体外细胞实验方法
细胞株在适当的培养基中保持10% FBS。
从Addgene(质粒)购买HA-FLAG-UCHL3。
#22564，然后再克隆到pGEX-4T-2载体(Clontech)中。UCHL3C94A和S75A突变体由位点定向突变层积产生)。抗uchl3抗体购自ProteinTech公司
(12384 - 1 - ap)。抗ub (P4D1)、抗rpa32 (9H8)、抗brca1 (D9)抗体购自Santa Cruz Biotechnology。抗rad51 (N1C2)是从GeneTex购买的。反
γH2AX(05 - 636),anti-BRCA2(OP95)和anti-MDC1(05 - 1572)
从微孔被购买。Anti-BRCA2(推上a303国道- 435 a)和
anti-γH2AX架a300型(- 081 a)从Bethyl购买实验室。抗53bp1 (NB100-304)购自Novus Biologicals。Anti-Flag(m2)、anti-HA anti-β-actin抗体
购买的σ。反磷（血清/thr）atm/atr衬底抗体（2851）是从细胞信号技术中购买的。
CRISPR / Cas9敲除
(sgRNAs)使用:sgUCHL3-1(5′-GCCGCTGGAGGCCAAT
CCCGAGG-3′)和sgUCHL3-2(5′-GCCCCGAAGCGCGCCC
ACCTCGG-3′)。gRNA序列被克隆到载体中。
LentiCRISPR-V2-puro。细胞被慢病毒感染
sgRNA-puro随后与2μg /毫升嘌呤霉素广泛的选择,和单一的克隆是通过连续稀释和放大。通过免疫印迹鉴定克隆
抗uchl3抗体，并通过DNA测序验证。
重组蛋白表达和下拉试验。
构建表达His-RAD51和GSTUCHL3蛋白的质粒，构建RAD51和UCHL3的编码序列
被亚克隆为pET-32a和pGEX-4T-2。为了产生重组蛋白，每个表达结构都转化为大肠杆菌BL21 (DE3)。总之,在LB培养基培养细菌在37°C到1.2(OD600)和冷却30分钟在冰上。然后细胞连续培养15 h在18°C添加0.8毫米isopropyl-b-D-hiogalactopyranoside之后(IPTG)。细胞
然后用超声波提取和裂解。细胞溶解产物
用16000g离心30min，得到的上清液与他的Mag Sepharose Ni (GE Healthcare)孵育，纯化His- rad51蛋白和GSH珠(Promega)，纯化
分别是GST和GST- uchl3蛋白。
体外GST-UCHL3拉试验,50μg重组GST和GST-UCHL3蛋白质绑定到谷胱甘肽珠子被5% BSA在4°C 2 h其次是孵化与50μg His-UCHL3额外2 h在4°C。然后用不同盐浓度的NETN 缓冲液冲洗5次。结合蛋白被筛选了1×SDSPAGE缓冲与加热10分钟在95°C。用单克隆抗his抗体检测His-RAD51，用Coomassie blue染色GST-UCHL3
体内变性去泛素化实验和体外脱泛素化实验
对于体内去泛素化实验，控制U2OS细胞，UCHL3敲除U2OS细胞，或UCHL3敲除U2OS 细胞稳定表达HA-UCHL3野生型和突变Cys95阿拉巴马州(CA突变)在120年被细胞溶解μL 62.5毫米Tris-HCl(pH值6.8),2% SDS、10%甘油,20毫米NEM,1毫米碘乙酰胺;煮15分钟;用含有蛋白酶抑制剂的NETN缓冲液、20mm NEM和1mm碘乙酰胺进行测定10次;然后离心分离细胞碎片。细胞提取物的免疫沉淀与指示抗体和涂抹抗ub抗体。为了制备大量泛素化蛋白作为体外脱泛素实验的底物，HEK293T细胞与Myc-RAD51和
His-Ubexpression载体一起转染。在变性条件下，用他的珠子从细胞提取物中纯化泛素蛋白。接下来，用Ub-RAD51蛋白从细胞提取物中纯化抗myc -琼脂糖颗粒在裂解缓冲液(50mm Tris-HCl pH)中7.8, 137毫米NaCl, 10毫米NaF, 1毫米EDTA, 1% Triton
X-1000.2%萨科齐，1mm DTT, 10%甘油，新鲜蛋白酶
抑制剂)。重组GST-UCHL3和UCHL3 CA在BL21细胞中表达，按照标准方案纯化。deubiquitination测定体外,ubiquitinated蛋白质是孵化与重组UCHL3 eubiquitination缓冲区(50毫米Tris-HCl pH值8.0,50 mM氯化钠,EDTA 1毫米,10毫米德勤,5%甘油)4 h 30°C。
芯片
通过转染I-SceI表达质粒，在U2OS DR-GFP细胞中诱导单个DSB。转染后24小时，细胞在室温下用1%甲醛固定10分钟，将蛋白质与DNA交联。加入甘氨酸(0.125 M) 5分钟，停止交联。细胞被收获,颗粒在细胞裂解缓冲resuspended(5毫米管道(KOH)在pH值8.0,85毫米氯化钾,0.5% NP-40)亮抑酶肽1μg /毫升,1μg /毫升抑肽酶,1
毫米PMSF。核在2000克的离心作用下，5分钟内被离心分离，然后在核溶解缓冲中重新悬浮（50 mM Tris在pH.1，10毫米EDTA，1%SDS，1 g/mL，1 g/mL aprotinin，1毫米PMSF），并将染色质切成平均大小为0.6 kb的染色质。用三文鱼精子DNA/蛋白-琼脂糖浆液预先清除裂解物。每个上清液的10%作为输入控制，并通过交联反转步骤进行处理。其余的上层清液与5μg孵化表示抗体在一夜之间在4°C。珠被洗了四次:一次在高盐缓冲(50毫米Tris-HCl pH值8.0,500毫米氯化钠,0.1% SDS、脱氧胆酸盐0.5%,1% NP-40,1毫米EDTA),在氯化锂缓冲区(50毫米Tris-HCl pH值8.0,250毫米氯化锂,NP-40 1%,0.5%脱氧胆酸盐,1毫米EDTA),和两次TE缓冲(10毫米Tris-HCl pH值8.0,1毫米EDTA,pH值8.0)。
然后在洗脱缓冲液(1% SDS, 0.1 M NaHCO3)中重新悬浮，在室温下旋转20分钟。洗脱样品孵育0.2 M
氯化钠一夜之间在65°C到反向交联。样本
孵化与核糖核酸酶为30分钟37°C其次是蛋白酶K 1 h在37°C。然后使用PCR清理试剂盒对DNA进行纯化，并用于定量PCR分析。芯片的PCR引物,～220个碱基对远离I-SceI 削减网站如下:向前,5′-GAGCAAGGGCGAGGAGCTGT 3′;和反向
5′-CCGTAGGTCAGGGTGGTCAC-3′。
HR分析
我们使用来自Maria Jasin博士(纪念斯隆凯特琳癌症中心)的U2OS DR-GFP细胞，通过CRISPR系统产生控制或UCHL3敲除U2OS DR-GFP细胞系。将ISceI表达载体(pCBA-I-SceI)转染到细胞中。在I-SceI转染后2 d采集细胞，并使用流式细胞术检测I-SceI 消化诱导的重组。采用pEGFP-C1平行转染法对转染效率进行归一化处理。
统计数据
对于细胞存活试验和HR试验，数据提出了均值±SEM的三个独立的实验。对于焦点形成分析，提出了数据作为三个独立的均值±SEM。每项实验计数超过200个细胞。
统计分析采用t检验、方差分析或log-rank检验。图中有1个星号表示P < 0.05, 2个星号表示P < 0.01。
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八体外哺乳动物细胞染色体畸变试验
九、体外哺乳动物细胞染色体畸变试验 In Vitro Mammalian Cells Chromosome Aberration Test 1 范围 本规范规定了体外哺乳动物细胞染色体畸变试验的基本原则、要求和方法。 本规范适用于检测化妆品原料及其产品的致突变性。 2 规范性引用文件 OECD Guidelines for Testing of Chemicals ( No.473, July 1997) 3试验目的 本试验是用于检测培养的哺乳动物细胞染色体畸变，以评价受试物致突变的可能性。 4 定义 染色体型畸变(Chromosome-type aberration)：染色体结构损伤，表现为在两个染色单体相同位点均出现断裂或断裂重组的改变。 染色单体型畸变(Chromatid-type aberration)：染色体结构损伤，表现为染色单体断裂或染色单体断裂重组的损伤。 染色体数目改变(Numerical aberration)：所用细胞株的正常染色体数目的变化。 结构畸变(Structural aberration)：在细胞分裂的中期相阶段，用显微镜检出的染色体结构改变，表现为缺失、断片、互换等。 有丝分裂指数(Mitotic index)：中期相细胞数与所观察的细胞总数之比值；是一项反映细胞增殖程度的指标。 5 试验基本原则 在加入和不加入代谢活化系统的条件下，使培养的哺乳动物细胞暴露于受试物中。用中期分裂相阻断剂（如秋水仙素或秋水仙胺）处理，使细胞停止在中期分裂相，随后收获细胞，制片，染色，分析染色体畸变。 6 试验方法 6.1 试剂和受试物制备 6.1.1 阳性对照物：可根据受试物的性质和结构选择适宜的阳性对照物，阳性对照物应是已知的断裂剂，能引起可检出的、并可重复的阳性结果。当外源性活化系统不存在时，可使用甲磺酸甲酯（methyl methanesulphonate (MMS)）、甲磺酸乙酯（ethyl methanesulphonate(EMS)）、乙基亚硝基脲(ethyl nitrosourea)、丝裂霉素C(mitomycin C)、4-硝基喹啉-N-氧化物（4-nitroquinoline-N-oxide）。当外源性活化系统存在时，可使用苯并（a）芘[benzo(a)pyrene]、环磷酰胺(cyclophosphamide)。 6.1.2 阴性对照物：应设阴性对照，即仅含和受试物组相同的溶剂，不含受试物，其它处理和受试物组完全相同。此外，如未能证实所选溶剂不具有致突变性，溶剂对照与本实验室空白对照背景资料有明显差异，还应设空白对照。 6.1.3 受试物 6.1.3.1 受试物的配制：固体受试物需溶解或悬浮于溶剂中，用前稀释至适合浓度；液体受试物可以直接加入试验系统和/或用前稀释至适合浓度。受试物应在使用前新鲜配制，否则就必
体外细胞实验方法
细胞株在适当的培养基中保持10% FBS。 从Addgene(质粒)购买HA-FLAG-UCHL3。 #22564，然后再克隆到pGEX-4T-2载体(Clontech)中。UCHL3C94A和S75A突变体由位点定向突变层积产生)。抗uchl3抗体购自ProteinTech公司 (12384 - 1 - ap)。抗ub (P4D1)、抗rpa32 (9H8)、抗brca1 (D9)抗体购自Santa Cruz Biotechnology。抗rad51 (N1C2)是从GeneTex购买的。反 γH2AX(05 - 636),anti-BRCA2(OP95)和anti-MDC1(05 - 1572) 从微孔被购买。Anti-BRCA2(推上a303国道- 435 a)和 anti-γH2AX架a300型(- 081 a)从Bethyl购买实验室。抗53bp1 (NB100-304)购自Novus Biologicals。Anti-Flag(m2)、anti-HA anti-β-actin抗体 购买的σ。反磷（血清/thr）atm/atr衬底抗体（2851）是从细胞信号技术中购买的。 CRISPR / Cas9敲除 (sgRNAs)使用:sgUCHL3-1(5′-GCCGCTGGAGGCCAAT CCCGAGG-3′)和sgUCHL3-2(5′-GCCCCGAAGCGCGCCC ACCTCGG-3′)。gRNA序列被克隆到载体中。 LentiCRISPR-V2-puro。细胞被慢病毒感染 sgRNA-puro随后与2μg /毫升嘌呤霉素广泛的选择,和单一的克隆是通过连续稀释和放大。通过免疫印迹鉴定克隆 抗uchl3抗体，并通过DNA测序验证。 重组蛋白表达和下拉试验。 构建表达His-RAD51和GSTUCHL3蛋白的质粒，构建RAD51和UCHL3的编码序列 被亚克隆为pET-32a和pGEX-4T-2。为了产生重组蛋白，每个表达结构都转化为大肠杆菌BL21 (DE3)。总之,在LB培养基培养细菌在37°C到1.2(OD600)和冷却30分钟在冰上。然后细胞连续培养15 h在18°C添加0.8毫米isopropyl-b-D-hiogalactopyranoside之后(IPTG)。细胞 然后用超声波提取和裂解。细胞溶解产物 用16000g离心30min，得到的上清液与他的Mag Sepharose Ni (GE Healthcare)孵育，纯化His- rad51蛋白和GSH珠(Promega)，纯化 分别是GST和GST- uchl3蛋白。 体外GST-UCHL3拉试验,50μg重组GST和GST-UCHL3蛋白质绑定到谷胱甘肽珠子被5% BSA 在4°C 2 h其次是孵化与50μg His-UCHL3额外2 h在4°C。然后用不同盐浓度的NETN缓冲液冲洗5次。结合蛋白被筛选了1×SDSPAGE缓冲与加热10分钟在95°C。用单克隆抗his 抗体检测His-RAD51，用Coomassie blue染色GST-UCHL3 体内变性去泛素化实验和体外脱泛素化实验 对于体内去泛素化实验，控制U2OS细胞，UCHL3敲除U2OS细胞，或UCHL3敲除 U2OS细胞稳定表达HA-UCHL3野生型和突变Cys95阿拉巴马州(CA突变)在120年被细胞溶解μL 62.5毫米Tris-HCl(pH值6.8),2% SDS、10%甘油,20毫米NEM,1
体外细胞培养
第一讲体外细胞培养的基本技术 ●体外细胞培养条件和基本技术 ●体外细胞培养 ●体外培养物的生长生物学 ●细胞系和细胞株 ●培养物的冷冻与复苏 ●培养物的污染、检测和排除 ●一、体外细胞培养条件和基本技术 体外细胞培养的优缺点 优点：简化细胞的生长环境，方便施加实验因素，便于观测实验结果，便于获得均一细胞群，能够进行大规模生物制品的生产。 体外细胞培养不足之处：培养对象脱离了机体的整体支配和调控，细胞间在一定程度上失去组织联系及相互作用。体外培养条件下的生长发育情况与在体时的情况存在一定差异，分析实验结果时必须考虑这种差异。 一、体外细胞培养条件 （一）、体外培养实验室 1. 准备室 2. 培养室：基本条件要求：清洁、无菌、干燥、不通风，并具有适宜的光线。空气调节用中央空调或分体式空调机。室顶安装紫外灯等消毒装置。 3. 缓冲室 4. 其他实验室 （二）、体外培养的设备和器具 设备：1. 超静工作台，生物安全柜，净化室 2. 培养箱：温度，湿度，pH值 3. 倒置显微镜 4. 水净化装置：去离子水净化装置，石英玻璃蒸馏器， 超纯水装置 5. 冰箱 6. 离心机7. 冷冻保存装置 8. 高压蒸汽消毒装置：电热干燥箱，pH计，天平 培养器具：1. 过滤除菌装置：Zeiss 滤器，抽滤式玻璃简易型滤器， 针头式加压塑料小滤器 2. 培养器皿：（1）溶液瓶（2）培养瓶（3）培养皿 （4）多孔培养板（5）离心管 3. 移液器 4.筛网：金属筛网（不锈钢网、铜网），尼龙筛网 （三）培养用液 ?水和平衡盐溶液（balanced salt solution, BSS) 水：离子交换水，蒸馏水 平衡盐溶液：主要成分：无机盐和葡萄糖 常用BSS: PBS ，Ringer Earle ，D-Hanks，Hanks ?培养液：1.天然培养液：1）血清：小牛血清,胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）,马血清，2）水解乳蛋白，3）胚胎渗出液 2.合成培养液：合成培养基的种类MEM，RPMI 1640，McCoy 5A，HAM F12等
USP87细胞毒性体外试验
87 BIOLOGICAL REACTIVITY TESTS, IN VITRO The following tests are designed to determine the biological reactivity of mammalia n cell cultures followi ng con tact with the elastomeric plastics and other polymeric materials with direct or in direct patie nt con tact or of specific extracts prepared from the materials under test. It is essential that the tests be performed on the specified surface area. When the surface area of the specime n cannot be determ in ed, use 0.1 g of elastomer or 0.2 g of plastic or other material for every mL of extraction fluid. Exercise care in the preparation of the materials to preve nt con tam in ati on with microorga nisms and other foreign matter. Three tests are described (i.e., the Agar Diffusi on Test , the Direct Con tact Test and the Elution Test ).1 The decision as to which type of test or the number of tests to be performed to assess the potential biological response of a specific sample or extract depends upon the material, the final product, and its inten ded use. Other factors that may also affect the suitability of sample for a specific use are the polymeric composition; processing and cleaning procedures; con tact ing media; in ks; adhesives; absorptio n, adsorptio n, and permeability of preservatives; and con diti ons of storage. Evaluatio n of such factors should be made by appropriate additi onal specific tests before determining that a product made from a specific material is suitable for its in ten ded use. Materials that fail the in vitro tests are can didates for the in vivo tests described in Biological Reactivity Tests, In Vivo 88 . USP R EFERENCE S TANDARDS 11 —USP High-Density Polyethylene RS. USP Positive Bioreaction RS. Cell Culture Preparation —Prepare multiple cultures of L-929 (ATCC cell line CCL 1, NCTC clone 929; alternative cell lines obtained from a standard repository may be used with suitable validation) mammalian fibroblast cells in serum-suppleme nted minimum esse ntial medium hav ing a seedi ng den sity of about 10 5 cells per mL. Incubate the cultures at 37 1 一in a h±midified
细胞克隆形成实验
机密提醒：这份文件及其传真件、复印件所包含的机密或法律保护信息是只提供给这份文件上所指定的个人或机构。如果您不是预定接受者，我们提醒您严禁以披露、拷贝、散发或任何形式利用这份文件及其传真件、复印件的内容。如果您错误的接收到这份文件及其传真件、复印件，请立即通知我们以便我们可以安排文件及其传真件、复印件返还并不会让您负担任何费用。 第 1 页 共 1 页 细胞克隆形成实验 一、 当单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，成为集落或克隆。每个克隆含有50以上的细胞，大小在0.3-1.0mm 之间。集落形成率表示细胞的独立生存能力。各种理化因素可能导致细胞的克隆形成能力发生改变。通过一定的实验方法可以对细胞的克隆形成能力进行检测。[晶莱生物] 二、实验方法 平板集落形成实验、软琼脂集落形成实验 (a)平板集落形成实验：本法适用于贴壁生长的细胞和正常培养的细胞 (b)软琼脂集落形成实验：本法适用于非锚着依赖性生长的细胞，如骨髓造血干细胞、肿瘤细胞株、转化细胞系。 三、注意事项 (a)琼脂对热和酸不稳定，若反复加热，容易降解而产生毒性，且硬度下降。因此高压灭菌后应进行分装； (b)细胞在进行克隆形成实验时要求有95%以上的分散度，否则结果的准确度会受到很大影响； (c)软琼脂与细胞混合时温度不能超过40℃，否则将会烫伤/死细胞； (d)接种时细胞密度适度，不可过高。 细胞在低密度、非贴壁状态条件下培养，生存率明显下降，永生细胞系/株克隆形成率可达到10%以上，但初代培养细胞和有限传代细胞系克隆形成率仅为0.5%-5%，甚至无法形成单个克隆。因此，为了提高克隆形成率，有时需要在培养基中添加胰岛素、地塞米松等促克隆形成物质。 细胞接种存活率只表示接种细胞后贴壁的细胞数，但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆。而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。由于细胞生物学性状不同，细胞克隆形成率差别也很大，一般初代培养细胞克隆形成率弱，传代细胞系强；二倍体细胞克隆形成率弱，转化细胞系强；正常细胞克隆形成率弱，肿瘤细胞强。并且克隆形成率与接种密度有一定关系，做克隆形成率测定时，接种细胞一定要分散成单细胞悬液，直接接种在碟皿中，持续一周，随时检查，到细胞形成克隆时终止培养。 四、周期 1-2个月
体外活性实验
体外活性试验相关知识 以健康人外周血单核细胞为前体细胞，体外诱导其为树突状细胞（DC ），分别负载多肽抗原，产生特异性细胞毒性T 淋巴细胞（CTL ），以探讨其对靶细胞的杀伤作用。 抗原肽诱导CTL 制备： ① 外周血单核细胞（PBMC ）的分离： 分别选取（经BCG 免疫，PPD 阳性）HLA-A2.1+、HLA-A3+ 人抗凝外周全血，通过淋巴细胞分离液分离获得PBMC 。 ② 树突状细胞的诱导： 将PBMC 在24孔板中贴壁培养，分离贴壁的单核细胞，每孔加含FBS 、GM-CSF 和IL-4的1640培养基，于37℃、5%CO2孵箱中，培养至第5天加LPS 诱导成熟，用相差显微镜观察DC 诱导培养过程中的细胞形态学变化。通过流式细胞术检测CD1a 、CD83、CD80、HLA-DR 的表达。 ③ 细胞毒T 淋巴细胞（CTL ）的体外诱导： DC 诱导至第5天，加入待测肽，第7天收获DC 。于24孔板中加入用免疫磁珠分选的CD8+ T 淋巴细胞作为反应细胞，DC 作为刺激细胞，第2天加IL-2，置37℃、5%CO2饱和湿度条件下培养。用肽负载的DC 按前述方法再重复刺激3次。收获CTL 用于检测。 细胞毒性分析：
④细胞毒活性检测： CTL杀伤实验用MTT法和4小时51Cr释放法。以抗原肽诱导CTL为效应细胞(E)，负载抗原肽的T2细胞作为靶细胞(T)。 MTT法 按效靶比20:1加入96孔板中，靶细胞每孔1×103个，设单独靶细胞孔和单独CTL孔，每组3复孔，每孔200 μL。37 ℃、5 %CO2孵育48 h后,加入MTT 0.2 mg/孔，继续培养4-6 h，去上清，加入DMSO 100 μL/孔，显色，酶标仪于波长570 nm下读数。按以下公式计算杀伤率。同时以不相关肽诱导的CTL作为阴性对照。 杀伤率=[1－（试验孔A值-效应细胞孔A值）/靶细胞孔A值]×100% 4h51Cr释放法 MTT 实验中与阴性对照比较杀伤作用存在显著性差异的候选肽使用更精确的4h51Cr 释放法来验证。RPMI1640 培养液洗涤2×106靶细胞，去上清液。用0.5 mL完全培养液悬浮细胞，加入100 μCi(3.7 MBq) Na251CrO4（即按200 μCi/mL），37 ℃水浴中标记1 h，每5-10 min摇晃一次，混匀细胞。用RPMI1640 培养液洗涤细胞三次，每次1000 rpm10 min。再用RPMI-1640 培养液悬浮细胞，置37 ℃水浴30 min，以减少非特异的自然释放。离心1000 rpm 10 min，去上清液。小心用RPMI-1640 培养液悬浮细胞，尽量减少振荡引起的细胞损伤以降低靶细胞的自然释放率，将细胞浓度调整为1×105/ mL 备用。在96孔板中加入51Cr 标记的靶细胞，每孔加100 μL（约为1×104个/孔）。向各孔加100 μL 效应细胞，设定不同效应细胞与靶细胞的比例（效靶比，E:T），同时另一组用不同的肽浓度(Peptide concentration)。阴性对照孔（自然释放）不加效应细胞只加100 μL完全培养液，阳性对照孔（最大释放）中加100 μL 1%NP40（或2%SDS，或1 mol/L盐酸或10 mg/mL Triton X-100 100 μL）每个实验置两个复孔。稍稍离心(1000 rpm 3 min)后，置37 ℃ 5% CO2的二氧化碳培养箱中培养4 h。离心培养板(1000 rpm 10min)，每孔吸出100 μL上清液置一次性使用的检测管中，在γ-计数仪上（或液闪计数仪上）测定上清液中的每min放射性活性（cpm值）。特异性杀伤活性的计算：细胞毒性(%)＝[（实验组cpm－自然释放组cpm）/（最大释放组cpm－自然释放组cpm）]×100%
基础的细胞实验
基础的细胞实验 1.体外培养细胞一代生存期 ?分为游离期、贴壁期、潜伏期、对数生长期、停止期（平台期）。 ?对数生长期：细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，细胞数量呈指数增长，细胞群体均一。最适合进行实验研究。 ?细胞摇匀的经验： 孔越小，越要好好摇。种的时候可以有意识的分散种细胞，而不是直接一个小区域种下去。96孔板种细胞轻点打进孔里，打的太猛细胞容易聚集在边缘。六孔板手动8字晃匀效果比较好。种细胞时晃动细胞很重要，但应避免在桌子上推着前后左右晃。在手中两个方向的八字晃会更稳更好。 2. 细胞计数 ?细胞悬液的细胞数/ml＝（四个大格子细胞数/4) ×稀释倍数×104/ml ?计数建议： 1)压边线细胞：计上不计下，计左不计右； 2)镜下偶见有两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团10%以上， 说明分散不好，需重新制备细胞悬液； 3)每个细胞悬液至少滴样两次求平均值。 ?提问：细胞计数的浓度控制在多少？计数重复几次？ 答：建议浓度控制在50-100万/ml。建议表型实验计数4次，普通实验计数2次。建议全部计数完再一起种板。 ?注意点：细胞计数不要同时记超过4株以上的细胞。若有需要，先消化记4株，细胞浓度调好静置一边；再消化计另外的。而后按消化和计数顺序种细胞。这样可以避免多株细胞同时消化而带来的消化不理想。 3. 常用细胞培养器皿
4. 液氮是低温制品，在使用过程中要防止冻伤。在液氮中操作及存取冷冻物品时速度要快， 要注意轻拿轻放，以免内容物解冻，造成不必要的损失。 5. 细胞传代 ?消化温度：室温或37℃。 ?消化时间：不超过10 min，也不可太短（须形成单细胞悬液）。 ?注意点： 1)防止细胞成片滑落（4℃消化，延长消化时间较易获得单细胞悬液）； 2)轻柔吹打，防止机械损伤； 3)离心时不超过300 g （1000 rpm），实验室目前离心所用转速为800rpm； 4)尽量避免刮伤培养瓶细胞贴附面，否则影响观察且细胞贴壁不均匀； 5)及时换液和传代，不可拖延，避免细胞过爆后细胞状态不好。 6. 细胞消化条件参考 Cell line 胰酶条件时间传代比例长满时间10cm dish细胞数 Huh1 EPET 37℃ 4 min 1：4 5d 400w Huh7 EPET 37℃ 2 min 1:6 4d 200w HLE EPET 37℃ 3 min 1:8 3d 200w HLF EPET 37℃ 3 min 1:8 3d 200w HepG2 0.25%Trypsin 37℃ 4 min 1:3 5d 200w Hep3B 0.25%Trypsin 37℃ 1.5 min 1:4 4d - HUCCT1 0.25%Trypsin 37℃ 6 min 1:10 3d 500w RBE EPET 37℃ 2 min 1:10 3d 200-300w Huh28 0.25%Trypsin 37℃ 6 min 1:3 3d 30w 293T 1/10 EPET RT 1 min 1:20 3d 1000w 3T3 EPET 37℃ 3 min 1:8 3d 400w THP1 - - - 1:4 3 - 7. 换液时机 1)pH降低。培养基颜色由红变橙要警惕，变成黄色前一定要换液。
体外细胞毒性实验
创新助手报告——主题分析报告 创新助手平台提供 北京万方软件股份有限公司 2014-07-11
报告目录 报告核心要素......................................................................................................... I 一、主题简介 (1) 二、主题相关科研产出总体分析 (1) 2.1 文献总体产出统计 (1) 2.2 学术关注趋势分析 (2) 三、主题相关科技论文产出分析 (2) 3.1 中文期刊论文 (2) 3.1.1 近十年中文期刊论文分布列表 (2) 3.1.2 中文期刊论文增长趋势 (3) 3.1.3 发文较多期刊 (4) 3.1.4 发文较多的机构 (4) 3.1.5 发文较多的人物 (4) 3.1.6 核心期刊分布数量对比 (4) 3.1.7最近相关中文期刊论文 (5) 3.1.8被引较多的相关期刊论文 (6) 3.2 学位论文 (7) 3.2.1 近十年学位论文年代分布列表 (7) 3.2.2 学位论文增长趋势 (8) 3.2.3 硕博学位论文数量对比 (9) 3.2.4 发文较多的机构 (9) 3.2.5 发文较多的人物 (9) 3.2.6 最近相关学位论文 (10) 3.3 中文会议论文 (10) 3.3.1 近十年中文会议论文年代分布列表 (10) 3.3.2 中文会议论文增长趋势 (11) 3.3.3 中文会议论文主办单位分布 (12) 3.3.4 发文较多的机构 (12) 3.3.5发文较多的人物 (13) 3.3.6最近相关中文会议论文 (13) 3.4 外文期刊论文 (14) 3.4.1 近十年外文期刊论文年代分布列表 (14) 3.4.2 外文期刊论文增长趋势 (14) 3.4.3 最近相关外文期刊论文 (15) 3.5 外文会议论文 (15) I
细胞生物学实验指导
实验一动物细胞的传代培养 一、实验目的 1．熟悉细胞培养过程中的无菌操作技术。 2．了解细胞传代培养的基本方法和主要操作步骤 二、实验原理 细胞培养(cell culture)是指从机体内取出某种组织或细胞，模拟机体内的生理条件使其在体外生存、生长和繁殖的过程。细胞的体外培养在细胞生物学和医学研究领域有着极为广泛的用途，这一技术已成为研究细胞生理、细胞增殖、细胞遗传、细胞癌变和细胞工程等课题的一项不可缺少的手段。细胞培养技术的突出优点在于能为研究者提供大量的生物性状相同的细胞作为研究对象，便于人们在体外利用各种不同的方法从不同的角度研究细胞生命活动的规律。另外，利用细胞培养技术还可使人们较为方便地研究各种物理、化学和生物因素对细胞结构和功能的影响。 细胞培养可分为原代培养和传代培养2种情况。所谓原代培养(primary culture)是指直接从机体取出组织或细胞后所进行的首次培养。而传代培养(subculture)是指当原代培养的细胞增殖到一定密度后，将其从原培养容器中取出，以1：2或其他比例转移到另一个或几个容器中所进行的再培养。传代培养可简称传代。在体外培养过程中，要使细胞能正常地生长、繁殖，需经常对其进行传代。传代的累积次数就是细胞的代数。
在从事细胞培养工作时常常会接触到细胞系(cell line)和细胞株 (cell strain)这两个容易混淆的概念。一般认为，细胞系指通过原代培养 并经传代后所形成的细胞群体，由于细胞系来源于原代培养，而原代培养物 中所含的细胞种类较多，故一个细胞系往往由多个生物学性状不同的细胞群 体所组成，而细胞株是利用单细胞分离培养法或克隆形成法从原代培养物或 细胞系中选择出的细胞群体，一个细胞株往往具有特殊的生物学性状或标记 并可持续存在。 细胞培养是一种程序复杂、条件较多且要求严格的实验性工作。由于细 胞在体外的生长、繁殖会受到温度、营养物质、酸碱度、渗透压及微生物等 多种因素的显着影响，故细胞培养工作的各个环节如培养器皿清洗消毒、营 养液配制和除菌、pH值调整、温度调节等操作都有严格的要求和规定，特 别要注意无菌操作，这是细胞体外培养成败的关键。 三、实验材料 人肝癌细胞株HepG2 四、实验器材 CO 恒温培养箱、超净工作台、恒温水浴箱、倒置相差显微镜、电热高2 压蒸汽消毒锅、细胞培养瓶、培养皿、吸管、除菌滤器、小烧杯、100mL玻 璃试剂瓶、橡皮瓶塞、酒精灯、记号笔。
细胞实验方法原理
一、细胞培养： 1. 细胞培养：从活的机体中取出组织或细胞，分散成单个细胞，模拟机体内的生长条件，在体外建立无菌、适温和一定营养条件等，使其在体外环境中继续生长繁殖的过程，并维持其结构和功能的技术。 2. 细胞培养的基本条件：无菌条件、细胞生长条件、细胞检测条件、细胞保存条件。 3. 无菌条件： 1）净化工作室：净化工作间是基于无菌条件下进行细胞培养操作的场所，设计标准为万级，专供细胞培养、冻存以及细胞治疗用。 ①细胞培养间：一般由更衣间、缓冲间、操作间三部分组成。每周乳酸、过氧乙酸熏蒸（2 小时）和每月新洁尔灭擦拭地面和墙壁一次的方式进行消毒 ②洁净层流罩：层流罩是可提供局部高洁净环境的空气净化的设备。主要由箱体、风机、 初效空气过滤器、中效空气过滤器、高效空气过滤器、阻尼层、灯具等组成。 ③传递窗：该装置是一种洁净室的辅助设备，主要用于洁净区与非洁净区之间小件物品的 传递，以减少洁净室的开门次数，把对洁净区的污染降低到最低程度。 ④无尘服 层流净化细胞培养室的总体要求：经济、有序、高效、安全。 相关制度： I.准入制度：没有经过培训的人员不得单独进入净化室工作。 进入净化室后要保持安静，不得大声喧哗。 II.安全制度：谨慎使用酒精灯，实验人员自觉维护室内设备的安全使用，对室内的仪器如CO2孵箱等要经常注意机器运转情况，发现问题及时检修或报告请人检修。离开时断开必要的仪器电源。 III.卫生消毒制度：一般情况下细胞间每天消毒一次，方法为紫外线消毒（每次30分钟至1小时）一次，另外每周用10％乳酸在紧闭门窗下熏蒸30分钟； 实验完毕应及时清理所用物品，注意台面整洁；层流净化室实施值日生负责制。 IV.出入制度：总体原则为进出净化室应按次序开、关门，只有将前面打开的门关闭后才允许打开下一个门，使缓冲间起到应有的作用。 所有进出层流净化细胞培养室的物品均应通过传递窗进行，紫外灯照射15分钟 2）无菌操作的仪器设备： ①超净工作台：工作原理是利用鼓风机驱动空气经过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使 空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。 使用前开启柜内紫外灯照射10－30分钟，预工作10－15分钟，以除去臭氧和使用工作台面空间呈净化状态。使用完毕后，要用70%酒精将台面和台内四周擦拭干净。 ②生物安全柜：既能使操作造成无菌、无尘的局部空气环境，保证检验、检测不受污染， 又能保证被研究的对象（如病菌、细菌等）不外溢，保护周围环境及操作人员安全。广泛应用于低、中等危险度（病原体1--3，DNA重组P1--P3）的临床细菌学，病毒学、微生物学、组织培养、生物学及生命科学的研究，加工、检验部门。 ③高压灭菌锅：121℃，20min，适用于耐高温耐高压，不怕潮湿的物品（器械、细菌培
T细胞体外扩增培养
人T细胞分离与体外培养实验方案 一．实验目的 从人外周血中分离PBMCs，利用CD3和CD3/CD28免疫磁珠分离并扩增T细胞，用于慢病毒载体的感染。 二．实验过程 1．人外周血单个核细胞的分离（每mL外周血大约可获得1×106个单个核细胞） ⑴采血，稀释（外周血：稀释液=1：1）； ⑵在离心管中加入人淋巴细胞分离液，沿倾斜的管壁缓缓加入稀释的外周血（Ficoll：稀释 血=1：2）； ⑶20℃，440g，离心20-30min； ⑷离心后轻轻吸取中间白膜层，移入另一试管中； ⑸加入足量的稀释液充分洗涤，400g，离心5min，弃上清； ⑹细胞沉淀加1640培养液重悬，即可用于T细胞的磁珠分选。 2．CD3+T细胞分选 ⑴适量的MACS缓冲液洗涤PBMCs（107/mL），300g，离心10min，去上清； ⑵MACS缓冲液重悬PBMCs（80μL/107PBMCs），加入CD3免疫磁珠（20μL/107PBMCs），混匀， 4℃孵育15min； ⑶MACS缓冲液（1-2mL/107 cells）洗涤细胞1次，300g，离心10min，弃去上清； ⑷500μL MACS缓冲液重悬细胞； ⑸将MS分离柱放置于磁力架上，加入500μL MACS buffer预清洗分离柱； ⑹将⑷步得到的细胞悬液加入预先洗涤过的MS分离柱，先流出的细胞为未标记的CD3-T细胞。 MACS缓冲液洗涤分离柱3次； ⑺将分离柱从磁力架上取下，放入合适的管子内，加入1mL MACS缓冲液至分离柱内，洗脱液 即为CD3+T细胞，细胞计数后，用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基重悬。 3．CD3+T细胞的激活和扩增 ⑴CD3/CD28免疫磁珠预先洗涤 ①涡旋30s以上重悬CD3/CD28免疫磁珠； ②取需要量的CD3/CD28免疫磁珠加至一个新的管中； ③加入与磁珠体积相等的缓冲液（至少1mL），混匀（涡旋5min或者颠倒混匀5min）； ④将管子置于磁力架上1min，弃去上清液；