DNA拓扑异构酶概述

DNA拓扑异构酶综述

摘要：DNA拓扑异构酶为催化DNA拓扑学异构体相互转变的酶之总称，是一种见于真核细胞和原核细胞中的重要生物酶，其对DNA转录、复制、染色体分离及基因表达等过程中的DNA 拓扑结构起着重要的调控作用。研究发现，与正常细胞不同，DNA 拓扑异构酶在肿瘤细胞中表现出不受其他因素影响的高水平表达，而许多抗肿瘤药物的作用机制也与DNA拓扑异构酶密切相关，因此它作为抗肿瘤药物的重要靶点引起了研究者的广泛关注。此外，科学家们还发现拓扑异构酶在神经发育调节上也起着一定的作用，虽然机制还需要进一步研究，但这一发现就有着重要意义。本文对DNA拓扑异构酶的反应、结构、分类及生物功能进行了简要的归纳，介绍了DNA拓扑异构酶抑制剂的研究及分类，并对拓扑异构酶在其他方面上的进展进行了简单的介绍。

关键词：DNA拓扑异构酶拓扑异构酶抑制剂抗肿瘤药物生物功能

DNA拓扑异构酶（topoisomerase）调控DNA超螺旋状态，它是存在于细胞核内的一类酶，参与DNA复制、重组、转录、修复等核内关键作用，它们能够催化DNA链的断裂和结合，从而影响DNA的拓扑状态。真核细胞的拓扑结构由两种关键拓扑异构酶拓扑异构酶I和拓扑异构酶II调节，拓扑异构酶I通过形成短暂的单链裂解-结合循环，催化DNA复制的拓扑异构状态的变化；相反，拓扑异构酶II通过引起瞬间双链酶桥的断裂，然后打通和再封闭，以改变DNA的拓扑状态。哺乳动物中，拓扑异构酶II又可以分为αII型和βII型。拓扑异构酶的应用也很广泛，如现已知这些酶是很多抗肿瘤药物的细胞内靶酶，在肿瘤细胞中，拓扑异构酶的含量高于正常细胞，所以以其为靶点的抑制具有一定特异性，因此对它的研究也越来越重视。

1、DNA拓扑异构酶 I

拓扑异构酶I催化DNA链的断裂和重新连接，每次只作用于一条链，即催化瞬时的单链的断裂和连接，它们不需要能量辅因子如ATP或NAD。E.coliDNA拓扑异构酶I又称ω蛋白，大白鼠肝DNA拓扑异构酶I又称切刻-封闭酶(nicking-closing enzyme )。

DNA拓扑异构酶能催化的反应很多，如DNA拓扑异构酶I对单链DNA的亲和力要比双链高得多，这正是它识别负超螺旋DNA的分子基础，因为负超螺旋DNA常常会有一定程度的单链区。负超螺旋越高，DNA拓扑异构酶I作用越快。现已知道，生物体内负超螺旋稳定在5%左右，低了不行，高了也不行。生物体通过拓扑异构酶I和II的相反作用而使负超螺旋达到一个稳定状态。现已发现，编码E．coli拓扑异构酶I的基因topA发生突变，则会引起旋转酶基因的代偿性突变；否则，负超螺旋增高，细胞生活能力降低。拓扑异构酶I作用的碱基序列特异性不高，但切点一定在C的下游方向4个碱基(包括C本身)的位置。在将DNA 单链切断后，拓扑异构酶I连接于切口的5端，并贮藏了水解磷酸二脂键的能量用以连接切口，因而拓扑异构酶I的作用不需能量供应。此外．拓扑异构酶I还能促进两个单链环的复性，其作用是解除复性过程所产生的链环数的负值压力，以使复性过程进行到底。如果在一个单链环上一个部位切断，而使另一部位绕过切口．则可产生三叶形结构分子 (trefoil knot)。如果有两个双链环，其中一个有一个切刻，拓扑异构酶I则可以将切刻对面的一条链切断，使完整的双链环套进去，再连接起来而成为环连体分子(catenane)。

拓扑异构酶Ⅰ最早是1971 年在大肠杆菌中被发现的，均为单体酶。拓扑异构酶Ⅰ根据

其结构域功能可以划分为 4 个域:C端结构域(C terminal domain)、核心结构域(core domain)、连接子区域(linker domain)和N端域(N-terminal domain)，其中C端结构域、核心结构域在催化活性中起主要作用。在拓扑异构酶Ⅰ的多个活性位点中，Arg488、Arg590、His632和Tyr723为研究比较明确的4个活性位点［7，8］。除Tyr723位于羧基端结构域外，其余三个均位于拓扑异构酶Ⅰ的核心结构域，如下图所示。

（左a：TOPOⅠ晶体结构；右b：TOPOⅠ活性位点）

2、DNA拓扑异构酶II

拓扑异构酶II能同时断裂并连接双股DNA链．它们通常需要能量辅因子ATP。在拓扑异构酶II中又可以分为两个亚类：一个亚类是DNA旋转酶(DNA gyrase )，其主要功能为引入负超螺旋，在DNA复制中起十分重要的作用。迄今为止，只有在原核生物中才发现DNA 旋转酶，另一个亚类是转变超螺旋DNA(包括正超螺旋和负超螺旋)成为没有超螺旋的松弛形式(relaxed form )。这一反应虽然是热力学上有利的方向，但不知道为什么它们仍然像DNA 旋转酶一样需要ATP，这可能与恢复酶的构象有关。这一类酶在原核生物和真核生物中都有发现。

大肠杆菌的拓扑异构酶II除了引入负超螺旋以外．还具有形成或拆开双链DNA环连体和成结分子的能力。II类拓扑异构酶没有碱基序列特异性，它们可以和任何相交的两对双链DNA结合。DNA旋转酶有两个α亚基和两个β亚基。α亚基约105KD，为gyrA基因所编码，具有磷酸二脂酶活性，可为萘啶酮酸(nalidixic acid )所抑制。β亚基约95KD，为graB 基因所编码，具有ATP酶活性，可为新生霉素(novobiocin )所抑制。这两种药物均可抑制野生型大肠杆菌的DNA复制。可见DNA旋转酶为E．coli的复制所不可缺少的。在切断一条DNA双链后，两个a亚基各结合于切口的一个5'端，并贮藏了水解磷酸二酯键而获得的能量，由于该酶的整体性，因而DNA链的四个断头并无任意旋转的可能性。由于酶的别构效应，使完整的双链穿过切口，然后再重新形成磷酸二酯键。β亚基的功能在于水解ATP以使酶分子恢复原来的构象，以便进行下一轮反应。这一点可以用ATP的同系物β,γ-亚氨基ATP代替ATP而得到证实。因为这一同系物不能被DNA旋转酶所水解，但它确能促进第一轮拓扑异构反应，使负超螺旋增加，而妨碍以后进一步的拓扑异构反应。

真核生物拓扑异构酶Ⅱ为同源二聚体，包括的两个亚型拓扑异构酶Ⅱα和拓扑异构酶Ⅱβ分别定位于染色体17q21—22［10］和3p24［11］单拷贝基因编码的二聚体蛋白。拓扑异构酶Ⅱ可划分为三个不同区域:C端域、N 端域(ATP结合域)以及中部功能域（如下图右）。DNA拓扑异构酶的C端域在其对DNA的构象识别方面起主要作用，N端域和中部功能域则为拓扑异构酶的主要活性域，如下图所示。

（左上a：TOPOⅡ结构；右上b：TOPOⅡ活性域）

3、应用（DNA 拓扑异构酶抑制剂---抗肿瘤药物的研究）

3.1 作用原理

对于DNA 拓扑异构酶抑制剂的作用原理，我们可以通过影响拓扑异构酶作用过程的各个阶段来破坏酶的活性。既可以直接作用于DNA，也可以作用于拓扑异构酶，还可以作用于DNA 拓扑异构酶-DNA 断裂复合物，来完成对拓扑异构酶活性的抑制，并最终导致细胞凋亡。抑制剂的作用实际上是使细胞内功能正常的拓扑异构酶转变为导致DNA链断裂的致伤物，而细胞死亡的最终原因可能是由于DNA 链断裂的错误修复或是由于可断裂复合物的形成及稳定存在，激活了细胞内一系列导致细胞程序性死亡的过程。

大体上来说，DNA 拓扑异构酶抑制剂的抑制机理可以分为两种，一种是毒性机理，一种是催化抑制机理。毒性机理是指抑制剂与Topo-DNA 共价复合物形成三元复合物，通过提高Topo-DNA 共价复合物的稳态浓度使拓扑异构酶“中毒”。而催化机理是指抑制剂通过阻滞拓扑异构酶的某一特定功能或催化反应中的某一步骤，进而抑制拓扑异构酶总的催化活性。

3.2 抑制剂类型

而对于拓扑异构酶抑制剂的类型，常用的有：有机小分子作为DNA 拓扑异构酶抑制剂，因其作用的底物不同，可以分为TopoⅠ抑制剂、TopoⅡ抑制剂和TopoⅠ/Ⅱ双重抑制剂，而以TopoⅠ为靶点的抑制剂主要是喜树碱及其衍生物；以TopoⅡ为靶点的抑制剂则较多，根据与底物的作用方式不同，将拓扑异构酶Ⅱ抑制剂分为TopoⅡ毒剂和TopoⅡ催化抑制剂，但迄今发现的TopoⅡ抑制剂大部分为TopoⅡ毒剂，常见的有阿霉素( Doxorubicin) ，VP-16( Etoposide) ，沙尔威辛等；大部分TopoⅠ/TopoⅡ双重抑制剂是TopoⅠ和TopoⅡ的双重毒剂，能同时稳定两种拓扑酶与DNA形成的可断裂复合物，从而抑制拓扑酶的活性。

还有金属配合物作为DNA 拓扑异构酶抑制剂，与有机化合物相比，金属配合物分子结构具有更好的可塑性，容易在配体上引入其他分子活性基团，可以针对不同的底物结合环境进行相应的结构修饰; 而且其丰富的光电磁性质将有助于探索某些复杂的生命过程。然而，虽然发现不少金属配合物具有识别和断裂DNA 功能，但真正在DNA 拓扑异构酶抑制方面的具体应用还非常少，至今仅有为数不多的关于金属配合物抑制DNA拓扑异构酶的研究报道，主要集中在铂类、钌类、金类等金属配合物方面。

其次便是一些铂类配合物作为拓扑异构酶抑制剂，铂类配合物作为研究最早的抗肿瘤药物，一直备受研究者关注。钌类配合物作为拓扑异构酶抑制剂，钌多吡啶配合物具有既为刚性又带手性的八面体构型，水溶性比较好，热力学性质稳定，不易发生配体取代，易于在近生理条件下开展研究，光化学、光物理信息丰富，毒性低，细胞膜透性较好，但目前钌类配合物作为拓扑异构酶抑制剂的抗肿瘤，活性研究仅限于体外研究阶段，需要更进一步对其作用机理等进行详细的研究，以确定其作为抗肿瘤药物的临床可能性。当然，还有其他一些金属配合物作为拓扑异构酶抑制剂，除了铂、钌类金属配合物以外，常见的已用于抗肿瘤药物

研究的还有金、镉、钴、镍等金属配合物，但是关于它们作为拓扑异构酶的抑制剂的报道则很少。

4、展望

从20世纪70年代发现DNA拓扑异构酶晶体结构至今，经过几十年的努力，人们已经

研制出一系列的拓扑异构酶抑制剂作为有效的抗肿瘤药物应用于临床，并对其作用机理做了大量研究。随着肿瘤生物学及相关学科的发展，人们逐渐认识到细胞癌变的本质是细胞信号转导通路的失调导致的细胞无限增殖。研发的重点正在从传统的细胞毒药物转移到针对肿瘤细胞内异常信号系统靶点的特异性新一代抗肿瘤药物。而DNA 拓扑异构酶作为抗肿瘤药物设计的重要靶标，便受到了许多研究者的关注。近年来以拓扑异构酶为靶点的抗癌药物如

阿霉素、表阿霉素、VP16、VM26、喜树碱及其衍生物等，已成为临床化疗方案中的重要药物。但目前仍有许多问题尚待深入研究和探讨，比如多数拓扑异构酶有机抑制剂存在结构复杂、特异性不高、溶解性差、毒性较大等缺点; 有关各类抑制剂与拓扑异构酶或（和）DNA 的作用机制尚不明确; 拓扑异构酶的某些生理功能还不是太确切; 拓扑异构酶引起细胞凋亡过程中相关信号分子的作用、信号转导途径的调控机制及Topo 抑制剂与信号网络的特异性等，抑制所完成的仅是全部过程中的一个必要起始步骤。所以，我们仍需更深一步的研究。

5、其他发现

不久之前，科学家发现，拓扑异构酶对“泛自闭症”有着一定的影响，研究称，一组被称为拓扑异构酶的酶系出现问题会对大脑发育的遗传机制产生重大影响，并可能导致自闭症谱系障碍（ASD）。选择性降低拓扑异构酶活性，会通过影响“转录伸长”降低“长基因”在小鼠和人类神经元中的表达。虽然很多ASD候选基因特别长，但已证实几种ASD候选基因的表达会被拓扑异构酶的抑制降低。这些发现表明，影响拓扑异构酶的化学物质和基因突变（也包括转录机构的其他部分）可能有助于ASD和其他神经发育疾病的发生。而这一研究或许能够最终解释大量的自闭症病例背后的生物学机制。

6、结语

DNA拓扑异构酶是近年来发现的肿瘤化疗的重要靶点。它涉及到抗癌作用的许多环节,如产生可切割的DNA复合物、干扰基因正常转录、抑制DNA合成等，同时还与肿瘤化学预防的靶点细胞诱导分化及蛋白激酶C有关。所以，拓扑异构酶抑制剂的研究，对定向治疗肿瘤有着重要的作用，其中金属配合物有着其独特的优势，我们应该投入更深一步的研究。此外,拓扑异构酶在抗药性、细胞突变及神经发育疾病中的重要作用亦不可忽视。

抗癌药物和拓扑异构酶作用实验具体步骤及详细方法

抗癌药物对ⅡDNA拓扑异构酶作用的实验具体步骤及方法DNA拓扑异构酶在DNA形成环状和超螺旋结构中起重要作用。另一方面在DNA超螺旋结构的松懈、DNA单、双链的断裂以至再连接的过程均有赖于该酶的参与，从而使DNA的复制或重组成为可能，关于抗癌药如烃化剂和非烃化剂，其中许多是以DNA拓扑异构酶为靶点使之形成可断裂的DNA蛋白复合物从而引起DNA损伤，这是近年来发展起来的一个新的研究领域。 一、材料准备 1. 药物制备 （1）将药物溶解于0. mol/l Hepes缓冲液或含10%~20%的二甲基亚砜中或其它助溶剂中。 （2）其它80%~90%为0.1 mol/l Hepes缓冲液，pH6.7，使药物的最终浓度为0.2~0.4 mmol/l。 2. 反应液 （1）反应液体积为24 ul （2）其中包含500 mmol/l Hepes pH6.7，50 mmol/l KCl 100 mmol/l NaCl，0.1 mmol/l EDTA，10 mmol/l MgCl2，0.1 mmol/l ATP，50 ug/ml BSA，0.26ug P4DNA。 二、实验步骤 1. 实验将微量试管分组为 （1）加药管、不加药对照管，已知药（VP-16）对照管和标准管（含不同浓度的酶，根据所用酶的活性定出第一管的酶稀释度，然后依次成倍递减至第四管，第5管不含酶的空白管）。 （2）除空白对照管外将其与全部管中均加入酶液（浓度同标准管第一管的浓度）。

（3）放恒温水浴30 min 即刻用终止液停止反应（终止液：2%sodium dodecyl、20%甘油。0.05%溴酚蓝）。 2. 将以上各管的样本加到1%琼脂糖凝胶上在电泳缓冲液（90 mmol/l tris-boric acid pH8.3和2.5 mmol/l EDTA）中进行电泳，50V过夜。 3. 电泳终了将凝胶膜用溴乙啶染色（30~40 min），此时用紫外灯照射则DNA可显示荧光带。 4. 然后可用吸收度计进行定量测定或用荧光带的长度与个标准管进行对比，亦可获得半定量的结果。 5. 一个酶单位是指在30 min内可使50% 0.26ug超螺旋DNA转变为解旋转的DNA，每个测定是用两个酶单位。 6. Ⅱ型DNA拓扑异构酶的分离制备 （1）人的Ⅱ型酶可用从白血病患者获得，例如慢性淋巴细胞白血病患者的外周白血病细胞中分离。 （2）将分离出的酶再用聚乙二醇纯化，再通过羟基磷灰石柱色谱、肝素-琼脂糖柱色谱和六氨基琼脂糖亲和色谱，使之纯化。 （3）用Coomassie蓝进行染色可见142 000、132 000和114 000 dalton三个区带。 7. P4超螺旋DNA的制备

DNA拓扑异构酶概述

DNA拓扑异构酶综述 摘要：DNA拓扑异构酶为催化DNA拓扑学异构体相互转变的酶之总称，是一种见于真核细胞和原核细胞中的重要生物酶，其对DNA转录、复制、染色体分离及基因表达等过程中的DNA 拓扑结构起着重要的调控作用。研究发现，与正常细胞不同，DNA 拓扑异构酶在肿瘤细胞中表现出不受其他因素影响的高水平表达，而许多抗肿瘤药物的作用机制也与DNA拓扑异构酶密切相关，因此它作为抗肿瘤药物的重要靶点引起了研究者的广泛关注。此外，科学家们还发现拓扑异构酶在神经发育调节上也起着一定的作用，虽然机制还需要进一步研究，但这一发现就有着重要意义。本文对DNA拓扑异构酶的反应、结构、分类及生物功能进行了简要的归纳，介绍了DNA拓扑异构酶抑制剂的研究及分类，并对拓扑异构酶在其他方面上的进展进行了简单的介绍。 关键词：DNA拓扑异构酶拓扑异构酶抑制剂抗肿瘤药物生物功能 DNA拓扑异构酶（topoisomerase）调控DNA超螺旋状态，它是存在于细胞核内的一类酶，参与DNA复制、重组、转录、修复等核内关键作用，它们能够催化DNA链的断裂和结合，从而影响DNA的拓扑状态。真核细胞的拓扑结构由两种关键拓扑异构酶拓扑异构酶I和拓扑异构酶II调节，拓扑异构酶I通过形成短暂的单链裂解-结合循环，催化DNA复制的拓扑异构状态的变化；相反，拓扑异构酶II通过引起瞬间双链酶桥的断裂，然后打通和再封闭，以改变DNA的拓扑状态。哺乳动物中，拓扑异构酶II又可以分为αII型和βII型。拓扑异构酶的应用也很广泛，如现已知这些酶是很多抗肿瘤药物的细胞内靶酶，在肿瘤细胞中，拓扑异构酶的含量高于正常细胞，所以以其为靶点的抑制具有一定特异性，因此对它的研究也越来越重视。 1、DNA拓扑异构酶 I 拓扑异构酶I催化DNA链的断裂和重新连接，每次只作用于一条链，即催化瞬时的单链的断裂和连接，它们不需要能量辅因子如ATP或NAD。E.coliDNA拓扑异构酶I又称ω蛋白，大白鼠肝DNA拓扑异构酶I又称切刻-封闭酶(nicking-closing enzyme )。 DNA拓扑异构酶能催化的反应很多，如DNA拓扑异构酶I对单链DNA的亲和力要比双链高得多，这正是它识别负超螺旋DNA的分子基础，因为负超螺旋DNA常常会有一定程度的单链区。负超螺旋越高，DNA拓扑异构酶I作用越快。现已知道，生物体内负超螺旋稳定在5%左右，低了不行，高了也不行。生物体通过拓扑异构酶I和II的相反作用而使负超螺旋达到一个稳定状态。现已发现，编码E．coli拓扑异构酶I的基因topA发生突变，则会引起旋转酶基因的代偿性突变；否则，负超螺旋增高，细胞生活能力降低。拓扑异构酶I作用的碱基序列特异性不高，但切点一定在C的下游方向4个碱基(包括C本身)的位置。在将DNA 单链切断后，拓扑异构酶I连接于切口的5端，并贮藏了水解磷酸二脂键的能量用以连接切口，因而拓扑异构酶I的作用不需能量供应。此外．拓扑异构酶I还能促进两个单链环的复性，其作用是解除复性过程所产生的链环数的负值压力，以使复性过程进行到底。如果在一个单链环上一个部位切断，而使另一部位绕过切口．则可产生三叶形结构分子 (trefoil knot)。如果有两个双链环，其中一个有一个切刻，拓扑异构酶I则可以将切刻对面的一条链切断，使完整的双链环套进去，再连接起来而成为环连体分子(catenane)。 拓扑异构酶Ⅰ最早是1971 年在大肠杆菌中被发现的，均为单体酶。拓扑异构酶Ⅰ根据

DNA拓扑异构酶

调控DNA的拓扑状态和催化拓扑异构体相互转换的一类酶，这些反应包括超螺旋性的变化和形成结及环链式结构。所有DNA的拓扑性相互转换均需DNA链暂时断裂和再连接。分为Ⅰ型和Ⅱ型。 为催化DNA拓扑学异构体相互转变的酶之总称。催化DNA链断开和结合的偶联反应，为了分析体外反应机制，用环状DNA为底物。在闭环状双链DNA的拓扑学转变中，要暂时的将DNA的一个链或两个链切断，根据异构体化的方式而分为二个型。切断一个链而改变拓扑结构的称为Ⅰ型拓扑异构酶（top- oisomeraseⅠ），通过切断二个链来进行的称为Ⅱ型拓扑异构酶（topoisomeraseⅡ）。属于Ⅰ型的拓扑异构酶，有大肠杆菌的ω蛋白（ω-protein，由分子量11万的单个多肽链所成）及各种真核细胞中存在的切断-结合酶（nicking-closing enzyme，分子量约6万5千—7万的及分子量约10万的）。Ⅱ型拓扑异构酶，有存在于细菌中的DNA促旋酶、噬菌体T4的拓扑异构酶Ⅱ以及真核细胞中依赖ATP的拓扑异构酶Ⅱ等。另外，噬菌体λ的irt基因产物和噬菌体φX174的基因A的产物等也具有切断—结合酶的活性，可认为是拓扑异构酶之一种。Ⅰ型拓扑异构酶不需要ATP的能量而催化异构体化，作为反应的中间产物，在原核生物来说是游离型的5′-OH末端扣3′-磷酸末端与酶形成共价键，而真核生物是3′-OH末端5′-磷酸末端与酶形成共价键。此酯键中所贮存的能量，可能在切断端的再结合上起着作用。Ⅰ型拓扑异构化酶催化的反应有下列各种：使超螺旋DNA 在每一切断—结合反应中，使L数（参见DNA拓扑学异构体）发生一种变化，即松弛（relaxation）（图1）。将互补的单链环状DNA转变成具有螺旋结构的双链环状DNA （图2），使单链DNA打结（topological knot）或解结（图3）。另外在二个环状双链DNA一个分子的一个链切断时，形成链环状二聚体的分子（ca-tenane）。在Ⅱ型拓扑异构酶中，DNA促旋酶可单独催化闭环状DNA产生超螺旋，这是独特的。其它二个型的酶，除可使超螺旋松弛也需要ATP的能量外，还可催化促旋酶的催化反应。真核细胞的拓扑异构酶Ⅰ，参与核小体的形成，细菌的ω蛋白参与转录和某种转位子的插入。促旋酶和T4拓扑异构酶Ⅱ参与DNA的复制和转录过程。

DNA拓扑异构酶概述教学文案

D N A拓扑异构酶概述

DNA拓扑异构酶综述 摘要：DNA拓扑异构酶为催化DNA拓扑学异构体相互转变的酶之总称，是一种见于真核细胞和原核细胞中的重要生物酶，其对DNA转录、复制、染色体分离及基因表达等过程中的DNA拓扑结构起着重要的调控作用。研究发现，与正常细胞不同，DNA 拓扑异构酶在肿瘤细胞中表现出不受其他因素影响的高水平表达，而许多抗肿瘤药物的作用机制也与DNA拓扑异构酶密切相关，因此它作为抗肿瘤药物的重要靶点引起了研究者的广泛关注。此外，科学家们还发现拓扑异构酶在神经发育调节上也起着一定的作用，虽然机制还需要进一步研究，但这一发现就有着重要意义。本文对DNA拓扑异构酶的反应、结构、分类及生物功能进行了简要的归纳，介绍了DNA拓扑异构酶抑制剂的研究及分类，并对拓扑异构酶在其他方面上的进展进行了简单的介绍。 关键词：DNA拓扑异构酶拓扑异构酶抑制剂抗肿瘤药物生物功能DNA拓扑异构酶（topoisomerase）调控DNA超螺旋状态，它是存在于细胞核内的一类酶，参与DNA复制、重组、转录、修复等核内关键作用，它们能够催化DNA链的断裂和结合，从而影响DNA的拓扑状态。真核细胞的拓扑结构由两种关键拓扑异构酶拓扑异构酶I和拓扑异构酶II调节，拓扑异构酶I通过形成短暂的单链裂解-结合循环，催化DNA复制的拓扑异构状态的变化；相反，拓扑异构酶II通过引起瞬间双链酶桥的断裂，然后打通和再封闭，以改变DNA的拓扑状态。哺乳动物中，拓扑异构酶II又可以分为αII型和βII型。拓扑异构酶的应用也很广泛，如现已知这些酶是很多抗肿瘤药物的细胞内靶酶，在肿瘤

细胞中，拓扑异构酶的含量高于正常细胞，所以以其为靶点的抑制具有一定特异性，因此对它的研究也越来越重视。 1、DNA拓扑异构酶 I 拓扑异构酶I催化DNA链的断裂和重新连接，每次只作用于一条链，即催化瞬时的单链的断裂和连接，它们不需要能量辅因子如ATP或NAD。E.coliDNA 拓扑异构酶I又称ω蛋白，大白鼠肝DNA拓扑异构酶I又称切刻-封闭酶(nicking-closing enzyme )。 DNA拓扑异构酶能催化的反应很多，如DNA拓扑异构酶I对单链DNA的亲和力要比双链高得多，这正是它识别负超螺旋DNA的分子基础，因为负超螺旋DNA常常会有一定程度的单链区。负超螺旋越高，DNA拓扑异构酶I作用越快。现已知道，生物体内负超螺旋稳定在5%左右，低了不行，高了也不行。生物体通过拓扑异构酶I和II的相反作用而使负超螺旋达到一个稳定状态。现已发现，编码E．coli拓扑异构酶I的基因topA发生突变，则会引起旋转酶基因的代偿性突变；否则，负超螺旋增高，细胞生活能力降低。拓扑异构酶I作用的碱基序列特异性不高，但切点一定在C的下游方向4个碱基(包括C本身)的位置。在将DNA单链切断后，拓扑异构酶I连接于切口的5端，并贮藏了水解磷酸二脂键的能量用以连接切口，因而拓扑异构酶I的作用不需能量供应。此外．拓扑异构酶I还能促进两个单链环的复性，其作用是解除复性过程所产生的链环数的负值压力，以使复性过程进行到底。如果在一个单链环上一个部位切断，而使另一部位绕过切口．则可产生三叶形结构分子 (trefoil knot)。如果有两个双链环，其中一个有一个切刻，拓扑异构酶I则可以将切刻对面的一

拓扑异构酶I的结构特点及其抑制剂研究进展

拓扑异构酶I的结构特点及其抑制剂研究进展 引言 DNA拓扑异构酶是存在于细胞核内的一类酶，他们能够催化DNA链的断裂和结合，从而控制DNA的拓扑状态。近来的研究表明，在RNA转录过程中，拓扑异构酶参与了超螺旋结构模板的调节。主要存在两种哺乳动物拓扑异构酶，一类叫拓扑异构酶I，一类叫拓扑异构酶II。拓扑异构酶I催化DNA链的断裂和重新连接，每次只作用于一条链，即催化瞬时的单链的断裂和连接，它们不需要能量辅因子如A TP或NAD。 E.coli DNA拓扑异构酶I又称ω蛋白，大白鼠肝DNA拓扑异构酶I又称切刻-封闭酶(nicking-c losing enzyme )。拓扑异构酶II能同时断裂并连接双股DNA链．它们通常需要能量辅因子A TP。拓扑异构酶Ⅰ( topoisomerase, Topo)参与DNA复制、转录、重组、修复等所有关键的细胞核内过程,是抗肿瘤研究的重要靶点,以TopoⅠ为靶点的药物在肿瘤化疗中被广泛应用。目前临床使用或处于临床前研究的拓扑异构酶Ⅰ抑制剂主要分为喜树碱类和非喜树碱类化合物。 1拓扑异构酶I的结构特点（拓扑异构酶I抑制剂研究进展） 1.1 拓扑异构酶I的四个主要结构域 人TopoⅠ为三维晶体结构的单体酶[4],分子量为91ku,共含765个氨基酸,定位于第20号染色体。有限蛋白裂解实验表明,该酶包含4个主要结构域,分别为N端域、核心域、连接子区( linker)和羧基端结构域。其中N端域具有高度正电性,疏水氨基酸很少,不能形成稳定的球形结构域。核心结构域包含了除Tyr723以外的所有活性位点残基。连接子区包含氨基酸636~712,与催化活性无关,但通过Lys650、Arg708与DNA 切割位点下游的核苷酸形成氢键,从而对DNA下游有稳定作用,进而减缓再连接过程。羧基端结构域,包含关键活性位点残基Tyr723,与独立的核心结构域(含氨基酸215-635)重组后可以得到接近全酶的活性。突变实验表明,该区还与TopoⅠ的激酶活性有关。 1.2拓扑异构酶I的活性位点 Stew art通过分析人TopoⅠ与DNA复合物的晶体结构,认为TopoⅠ活性位点内的Arg488,Arg590与DNA骨架上磷酸二酯键的一个非桥连氧原子形成氢键,另一个非桥连的氧原子与His632末端Nε2氧原子形成氢键,从而稳定五价配位的催化中间体。然而, Tyr723羟基0.4 nm内没有发现可作为广义碱的侧链原子。最近,切割位点21位为胞嘧啶的TopoⅠ与DNA的非共价复合物Topo70晶体结构测定结果表明,距Tyr723羟基0.23 nm处存在一个水分子,与Arg590的胍基形成较强的氢键作用(距离为0.25 nm),这很可能就是活化Tyr723羟基的特异碱。在该晶体结构中,还发现磷酸基团旋转约75°,使得Lys532可以与一个非桥连氧原子形成氢键。这提示Lys532是继Arg488、Arg590、His632和Tyr723后发现的第5个活性位点功能残基[5]。 2拓扑异构酶I的作用机理 在DNA的复制、转录等过程中,TopoⅠ的酪氨酸残基与DNA的3′末端以磷酸二酯键结合,形成TopoⅠ-DNA可裂解复合物,介导DNA单链断裂,使超螺旋得到松弛,然后再将已断裂的DNA连接起来[1]。肿瘤细胞中TopoⅠ含量及活性远高于正常体细胞,抑制TopoⅠ-DNA可裂解复合物解离,就能选择性抑制肿瘤细胞的快速增殖,进而杀死肿瘤细胞, TopoⅠ由此成为公认的抗癌药作用靶点。TopoⅠ抑制剂并非单纯抑制该酶的催化活性,还可通过与TopoⅠ-DNA可裂解复合物可逆结合,形成抑制剂-TopoⅠ-DNA三元复合物,阻止DNA重新连接,致使复制不能进行下去,从而使细胞死亡。

拓扑异构酶

拓扑异构酶 2006_01 译者：高丽华（农科院生物所） 每个人的细胞里都包含有约2 米长的DNA 分子，并且折叠起来储存在比自己小一百万倍的细胞核里。你可能会质疑，如此又长又细的DNA 分子怎么可能就这么容易地缠绕拥挤在细胞核里。更让人疑惑不解的是，DNA 是一个双链超螺旋结构，它必须解链成松散状态才能获得遗传信息。如果你曾经试图解开拧成一根绳子的两个单独的纤维，那么你就会明白这个棘手的问题，你的细胞里有几种不同类型的拓扑异构酶用来解开松弛的DNA 单链。释放DNA I 型拓扑异构酶用来解决DNA 螺旋缠绕和释放过程中造成的张力，具体例子请看la36。该酶缠绕在DNA 链上，切开一条DNA 链。之后，缠绕受损的位点，该酶迫使螺旋旋转，释放每一个正超螺旋或负超螺旋。一旦DNA 变得松弛，DNA 拓扑异构酶将重新连接断开的链，恢复DNA 的双螺旋结构。 解开DNA Ⅱ型拓扑异构酶展示于下一页，专门断裂核内DNA。例如，当细胞进行分裂时，它需要将

每个染色体的两个拷贝分离开。在这个过程中，两个姊妹染色单体的一部分会相互可能缠绕在一起，但是他们是独立存在的。II 型拓扑异构酶通过允许一个DNA 螺旋穿过另一个螺旋解决了这个问题。它切断DNA 双螺旋两条链，牢牢缠绕着两条断链。然后，它通过断链见的间隙，通过其他DNA。最后，重新连接断头，恢复的DNA 的超螺旋结构。 毒素和治疗 DNA 松弛和解旋过程是DNA 进行正确的维护所不可缺少的，所以拓扑异构酶对毒素非常敏感。如果拓扑异构酶被阻断，细胞将在DNA 转录和细胞分裂过程中遇到问题。癌症化疗利用了这一点，使用药物，使拓扑异构酶失活，杀死快速分裂的癌细胞。例如，广泛使用的蒽环类药物，如阿霉素和柔红霉素，可以攻击II 型拓扑异构酶，以及植物毒素喜树碱块类阻止I 型拓扑异构酶对DNA 的松弛作用。 II 型拓扑异构酶 II 型拓扑异构酶具有断裂DNA 双螺旋结构的功能，通过一个间隙穿过另一个螺旋，并释放其后面的DNA 双螺旋结构。这张图片展示出的是两个PDB 图片：1bgw 具有拓扑异构酶的下部分的结构域，1ei1 是一个旋转酶，它是拓扑异构酶的上部分的结构域。人们认为拓扑异构酶是高度动态的结构，具有多个结合位点来结合DNA 进入DNA 的大小沟。两个酪氨酸以红色显示，切割DNA 链，并与切割的DNA 链形成共价键，紧紧地缠绕在一起，直到DNA 恢复原来的双螺旋结构。