要，通常是以10%二甲基亚砜与90%胚胎血浆的混合物冷冻。在自体骨髓移植中，二甲基亚砜与病人的造血干细胞一并重新注射入体内。另一种在生物学上重要的功能，他可以使未分化的干细胞，诱导为成熟的肌肉细胞。它也广泛应用于溶解在生化或细胞生物学实验的化学品。 二甲基亚砜使用可回溯自1963年，俄勒冈大学以Stanley Jacob为首的医学院团队发现二甲基亚砜能深入渗透但不破坏皮肤与其他皮膜，而且可携带其他物质深入生物系统中。一些人表示在接触皮肤之后，有类似洋葱或大蒜的气味产生，乃是因为二甲基亚砜被代谢作用还原为二甲基硫的关系。在医药上，二甲基亚砜最主要利用于局部止痛剂、局部药物载体、消炎药与抗氧化剂。二甲基亚砜曾被测试用于治疗极多的健康状况与疾病上。美国食品药物管理局（FDA）目前只核准二甲基亚砜用于缓和间质性膀胱炎症状的治疗。药物的专利权只有17年的期限, 数十年前便已开始使用的二甲基亚砜现在已经不可能取得专利权。由于药品公司甚少会投资在没有专利权保障的药物上，关于二甲基亚砜的药性的研究并不多。二甲基亚砜也是一种马用的药膏。 二甲基亚砜是常用的有机溶剂中，溶解能力最强的一种。它可以溶解大部份的有机物，包括碳水化合物、聚合物、肽，以及很多的无机盐和气体。它可以溶解相等于自己50-60%重量的溶质（其他一般溶剂只可以溶解10-20%），所以它在样本管理和高速药物筛检中是很重要的。 在某些条件下，当二甲基亚砜与酰氯接触时，会发生爆炸性反应。 其他极性非质子性溶剂 二甲基亚砜是重要的极性非质子性溶剂。它的毒性比其他如二甲基甲酰胺（DMF）、二甲基乙酰胺（DMAC）、N-甲基吡咯烷酮（NMP）及六甲基磷酰胺（HMPA）等此类溶剂低。安全性