克隆存、凋亡等试验

克隆存活实验(Clonogenic Formation Assay, CFS)

克隆存活实验是放射生物学经典的体外实验之一。本次研究中采用的克隆存活实是按照GSI生物物理部下属的临床放射研究组制定的标准操作程序进行的。具体如下:

1.预先准备好的细胞样本,包括培养在细胞培养瓶中的细胞或者在环形培养皿中细胞样品(GSI专利);

2.需要进行射线照射的细胞样品;

3.光子射线或碳离子进行不同物理剂量的照射;

4.胰酶消化后进行计数;

5.一定体积的细胞混悬液再次接种到T25的细胞培养瓶;

6.细胞培养箱中培养11天;

7.小心倒出细胞培养液,然后每个细胞培养瓶加入70%酒精3ml进行细胞灭活兼细胞克隆脱水固定;

8.亚甲基蓝进行染色:RAT-1细胞需使用3 X亚甲基蓝进行染色8分钟,然后迅速用5ml去离子水清洗每个细胞培养瓶。IEC-6细胞使用3X亚甲基蓝进行染色15分钟,然后迅速用5ml去离子水清洗每个细胞培养瓶。

9.染色并清洗过的细胞培养瓶需要在通风柜中自然干燥(通常至少需要24小时);

10.在解剖显微镜下进行克隆计数,具有超过50个细胞的克隆看做一个有效克隆计数;

11.根据所的克隆数计算每个计量点的存活率;

12.使用GSI自行研发的“GD”程序进行曲线初步拟合,由此得到细胞的接种贴壁率(Plating Efficiency, PE);

13.没一个剂量点的存活率均除以PE进行标准化计算,所得到的为每个剂量点的存活分数;

14.使用每一组的存活分数通过二次方程(公式1.4)进行曲线的绘制和拟合;

15.绘制细胞存活曲线(Survival C urve),横坐标X轴是照射物理剂量,Y轴是标准化后的存活分数,Y 轴为对数刻度。

备注:

RAT-1在胰酶消化后需要离心机离心(521g,8分钟),之后进行计数。而IEC-6不需要离心这一步骤,但是本次实验中需要有两种细胞的共培养体系,因此两个细胞系均需要离心后再计数进行克隆存活实验。每个细胞培养瓶接种一定细胞数目,混悬液的体积(D)由下列公式计算得出:

Annexin V-FITC/PI细胞凋亡双染试剂盒说明书

一、概述

在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸只分布在细胞膜脂质双层的内侧，细胞发生凋亡最早期，膜磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧，这一变化早于细胞皱缩、染色质浓缩、DNA片断化和细胞膜的通透性增加等凋亡现象。AnnexinV是一种磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此AnnexinV被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。碘化丙啶（Propidium Iodide,PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但凋亡中晚期的细胞和死细胞由于细胞膜通透性的增加，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将Annexin V与PI匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。

二、试剂盒组份

Product code Description

556547 Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit I

Components:

556547a Annexin V Binding Buffer, 10X conc (51-66121E

556547b Annexin V-FITC (51-65874X)

556547c Propidium Iodide Staining Solution(51-66211E)

三、步骤

贴壁细胞需用0.25%的胰酶消化。注意过度消化可损伤细胞。在消化时可加2％的BSA 可防止消化过度。如果用含EDTA的胰酶消化时，注意必须彻底清除EDTA：在标记前用1×PBS 或1×bindingbuffer洗涤，清除EDTA，以免残余的EDTA与Ca2＋螯合，影响Annexin V的结合。（1）用去离子水将10×Binding Buffer稀释成1×Binding Buffer；

（2）细胞收集。悬浮细胞收集：离心5分钟；贴壁细胞：用不含EDTA的胰酶消化收集后（注：胰酶消化时间不宜过长，否则会影响细胞膜上磷脂酰丝氨酸与Annexin V-FITC的结合），于室温2000rpm离心5～10分钟，收集细胞；

（3）细胞洗涤：用预冷1×PBS（4℃）重悬细胞一次，2000rpm离心5～10分钟，洗涤细胞；（4）加入300μL 的1×Binding Buffer 悬浮细胞；

（5）Annexin V-FITC标记：加入5μL的Annexin V-FITC混匀后，避光，室温孵育15分钟；（6）PI标记：上机前5分钟再加入5μL的PI染色。

（7）上机前，补加200μL的1×Binding Buffer。

四、保存：4℃保存，两个月内可保持稳定；避免反复冻融。

五、注意事项

（1）本试剂只适用于实验，不适用于临床检测；

（2）PI（propidium iodide，碘化丙锭）有毒性，能通过皮肤吸收，对眼睛有刺激作用，使用时需戴手套；

（3）Annexin V-FITC和PI是光敏物质，在操作时请注意避光。在处理和标记时，尽可能在暗处进行。在孵育阶段，用铝箔包裹容器或置于抽屉中。细胞标记后，在暗室内用显微镜观察；（4）整个操作过程动作要尽量轻柔，勿用力吹打细胞，尽量在4℃下操作，以免影响细胞状态。（5）在细胞洗涤的最后一步，请尽量将上清弃净，以免PBS残留，有可能会影响实验结果。（6）为防止荧光衰变，宜在1小时内进行流式检测。

（7）PI染色时间过长有可能造成检测的凋亡率偏高，建议首先进行Annexin V-FITC染色，最短可在上机前5分钟再加入PI染色。

细胞粘附力实验

平板粘附实验依浓度不同，分为3 组，每组细胞设5 个平行复孔实验（n=5）：A549 对照组、2.5μmol/L的ASODN 组和5μmol/L的ASODN 组。96 孔培养板分别均匀包被Matrigel 10μl，4℃过夜，超净工作台风干。紫外线照射消毒。取对数生长期（60%~70%融合状态）的A549 细胞，0.25%胰酶消化成细胞悬液，以5×104 个/ml 接种于96 孔细

胞培养板，每孔0.1 ml，60 min 后，37℃ PBS 洗去未粘附的细胞，MTT法测各孔490 nm波长光吸收值。用光吸收值大小代表粘附活细胞的相对数量。

软琼脂克隆形成实验步骤完整版

软琼脂克隆形成实验步 骤完整版 集团标准化办公室：[VV986T-J682P28-JP266L8-68PNN]

注意：软琼脂克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。软琼脂培养法常用检测肿瘤细胞和转化细胞系。接种细胞的密度每平方厘米不超过35个，正常细胞在悬浮状态下不能增殖，不适用于软琼脂克隆形成试验。 1、配制100ml的1.2%Argrose和0.7%Argrose，Argrose用DNA电泳用BIOWESTREGULARArgroseG10 （4℃），溶剂用双蒸水（DDW），高压灭菌后，维持在42℃中不会凝固；配制500ml的2×1640和 0.005%的结晶紫。 2、实验前，将水浴锅放入超净台内，紫外照射，设定温度42℃。提前融化血清和双抗。 3、如已制好上下胶，则在微波炉中溶解1.2%Argrose下胶和0.7%Argrose上胶，降温后放入42℃水浴锅 中保持。 4、根据实验需要的量配制20%FBS+2×1640+2×PS（5种细胞配40ml），每种细胞设3个复孔。 5、铺下胶：按1:1比例使1.2%Argrose下胶和20%FBS+2×1640+2×PS混合，6孔盘每孔迅速加入1.5ml 混合液，轻轻混匀，室温静置待下胶凝固（加混合液时不能产生气泡）。对于一个6孔盘，配5ml上述培养液+5ml1.2%Argrose下胶于50ml离心管中（离心管要一直置于水浴锅中）。 6、细胞计数：取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞，作活细胞计数， 用正常培养液调整细胞密度至40×104／ml以上，这样加的体积小于100ul，不会影响其他成分的稀释程度。每孔铺1万个细胞，准备4个孔的细胞数，即4×104。 7、铺上胶：按1:1比例混合0.7%Argrose上胶和20%FBS+2×1640+2×PS，每种细胞需先配2ml（20%FBS+2 ×1640+2×PS）+2ml0.7%Argrose上胶于离心管中混匀，放入42℃水浴锅中保持。再将细胞悬液加入上述混合液中，混匀后迅速加入6孔盘中，每孔1ml。待上层琼脂凝固后，置于5%CO ，37℃，培养2－3 2周。 8、间隔2天补加200ul10%FBS+1640+1×PS，以防过于干燥。 9、计数克隆：把平皿放置在倒置显微镜下（100×），在镜下随机选择10个视野，计数视野中大于50个 克隆数(﹥0.05mm的克隆)和所有克隆数，克隆形成率=大于50个克隆数\所有克隆数×100%。每孔加入1ml的0.005%结晶紫染色1h以上，镜下拍照。 10、数据处理：每个视野的面积是1mm2,6孔盘每孔的面积是9.6cm2,则一个孔中总的克隆数=平均克隆数× 960，如果要比较﹥0.05mm的克隆的绝对值，则可以利用“每孔﹥0.05mm的克隆数/每孔总细胞克隆数”，将分母取一组作为标准，做出此组与其他组的比值系数，再分别用此系数乘以各组﹥0.05mm的克隆的绝对值，就得到总细胞克隆数相同条件下的﹥0.05mm的克隆的绝对值，可进行比较。

软琼脂克隆形成实验步骤(完整版)

注意：软琼脂克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。软琼脂培养法常用检测肿瘤细胞和转化细胞系。接种细胞的密度每平方厘米不超过35个，正常细胞在悬浮状态下不能增殖，不适用于软琼脂克隆形成试验。 1、配制100ml的1.2% Argrose和0.7%Argrose，Argrose用DNA电泳用BIOWEST REGULAR Argrose G10（4℃），溶剂用双蒸水（DDW），高压灭菌后，维持在42℃中不会凝固；配制500ml的2×1640和0.005%的结晶紫。 2、实验前，将水浴锅放入超净台内，紫外照射，设定温度42℃。提前融化血清和双抗。 3、如已制好上下胶，则在微波炉中溶解1.2%Argrose下胶和0.7% Argrose上胶，降温后 放入42℃水浴锅中保持。 4、根据实验需要的量配制20%FBS+2×1640+2×PS（5种细胞配40ml），每种细胞设3 个复孔。 5、铺下胶：按1:1比例使1.2%Argrose下胶和20%FBS+2×1640+2×PS混合，6孔盘每 孔迅速加入1.5ml混合液，轻轻混匀，室温静置待下胶凝固（加混合液时不能产生气泡）。对于一个6孔盘，配5ml上述培养液+5ml 1.2%Argrose下胶于50ml离心管中（离心管要一直置于水浴锅中）。 6、细胞计数：取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞， 作活细胞计数，用正常培养液调整细胞密度至40×104／ml以上，这样加的体积小于100ul，不会影响其他成分的稀释程度。每孔铺1万个细胞，准备4个孔的细胞数，即4×104。 7、铺上胶：按1:1比例混合0.7% Argrose上胶和20%FBS+2×1640+2×PS，每种细胞需 先配2ml（20%FBS+2×1640+2×PS）+2ml0.7% Argrose上胶于离心管中混匀，放入42℃水浴锅中保持。再将细胞悬液加入上述混合液中，混匀后迅速加入6孔盘中，每孔1ml。待上层琼脂凝固后，置于5%CO2，37℃，培养2－3 周。 8、间隔2天补加200ul 10%FBS+1640+1×PS，以防过于干燥。 9、计数克隆：把平皿放置在倒置显微镜下（100×），在镜下随机选择10个视野，计数 视野中大于50个克隆数(﹥0.05mm的克隆)和所有克隆数，克隆形成率=大于50个克隆数\所有克隆数×100%。每孔加入1ml的0.005%结晶紫染色1h以上，镜下拍照。

克隆羊多莉

由“多利”引发的思考 当英国科学家维尔穆特成功地用体细胞克隆出“多利”羊之后，在社会上引起了巨大的反响。克隆技术的应用标志着人类在生物学领域的一项重大突破，它具有极其重要的生物学意义。克隆羊“多利”的诞生表明了哺乳动物卵母细胞可以重编体细胞核的程序，使已分化了的体细胞具有全能性。与此同时，对于克隆人可能对于社会的伦理和道德规范所产生的巨大影响也应当引起人们的高度重视，克隆人在技术上是可以做的，但在伦理上不应该做。然而，克隆技术对人类社会的文明与进步是有益的，应当得到充分的肯定。 “克隆”是英文中"Clone"的音译，意为生物体通过体细胞进行的无性繁殖以及由无性繁殖形成的基因型完全相同的后代个体组成的种群。 在自然条件下，由于许多植物本身就适宜进行无性繁殖，因此它们很容易形成克隆。在动物界，这种繁殖方式多见于无脊椎动物，如原生动物的分裂生殖等。但是，对于高等动物，由于在自然状态下它们一般只能进行有性繁殖，所以要使它们进行无性繁殖，科学家必须经过一系列复杂的操作程序。首先要用外科手术除去受精卵的细胞核，或用辐射等手段使受精卵内的细胞核失去活性，然后再将另一个个体的细胞核转换到已去除细胞核的受精卵中。本世纪五十年代，科学家用上述方法成功地无性繁殖出一种两栖动物——非洲孤蟾，此举揭开了细胞生物学的新篇章。“多利”羊是第一只利用成年动物细胞核经过无性繁殖方式获得的哺乳动物，因而具有里程碑式的意义。“多利”的核遗传物质来源一只六岁绵羊的乳腺细胞核，维尔穆特及其同事将获得的乳腺细胞进行体外培养，这些细胞的主要类型为乳腺上皮细胞（90%以上），并包括成纤维细胞等其他类型的分化细胞。他们利用降低培养基中血清浓度的方法使培养乳腺细胞处于有丝分裂停滞状态（G[,0]期），然后将处于G[,0]期乳腺细胞的细胞核称植到去核的未受精卵细胞中，在绵羊输卵管中把融合细胞培养至桑椹胚或胚泡期，大约6天的培养后，植入受体羊子宫中进行孕育和分娩，“多利”就是精确地通过这种方式诞生的。 “多利”的新奇之处在于：第一，不用并挑出胚胎细胞的细胞核，而“装入”体细胞（乳腺细胞）的细胞核，进行核移植，它也照样可以分裂并发育成个体。按照发育生物学的观点，成羊体细胞是一种“定向”了的、一定程度上分化了的细胞，即这种细胞的性质已经定型，是哪种类型的细胞或组织就是哪种类型的细胞或组织，正如乳腺细胞只能发育成乳腺组织一样，不可能“再回头”，重新获得“全能性”。然而“多利”的成功依然说明，即使分化了的体细胞在一定的条件下，仍然具有“全能性”。第二，由于移入卵内的是体细胞，不仅含有双倍的染色体，而且由此产生的后代细胞的染色体均是该体细胞的遗传拷贝，因而由此发育而成的个体的遗传性质与核供体的亲本是一致的。另外，由于“多利”的产生未经过精子与卵细胞的结合的受精过程，属于无性繁殖，故此称为“克隆羊”，意思是“无性繁殖的羊”。 克隆羊“多利”的诞生标志着哺乳动物获得了一种人为的全新的生殖方式，意味着人类可以利用动物一个细胞大量生产出完全相同的生命体。克隆羊继承了核供体羊的全部遗传特性，超越了传统生殖方式之下子代兼有亲代双方遗传特性的常规。 由于克隆技术具有应用于人类的潜能，那么，从克隆羊联想到克隆人的产生就是十分自然的事。从技术上看，克隆羊的成功使这种可能性向现实性迈出了一步，人们似乎看到了克隆人诞生的前景。人不仅是一个具有生物特性的个体，而且还是一个具有社会特性的个体，这是人和动物的一个本质区别。从人的社会性考虑，克隆人的产生势必带来对社会组成结构的冲击，引起的社会问题将会是多方面的： (1)从社会伦理角度看，用克隆技术来培育具有特定生理性状的人，对于作为自然物种一部分的人类的发展是一种过强的干预。这种干预可能影响人类的人种自然构成和自然发展。被克隆的人，其生理性状是完全受到控制的，这样的人在社会生活中的悲观心理和宿命感可

细胞克隆形成实验

细胞xx形成实验 当单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，成为集落或克隆。 每个克隆含有50以上的细胞，大小在之间。集落形成率表示细胞的独立生存能力。各种理化因素可能导致细胞的克隆形成能力发生改变。通过一定的实验方法可以对细胞的克隆形成能力进行检测。 细胞接种存活率只表示接种细胞后贴壁的细胞数，但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆。而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。由于细胞生物学性状不同，细胞克隆形成率差别也很大： 一般初代培养细胞克隆形成率弱，传代细胞系强；二倍体细胞克隆形成率弱，转化细胞系强；正常细胞克隆形成率弱，肿瘤细胞强。 实验方法： 平板集落形成实验、软xx集落形成实验 (a)平板集落形成实验：本法适用于贴壁生长的细胞和正常培养的细胞(b)软琼脂集落形成实验：本法适用于非锚着依赖性生长的细胞，如骨髓造血干细胞、肿瘤细胞株、转化细胞系。 平板xx形成实验基本步骤： 1、取对数生长期的各组细胞，分别用%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，并把细胞悬浮在10%胎牛血清的DMEM培养液中备用。 2、将细胞悬液作梯度倍数稀释，每组细胞分别以每皿50、100、200个细胞的梯度密度分别接种含10mL37℃预温培养液的皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。 置37℃ 5% CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养2～3周。

3、经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。加4%多聚甲醛固定细胞5mL固定15分钟。然后去固定液，加适量GIMSA应用染色液染10～30分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。 4、将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜（低倍镜）计数大于10个细胞的克隆数。最后计算克隆形成率。 克隆形成率=（克隆数/接种细胞数）×100% 平板克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。 平板克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。 软xx培养xx形成试验基本步骤： (1)取对数生长期细胞，用%胰蛋白酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞，作活细胞计数，用含20%胎牛血清的DMEM培养液调整细胞密度至1×106细胞/L。然后根据实验要求作梯度倍数稀释。 (2)用蒸馏水分别制备出%和%两个浓度的低溶点琼脂糖液，高压灭菌后，维持在40℃中不会凝固。 (3)按1:1比例使%的琼脂糖和2×DMEM培养基(含有2×抗生素和20%的小牛血清)混合后，取3mL混合液注入直径6cm平皿中(10cm平皿加7～10mL)，冷却凝固，可作底层琼脂置CO2温箱中备用。 (4)按1:1比例让%的琼脂糖和2×DMEM培养基在无菌试管中相混以后，再向管中加入的细胞悬液，充分混匀，注入铺有%琼脂糖底层平皿中，逐形成双琼脂层。 待上层琼脂凝固后，置入37℃ 5%CO2温箱中培养10～14天。

细胞克隆形成实验

机密提醒：这份文件及其传真件、复印件所包含的机密或法律保护信息是只提供给这份文件上所指定的个人或机构。如果您不是预定接受者，我们提醒您严禁以披露、拷贝、散发或任何形式利用这份文件及其传真件、复印件的内容。如果您错误的接收到这份文件及其传真件、复印件，请立即通知我们以便我们可以安排文件及其传真件、复印件返还并不会让您负担任何费用。 第 1 页 共 1 页 细胞克隆形成实验 一、 当单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，成为集落或克隆。每个克隆含有50以上的细胞，大小在0.3-1.0mm 之间。集落形成率表示细胞的独立生存能力。各种理化因素可能导致细胞的克隆形成能力发生改变。通过一定的实验方法可以对细胞的克隆形成能力进行检测。[晶莱生物] 二、实验方法 平板集落形成实验、软琼脂集落形成实验 (a)平板集落形成实验：本法适用于贴壁生长的细胞和正常培养的细胞 (b)软琼脂集落形成实验：本法适用于非锚着依赖性生长的细胞，如骨髓造血干细胞、肿瘤细胞株、转化细胞系。 三、注意事项 (a)琼脂对热和酸不稳定，若反复加热，容易降解而产生毒性，且硬度下降。因此高压灭菌后应进行分装； (b)细胞在进行克隆形成实验时要求有95%以上的分散度，否则结果的准确度会受到很大影响； (c)软琼脂与细胞混合时温度不能超过40℃，否则将会烫伤/死细胞； (d)接种时细胞密度适度，不可过高。 细胞在低密度、非贴壁状态条件下培养，生存率明显下降，永生细胞系/株克隆形成率可达到10%以上，但初代培养细胞和有限传代细胞系克隆形成率仅为0.5%-5%，甚至无法形成单个克隆。因此，为了提高克隆形成率，有时需要在培养基中添加胰岛素、地塞米松等促克隆形成物质。 细胞接种存活率只表示接种细胞后贴壁的细胞数，但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆。而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。由于细胞生物学性状不同，细胞克隆形成率差别也很大，一般初代培养细胞克隆形成率弱，传代细胞系强；二倍体细胞克隆形成率弱，转化细胞系强；正常细胞克隆形成率弱，肿瘤细胞强。并且克隆形成率与接种密度有一定关系，做克隆形成率测定时，接种细胞一定要分散成单细胞悬液，直接接种在碟皿中，持续一周，随时检查，到细胞形成克隆时终止培养。 四、周期 1-2个月

(完整版)细胞集落形成实验

细胞集落形成实验方法介绍 非整倍体无限细胞系和癌细胞株中，仍然存在不同细胞亚群，它们的功能和生长特点有些差异，其中有些亚群细胞对培养环境有较大的适应性和具有较强的独立生存能力，细胞集落率高。纯化细胞群来自一个共同的祖细胞，细胞遗传性状、生物学特性相似，利于实验研究。原代培养细胞和二倍体有限细胞系，细胞集落率很低。细胞集落化培养之前，应先测定细胞集落形成率，以了解细胞在极低密度条件下的生长能力。 集落抑制率=（1-（实验组集落形成率/对照组集落形成率））×100% （一）原理 细胞集落形成率单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，称为集落或克隆。每个克隆含有50个以上的细胞，大小在0.3-1.0mm 之间。集落形成率表示细胞独立生存能力。常用方法有平板集落形成试验、软琼脂集落形成试验。 （二）实验用品 1.材料：Hela细胞。 2.器材：（直径60mm ）培养皿、细胞记数板、烧杯、吸管、离心机、离心管、废液瓶、倒置显微镜、二氧化碳培养箱、超净工作台、水浴锅。 3.试剂：Giemsa染液、0.25%胰蛋白酶消化液、血清细胞培养液、安尔碘、琼脂。 （三）方法 1.平板克隆形成试验 本法适用于贴壁生长的细胞，包括培养的正常细胞和肿瘤细胞。 (1)对指数生长期细胞，采用常规消化传代方法，制成细胞悬液。 (2)细胞悬液反复吹打，使细胞充分分散，单个细胞百分率应在95%以上。细胞记数，并用培养基调节细胞浓度，待用。 (3)根据细胞增殖能力，将细胞悬液倍比稀释。一般按照每皿含50、100、200个细胞的浓度分别接种5ml细胞悬液到培养皿（直径60mm ）中，以十字方向轻轻晃动培养皿，使细胞分散均匀。 (4)培养皿置37℃、5%CO2中培养2~3周，中间根据培养液pH变化适时更换新鲜培养液。 (5)当培养皿中出现肉眼可见克隆时，终止培养，弃去培养液，PBS液小心浸洗2次，空气干燥。甲醇固定15分钟，弃甲醇后空气干燥。用Giemsa染液染色10分钟，流水缓慢洗去染液，空气干燥。 2.软琼脂集落形成试验

克隆羊的培育过程学习资料

克隆羊的培育过程

克隆羊的培育 克隆羊（Cloned sheep）是世界上用已经分化的成熟的体细胞（乳腺细胞）克隆出的羊。这项研究不仅对发育遗传学、胚胎学、医学有重大意义，而且也有巨大的经济潜力。克隆技术可以用于器官移植，造福人类；也可以通过这顶技术改良物种，给畜牧业带来好处。克隆技术若与转基因技术相结合，可大批量“复制”含有可产生药物原料的转基因动物，从而使克隆技术更好地为人类服务。如今，世界第一批无性繁殖的转基因羊在英国诞生。克隆技术可以拯救濒危动物，保护生态平衡。 多利出世历经曲折。在培育多利羊的过程中，科学家采用体细胞克隆技术，主要分4个步骤进行： 步骤一：从一只6岁芬兰多塞特白面母绵羊（姑且称为A）的乳腺中取出乳腺细胞，将其放入低浓度的营养培养液中，细胞逐渐停止分裂，此细胞称之为“供体细胞”； 步骤二：从一头苏格兰黑面母绵羊（B）的卵巢中取出未受精的卵细胞，并立即将细胞核除去，留下一个无核的卵细胞，此细胞称之为“受体细胞”； 步骤三：利用电脉冲方法，使供体细胞和受体细胞融合，最后形成“融合细胞”。电脉冲可以产生类似于自然受精过程中的一系列反应，使融合细胞也能像受精卵一样进行细胞分裂、分化，从而形成“胚胎细胞”； 步骤四：将胚胎细胞转移到另一只苏格兰黑面母绵羊（C）的子宫内，胚胎细胞进一步分化和发育，最后形成小绵羊--多莉。 克隆羊多莉死亡的原因：

①克隆动物确实存在早衰现象，它们从一出生起身体的衰老程度就类似于被克隆个体，所以它们的寿命被缩短。就多莉事件而言，数字上也比较符合这个推测。但是克隆动物是否存在不可避免的早衰问题，还缺乏有力的证据，根据以后许多克隆实验表明，早衰问题并不普遍。 ②克隆技术过程中的一些物理化学伤害导致了多莉的健康隐患，使得它容易患病。克隆动物的健康问题十分普遍，就世界各地的报道来看，克隆动物畸形、流产等等的几率是相当高的。 ③第三种，多莉属于普通患病死亡。关节炎和肺部感染是绵羊的常见疾病，特别是对于室内饲养的绵羊来说患病的可能更大。 克隆羊多莉成功意义： 莉的诞生证明高度分化成熟的哺乳动物乳腺细胞，仍具有全能性。 ②成功地找到了供体核与受体卵细胞质更加相容的方法。克隆多莉的实验解决了高度分化了的体细胞核移植成功的关键性技术，居于世界领先地位。 ③应用克隆技术，繁殖优良物种。建造动物药厂，制造药物蛋白。 ③建立实验动物模型，探索人类发病规律。 ④克隆异种纯系动物，提供移植器官。 ⑤拯救濒危动物，保护生态平衡。

细胞克隆形成实验

细胞克隆形成实验 当单个细胞在体外增殖6 代以上，其后代所组成的细胞群体，成为集落或克隆。每个克隆含有50 以上的细胞，大小在0.3-1.0mm 之间。集落形成率表示细胞的独立生存能力。各种理化因素可能导致细胞的克隆形成能力发生改变。通过一定的实验方法可以对细胞的克隆形成能力进行检测。 细胞接种存活率只表示接种细胞后贴壁的细胞数，但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆。而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。由于细胞生物学性状不同，细胞克隆形成率差别也很大： 一般初代培养细胞克隆形成率弱，传代细胞系强；二倍体细胞克隆形成率弱，转化细胞系强；正常细胞克隆形成率弱，肿瘤细胞强。 实验方法： 平板集落形成实验、软琼脂集落形成实验 (a) 平板集落形成实验：本法适用于贴壁生长的细胞和正常培养的细胞 (b) 软琼脂集落形成实验：本法适用于非锚着依赖性生长的细胞，如骨髓造血干细胞、肿瘤细胞株、转化细胞系。 平板克隆形成实验基本步骤： 1、取对数生长期的各组细胞，分别用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，并把细胞悬浮在10%胎牛血清的DME培养液中备用。 2、将细胞悬液作梯度倍数稀释，每组细胞分别以每皿50、100、200个细胞的梯度密度分别接种含10mL37°C预温培养液的皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。置37C 5% CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养2?3周。 3、经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液，用 PBS小心浸洗2次。加4%多聚甲醛固定细胞5mL固定15分钟。然后去固定液，加适量GIMSA应用染色液染10?30分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。 4、将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜(低倍镜)计数大于10个细胞的克隆数。最后计算克隆形成率。 克隆形成率=(克隆数/接种细胞数)X100% 平板克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。

最新soft agar assay protocol软琼脂克隆形成实验教学内容

1.软琼脂克隆形成实验 1)配制1.2%和0.7%的琼脂糖，高压灭菌后置于55℃水浴中，使其保持融化状 态。 2)配含20%FBS、2×抗生素的2×RPMI 1640培养基，37℃预热。 3)灌下层胶：1.2%的琼脂糖胶与2×培养基1:1混合，加入到6孔板中，每孔3ml， 室温放置待其凝固。 4)等待下层胶凝固过程中消化B16 con shRNA与B16 Myo7a shRNA稳转细胞， 计数，用无血清培养基调整浓度为5×104/ml，每孔用100μl细胞，设3个平行孔。 5)下层胶凝固后灌上层胶：0.7%的琼脂糖胶与2×培养基1:1混合(温度约40℃ 左右)，加入100μl细胞悬液，即5000个细胞，混匀，加入孔板中，每孔3ml。 6)37℃5% CO2培养，约2-3周收细胞，0.1%结晶紫染色，计数并比较两组克 隆形成情况。 1、人生最重要的不是努力，不是奋斗，而是抉择。 2、老板只能给一个位置，不能给一个未来。舞台再大，人走茶凉。 3、意外和明天不知道哪个先来。没有危机是最大的危机，满足现状是最大的陷阱。 4、所见所闻改变一生，不知不觉断送一生。 5、生意，可以掌控努力与投资，却无法掌控结果。人生得意时找出路，失意时才有退路，宝马都有备胎，您的人生呢？ 6、世界上有多少有才华的失败者，世界上有很多高学历的无业游民—是因为选择错误。 7、下对注，赢一次；跟对人，赢一世。 8、学识不如知识，知识不如做事，做事不如做人。 9、不识货，半世苦；不识人，一世苦。 10、生命不在于活得长与短，而在于顿悟的早与晚。

11、做人处事，待人接物：重师者王，重友者霸，重己者亡。 12、没有目标的人永远为有目标的人去努力。 13、人生三阶段：比才华；比财力；比境界。 14、人若把自己框在一定的范围内，就容易限制了自己的思维和格局。 15、今天的优势会被明天的趋势代替，把握趋势，把握未来。 16、读万卷书不如行千里路，行千里路不如阅人无数，阅人无数不如名师指路。经师易得，人师难求。 17、学历代表过去，财力代表现在，学习力代表将来。 18、人生能走多远，看与谁同行；有多大成就，看有谁指点。 19、聪明的人看得懂，精明的人看得准，高明的人看得远。 20、做人不成功，成功是暂时的；做人成功，不成功也是暂时的。 记住这些话他会帮你变得更完美 记住： 再烦，也别忘微笑；再急，也要注意语气； 再苦，也别忘坚持；再累，也要爱自己。 低调做人，你会一次比一次稳健；高调做事，你会一次比一次优秀。成功的时候不要忘记过去；失败的时候不要忘记还有未来。 有望得到的要努力，无望得到的不介意，则无论输赢姿态都会好看。生活不是单行线，一条路走不通，你可以转弯。 泪水和汗水的化学成分相似，但前者只能为你换来同情，后者却可以为你赢的成功。 变老是人生的必修课，变成熟是选修课。 以锻炼为本，学会健康；以修进为本，学会求知；

(完整版)克隆羊多莉教学设计

《克隆羊多莉》第一讲教学设计 山海关区南园小学李全奇 一、教学内容：义务教材小学五年级科学下册《克隆羊——多莉》 二、教学设想： 学生从课外知识的阅读中接触并了解了一些克隆和基因知识，也知道它们在生活中的一些应用的事例，教材中做了相对系统一点儿地安排，想让学生应用相关知识解决一些实际问题。我们就要给他们空间，发挥学生的主动性、参与性、探索性和创造性；让他们自己动手做，动脑想，认真思考，互相研讨，从而使学生的处理信息能力，逻辑思辨能力，想象能力得到训练和培养。 三、学情分析： 学生前期学习了生物的繁殖，知道一个新的生命是如何诞生的，了解了相似与差异性，知道生物具有遗传和变异的特性，这为本节课的学习做好了铺垫。同时，五年级的学生们有了一定的自我学习能力，能够在课下独自搜集整理相关资料，以此来引导学生学会思考问题、解决问题。 四、教学目标： 科学探究目标： 1、能通过讨论等方式探究克隆技术和基因工程给人类带来的影响。 2、能将所收集的资料进行整理，设计成有条理的讲演稿向其他人介绍。 3、能有一定根据地提出自己的观点，并能对其他同学的观点进行评价。 情感态度与价值观： 能体会到科学技术的“双刃剑”含义 科学知识目标： 能解释克隆技术和基因工程 科学、技术、社会、环境： 能从正反两个方面说出克隆技术给人类带来的影响 五、教学重难点 重点：1.了解克隆技术和基因工程技术；2.认识到新技术给人类带来的影响；3.通过学生自己动手搜集资料来激发学生对生命科学新成果的关注。 难点：1、认识了解克隆技术的操作过程；2.学生自己搜集整理资料的能力；3.理解克隆技术是把“双刃剑”。 六、教学准备： 教师准备：制作幻灯片；搜集相关内容的资料 学生准备：搜集与克隆有关的资料，并进行整理。 七、教学过程实施：

细胞实验操作流程

细胞冻存、复苏及传代操作流程 1. 试剂与仪器： 1.1 试剂 PBS磷酸缓冲液：Solarbio，货号：P1022 胰蛋白酶-EDTA溶液：Gibco公司，货号15400054 100 mL； 青链霉素：Gibco公司，货号15140-112 100 mL； FBS：Gibco公司，货号10091-148 500 mL； DMEM （4.5g/L glucose）培养基：CORNING公司，货号10-013-CVR 500 mL；RPMI 1640 ：CORNING公司，货号10-040-CVR 500mL； DMSO：SIGMA公司，货号：D8418； PBS磷酸缓冲液：Solarbio，货号：P1022 1.2 仪器 生物安全柜： 离心机： 37℃恒温水浴箱： -80℃冰箱： 4℃冰箱： 荧光倒置显微镜： 37℃恒温培养箱： 液氮罐： 2、实验方法： 2.1 细胞冻存 配制含10% 体积DMSO的冻存培养液（90% FBS+10% DMSO或70%培养基+20%FBS+10%DMSO），冻存盒室温放置。 将正常生长的贴壁细胞用PBS清洗2遍后加入胰蛋白酶-EDTA（6 cm皿加入1 mL，10 cm皿或T25细胞瓶加入2 mL），37℃放置直至细胞显微镜下缩成圆球状，加入消化液体积2倍以上培养基，终止消化，将细胞吸取至15 mL离

心管中，800 rpm离心5 min，去上清加入适量冻存液重悬细胞，1mL分装于冻存管中，做好标记。 悬浮细胞收集细胞培养液于15 mL离心管中，800 rpm离心5 min，去上清加入适量冻存液重悬，1 mL分装于冻存管中，做好标记。 将冻存管放入冻存盒中，放入-80℃过夜，第二天转入液氮中长期保存。2.2 细胞复苏 从液氮罐中取出冻存管，快速浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化；从37℃水浴中取出冻存管，在安全柜中，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到15 mL离心管中（15 mL 离心管中已事先加入4 mL培养基）混匀，800 rpm，离心5 min，弃去上清液，加入含10%血清的培养液重悬细胞，根据离心后的细胞沉淀，将细胞培养在10 cm 皿或6 cm皿的培养皿中（一般选用6 cm皿）37℃培养箱静置培养。次日更换1次培养液，继续培养。 2.3 细胞传代 状态良好的贴壁细胞用PBS清洗2遍后加入胰蛋白酶-EDTA（6cm皿加入1 mL，10 cm皿或T25细胞瓶加入2 mL），37℃放置直至细胞显微镜下缩成圆球状，加入胰酶体积2倍以上培养基，终止消化，将细胞吸取至15 mL离心管中，800 rpm离心5 min，去上清加入1-2ml培养基重悬细胞，吹打均匀后根据细胞生长速度1瓶传2瓶或1瓶传3瓶，补齐培养基（6cm皿加5ml，10cm皿加10ml）后放入37℃培养箱继续培养。 悬浮细胞在显微镜下观察，健康的细胞干净而透明，核清晰可见，静置培养时常见小细胞团。 ①若细胞状态好，培养基干净而无明显颗粒物沉淀，可直接1:2或1:3分瓶传代培养。 ②若细胞有碎片，培养基中颗粒物多，则需收集细胞培养液于15ml离心管中，600rpm离心5min，去上清，加入适量完全培养基重悬，轻柔吹打混匀后，根据细胞生长速度，1:2或1:3传代培养。 3、注意事项 1）细胞一旦染菌后直接舍弃并检查所有试剂耗材是否污染，如细胞样本非常

肿瘤细胞软琼脂克隆形成实验

Soft Agar Colony Formation Assay Darren Carpizo, M.D. Overview: This assay is designed to assay a cell's ability to grow unattached to a surface and therefore suspended in agar. The assays are done in 6cm plates. A bottom layer of enriched media + agar is poured first (2.5ml), after solidifying this is followed by a layer containing a lower amount of agar and containing a specified number of cells (cell layer = 5ml), after solidifying a top layer is poured. The plates are placed in the incubator and after two weeks or so, colonies are counted by naked eye. 1)Make sol'ns of 2X Iscove's Media (Gibco BRL, dissolve one 1L packet in 500ml of water) and filter sterilize, make about 100 ml of 1X by diluting the 2X, separate from this 100ml make 100 ml of 1X Iscove's containing 10% FBS 2)Make Noble Agar (Difco) at 1.3% and place in 55° C water bath to keep in liquid phase 3)Determine the number of sample pairs you will be making (a sample pair consists of one plate control and one plate experimental. I usually made 4 sample pairs or an n of 4. Add one to this, so n of 4 +1 = 5 4)The bottom and top layer solutions are made as one and divided in half. The cell layer solution is made separately. 5)Determine the volume of reagents that make up each of the above solutions according to the following formula: Bottom/Top layer - 2X Iscove's 5ml X n sample pairs (5) = 25 ml FBS - 1ml X n sample pairs (5) = 5ml 100X Glutamine .1 ml X n sample pairs = 0.5 ml 1.3% Noble Agar - 5ml X n sample pairs = 25ml pour these volumes into a 50 ml conical and separate the total volume in 1/2 into one tube for the bottom and the other for the top **Do Not add the Agar until you are just ready to pour, so separate the total (without the agar) into a bottom and top tubes (the volume of agar that will be added to each will be 12.5ml) Cell Layer media - 2X Iscove's 2 X n = 10ml 1X Iscove's 4 X n = 20ml FBS 1 X n = 5ml 100X glutamine 0.08 x n = .4 ml Noble agar 2 X n = 10ml (again do not add this until ready to pour) 6)Pour 12.5 ml of 1.3% Noble agar to the bottom layer tube, mix thoroughly and pipette 2.5 ml to each of 8 plates, place in 37° C incubator 7)Trypsinize cells, collect disattached cells and spin down, rususpend pellet in 5ml of 1X Iscove's + 10% FBS for counting. Determine the conc of cells in cells/ml and then calculate

冀教版五年级科学下册《克隆羊——多莉》教案

冀教版五年级科学下册教案 克隆羊——多莉 教学目标： 能力目标： 1.学会收集资料，能通过各种方法和途径收集到有关克隆技术的发展和基因工程的资料； 2.学会交流和汇报，能够将自己的收获展示给大家，并能够在交流活动中获得他人的信息。知识目标：了解克隆技术的利弊，认识到克隆技术和基因工程对人类社会发展的影响。 情感目标： 1.体会在收集资料过程中的各种困难； 2.学会与人交流，学会与人合作； 3.激发对生物技术发展研究的兴趣和探究的欲望。 教学重点： 通过各种方法和途径收集到有关克隆技术的发展和基因工程的资料； 教学难点： 了解克隆技术的利弊，认识到克隆技术和基因工程对人类社会发展的影响。 教学准备： 教师准备与克隆技术和基因工程相关的资料和图片； 布置学生在课前准备和收集相关的资料。 教学过程： 一、导入课题，进入沙龙 出示“克隆羊---多莉”的图片 介绍多莉的相关资料（包括诞生的时间、特别之处、对世界的影响） 学生提出问题 介绍课的形式，进入沙龙 二、沙龙活动 （一）、走进“克隆” 老师作为主持人组织学生将各自收集到的有关克隆的资料与大家进行交流； 引导学生对各种信息进行整理，并补充不全面的地方。 （二）、亲近“克隆”

提出问题：克隆技术给人类带来了那些影响？ 讨论形式： a.学生与学生展开讨论 b.学生与老师展开讨论 c.个别与集体展开讨论 引导学生归纳对克隆技术的认识。 第二课时 （三）、拓展“克隆”—基因工程 1.学生推举小主持人介绍“科学在线”的内容，和组织学生进行资料的展示； 2.组织开展：对基因工程的讨论 3.汇报自己对基因工程的认识和展望。 三．沙龙结束 教师对本节课做出评价（多方面）； 展望并激发学生的继续研究的兴趣。 相关的资料链接： 1938年：德国科学家首次提出克隆设想。 1952年：科学家开始用青蛙进行克隆实验。 1970年：克隆青蛙实验取得突破，青蛙卵发育成了蝌蚪，但是在开始进食以后死亡。 1981年：科学家进行克隆鼠实验，据称用鼠胚胎细胞培育出了正常的鼠。 1984年：第一只胚胎克隆羊诞生。 1997年2月24日：英国罗斯林研究所宣布克隆羊培育成功。科学家用取自一只6岁成年羊的乳腺细胞培育成功一只克隆羊。 1998年2月23日：英国PPL医疗公司宣布，该公司克隆出一头牛犊“杰弗逊先生”。 1998年7月5日：日本科学家宣布，他们利用成年动物体细胞克隆的两头牛犊诞生。 1998年7月22日：科学家采用一种新克隆技术，用成年鼠的体细胞成功地培育出了第三代共50多只克隆鼠，这是人类第一次用克隆动物克隆出克隆动物。 1999年5月31日：美国夏威夷大学的科学家，利用成年体细胞克隆出第一只雄性老鼠。 1999年6月17日：以美藉华人科学家杨向中为首的研究小组利用一头13岁高龄的母牛耳

冀教科学《克隆羊—多莉》教案

冀教版五年级下科学教案 第二单元生命的延续 10.克隆羊--多莉 教学目标： 能力目标： 1.学会收集资料，能通过各种方法和途径收集到有关克隆技术的发展和基因工程的资料； 2.学会交流和汇报，能够将自己的收获展示给大家，并能够在交流活动中获得他人的信息。 知识目标：了解克隆技术的利弊，认识到克隆技术和基因工程对人类社会发展的影响。 情感目标： 1.体会在收集资料过程中的各种困难； 2.学会与人交流，学会与人合作； 3.激发对生物技术发展研究的兴趣和探究的欲望。 教学重点： 通过各种方法和途径收集到有关克隆技术的发展和基因工程的资料； 教学难点： 了解克隆技术的利弊，认识到克隆技术和基因工程对人类社会发展的影响。教学准备： 教师准备与克隆技术和基因工程相关的资料和图片； 布置学生在课前准备和收集相关的资料。 教学过程： 一、导入课题，进入沙龙 出示“克隆羊---多莉”的图片 介绍多莉的相关资料（包括诞生的时间、特别之处、对世界的影响） 学生提出问题 介绍课的形式，进入沙龙 二、沙龙活动 （一）走进“克隆” 老师作为主持人组织学生将各自收集到的有关克隆的资料与大家进行交流； 引导学生对各种信息进行整理，并补充不全面的地方。

（二）亲近“克隆” 提出问题：克隆技术给人类带来了那些影响？ 讨论形式： a.学生与学生展开讨论 b.学生与老师展开讨论 c.个别与集体展开讨论 引导学生归纳对克隆技术的认识。 （三）拓展“克隆”—基因工程 1.学生推举小主持人介绍“科学在线”的内容，和组织学生进行资料的展示； 2.组织开展：对基因工程的讨论 3.汇报自己对基因工程的认识和展望。 三、沙龙结束 教师对本节课做出评价（多方面）； 展望并激发学生的继续研究的兴趣。 相关的资料链接： 1938年：德国科学家首次提出克隆设想。 1952年：科学家开始用青蛙进行克隆实验。 1970年：克隆青蛙实验取得突破，青蛙卵发育成了蝌蚪，但是在开始进食以后死亡。 1981年：科学家进行克隆鼠实验，据称用鼠胚胎细胞培育出了正常的鼠。1984年：第一只胚胎克隆羊诞生。 1997年2月24日：英国罗斯林研究所宣布克隆羊培育成功。科学家用取自一只6岁成年羊的乳腺细胞培育成功一只克隆羊。 1998年2月23日：英国PPL医疗公司宣布，该公司克隆出一头牛犊“杰弗逊先生”。 1998年7月5日：日本科学家宣布，他们利用成年动物体细胞克隆的两头牛犊诞生。 1998年7月22日：科学家采用一种新克隆技术，用成年鼠的体细胞成功地培育出了第三代共50多只克隆鼠，这是人类第一次用克隆动物克隆出克隆动物。 1999年5月31日：美国夏威夷大学的科学家，利用成年体细胞克隆出第一只雄性老鼠。

软琼脂克隆形成试验

克隆形成试验-软琼脂克隆形成试验 克隆形成率 细胞接种存活率只表示接种细胞后贴壁的细胞数，但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆。而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。由于细胞生物学性状不同，细胞克隆形成率差别也很大，一般初代培养细胞克隆形成率弱，传代细胞系强；二倍体细胞克隆形成率弱，转化细胞系强；正常细胞克隆形成率弱，肿瘤细胞强。并且克隆形成率与接种密度有一定关系，做克隆形成率测定时，接种细胞一定要分散成单细胞悬液，直接接种在碟皿中，持续一周，随时检查，到细胞形成克隆时终止培养。 1、平板克隆形成试验 基本步骤： (1)取对数生长期的单层培养细胞，用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，把细胞悬浮在10%胎牛血清的RPMI1640培养液中备用。 (2)将细胞悬液作梯度倍数稀释，以适当的细胞密度(根据增殖能力)接种于培养皿中。一般分每皿50、100、200个细胞的梯度密度分别接种含10mL 37℃预温培养液的皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。置37℃ 5% CO2及饱和湿度的环境下，静置培养2～3周。 (3)经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。加纯甲醇或1:3醋酸/甲醇5mL，固定15分钟。然后去固定液，加适量Giemsa应用染色液染10～30分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。 (4)将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜(低倍镜)计数大于10个细胞的克隆数。最后计算克隆形成率。 克隆数 克隆形成率= —————×100% 接种细胞数 平板克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。 2、软琼脂培养克隆形成试验 基本步骤： (1)取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞，作活细胞计数，用含20%胎牛血清的DMEM培养液调整细胞密度至1×106细胞/L。然后根据实验要求作梯度倍数稀释。 (2)用蒸馏水分别制备出1.2%和0.7%两个浓度的低溶点琼脂糖液，高压灭菌后，维持在40℃中不会凝固。 (3)按1:1比例使1.2%的琼脂糖和2×DMEM培养基(含有2×抗生素和20%的小牛血清)混合后，取3mL混合液注入直径6cm平皿中(10cm平皿加7～10mL)，冷却凝固，可作底层琼脂置CO2温箱中备用。 (4)按1:1比例让0.7%的琼脂糖和2×DMEM培养基在无菌试管中相混以后，再向管中加入0.2mL的细胞悬液，充分混匀，注入铺有1.2%琼脂糖底层平皿中，逐形成双琼脂层。待上层琼脂凝固后，置入37℃ 5%CO2温箱中培养10～14天。 (5)把平皿放置在倒置显微镜下，观察细胞克隆数。计算形成率。 软琼脂培养法常用检测肿瘤细胞和转化细胞系。试验中琼脂与细胞相混时，琼脂温度不宜超