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柏科植物组织培养研究现状与展望

第25卷第2期世界林业研究Vol.25No.2 2012年4月World Forestry Research Apr.2012

柏科植物组织培养研究现状与展望*

金江群韩素英郭泉水

(中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所,国家林业局森林生态环境重点实验室,北京100091)

摘要:柏科植物组织培养困难,但经过多年的探索取得了很大进展。文中综述20世纪70年代以来柏科植物组织培养中外植体选择、培养基制备、诱导分化、试管苗生根、组培苗移栽等关键环节的研究进展及存在的主要问题,提出研究展望,为深入开展柏科植物组织培养研究提供参考。

关键词:柏科,组织培养,研究进展

中图分类号:S723.1+32.6文献标识码:A文章编号:1001-4241(2012)02-0034-07

Research Advances and Prospect in Tissue Culture of Cupressaceae

Jin Jianɡqun Han SuyinɡGuo Quanshui

(1Research Institute of Forest Ecology and Protection,Chinese Academy of Forestry;Key Laboratory of Forest Ecology

and Environment,State Forestry Administration,Beijing100091,China)

Abstract:Cupressaceae is difficult for tissue culture,but after years of exploration,the research in this regard has made great progress.This paper summarized the research progress of tissue culture of Cupressaceae since the1970s,with regard to explant selection,medium preparation,induction of differentiation,rooting,regenerated plantlet transplant and so on.The primary problems rising in the research were also described.

Finally,the paper prospected the future research,which would provide a reference for further study on plant tissue culture of Cupressaceae.

Key words:Cupressaceae,tissue culture,research advances

全世界共有柏科植物22属,约150种,中国产8属29种7变种[1]。柏科植物中大多数树种材质优良,耐腐朽,可作为建筑、桥梁、家具等用材;树形优美,叶色翠绿或浓绿,常被栽培作园林绿化或庭园观赏植物。柏科植物具有抗肿瘤、抗氧化等广泛的生物活性,是重要的药用植物;由于其生态适应性强,在造林、固沙及水土保持方面也占有重要地位。鉴于其重要的经济和生态价值,有关柏科植物繁殖的研究日益受到重视。目前,在柏科植物有性繁殖[2-6]和扦插繁殖[7-9]方面已取得了很多研究成果,并成为柏科植物繁殖的主要途径,组织培养工作也取得了较大进展。

组织培养可以通过连续继代获得大量繁殖体,对于有性繁殖困难、繁殖材料又极度匮乏的珍稀濒危树种而言,其重要性尤为凸显[10]。通过组织培养繁殖的无性系苗木可以保持母本的优良性状,有利于遗传改良和新基因型树种的形成;而且其组织培养不受季节、取材数量等方面的限制,一旦组培技术获得突破,则可进行大规模育苗,既可作为商业生产的手段,也是保护珍稀濒危植物的重要生物技术。不同植物组织培养成效不同,柏科植物组织培养成功的范例还很少,但经过多年的探索仍取得了很大进展,特别是在外植体选择、培养基制备、诱导分化、试管苗生根、组培苗移栽等关键环节上积累了一些成功的经验。本文将综述20世纪70年代以来国内外柏科植物组织培养研究现状,并针对研究中存在的主要问题提出未来应加强的研究工作,以期为深入开展柏科植物的组

*收稿日期:2010-11-04

基金项目:国家林业局野生动植物保护项目(2011)

作者简介:金江群(1986-),女,重庆人,硕士研究生,研究方向为繁殖生态学及抗性生理,E-mail:tiamojjq@http://www.wendangku.net/doc/44ad00e42f60ddccdb38a0c1.html 通讯作者:郭泉水,男,研究员

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织培养和研究提供参考。

1外植体

1.1外植体选择

选择具有最大分化潜能的外植体是确保组织培养成功的关键[11]。柏科植物中已成功诱导分化的外植体有成熟胚、未成熟胚、上胚轴、子叶、下胚轴、胚乳、茎尖、嫩叶、腋芽、小枝、茎段等,其中胚和茎尖分化率较高,是常用的外植体。

不同外植体诱导率不同,同一外植体也可诱导分化出不同组织,而同一树种不同外植体诱导出的试管苗间对培养条件的适应性也有差异。李春艳等用叉子圆柏(Sabina vulgaris)茎段、茎尖、叶诱导出愈伤组织,其中茎尖愈伤组织诱导率为100%,茎段为59%,叶为67%,而根尖则无愈伤组织形成[12]。石美丽等则用叉子圆柏的茎段诱导出丛生芽[13]。Gomez等通过试验发现,由叶片诱导的酸刺柏(Juniperus oxycedrus)丛生芽生根率可达100%,而在同样的培养条件下,由茎尖和茎段诱导的丛生芽生根率仅为7% 10%[14]。1.2外植体预处理

对外植体进行适当预处理,可提高出愈率和诱导丛生芽分化。齐力旺等用侧柏胚乳诱导愈伤组织时发现,热激可使出愈率提高55.0% 60.0%,且在未出愈的培养基上进行热激后,也产生了愈伤组织,但热激并未使出愈始期提前。另外,胚乳刻伤也可使出愈率提高20%[15]。Lambardi等用地中海柏木(Cu-pressus sempervirens)胚诱导丛生芽时,先将种子淋洗后在5?的黑暗条件下层积3 4天,再将胚剥离培养,一个外植体平均分化出14个芽[16]。Mostafa在对裸子植物无性繁殖的研究中将植物个体的激素处理与试管培养相结合,获得了多种裸子植物的试管苗,其中包括柽柳叶圆柏(Juniperus sabina var.tamariscifo-lia)及北美乔柏(Thuja plicata)等。其在进行组织培养前,首先对要取材的外植体施用外源激素,这样能够使植物体在叶腋、茎尖等部位产生大量新芽,这些新芽在形态上更为幼嫩,甚至接近刚萌发的幼苗[17]。

1.3外植体消毒

为了减少污染,在外植体选择时应该尽量选择带菌少的部位。胚不易污染且具有极幼嫩的分生组织细胞,是极好的外植体材料。如果选用茎尖、鳞叶等作为外植体,应尽量选择室内栽培的植株,采新生的嫩芽、新叶;野外取材时,可在取材前对母本喷施杀菌剂、杀虫剂等。对于准备接种的外植体,应进行彻底的表面消毒和深度灭菌,深度灭菌时常常会用到灭菌效果好的升汞,但由于其污染环境,应该注意回收利用和废液处理。

Morte等以1年生山达脂柏(Tetraclinis articula-ta)幼苗的茎尖为外植体进行组织培养时,采用将流水冲洗与30%次氯酸钠溶液、10%双氧水及80%乙醇消毒相结合的方法[18]。在对叉子圆柏的小枝灭菌中,采用消毒剂与灭菌剂配合使用的方法,可以获得很好的消毒效果[12]。Mario等在对Juniperus navicu-laris茎尖进行消毒时采用了漂白剂和杀真菌剂相结合的方法,污染率仅为1%[19]。

2培养基

2.1基本培养基

目前,常用的基本培养基主要有MS(Murashige 和Skoog,1962),SH(Schenk和Hild-ebrandt,1972),DCR(Gupta和Durzan,1985),WPM(Lloyd和Mc-Cown,1981),LP(von Am-old和Eriksson,1981),GD (Gresshoff和Day,1972),DKW(Driver和Kuniyuki,1984),QP(Quoirin和Lepoivre,1977)等。不同树种、不同外植体、同一外植体的不同发育时期适宜的培养基不尽相同,同一外植体不同培养阶段所需的培养基条件也存在着一定的差异。

Mimi等用ACLP(LP medium of Aitken-Christie,1984),CBM(Cupressus Basal medium,1985),CD (Campbell和Durzan,1975),CDAA(CD medium modi-fied by Ishii,1986)及SH为基本培养基,以黄扁柏(Chamaecyparis nootkatensis)的胚为外植体进行丛生芽诱导,发现SH的诱导率可达73%,CBM,CD和CDAA均为60%,而ACLP仅为53%[20]。

对于一些植物而言,在培养基中存在某一特定的成分会影响试管苗的生长或分化。据报道,在不加硝酸铵的MS培养基上可以从乔桧(Juniperus excelsa)的愈伤组织上诱导出丛生芽,而在全量的MS培养基上则没有芽形成[21]。Pochet等通过研究发现,在培养条件一致的情况下,含SO-2

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较多的琼脂对北美乔柏丛生芽诱导有益[22]。

2.2生长调节物质

不同生长调节物质以及不同浓度和处理时间等对外植体分化会产生不同影响。柏科植物组织培养常用

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的激素有BA(N6-benzyladenine,6-苄基腺嘌呤),IAA(indole-3-acetic acid,吲哚乙酸),ABA(abscisic acid,脱落酸),NAA(α-naphthlcetic acid,萘乙酸),IBA(Indole-3-Butytric acid,吲哚丁酸),2,4-D (2,4-Dichlorophenoxy acid,2,4-二氯苯氧乙酸),2ip [N6-(2-Isopentenyl)adenosine,异戊烯腺嘌呤],ZT(zeatin,玉米素),KT(Kinetin,激动素)等。诱导时间一般为1 4周。Lambardi等用地中海柏木的胚进行丛生芽诱导时将胚接于含10μM/L BA的1/2QP培养基上培养10天后即转到不含激素的培养基上进行培养[16]。Indra等进行加那利刺柏(Juniperus cedrus)胚培养时在加入5μM BA的1/2QP培养基上培养15天后转入伸长培养基中培养[23]。而绿干柏(Cupressus arizonica)则在添加激素的培养基上培养1个月后再转至无激素的培养基上进行伸长生长培养[24]。

生长调节物质在使用时可以单独添加,也可以多种激素配合使用。Loureiro等进行腓尼基桧(Juniperus phoenicea)的茎尖培养时发现,在DKW培养基中同时添加NAA和BA比只添加BA形成了更多的丛生芽[25];而以添加10μM/L ZT的1/2QP培养基培养日本香柏(Thuja occidentalis)茎尖,诱导的丛生芽数量大于ZT与KT或2ip配合使用的培养基[26]。因此,在培养基中添加生长调节物质应根据树种、培养目的和培养阶段来具体调配。

2.3附加成分

在培养基中添加一些附加成分可以起到诱导外植体分化的作用。水解酪蛋白、水解乳蛋白、L-谷氨酰胺等既可用于愈伤诱导,也可以添加到丛生芽诱导的培养基中[27]。Gomez等认为,在诱导酸刺柏愈伤组织的培养基中加入100mg/L水解酪蛋白能有效提高愈伤组织增殖效率[28]。活性炭可以吸附培养基中累积的抑制物质和氧化物质,有利于细胞生长[29]。在很多报道中,都将添加活性炭而不加激素的培养基作为伸长培养基,而且其促进不定芽伸长生长的效果明显。另外,这种无激素而添加活性炭的培养基还常被作为生根培养基。由于柏科植物次生代谢物质成分复杂,萜烯、单宁等多酚类物质在培养基中的累积致使褐化现象常有发生,在培养基中加入适量抗氧化物质可以有效防止褐化现象。Mahmood在对几种刺柏属植物的组培时通过加入PVP(polyvinyl pyrroli-done,聚乙烯基吡咯烷酮)来防止褐化现象[30],而Mario等在进行Juniperus navicularis生根培养时则通过在培养基中加入AA(Ascorbic acid,抗坏血酸)来防止褐化现象[19]。Lorenzo等在大果柏木(Cupressus macrocarpa)和南美扁柏(C.arizonica)愈伤组织诱导和细胞悬浮培养时也发现,培养基中加入PVP和AA 能有效防止褐化[31]。

2.4培养条件

培养室的温度、湿度、光照时数、光质等都会在一定程度上影响外植体的器官分化和生长。培养室温度常设为(25?2)?左右,湿度一般为75%,光照强度约1600Lx,波长350 750nm,光照时数16h/d[32],不同植物的培养环境应根据具体情况调整。Javeed在用波斯杜松(Juniperus polycarpos)茎尖诱导愈伤组织时发现,在漫射光条件下能更好地诱导愈伤组织生成[33]。除了周期性的光照,在柏科植物的组培过程中适当的暗培养也是有益的。Mario等在Juniperus navicularis生根培养时先进行1个星期19?恒温的暗培养,最大生根率能达到60%[19]。在愈伤组织培养时,暗培养应用更多。Andreas等在欧洲刺柏(Juni-perus communis)体细胞胚培养中,首先在完全黑暗条件下进行3次以1个月为周期的继代培养,获得胚性细胞系[34]。大果柏木和南美扁柏愈伤组织诱导需在黑暗条件下进行,给外植体12h/d光照时,培养4周开始褐化,继代2次即全部死亡[31]。Sakal等培养墨西哥柏(Cupressus lusitanica)等几种柏树以获得其有效成分时,在27?黑暗条件下震荡培养1个月后提取愈伤组织中积累的次生代谢物质用于制药等[35]。另外,培养基的酸碱度也会影响外植体的生长,一般来说,以pH值5.7 5.8为好,其诱导分化速度快、效果好。

3增殖培养及芽诱导

增殖培养是组织培养中的重要环节,基本培养基类型、激素种类及浓度等都会影响芽的增殖,根据树种的不同,应当选用不同的培养基和激素。柏科植物的增殖培养有不定芽和腋芽2种方式。不定芽的形成可以通过直接从外植体上诱导产生,也可以从外植体上诱导出愈伤组织,再通过愈伤组织诱导产生不定芽,而直接诱导是柏科植物组培不定芽形成的主要途径。从外植体上诱导出愈伤组织,再从愈伤组织中诱导出不定芽的实例较少。直接从外植体上诱导不定芽是常用的方式,表1列出了部分已经直接成功从外植体诱导出不定芽的柏科植物。

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表1柏科植物丛生芽诱导

拉丁学名中文名称外植体培养基激素(mg/L)参考文献Chamaecyparis nootkatensis黄扁柏胚SH BA(0.35)文献[20]

C.pisifera cv.squarrosa绒柏茎尖MS BA(0.2)+2,4-D(0.75)+

NAA(0.5)+尿素(60)

文献[36]

Cupressus arizonica绿干柏嫩叶FK2ip(2)文献[24]C.sempervirens地中海柏木胚1/2QP,DCR2,4-D(2.2)/BA(1.28)文献[16]Juniperus cedrus加那利刺柏胚1/2QP BA(0.64)文献[23]

J.excelsa J.navicularis 乔桧

———

子叶

嫩枝

EM/MS

EM/MS

GD

BA(0.5)+NAA(0.02)

BA(1.0)+NAA(0.02)

BA(0.2)+NAA(0.5)

文献[37]

文献[37]

文献[19]

J.oxycedrus酸刺柏叶Mod-SH BA(0.11)文献[38]J.oxycedrus酸刺柏茎尖Mod-SH BA(0.11)文献[14]J.phoenicea腓尼基桧茎尖DKW NAA(0.5)/KT(0.2)文献[25]Sabina chinensis圆柏茎尖1/2MS BA(0.5)+NAA(0.5)+IBA(0.2)文献[39]S.vulgaris叉子圆柏茎尖1/2MS BA(5)+NAA(0.3)文献[13]Tetraclinis articulata山达脂柏茎尖SH BA(0.5)文献[18]Thuja occidentalis日本香柏胚1/2QP ZT(2)文献[26]T.plicata北美乔柏腋芽Mod-MS2ip(200),浸1h后冲洗接种文献[22]注:EM(Eriksson Media,1965),FK(Fujimura和Komamine media,1975)

用于柏科植物丛生芽诱导的培养基多为MS和SH以及各种改良MS和改良SH。激素通常为NAA,IBA,2,4-D,KT,BA和ZT等,多为不同激素结合使用,但也有报道认为单独使用KT或BA效果比配合使用更好。不同的树种适宜的培养基和激素不同。张秀华等通过试验发现,在同样的条件下以圆柏和龙柏当年生幼嫩茎段为外植体进行组织培养,在1/2MS +BA0.5mg/L+NAA0.5mg/L的培养基上圆柏试管苗分化率最高;而龙柏则在1/2MS+BA1.5mg/L +NAA0.5mg/L的培养基上分化率最高,BA(1.0 mg/L)+NAA(0.01mg/L)是龙柏芽增殖的最好激素组合[39]。Gomez等认为,0.5μM/L BA是最适宜酸刺柏丛生芽增殖的激素,而在培养基中加入0.5μM BA和0.05μM KT时最有利于丛生芽的伸长生长[14]。

4生根培养和移栽

4.1生根培养

生根培养是柏科植物组织培养的瓶颈[41]。多种植物有试管苗培养成功却未能生根的报道,或生根率极低。这就限制了其组织培养技术在商业生产上的应用。如何提高生根率是柏科植物组织培养中亟待解决的问题。外植体的基因型及年龄、不定芽发育情况、生长调节剂的使用、预处理、培养环境(温度、光照)等都会影响生根率和根的质量[32]。由于其生根周期长,常导致在试管内生根时遇到营养供给不足的情况,所以除了应用组织培养传统的试管内生根方法之外,在柏科植物的生根培养中还常常用试管外生根的方法。

4.1.1试管内生根

柏科植物生根培养的基本培养基往往与重生芽分化及伸长生长等培养阶段所用的基本培养基相同,但有时会将大量元素减半。常用的生长调节剂有IBA,NAA,IAA,KT和ZT等,生长调节剂在生根培养中常配合使用,但也有试验认为单独使用一种生长调节剂生根效果更好。Thomas等研究发现,NAA和KT 及ZT都能诱导侧柏(Platycladus orientalis)愈伤组织生根[41]。Morte等将山达脂柏丛生芽接种在含9.8μM IBA和10.7μM NAA的SH培养基上,其生根率可达60%,而只加入9.8μM IBA时生根率仅为34%[18]。绒柏(Chamaecyparis pisifera)的不定芽茎段接种在生根培养基(MS+KT0.3mg/L+IBA0.2mg/

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L+2,4-D1.8mg/L)上,20天后即有根长出,40天后根长达2 4mm,生根率达85%[43]。活性炭常被作为附加成分加入生根培养基,可明显提高生根率。但Gomez等认为,活性炭的加入使酸刺柏的生根率大幅度降低,而在含有2.5μM NAA和4%(w/v)蔗糖的培养基上生根率能达到100%[44]。

柏科植物生根培养普遍采用先将外植体用激素诱导一段时间后再转入不含激素的培养基上进行生根培养的办法。外源激素的处理方法可以是速蘸或直接加入培养基进行一定时期诱导培养,速蘸时间5 s和5min及10min不等。根诱导培养的时间也有2周、3周、4周等,但无论诱导时间长短,最后都将转入不含激素的培养基中进行相对更长时间的生根培养。Loureiro等在腓尼基桧茎尖培养中将无根试管苗蘸入2.4μM IBA溶液中5min,再转入不添加激素的OM(Rugini olive medium)培养基中进行生根培养,生根率达40%[25]。Mario等在Juniperus navicularis生根培养中使用了5s速蘸、5min激素处理、3d激素处理和2周诱导培养等多种方法,结果发现进行2周诱导培养后生根率最高,达到60%[19]。

4.1.2试管外生根

柏科植物试管苗生根时间长,进行试管内生根时,如果长时间不转接,试管苗会营养不良,但培养时间短又不能形成不定根。为了解决这一矛盾,常进行试管外生根,即将无根试管苗移栽至合适的基质上,并提供适当的营养、水分、光照、温度等条件,使其可以长时间固定于适宜的环境中,不用转接,也不再存在缺乏营养的问题,从而达到生根的目的。有试验表明,某些树种的无根试管苗在有菌条件下的生根效果与无菌条件下相同甚至更好。

Mimi等报道,黄扁柏在SH培养基中生根率仅为13% 15%,将无根试管苗栽种在珍珠岩和泥炭土按1?1(v?v)混合的基质中移入温室进行试管外生根9 12个月后生根率达到59% 62%[20]。Indra等认为,加那利刺柏在试管内的生根率为0%,在珍珠岩+泥炭土+蛭石(体积比1?1?1)混合的基质中培养5个月后生根率可以达80% 100%[23]。Ne-gussie在进行乔桧的试管苗生根培养时,首先将试管苗在加入IBA(1mg/L)和NAA(0.5mg/L)或含1%(w/v)活性炭的培养基上诱导3周后再进行试管外生根,4个月后即可生根[37]。对Juniperus navicu-laris而言,试管外生根率为34%,小于试管内60%的生根率,但通过试管外生根的个体更健康且生长更快[19]。

4.2植株移栽

移栽的湿度、温度、光照等环境条件,幼苗本身的适应性,移栽基质等多种因素影响试管苗移栽的成活率。在无菌条件下培养的幼苗移栽到有菌的环境条件中,本身的抗性低也会影响成活率。移栽后的空气湿度和光照等自然条件与培养室中恒定的温度及光照条件相比发生了变化,都会影响到组培苗的成活,移栽前往往需要炼苗。将培养瓶放入日光温室中可以使其适应自然光照的变化,而开瓶炼苗使其适应空气湿度及有菌条件,再移栽可以提高成活率。

移栽基质常用珍珠岩、泥炭土、蛭石和河沙等,可以是某一种基质,也可以是按不同比例配制的混合基质,不同树种适宜的基质不同。珍珠岩、蛭石、泥炭土按体积比1?1?1混合是最常用的移栽基质。此外,按其他比例配制的基质也有报道。例如,Loureiro等将腓尼基桧生根试管苗移栽到泥炭土与珍珠岩(3?2)混合的基质中生长良好[25]。生根30天的圆柏(Sabina chinensis)组培苗移栽到蛭石+砂土(1?2)的灭菌基质中,遮荫,成活率在90%以上[42]。

5评述与展望

自从植物组织培养技术诞生以来,已有130余科1500余种植物经组织培养获得了完整植株[43]。而柏科植物较少,仅有20余种。组织培养未能广泛应用在柏科植物繁殖上,主要原因是存在不易获得分化率高的外植体、常用外植体灭菌比较困难、试管苗培养周期长和生根困难等。

1)组织培养最大的优点是能在快速和大量繁殖个体的同时保持母本的优良性状。柏科植物中有大量树种为重要的观赏植物和用材树种,进行组织培养不仅可以快速繁殖,而且可以保留其遗传性状。因此,在柏科植物中开展组织培养研究十分必要。柏科植物组织培养中应重点解决的是周期长、生根难等问题。大量实验表明,以胚等幼嫩材料为外植体进行组织培养更易获得生根试管苗。只有成年植株才能完全体现其基因型,在无性繁殖的取材中,应从发育完全、性状优良的成年母树上取材进行繁殖。但从成年植株上获取外植体进行组织培养加大了分化及生根等的难度,且难以控制污染。通过成年树木复幼后采集外植体进行组织培养,既能保证其基因的优良性状

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又具有较高的分化潜能,将是以后柏科植物组织培养的方向。通过修剪等方法使母树复幼从而获得具有较强生根能力插穗已被广泛应用到树木扦插试验中,同样,组织培养中也有通过施用外源激素获得幼态茎尖作为外植体的例子。另外,试管内连续多次继代培养,可以使许多成熟树木的分生组织复幼。通过试管培养诱导复幼的裸子植物有北美崖柏、海岸松(Pinus pinaster)、北美红杉(Sequoia simpervirens)、日本柳杉(Cryptomeria japonica)等[44]。通过继代复幼的外植体再诱导分化可以提高分化率。

2)柏科植物枝叶形态特殊(鳞状叶),在以茎尖、鳞叶和茎段为外植体进行组织培养时,污染控制也是一个难点。在采集材料前喷施杀菌剂或以室内培养植株为培养材料等方法可以减少污染。落叶树种可以采枝条放入人工气候箱内培养,采新生芽为外植体进行培养也是有效降低污染的方法。对于柏科植物这些常绿树种而言,除了尽量采取带菌少的部分为外植体之外,采用合适的表面灭菌和深度灭菌方法显得尤其重要,常用升汞、次氯酸钠、双氧水、乙醇等灭菌剂,用杀真菌剂、漂白剂、消毒剂等配合灭菌剂使用能有效降低污染。

3)试管苗生根困难是柏科植物组织培养的技术瓶颈。有些种能诱导丛生芽分化,却未能实现其试管苗生根,有些虽然有生根的情况,但生根率低。柏科植物试管苗生根周期长与组织培养中应该经常转接试验材料至新鲜培养基以提供更好的营养条件供植物生长相矛盾,缩短试管苗生根周期或者提供良好的条件进行试管外生根应是今后努力的方向。

4)目前对柏科植物生根机理研究较少,今后应加强植物组织培养外部影响因素的研究,特别是培养基的配制、新型的生长调节物质的研究与使用、生根培养和移栽障碍等方面尚需深入探讨,同时应开展组织分化、生根机理方面的基础研究。

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