自由基及检测方法

ESR

电子顺磁共振（EPR）或称电子自旋共振（ESR）现象最早发现于1944年。它利用具有未成对电子的物质在磁场作用下吸收电磁波的能量使电子发生能级间的跃迁的特征，对顺磁性物质进行检测与分析。

自旋捕集方法是将不饱和的抗磁性化合物（自旋捕集剂）加入反应体系,与反应体系中产生的各种活性高、寿命短的自由基结合形成相对稳定的自旋加合物,以适于ESR检测其原理是利用适当的自旋捕捉剂与活泼的短寿命自由基结合,生成相对稳定的自旋加合物,可以用电子自旋共振波谱法检测自旋加合物的数量,利用自旋加合物的数量来计算原来自

由基的多少。

H：

V：

ESR测自由基是怎么被检测的（细胞，组织，溶液？体内，体外？）

(MGD)2 - Fe 2 +,是含有10mmol·Ｌ- 1MGD 和2mmol·Ｌ- 1FeSO4的溶液。

体外捕集：处死后取组织（血液、细胞），加入捕集剂，ESR测定

体内捕集：腹腔注射捕集剂，处死取组织（血液、细胞），ESR测定

腹腔注射几乎没有检测到自由基信号，或者信号很弱，而处死后样品加捕获剂则可以检测到自由基信号。

通用捕获剂

典型的自旋捕捉剂是亚硝基化合物或氮氧化合物，把足够量的自旋捕捉剂加入到产生自

由基的体系中，自旋捕获剂就会快速地和任何出现的自由基反应，最后给出稳定的可检测的

氮样氧自由基加合物。所形成的自由基加合物的ESR 谱上有被捕自由基基因给出的超精细

分裂,可鉴别被捕自由基通用自旋捕获剂所形成的自由基加合物对自由基结构变化相当敏

感，

ESR 技术检测O-2

O-2可以与1，2-二羟基苯-3，5-二磺酸钠(Tiron)(钛铁试剂)快速反应生成一种称之为“Tiron 半醌自由基”的自旋加合物，比较稳定，可在室温下应用电子顺磁共振波谱仪(EPR)进行检测，从而解决了生理条件下水溶液中寿命极其短暂的O-2·的定性和定量问题

ESR 技术检测·OH

DMPO作自由基捕获剂对自由基结构变化相当敏感,可以提供自由基结构的详细信息。

它与·OH产生的自旋加合物的ESR谱表现出特别容易识别的特征谱线。在溶液中容易形成

的自我捕集产物二聚体自由基不会干扰实验结果。

ESR 技术检测血红蛋白结合的一氧化氮

在组织或血液中，一氧化氮大多与氧或过渡金属反应生成了硝酸盐或亚硝酸盐以及一氧

化氮与金属的配合物。一氧化氮与血红蛋白的结合速率常数非常高，而且能够得到有特征的ESR 波谱。利用这一性质，我们可以用血红蛋白作为一氧化氮的捕集剂检测一氧化氮自由

基。但是，HbNO 极易氧化，这就限制了这种方法在富氧条件下的应用。

ESR 技术检测生物体系产生的一氧化氮

一氧化氮与含金属蛋白反应产生的亚硝酰的金属配合物，往往会抑制细胞中许多重要的酶，对细胞产生毒害作用。目前应用较多的捕集剂的有Fe2+- (DETC)2，它可与一氧化氮形成稳定的单亚硝酰-铁配合物MNIC，给出特征的ESR 波谱。但由于Fe2+-( DETC)2不溶

于水，在一定程度上限制了它的使用。铁配合物捕集一氧化氮的最新进展得益于Komarov

等人的研究，他们使用DETC 的衍生物MGD，与亚铁离子合成稳定的亲水性配合

( MGD)2- Fe2+，该配合物易溶于水( MGD)2-Fe2+非常适合捕集检测活细胞或组织中放的一

氧化氮。但MNIC-DETC为疏水性物质，MNIC-MGD 为亲水性物质; MNIC-DETC 可附

着于细胞膜甚至进入细胞，而MNIC-MGD 不能进入细胞。因此，根据其各自的特性，实

验中应选取不同的捕捉剂。

分光光度法

概念：是利用物质所特有的吸收光谱来鉴别物质或测定其含量的一项技术。

特点：灵敏度高、精确度高、操作简便、快速。对于复杂的组分系统，无须分离即可检测出

其中所含的微量组分的特点。

原理：利用自由基使显色剂发生颜色变化, 根据吸光度的变化值而间接测得自由基的含量

1、羟基自由基

1．1 水杨酸法

, ·OH氧化水杨酸得到 2 , 3-二羟基苯甲酸, 用其在510 nm 处的Fenton 反应产生·OH

的量成正比。

的多少, 吸光度值与·OH

吸光度值表示·OH

1．2 细胞色素 C 氧化法

能使还原型细胞色素C(浅红色)氧化成氧化型细胞色素C(浅黄色) 通过

其反应机理为·OH

的含量。

测定反应体系中吸光度的减少量(550 nm) , 间接测得·OH

1．3 脱氧核糖法

采用Fe3 +-EDTA-抗坏血酸-过氧化氢体系产生·OH。此方法中脱氧核糖作为·OH

的攻击目

攻击后裂解, 在酸性、加热的条件下可与硫代巴比妥酸反应生成红色

标。脱氧核糖受·OH

的含量。

化合物。可根据在532 nm 处测定的吸光度值来间接反映·OH

1．4 DMSO

羟自由基氧化DMSO生成的甲醛与2,4-二硝基苯肼（DNPH）反应在碱性条件下生成

稳定的酒红色腙类物质，其最大吸收波长为390nm，分光光度法测定其含量可间接测定羟

自由基的生成量。

1.5氧化褪色分光光度法

亚甲兰(MB)、二甲基亚砜（DMSO）、溴邻苯三酚红(BPR)、茜素紫、邻二氮菲-Fe2+

·OH使邻二氮菲-Fe2+氧化为邻二氮菲-Fe3+, 使邻二氮菲-Fe2+ Fenton 反应产生·OH,

的能

在536 nm 处的最大吸收峰消失。根据536 nm 处吸光度变化判断受试物清除·OH 力。需要注意的是, 测定时加样方法对结果有重要影响, 需先将邻二氮菲、PBS 及水混

匀, 并且每管加入FeSO4后立即混匀, 否则会使局部颜色过浓, 影响结果的重复性。

2、超氧自由基

超氧自由基的分光光度法测定, 最常用的方法有细胞色素 C 的超氧自由基还原法和

硝基四氮唑蓝(nitro bluetetrazolium , NBT) 还原法。

具有氧化活性的细胞色素C被O2-还原后, 形成了在波长550 nm 处有强吸收的亚

铁细胞色素, 可以用于O2-的测定。但是, 细胞色素C还原法的体系中如果存在着其他还

原性物质便会对结果造成干扰, 如还原性酶的干扰。

NBT 在O2-的作用下, 还原生成不溶于水、蓝色的二甲臜(Diformazan), 它的最大吸

收波长560 nm , 吸光系数达10000 以上, 测定灵敏度相当高。

肾上腺素氧化法以肾上腺素氧化为肾上腺素红作为O2-生成的指标。测定310 nm处肾

上腺素红的产量可间接测出反应体系的O2-含量。该法操作简便, 而且灵敏度可以设法增

加, 但干扰因素较多。

在羟胺氧化法中O2-可氧化羟胺生成亚硝酸根,在酸性条件下, 亚硝酸与氨基苯磺酸和N2甲奈基二氨基乙烯反应生成红色化合物, 后者在530 nm 处有最大吸收峰,测定在530 nm 处的吸光度变化, 可以间接的反映O2-的含量, 但是该方法存在一定的缺点, 如甲萘胺溶液不稳定、空白值较大等。

3、NO

Griess 试剂由磺酸( sulpheilic acid) 和萘乙二胺组成。在酸性条件，这一试剂可以与

亚硝酸盐反应生成红色物质在545 －-555 nm 有一个最大吸收。可以用分光光度计检测。Griess 试剂法最大的优点是简便易行，通常只需要将试剂加入待测的样品中即可。但是这

种简单做法在生物体系中却常常不能准确反映一氧化氮的生成量。因为一氧化氮会发生反

应，并依环境及时间按一定比例生成亚硝酸盐或硝酸盐。另外，某些生物体系如血液，尿液及体液中本身就存在一定浓度的硝酸盐和亚硝酸盐，这就需要使传统的Griess 法与新的技术相结合，增加灵敏度并同时检测硝酸盐及亚硝酸盐的含量

4、CAT

CAT作用于底物中过氧化氢,使过氧化氢分解成水和氧气,体系中残留的过氧化氢再与钼

酸胺作用生成黄色复合物,其呈色的深浅可用分光光度计进行测定,从而反应出过氧化氢酶活性,是一个简易快速及精确的检验方法。

5.SOD

5.1 细胞色素C还原法

细胞色素C还原法(McCord法)：原理是黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶体系中产生的O2-使一定量的氧化型细胞色素C还原为还原型细胞色素C，后者在550nm有最大光吸收。在SOD 存在时，由于一部分O2-被SOD催化而歧化O2-还原细胞色素C的反应速度则相应减少，

即其反应受到抑制。将抑制反应的百分数与SOD浓度作图可得到抑制曲线，由此计算样品

中SOD活性。本法是间接法中的经典方法，但本法灵敏度较低。

5.2 NBT法

O2-可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收。而SOD可清除O2-，从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反

之酶活性愈高。一个酶活力单位定义为将NBT的还原抑制到对照一半（50％）时所用的酶量。

5.3邻苯三酚自氧化法

利用邻苯三酚在碱性条件下能迅速自氧化，释放出O2-，生成带色的中间产物。反应开

始后先变成黄绿色，几分钟后转为绿色，最后转变为黄色。黄绿色产物在325nm处测定溶液的吸光度。加入酶液使O2-歧化，产生O2和H2O2,是中间产物不能累积。酶活性单位采

用1mL反应液中每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%时的酶定量为一个活力单位。邻苯三酚自氧化速率随其浓度的升高而增加。

6、GSH-Px

谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）是机体内广泛存在的一种重要的过氧化物分解酶。

GSH-Px的活性中心是硒半胱氨酸，其活力大小可以反映机体硒水平。硒是GSH-Px酶系的组成成分，它能催化GSH变为GSSG，使有毒的过氧化物还原成无毒的羟基化合物，从

而保护细胞膜的结构及功能不受过氧化物的干扰及损害。

谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）是体内存在的一种含硒清除自由基和抑制自由基反应

的系统。对防止体内自由基引起膜脂质过氧化特别重要，其活力以催化GSH氧化的反应速度，及单位时间内GSH减少的量来表示，GSH和5,5’-二硫对硝基苯甲酸（DTNB）反应在GSH-Px催化下可生成黄色的5-硫代2-硝基苯甲酸阴离子，于423nm波长有最大吸收峰，测定该离子浓度，即可计算出GSH减少的量，由于GSH能进行非酶反应氧化，所以

最后计算酶活力时，必须扣除非酶反应所引起的GSH减少。

总体上来说, 分光光度法操作简单, 费用少, 仪器设备价格低廉, 但存在检测的灵敏度

较低, 检测限较高, 专一性不强等缺点。

分光光度如何定量

根据朗博（Lambert）-比尔（Beer）定律：A=abc

式中A为吸光度，b为溶液层厚度（cm），c为溶液的浓度（g/dm3），a为吸光系数。

其中吸光系数与溶液的本性、温度以及波长等因素有关。

化学发光法（CL）

化学发光的原理是发光剂被自由基氧化成激发态，反应物或产物分子从中获得能量的电

子激发，形成电子激发态, 当返回基态时, 以发射光子的形式释放能量, 这一过程称为化学发光(CL) 。

常用的发光试剂鲁米诺（氨基苯二酰一肼）和光泽精（N，N二甲基二吖啶硝酸盐）

鲁米诺可检测活性氧（氧、H2O2、O-2、·OH）、LPO、NO

在碱性溶液中(p H 10 左右) , 首先形成单价阴离子, 然后在催化剂, 如酶, Fe2 +, Co2 +, Ni2 +和Cu2 +等过渡金属离子或者金属络合物的催化下与溶液中的溶解氧或者过

氧化氢发生氧化还原反应, 生成激发态的两价阴离子氨基肽酸盐(APD) ,APD 经非辐射性跃迁回到基态时, 放出光子。检测光的强度就可以确定自由基含量。

光泽精对O-2有特异性

在碱性条件下, 光泽精与O-2等过氧化物作用形成激发态N2甲基吖啶(N2methylacridan) 。利用光泽精化学发光法也可检测细胞线粒体内特定种类的自由基: 光泽精通过其本身的正电荷与线粒体内膜上负电荷之间的作用通过线粒体膜线粒体内膜后

首先被还原成单价光泽精自由基, 然后光泽精自由基与O-2反应生成不稳定的中间物并分

解出激发态分子, 激发态分子跃迁到基态的过程中释放光子, 通过微弱发光仪测定发光强度, 以此间接测定O-2的生成及数量。但是在实际应用中, H2O2 的分解过程同样会产生自由基, 可能会影响结果的准确性。

O2- ·　

臭氧测NO

臭氧与一氧化氮反应速度极快，发光强大。基于一氧化氮和臭氧反应原理的化学发光检

测灵敏度高，但是只能检测气相体系的一氧化氮，目前很多实验作了种种改进，也可检测液相中的一氧化氮，甚至将硝酸盐及亚硝酸盐还原为一氧化氮来检测。

NO+O3→NO2·　NO2·→NO2+h

化学发光法是一种灵敏、准确检测自由基的方法。与ESR和HPLC法相比，具有操作简便、设备成本较低、测定快速等优点。

化学发光法缺点（评价）

缺点：但是在进行复杂样品分析的时候，由于发光体系的选择性很差，不能对待测组分很好

的定性，是其在实际应用中受到了很大限制。

优点：化学发光法是一种简便、快速、灵敏的痕量分析方法。对于成分简单的样品，通过标

准曲线法、标准加入法等可以直接对待测组分进行很好的定量分析。

需要注意的是：不同的反应体系需要不同的PH条件。

荧光分析法

荧光探针法

原理：荧光探针法测定技术的核心是荧光探针, 探针本身应该没有荧光或只有很弱的荧光, 能很容易通过细胞膜, 但在细胞或细胞器内被自由基氧化后发出较强的荧光。

常用的荧光探针有 2 ,7-二氯荧光黄乙酰乙酸（DCFH-DA）、DAF-FMDA 、双氢罗丹明123 (DHR) 、二氢乙锭(DHE) 等

可检测O2- 、· OH和NO

DCFH-DA具有亲脂性, 很容易通过细胞膜, 进入细胞后在细胞内脂酶的作用下脱去乙酸

盐基团成为有极性的DCFH , 但DCFH不产生荧光, 细胞胞浆中的氧化物能够氧化DCFH 为能发出很强荧光的 2 ,7-二氯荧光素(DCF) ,激发波长为488nm,发射波长为525nm。DCF 形成量与细胞氧化物水平成正比例关系, 因此, 其荧光强度间接代表细胞

内过氧化物的水平。

可检测：O2- ·、OH ·

DAF-FMDA可以穿过细胞膜(cell-permeable)，进入细胞后可以被细胞内的酯酶催化形成

不能穿过细胞膜的DAF-FM。DAF-FM本身仅有很弱的荧光，但在和一氧化氮反应后可以

产生强烈荧光，激发波长为495nm，发射波长为515nm。

可检测：NO

DHR本身没有荧光，它被氧化后（与单线态氧结合）就生成具有强荧光性质的RH。

使用DCFH-DA 与DHR 时,仪器的激发波长488 nm , 发射波长在525 或530 nm 左右。测胞浆内自由基, 往往用DCFH-DA 探针; 而测线粒体内的自由基, 则常用DHR 作荧光探针。

可检测：O2-、·OH

DHE能自由透入细胞内被O2-直接氧化成溴化乙锭(EB) , EB 的荧光强度与O2-浓度成正比, 从而间接反映O2-的含量。使用HE时, 仪器的激发波长488 nm , 发射波长在610 或650 nm 左右

可测：O2-

任何可以检测fluorescein的仪器，包括荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、流式细胞仪、荧

光分光光度计或荧光酶标仪都可以用于该荧光探针的检测。

2-吡啶甲醛苯并噻唑啉只能被O2-氧化，而共存的双氧水和羟基自由基都不能使其在测定波

长下的荧光发生变化，所以探针试剂对O2-具有专一性。

直接检测方法,它是利用激光照射·　OH使其发出特征激光诱导荧光成像法是目前惟一的·OH

荧光,用特殊相机记录荧光密度,从而测算被测分子基团浓度。

荧光光度法

用荧光光度法来检测自由基的含量时, 使用的捕获剂在捕获自由基后会发生荧光强度

的变化。

利用物质吸收较短波长的光能后发射较长波长特征光谱的性质，对物质定性或定量分析

的方法。可以从发射光谱或激发光谱进行分析。

LPO

可以检测：·OH、

在常见的捕获剂中, 荧光强度减弱的捕获剂有Ce3 +、罗丹明6G、水杨基荧光酮, 而荧光增强的有苯甲酸、Hantzsch 反应等, 下面就分别从这两方面介绍常见捕获剂的应用。

1．1 荧光减弱的捕获剂

方光荣等研究了OH ·与Ce3 +的反应, 表明在酸性条件下, 有强荧光的Ce3 +被氧化生成无荧光的Ce4 +。测定反应前后荧光强度的下降可间接测定羟基自由基的含量, 该方法可作为筛选抗氧化剂的方法。

碱性介质中罗丹明6G能产生特征荧光, 其最大激发波长和发射波长分别为350和550 nm , Mn 2 +-H2O2体系在碱性介质中产生的羟自由基可以迅速氧化罗丹明6G使其荧光猝灭, 如果存在抗氧化物质可以清除羟自由基, 便会使溶液的荧光猝灭程度降低, 据此建立了测定抗氧化活性的方法。

任凤莲等人的实验发现Co2 +与H2O2反应生成羟自由基的产率比Fenton 试剂高100 倍以上。采用水杨基荧光酮(SAF)-Co 2 +-H2O2荧光法测定羟自由基的新体系, 激发波长和发射波长为510 和500 nm , 测定体系在反应前后的荧光变化,可间接测定羟自

由基的产生量。

除了这几种常见的捕获剂外, 还有一些研究者采用了其他的试剂, 荧光素钠本身能产

生特征荧光, 其激发波长和发射波长分别为491 和512nm。

在碱性介质中, Mn 2 +-H2O2体系产生的羟自由基可以迅速氧化荧光素钠使荧光猝

灭。张爱梅等提出检测Fenton 反应产生羟自由基的方法。羟自由基与吖啶红发生反应后, 吖啶红的荧光强度减弱, 测定其荧光强度的变化, 可间接测定羟自由基的产生量。

1．2 荧光增强的捕获剂

谷学新等利用Fenton 反应产生的羟基自由基氧化DMSO 生成的甲醛与乙酰丙酮、

氨发生Hantzsch 反应, 产物 3 ,5-二乙酰-1 ,4-二氢吡啶产生特征荧光, 其最大激发波长和最大发射波长分别为491 和512 nm。通过测定荧光强度的变化可以间接定量测定

羟基自由基的产生量。

荧光光度法可以定量

A=cl 、l为常数，可以根据所得的A计算出 c

激发波长，荧光波长

激发波长：仪器给出的激发光波长

荧光波长：样品被激发光照射后，发出荧光的波长

CE 铈shì

HPLC

HPLC法测定需要先用捕捉剂捕获自由基，捕捉剂应能与自由基反应形成稳定的结合

物，且易于分离与检测。一般的·OH捕捉剂是安息香酸/水杨酸(SA)、苯二甲酸、二甲亚砜(DMSO)等。·OH与二甲基亚砜反应生成甲磺酸,可以通过HPLC来测定其含量,从而推测·OH 的含量。

这种方法具有测量方便,高效,灵敏度高,检测限可达10-9~10-11g等优点，但是,又因为它需要昂贵的设备并且反应过程比较复杂,有很多的中间产物与支线产物,所以在自由基的准

确定量检测上,仍显不足。

HPLC定性定量

定性：用“标样”的保留值定出被测组分的位置。

定量：定量分析的具体内容：确定样品的类型，主要成分/痕量成分；使分析条件的分离度（R）大于1.5；色谱峰的定性，峰一致性测定；检测限及定量限（确定灵敏度及线性范围）；用标样建立标准曲线

常用的定量方法：

1.峰面积百分比法：由于检测技术的影响，在液相色谱中不常

公式：C%=（A i/∑A i）*100%

特点：各组分要全部流出、全部被检测，并对检测器的响应值一样简单，液相色谱目前很难

做到这点；与进样量无关；不需标样；简单

2.外标法：在液相色谱中用的最多

配制一系列已知浓度的标样

计算公式：校正因子：RF（xi）=标样浓度C（X i）/ 标样响应值R（X i）

未知组分的浓度：C i=RF（Xi）* 样品响应值A i

特点：无需各组分都被检出、洗脱；需要标样；标样及样品测定的条件要一致；进样体积要

准确

3.内标法：准确，但是麻烦；在标准方法中用的最多

配制一系列浓度的标样，其中加有内标样

计算公式：

校正因子：RF（xi）=内标样响应值R（I.S）/标样响应值R（X i）*标样浓度C（X i）

未知组分的浓度：C i=RF（Xi）*（样品峰面积A i/内标峰面积A i.s）

特点：无需各组分都被检出、洗脱；需要标样，需要内标样；结果与进样体积无关

自动电位滴定法

电位滴定法与直接电位法的不同在于，它是以测量滴定过程中指示电极的电极电位（或

电池电动势）的变化为基础的一类滴定分析方法。滴定过程中，随着滴定剂的加入，发生化

学反应，待测离子或与之有关的离子活度（浓度）发生变化，指示电极的电极电位（或电池

电动势）也随着发生变化，在化学计量点附近，电位（或电动势）发生突跃，由此确定滴定

的终点。

在滴定管末端连接可通过电磁阀的细乳胶管，此管下端接上毛细管。滴定前根据具体的滴定对象为仪器设置电位（或pH）的终点控制值（理论计算值或滴定实验值）。滴定开始

时，电位测量信号使电磁阀断续开关，滴定自动进行。电位测量值到达仪器设定值时，电磁阀自动关闭，滴定停止。

现代的自动电位滴定已广泛采用计算机控制。计算机对滴定过程中的数据自动采集、处理，并利用滴定反应化学计量点前后电位突变的特性，自动寻找滴定终点、控制滴定速度，到达终点时自动停止滴定，因此更加自动和快速。

其原理是: 以过量的Fe2+与羟基自由基反应, 然后用重铬酸钾返滴剩余的Fe2+, 进而可以计算出羟基自由基浓度。自动电位滴定法以铂电极为指示电极, 双盐桥饱和甘汞电极作

为参比电极, 根据滴定过程中化学计量点附近的电位突跃来确定电位滴定终点, 并记录化学计量点电位值E0。锁定此电位值后, 由仪器完成待测样品的自动滴定过程。

滴定过程中的主要反应式:

H++Fe2++·OH→Fe3++H2O

Cr2O72-+6Fe2++14H+→6Fe3++2Cr3++7H2O

由于电位滴定中所测得是相对电位变化, 而不是绝对值, 所以在直接电位法测量中的一

些影响因素,可以忽略不计, 另一方面由于终点电位突跃变化大,测定中标准电位不稳定所引

起的滴定误差是很小的,这就容易得到准确的结果, 特别是对测定较高浓度的样品, 其优点更为明显。

自动电位滴定法评价

将电化学分析和氧化还原法结合起来，与氧化还原滴定相比，自动电位滴定由于不受指

示剂以及人为判断滴定终点的影响，操作过程中误差小，分析结果准确度高、稳定性好。

该方法终点判断简单、操作简单、测定快速、成本低廉，可作为一种简便易行的测定羟自由

基浓度的方法。

极谱法

极化电极（滴汞电极）通常和极化电压负端相连，参比电极（甘汞电极）和极化电压正

端相连。当施加于两电极上的外加直流电压达到足以使被测电活性物质在滴汞电极上还原的

分解电压之前，通过电解池的电流一直很小（此微小电流称为残余电流），达到分解电压时，被测物质开始在滴汞电极上还原，产生极谱电流，此后极谱电流随外加电压增高而急剧增大，

并逐渐达到极限值（极限电流），不再随外加电压增高而增大。这样得到的电流-电压曲线，称为极谱波。极谱波的半波电位E1/2是被测物质的特征值，可用来进行定性分析。扩散电

流依赖于被测物质从溶液本体向滴汞电极表面扩散的速度，其大小由溶液中被测物质的浓度

决定，据此可进行定量分析。

·OH氧化二甲亚砜（DMSO），生成的甲醛和乙酰乙酯和氨发生Hantzsch反应，反应产物3,5-二乙氧基羰基-2,6-二甲基-1,4-二氢吡啶在-1.09V（对饱和甘汞电极）处有一灵敏

的二阶导数极谱峰。通过电流变化可间接测定·OH产量，可用于筛选自由基清除剂和在线

测定·OH。此法灵敏度高、操作简便。

羟基自由基的测定方法

羟基自由基(.OH)是最活跃的一种活性分子，也是进攻性最强的化学物质之一，几乎可以与所有的生物分子、有机物或无机物发生各种不同类型的化学反应，并伴有非常高的反应速率常数和负电荷的亲电性。羟基自由基是目前所知活性氧自由基中对生物体毒性最强、危害最大的一种自由基，可以通过电子转移、加成以及脱氢等方式与生物体内的多种分子作用，造成糖类、氨基酸、蛋白质、核酸和脂类等物质的氧化损伤，使细胞坏死或突变，羟基自由基还与衰老、肿瘤、辐射损伤和细胞吞噬等有关。羟基自由基由于其寿命短，反应活性高，存在浓度低，目前尚未有专一、有效的方法可以精确测定羟基自由基的含量，其测定方法也成为一项国际性的难题。本文对近几年出现的羟基自由基检测方法进行了综述。 1电子自旋共振法 电子自旋共振法或电子顺磁共振法主要研究对象为未成对的自由基或过渡金属离子及其化合物。自旋捕捉(spin trapping)技术的出现为化学反应中自由基中间体及生命活动过程中短寿命自由基的检测开辟了新的检测途径[[1]]。此方法是利用捕捉剂与自由基结合形成相对稳定的自旋加合物(spin adducts)，然后进行ESR测定。 2HPLC法 HPLC法可用于间接测定自由基。测定过程中必须先选择合适的化合物捕集被测体系中的自由基，使之生成具有一定稳定性，且能被液相色谱分离与检测的产物，然后用HPLC进行测定。1）、采用二甲基亚砜捕集羟基自由基的HPLC测 2）、采用水杨酸捕集羟基自由基的HPLC测定方法 3化学发光法 化学发光法是一种灵敏、准确的检测自由基的方法，其原理是利用发光剂被活性氧自由基氧化成激发态，当其返回到基态时放出大量光子，从而对发光起放大作用。且自由基产生越多，发光值就越大。通过函数换算间接反应系统中自由基的量。与ESR和HPLC法相比，具有操作简便、设备成本较低、测定快速等优点。4氧化褪色光度法 6极谱法 7毛细管电泳-电化学检测法 8胶束电动毛细管色谱法

羟基自由基清除注意事项

一般而言，对于Fenton试剂与有机化合物氧化能力的影响因素大致上可分为： A.亚铁离子浓度。 B.过氧化氢浓度。 C.溶液于反应时的反应温度。 D.溶液中的pH值。 以下将对此四项变因做详细的探讨： A.亚铁离子浓度的影响 在Fenton试剂的反应中，亚铁离子主要是扮演着催化过氧化氢的角色。因此，若溶液中没有亚铁离子当触媒，则其溶液可能就没有氢氧自由基的生成。所以，大致上分解反应会随亚铁离子的浓度增加而加快，亚铁添加量会影响脱色效率，亚铁剂量愈高效果愈佳，此原因为增加亚铁剂量将使氧化反应更加完全并且可产生混凝机制而进行脱色(26)。但亚铁离子本身会与有机物形成竞争，亚铁离子浓度过高会增加氢氧自由基的消耗，反而造成处理效果的下降，反应式如下： Fe2+ + ·OH Fe3+ + OH- 故当浓度到达某一定值时，则其分解速率便不会在随着亚铁离子浓度的增加而持续加快，且亚铁离子浓度和生成物的比值也将可能会影响生成物的分布。一般而言，亚铁离子浓度皆维持在亚铁离子与其反应物之浓度比值为1：10-50(wt/wt)。 此外，亚铁在Fenton程序中除了扮演催化过氧化氢的角色外，亦具有混凝的功能，因此过量的铁离子加入将会造成过度的混凝，降低Fenton程序处理的效果，其可能的反应如下所示: B.过氧化氢浓度的影响 反应过程中，过氧化氢的浓度会直接影响氧化有机物的效果。一般而言，随着过氧化氢添加量的增加，有机物的氧化效果亦将随之提升，并且过氧化氢的添加浓度不同，则分解反应生成的产物将会有所差异。大致而言，在过氧化氢浓度越高的情况下，则其氧化反应产物，将会更趋近于最终产物。但是，当溶液中的过氧化氢浓度过高时，反而会使过氧化氢与有机物竞争氢氧自由基，而造成反应速率的结果可能不如预期一般增加。此外，当Fenton试剂系统中过氧化氢浓度远高于亚铁离子浓度时，Fenton法所产生的氢氧自由基会与过氧化氢反应产生perhydroxyl radical (HO2．)及一系列反应，且三价铁离子会与HO2．进行氧化还原反应生成superoxide radical anion (O2．)，造成过氧化氢消耗量的增加，过量的过氧化氢加药量并不必然增加氢氧自由基的浓度，氢氧自由基达到稳定浓度所需反应时间随加药量增加而增加(27)。因此，若以连续之方式加入低浓度之过氧化氢，减少因为过氧化氢初始浓度过高所导致的抑制效应，亦可得到较好的氧化效果。 C.温度的影响 根据Arrhennius' Law：k=k0exp(-Ea/RT)可得知温度的改变会影响活化能及反应速率常数，进而影响反应速率。 对于Fenton试剂反应而言，一般若选用的反应温度条件是在小于20℃以下时，其对有机物的氧化速率将会随温度升高而加快。但是，倘若将其反应的温度升高至40-50℃时，其Fenton反应将会可能因为温度过高，进而使过氧化氢自行分解成水与氧(2H2O2 → 2H2O + O2 )，造成Fenton试剂对氧化有机物之反应速率减慢。 因此，当过氧化氢浓度超过10-20 g/L时，在其经济与安全的考量下，应谨慎选择适当的温度。在一般商业应用上，通常皆将其反应的温度设定在20-40℃之间。 D. pH值的影响 于Fenton试剂反应中，其反应溶液之pH值对Fenton法之影响，关系到铁离子错合效应、铁

第二章_自由基聚合-习题

第二章自由基聚合－习题 1.举例说明自由基聚合时取代基的位阻效应、共轭效应、电负性、氢键和溶剂化对单体聚合热的影响。 2.什么是聚合上限温度、平衡单体浓度？根据表3-3数据计算丁二烯、苯乙烯40、80℃自由基聚合时的平衡单体浓度。 3.什么是自由基聚合、阳离子聚合和阴离子聚合？ 4.下列单体适合于何种机理聚合：自由基聚合，阳离子聚合或阴离子聚合？并说明理由。 CH 2=CHCl，CH 2 =CCl 2 ，CH 2 =CHCN，CH 2 =C(CN) 2 ，CH 2 =CHCH 3 ，CH 2 =C(CH 3 ) 2 ， CH 2=CHC 6 H 5 ，CF 2 =CF 2 ，CH 2 =C(CN)COOR， CH 2=C(CH 3 )-CH=CH 2 。 5.判断下列烯类单体能否进行自由基聚合，并说明理由。 CH 2=C(C 6 H 5 ) 2 ，ClCH=CHCl，CH 2 =C(CH 3 )C 2 H 5 ，CH 3 CH=CHCH 3 ， CH 2=C(CH 3 )CO℃H 3 ，CH 2 =CH℃℃H 3 ，CH 3 CH=CHCO℃H 3 。 6.对下列实验现象进行讨论： （1）乙烯、乙烯的一元取代物、乙烯的1,1-二元取代物一般都能聚合，但乙烯的1,2-取代物除个别外一般不能聚合。 （2）大部分烯类单体能按自由基机理聚合，只有少部分单体能按离子型机理聚合。 （3）带有π-π共轭体系的单体可以按自由基、阳离子和阴离子机理进行聚合。 7.以偶氮二异丁腈为引发剂，写出苯乙烯、醋酸乙烯酯和甲基丙烯酸甲酯自由基聚合历程中各基元反应。 8.对于双基终止的自由基聚合反应，每一大分子含有1.30个引发剂残基。假定无链转移反应，试计算歧化终止与偶合终止的相对量。 9.在自由基聚合中,为什么聚合物链中单体单元大部分按头尾方式连接? 10.自由基聚合时，单体转化率与聚合物相对分子质量随时间的变化有何特征？与聚合机理有何关系？ 11.自由基聚合常用的引发方式有几种？举例说明其特点。 12.写出下列常用引发剂的分子式和分解反应式。其中哪些是水溶性引发剂，哪些是油溶性引发剂，使用场所有何不同？ （1）偶氮二异丁腈，偶氮二异庚腈。 （2）过氧化二苯甲酰，过氧化二碳酸二乙基己酯，异丙苯过氧化氢。 （3）过氧化氢-亚铁盐体系，过硫酸钾-亚硫酸盐体系，过氧化二苯甲酰-N,N二甲基苯胺。 13.60℃下用碘量法测定过氧化二碳酸二环己酯(DCPD)的分解速率，数据列于下 表，求分解速率常数k d (s -1 )和半衰期t 1/2 (hr)。

自由基及检测方法

ESR 电子顺磁共振（EPR）或称电子自旋共振（ESR）现象最早发现于1944年。它利用具有未成对电子的物质在磁场作用下吸收电磁波的能量使电子发生能级间的跃迁的特征，对顺磁性物质进行检测与分析。 自旋捕集方法是将不饱和的抗磁性化合物（自旋捕集剂）加入反应体系,与反应体系中产生的各种活性高、寿命短的自由基结合形成相对稳定的自旋加合物,以适于ESR检测其原理是利用适当的自旋捕捉剂与活泼的短寿命自由基结合,生成相对稳定的自旋加合物,可以用电子自旋共振波谱法检测自旋加合物的数量,利用自旋加合物的数量来计算原来自由基的多少。 H： V： ESR测自由基是怎么被检测的（细胞，组织，溶液？体内，体外？） (MGD)2 - Fe2 +,是含有10mmol·L- 1MGD 和2mmol·L- 1FeSO4的溶液。 体外捕集：处死后取组织（血液、细胞），加入捕集剂，ESR测定 体内捕集：腹腔注射捕集剂，处死取组织（血液、细胞），ESR测定 腹腔注射几乎没有检测到自由基信号，或者信号很弱，而处死后样品加捕获剂则可以检测到自由基信号。 通用捕获剂 典型的自旋捕捉剂是亚硝基化合物或氮氧化合物，把足够量的自旋捕捉剂加入到产生自由基的体系中，自旋捕获剂就会快速地和任何出现的自由基反应，最后给出稳定的可检测的氮样氧自由基加合物。所形成的自由基加合物的ESR 谱上有被捕自由基基因给出的超精细分裂,可鉴别被捕自由基通用自旋捕获剂所形成的自由基加合物对自由基结构变化相当敏感， ESR 技术检测O-2 O-2可以与1，2-二羟基苯-3，5-二磺酸钠(Tiron)(钛铁试剂)快速反应生成一种称之为“Tiron 半醌自由基”的自旋加合物，比较稳定，可在室温下应用电子顺磁共振波谱仪(EPR)进行检测，从而解决了生理条件下水溶液中寿命极其短暂的O-2·的定性和定量问题 ESR 技术检测·OH DMPO作自由基捕获剂对自由基结构变化相当敏感,可以提供自由基结构的详细信息。它与·OH产生的自旋加合物的ESR谱表现出特别容易识别的特征谱线。在溶液中容易形成的自我捕集产物二聚体自由基不会干扰实验结果。 ESR 技术检测血红蛋白结合的一氧化氮 在组织或血液中，一氧化氮大多与氧或过渡金属反应生成了硝酸盐或亚硝酸盐以及一氧化氮与金属的配合物。一氧化氮与血红蛋白的结合速率常数非常高，而且能够得到有特征的ESR 波谱。利用这一性质，我们可以用血红蛋白作为一氧化氮的捕集剂检测一氧化氮自由基。但是，HbNO 极易氧化，这就限制了这种方法在富氧条件下的应用。 ESR 技术检测生物体系产生的一氧化氮 一氧化氮与含金属蛋白反应产生的亚硝酰的金属配合物，往往会抑制细胞中许多重要的酶，对细胞产生毒害作用。目前应用较多的捕集剂的有Fe2+- (DETC)2，它可与一氧化氮形成稳定的单亚硝酰-铁配合物MNIC，给出特征的ESR 波谱。但由于Fe2+-( DETC)2不溶

超氧自由基清除能力测定法-操作图解

超氧自由基（·O2-）的清除能力测定法（连苯三酚自氧 化法） （适用于：SOD及各种抗氧化剂） 操作图解 具体方法 1 溶液配制 1.1 Tris溶液（0.1mol/L）：1.21 gTris（三羟甲基氨基甲烷，M.W. 121.1）+100 mL蒸馏水。 1.2 HCl溶液（0.1mol/L）：取0.1 mL浓盐酸，加蒸馏水稀释到6 mL。 1.3 Tris-HCl缓冲液（0.05mol/L，pH7.4，含1mmol/L Na2EDTA） 40 mL0.1 mol/L Tris溶液+ x mL0.1 mol/L HCl溶液+15.2 mg Na2EDTA，混合，稀释到80 mL。用pH 计测量，pH应为7.4。用棕色瓶保存在冰箱内(最多保存三天) 。（以上为一个样品的用量）用前稍热至室温，再测pH值，符合要求即可。 1.4 60 mmol/L连苯三酚溶液（溶于1 mmol/L盐酸中） 取0.1mol/L HCl溶液（见1.2项）20μL，用蒸馏水稀释到2 mL，得1 mmol/L盐酸溶液（用pH计测量，pH＝2.5-3.0）。再往里加连苯三酚14.6 mg (M。W.126.1 )，即得。（当天有效,以上为1个样品的用量）。 2 测试液 2.1连苯三酚溶液：取2950μL Tris-HCl缓冲液加入到石英比色皿中，再加约50μL连苯三酚溶液，迅速混合(颠覆式)，开始计时,每隔30秒读数一次A值（325nm），至300秒（5min）时为止。（空白参比：Tris-HCl 缓冲液） ΔA＝A325nm,300s - A325nm,30s。由于ΔA值反映了生成·O2的初始浓度，所以，对于同一批实验而言，此时的ΔA值必须相等。此时的ΔA为ΔA0。 3.2 样品溶液：取xμL样品溶液加入到大石英比色皿中，再加（2950-x）μL Tris-HCl缓冲液，再加50μL 连苯三酚溶液，迅速混合(颠覆式)，开始计时,每隔30秒读数一次（A值，325nm），至300秒时为止。（空白参比：Tris-HCl缓冲液） ΔA＝A325nm,300s - A325nm,30s。此时的ΔA为ΔA样。 3 计算公式

第二章--自由基聚合.

第二章 自由基聚合 习题参考答案 1．举例说明自由基聚合时取代基的位阻效应、共轭效应、电负性、氢键和溶剂化对单体聚合热的影响。 解答： 以结构最简单的聚乙烯为标准，其聚合热为-88.8kJ/mol 。 位阻效应：单体的位阻效应加大，聚合放热下降。 如异丁烯，其聚合热为-54kJ/mol 。这是因为单体的取代基在空间伸展范围大，而成链后，伸展范围小，键角压缩，需贮藏一定能量。 共轭效应：单体的共轭效应加大，聚合放热下降。如丁二烯，其聚合热为-73kJ/mol 。这是因为聚合后，单体原有的共轭作用下降，稳定性下降，需用一定能量。 电负性：单体带强电负性取代基，聚合放热上升。如四氟乙烯，其聚合热为-154.8kJ/mol 。这是因为碳-氟键能大，氟原子半径小。 氢键和溶剂化：单体的氢键和溶剂化大于聚合物的，聚合放热下降。如丙烯酸，其聚合热为-67kJ/mol 。这是单体间氢键作用大的原因。 2．比较下列单体的聚合反应热的大小并解释其原因：乙烯、丙烯、异丁烯、苯乙烯、α-甲基苯乙烯、 氯乙烯、四氟乙烯。 解答： 3．什么是聚合上限温度、平衡单体浓度？根据表3-3数据计算丁二烯、苯乙烯40℃、80℃自由基聚合时的平衡单体浓度。 解答： 聚合上限温度：当聚合和解聚处于平衡状态时，△G = 0，则△H = T △S 。这时的反应温度称为聚合上限温度（ceiling temperature ），记为T c 。一般规定平衡单体浓度为1mol/L 时的平衡温度为聚合的上限温度。 平衡单体浓度：链增长和解聚达平衡时体系的单体浓度，一般取标准状态。 丁二烯：? ?? ? ??-=O c O e ΔS T ΔH R 1ln[M] （1）40℃（313K ），△H = -73.7KJ/mol ，△S = -85.8J/mol ，R = 8.314 [M]e = 1.52×10-8 mol/L （2）80℃ [M]e = 3.77×10-7 mol/L 苯乙烯：（1）40℃（313K ），△H = -69.9KJ/mol ，△S = -104.7J/mol ，R = 8.314 [M]e = 6.36×10-7 mol/L （2）80℃ [M]e = 1.33×10-5 mol/L 4．α-甲基苯乙烯在0℃可以聚合，升温至66℃后不能聚合，但进一步加大反应压力，该单体又可以发生聚合。请说明其原因。 解答： （1）在标准状态： e O O c Rln[M]ΔS ΔH T += △H = -35.2KJ/mol ，△S = -103.8J/mol ，R = 8.314

超氧阴离子自由基检测试剂盒(磺胺比色法)

超氧阴离子自由基检测试剂盒(磺胺比色法) 简介： 超氧阴离子自由基作为生物体代谢过程中产生的一种自由基，可攻击生物大分子，如脂质、蛋白质、核酸和聚不饱和脂肪酸等，使其交链或者断裂，引起细胞结构和功能的破坏，与机体衰老和病变有很密切的关系，清除超氧阴离子自由基的研究已经得到了广泛的关注。 Leagene 超氧阴离子自由基检测试剂盒(磺胺比色法)又称超氧阴离子清除能力检测试剂盒，其检测原理是利用羟胺氧化的方法可以检测生物体系中超氧阴离子自由基(O 2-)，即超氧阴离子自由基(O 2-)与羟胺反应生成NO 2-，在一定范围内颜色深浅与超氧阴离子自由基(O 2-)成正比，根据NO 2-反应的标准曲线将A 530换算成NO 2-浓度，再依据上述关系式即可计算出O 2-浓度。该试剂盒主要用于测定植物组织中的超氧阴离子自由基含量或超氧阴离子清除能力。该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。 组成： 自备材料： 1、 蒸馏水 2、 实验材料：植物组织(大豆、绿豆、玉米等叶片)、血液、组织样本等 3、 研钵或匀浆器 4、 离心管或试管 5、 低温离心机 6、 恒温箱或水浴锅 7、 比色杯 8、 分光光度计 操作步骤(仅供参考)： 编号 名称 TO1123 50T Storage 试剂(A): NO 2-标准(1mM) 1ml RT 试剂(B): O 2- Lysis buffer 125ml RT 试剂(C): 羟胺溶液 30ml RT 试剂(D): 氨基苯磺酸显色液 30ml 4℃ 避光 试剂(E): 萘胺显色液 30ml 4℃ 避光 使用说明书 1份

1、准备样品： ①植物样品：取正常或逆境下的新鲜植物组织，清洗干净，擦干，切碎，迅速称取预冷的O2-Lysis buffer后冰浴条件下匀浆或研磨，4℃离心，上清液即为超氧阴离子自由基提取液，4℃保存备用。 ②血浆、血清和尿液样品：血浆、血清按照常规方法制备后可以直接用于本试剂盒的测定，4℃保存，用于超氧阴离子自由基的检测。 ③高活性样品：如果样品中含有较高浓度的超氧阴离子自由基，可以使用O2- Lysis buffer 进行恰当的稀释。 2、配制系列NO2-标准溶液：取出NO2-标准(1mM)恢复至室温后，以NO2-标准(1mM) 按下表继续稀释： 加入物(ml) 1 2 3 4 5 6 NO2-标准(1mM)0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 蒸馏水0.99 0.98 0.97 0.96 0.95 0.94 NO2-含量(μM) 10 20 30 40 50 60 3、O2-加样：按照下表设置空白管、标准管、测定管，溶液应按照顺序依次加入，并注意 避免产生气泡。如果样品中的超氧阴离子自由基浓度过高，可以减少样品用量或适当稀释后再进行测定，样品的检测最好能设置平行管。 加入物(ml) 空白管标准管测定管 蒸馏水1—— 系列NO2-标准(1-6号管) — 1 — 待测样品——0.25 O2- Lysis buffer ——0.25 羟胺溶液——0.5 混匀，25℃水浴孵育。 氨基苯磺酸显色液0.5 0.5 0.5 萘胺显色液0.5 0.5 0.5 混匀，30℃水浴孵育。 4、O2-测定：以空白调零，分光光度计(1cm光径比色杯)检测标准管、测定管530nm处吸光度(A标准、A测定)。 计算： 以系列NO2-标准(1-6号管)含量(μM)为横坐标，以对应的吸光度为纵坐标，制作标准曲线，根据测定管的吸光度进而计算NO2-含量。根据如下公式计算具体样品中超氧阴离子

氧自由基与氧自由基清除剂依达拉奉

氧自由基与氧自由基清除剂依达拉奉 山东大学齐鲁医院麻醉科（250012）于金贵 一、氧自由基 （一）自由基的概念 自由基（free radical，FR）是指外层轨道上有未配对电子的原子、原子团、分子或离子的总称。因其含有未配对的电子，故化学性质非常活泼，极易与其生成部位的其他物质发生反应，而这种反应的最大特点是以连锁反应的形式进行。氧原子上有未配对电子的自由基称为氧自由基。人体吸入的分子氧，在正常状态下绝大多数（98%）都连接4个电子，它们最终与H+结合，代谢还原为H2O。但有极少数氧（1~2%）在代谢过程中被夺去或接受一个电子而形成活性氧，即氧自由基。 （二）氧自由基的生理作用 氧自由基在生理上是必需的物质，如合成ATP 和前列腺素、中性粒细胞杀灭细菌、酸性粒细胞杀灭寄生虫等过程都必须有氧自由基参与。氧自由基在体内的生成与清除保持动态平衡，且在体内存在时间甚短。由于其化学性极强，反应剧烈，过量产生会对机体造成极大危害。 （三）氧自由基的种类及其作用

1. 超氧化物阴离子：氧自由基连锁反应的启动者，使生物膜、激素和脂肪酸过氧化。 2. 羟自由基（OH∙）：作用最强的自由基，可破坏氨基酸、蛋白质、核酸和糖类。 3. 过氧化氢（H2O2）：过渡型氧化剂，主要使巯基氧化，可氧化不饱和脂肪酸。 4. 单线态分子氧（1O2）：氧分子的激发状态，亲电子性强，在光作用下可由O2直接产生，对细胞有杀伤作用。 5. 其他含氧的自由基如脂质过氧化物（ROOH）：易于分解再产生自由基，腐化脂肪，破坏DNA，可与蛋白质交联使之形成变性交聚物。 （四）机体抗氧化机制 机制一：直接提供电子，以确保氧自由基还原；机制二：增强抗氧化酶的活性，以有效地消除或抵御氧自由基的破坏作用如酶类抗氧化剂超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）；非酶类抗氧化剂如维生素E、维生素C、辅酶Q、还原型谷胱甘肽（GSH）、葡萄糖、含硫氨基酸和不饱和脂肪酸等。 SOD多存在于细胞的线粒体内，作用是将氧自由基歧化，将其一半转变成H2O，另一半转变成O2，从而清除氧自由基。CAT是血红蛋白酶类之一，作用是分解H2O2，并将其清除之。

超氧阴离子清除实验

·O2ˉ自由基清除实验 (1) 实验原理 黄嘌呤氧化酶 黄嘌呤＋H2O+O2尿酸＋H2O2+·O2ˉ 即黄嘌呤氧化酶在有氧条件下催化黄嘌呤转化为尿酸，同时产生超氧阴离子自由基(·O2ˉ)。·O2ˉ与NBT结合后呈蓝色，样品清除能力越大，与NBT结合的·O2ˉ越少，溶液的颜色越浅。 (2)试剂 Xanthine(黄嘌呤): (C5H4N4O2 ), MW=152.1, 6.084mg/100mL(0.4mmol/l) 实际配制：1.216mg/10mL，与NBT等体积混合使用 Xanthine oxidase(黄嘌呤氧化酶)贮液: 1 unit/mL , (溶解酶的溶液要高压灭菌！防止蛋白酶对酶的降解！) 0.05 unit/mL，每次取200uL稀释到4mL(PBS溶解) NBT: (Nitro blue tetrazolium chloride氯化硝基四氮唑蓝), MW=817.65, 黄色19.6236mg/100mL(0.24mmol/l) 实际配制3.925mg/10mL，与Xanthine等体积混合使用 PBS(0.01mol/L,pH=8.0): NaCl 8g, KCl 0.2g, Na2HPO4(无水) 1.44g, KH2PO4 0.24g, 800mL水，用NaOH(1M)调pH到8.0，定容到1000mL。 实际配制500mL。高压灭菌，室温保存。 PBS(0.01mol/L,pH=7.4): 配制同上 Ascorbic acid: MW=176.12 母液为1mg/mL 先两倍逐级稀释5个浓度 实际配制见记录本！ HCl(1M): MW=36.5 310ul/10ml.(36% HCl密度1.18g/ml) 实际配制：800uL浓盐酸+9mL水，于塑料管中4℃保存。 NaOH(1M): MW=40 0.4g/10mL, 存于冰箱 (3) 测定方法 超氧阴离子自由基清除能力的测定参照Bae等人的方法略加改进。样品溶液1-5mg/ml 起始浓度，用于水或50%乙醇溶液。 Bae, S.W., Suh, H.J., 2007. Antioxidant activities of ve different mulberry cultivars in Korea.

第三章__自由基聚合

第三章自由基聚合 思考题3.2 下列烯类单体适用于何种机理聚合?自由基聚合、阳离子聚合还是阴离子聚合?并说明原因。 (1)CH2——CHCl (2)CH2＝CCl2(3)CH2＝CHCN (4)CH2＝C(CN)2 (5)CH2＝CHCH3(6)CH2＝C(CH3)2(7)CH2=CHC6H5 (8)CF2＝CF2(9)CH2＝C(CN)COOR (10)CH2＝C(CH3)-CH＝CH2 答可以通过列表说明各单体的聚合机理，如下表：

思考题3.3 下列单体能否进行自由基聚合，并说明原因。 (1)CH2＝C(C6H5)2(2)CH3CH＝CHCOOCH3(3)CH2＝C(CH3)C2H5 (4)ClCH＝CHCl (5)CH2＝CHOCOCH3(6)CH2＝C(CH3)COOCH3 (7)CH3CH＝CHCH3(8)CF2＝CFCl 答(1) CH2＝C(C6H5)2不能进行自由基聚合，因为l,1-双取代的取代基空间位阻大，只形成二聚体。

(2) CH3CH＝CHCOOCH3不能进行自由基聚合，因为1,2-双取代，单体结构对称，空间阻碍大。 (3) CH2＝C(CH3)C2H5不能进行自由基聚合，两个取代基均为供电基团，只能进行阳离子聚合。 (4)ClCH＝CHCl不能进行自由基聚合，因为1,2-双取代，单体结构对称，空间阻碍大。 (5)CH2＝CHOCOCH3能进行自由基聚合，因为-COCH3为吸电子基团，利于自由基聚合。 (6) CH2＝C(CH3)COOCH3能进行自由基聚合，因为l,1-双取代，极化程度大，甲基体积小，为供电子基团，而-COOCH3为吸电子基团，共轭效应使自由基稳定。 (7) CH3CH＝CHCH3不能进行自由基聚合，因为1,2-双取代，单体结构对称空间阻碍大。 (8) CF2＝CFCl能进行自由基聚合，F原子体积小，Cl有弱吸电子作用。 思考题3.7为什么说传统自由基聚合的机理特征是慢引发、快增长、速终止？在聚合过程中，聚合物的聚合度、转化率，聚合产物中的物种变化趋向如何? 答自由基聚合机理由链引发、链增长、链终止等基元反应组成，链引发是形成单体自由基(活性种)的反应，引发剂引发

清除氧自由基

1、超氧负离子 黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶系统产生超氧负离子产生超氧负离子 黄嘌呤、黄嘌呤氧化酶、 清除超氧自由基负离子O2- 徐艳,曲婷婷. 甘草消除氧自由基的体外研究[J]. 食品研究与开发,2006,(8). 2、1.2.2NBT 光还原反应中主要试剂的配制 1.2.2.1 测试缓冲液: 0.026 mol/LMet- 磷酸钠缓冲液具体配制方法: 首先配制0.1 mol/LpH7.8Na2HPO4- NaH2PO4缓冲液 a 称取Na2HPO4·12H2O( MW=358.14) 3.581 4 g 于100 mL 小烧杯中, 加少量蒸馏水溶解后, 移入100 mL容量瓶中, 用蒸馏水定容至刻度。 b 称取NaH2PO4·2H2O(MW=156.01)0.780 g 于50 mL小烧杯中, 加少量蒸馏水溶解后, 移入50 mL 容量瓶中, 用蒸馏水定容至刻度。 c 量取91.5 mL a 液与8.5 mL b 液混合后, 该液即为0.1 mol/LpH7.8 磷酸钠缓冲液。 d 称取L- Met( MW=149.2) 0.194 1 g 于50 mL 小烧杯中, 用少量0.1 mol/LpH7.8 磷酸钠缓冲液溶解后, 移入50 mL 容量瓶中, 用0.1 mol/LpH7.8 磷酸钠缓冲液定容至刻度。 1.2.2.2 NBT( 氯化硝基四氮唑蓝) 的配制(7.5×10-4mol/L) 称取NBT( MW=817.7) 0.061 3 g 于50 mL 小烧杯中, 用少量蒸馏水溶解后, 移入100 mL 容量瓶中, 用蒸馏水定容至刻度。 1.2.2.3 核黄素溶液(2×10-5 mol/L) a.称取EDTA( MW=292) 0.002 92 g 于50 mL 小烧杯中, 用少量蒸馏水溶解。 b.称取核黄素( MW=376.36) 0.073 5 g 于50 mL 小烧杯中, 用少量蒸馏水溶解。合并 a 液和 b 液, 移入100 mL 容量瓶中, 用蒸馏水定容至刻度( EDTA0.1 mmol,核黄素2 mmol)。贮于冰箱中, 避光保存, 用时稀释100 倍。 1.2.3 甘草提取物溶液的配制 1.2.3.1 甘草酸溶液的配制 称取甘草酸0.05 g 用少量稀醇(10 %乙醇溶液)溶解后, 移入50 mL 容量瓶中, 用稀乙醇定容至刻度, 即为 1 g/ mL 的甘草酸溶液。 1.2.3.2 甘草次酸溶液的配制 称取甘草次酸0.05 g 用少量稀醇(10 %乙醇溶液)溶解后, 移入50 mL 容量瓶中, 用稀乙醇定容至刻度,即为 1 g/mL 的甘草次酸溶液。 1.2.3.3 甘草总黄酮组溶液的配制

如何清除体内自由基

如何清除体内自由基 消除体内自由基，应该要了解自由基的来源，从外界到身体内部的代谢一起中和性的描叙不要单方面的讲叙体内各种酶与自由基之间的关系 人体内的自由基有两个来源：其一是来自环境，如环境污染、食品污染、过度的紫外线照射和各种辐射、杀虫剂、室内外废气、吸烟、二手烟、酗酒、工作压力、生活不规律等等，都会直接导致人体内产生过多的自由基（活性氧）；食品添加剂、食用脂肪和熏炸烤肉、某些抗癌药物、安眠药、抗生素、有机物腐烂物、塑料用品制造过程、油漆干燥挥发、石棉粉尘、空气污染、化学致癌物、大气中的臭氧等也都能诱发人体内产生自由基。 其二是来自体内，人体内组织细胞的新陈代谢也会产生自由基，这是人体代谢过程的正常产物，十分活跃又极不稳定，它们会附着于健康细胞之上，再慢慢瓦解健康细胞，而被破坏的细胞则又再转而侵害更多健康的细胞，如此恶性循环从而导致人体的衰老和疾病的发生。另外，组织器官损伤后的缺血一段时间后又突然恢复供血(即重灌流)，如心肌梗塞、脑血栓、外伤、外科手术后，自由基会大量生成。正常人体有一套清除自由基的系统，但这个系统的力量会因人的年龄增长及体质改变而减弱，致使自由基的负面效应大大增强，引起多种疾病发病率的提高。活性氧自由基对人体的损害实际上是一种氧化过程。因此，要降低自由基的损害，就要从抗氧化做起。 听说过抗氧化剂吗？它对人体的健康可是有着密切的关系。既然自由基不仅存在于人体内，也来自于人体外，那么，降低自由基危害的途径也有两条：一是，利用内源性自由基清除系统清除体内多余自由基；二是发掘外源性抗氧化剂——自由基清除剂，阻断自由基对人体的入侵。 大量研究已经证实，人体内本身就具有清除多余自由基的能力，这主要是靠内源性自由基清除系统，它包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶等一些酶和维生素C、维生素E、还原型谷胱甘肽、β-胡萝卜素和硒等一些抗氧化剂。酶类物质可以使体内的活性氧自由基变为活性较低的物质，从而削弱它们对肌体的攻击力。酶的防御作用仅限于细胞内，而抗氧化剂有些作用于细胞膜，有些则是在细胞外就可起到防御作用。这些物质就深藏于我们体内，只要保持它们的量和活力它们就会发挥清除多余自由基的能力，使我们体内的自由基保持平衡。 要降低自由基对人体的危害，除了依靠体内自由基清除系统外，还要寻找和发掘外源性自由基清除剂，利用这些物质作为替身，让它们在自由基进入人体之前就先与自由基结合，以阻断外界是自由基的攻击，使人体免受伤害。在自然界中，可以作用于自由基的抗氧化剂范围很广，种类极多。目前，国内外已陆续发现许多有价值的天然抗氧化剂。如β－胡萝卜素（维生素A）、维生素C、维生素E、番茄红素、辅酶q10、等等。此外，我国很多中草药植物中的有效成分都是天然抗氧化剂，例如，银杏黄酮、甘草黄酮等，另外还有巴西菇、灰树花、茯苓、黄芪、丹参、银杏、枸杞、灵芝、人参......。 吃什么可以减少体内自由基 在正常的生命过程中，自由基为维持生命所必需。体内自由基不断产生，也不断地被清除，两者 处于动态平衡之中，使之维持在一个正常的生理水平上。自由基在生物体内具有参与吞噬病原体，参 与前列腺素和凝血酶原的合成、解毒，参与体内部分生化反应和胶原蛋白的合成，调节细胞增殖与分化，参与机体免疫和环核苷酸的生物合成，以及生殖和胚胎发育等重要的生理功能。但是当自由基过 量时，自由基在机体内损伤蛋白质、核酸和生物膜，导致细胞凋亡，并参与许多疾病的发病过程。 由基清除剂即抗氧化剂清除机体自由基，保护机体免受氧化损害中起重要作用。因此，近年来对 自由基清除剂的研究备受关注。多吃点抗氧化剂食物有利于减少体内多余自由基。 方法/步骤 1.全面复方自由基清除剂：葡茶多酚胶囊。适当吃葡茶多酚可以全面清除体内多余自由

第二章 自由基聚合习题

第二章自由基聚合习题 一、什么是自由基聚合、阳离子聚合和阴离子聚合？ 二、下列单体适合于何种机理聚合：自由基聚合，阳离子聚合或阴离子聚合？并说明理由。 CH2=CHCl，CH2=CCl2，CH2=CHCN，CH2=C(CN)2，CH2=CHCH3，CH2=C(CH3)2，CH2=CHC6H5，CF2=CF2，CH2=C(CN)COOR， CH2=C(CH3)-CH=CH2。 3.判断下列烯类单体能否进行自由基聚合，并说明理由。 CH2=C(C6H5)2，ClCH=CHCl，CH2=C(CH3)C2H5，CH3CH=CHCH3， CH2=C(CH3)COOCH3，CH2=CHOCOCH3，CH3CH=CHCOOCH3。 四、对于双基终止的自由基聚合反应，每一大分子含有1.30个引发剂残基。假定无链转移反应，试计算歧化终止与偶合终止的相对量。 五、写出下列常用引发剂的分子式和分解反应式。其中哪些是水溶性引发剂，哪些是油溶性引发剂，使用场所有何不同？ （1）偶氮二异丁腈；（2）过氧化二苯甲酰；（3）过硫酸钾-亚硫酸盐体系，（4）过氧化二苯甲酰-N,N二甲基苯胺。 六、解释引发效率、诱导分解和笼蔽效应。 七、什么是自动加速现象？产生的原因是什么？对聚合反应及聚合物会产生什么影响？ 八.什么叫链转移反应？有几种形式？对聚合反应速率和聚合物的相对分子质量有何影响？ 九、讨论下列几种链转移、链增长、再引发速率常数的相对大小对聚合反应速率和聚合物相对分子质量的影响： （1）k P 》k tr ka≈ k P （2）k P《k tr ka≈ k P （3）k P》k tr ka〈k P （4）k P《k tr ka〈k P （5）k P《k tr k a = 0

清除自由基研究方法汇总

电子自旋共振法（ESR）、高效液相色谱法、化学发光法、比色法、分光光度法 自由基清除剂也称为抗氧化剂，可清除体内多余的自由基，减轻它们对机体的损伤。目前常用超氧阴离子自由基体系（O2-·）、羟基自由基体系（·OH）、二苯代苦味酰基自由基体系（DPPH·）对某抗氧化剂的体外清除自由基能力进行了研究。 其中ESR法和气相色谱法、HPLC 法对自由基的检测灵敏度高，但对设备要求较高，操作复杂，无法在一般实验室普及。而其中的分光光度法、化学发光法、荧光分析法等不需要昂贵的仪器，易于被一般实验室所采用，但测定过程中的干扰因素较多，容易对测定的准确性和灵敏度造成影响。分光光度法最常用。 原理部分： 1.DPPH·法测试机理 DPPH·（二苯代苦味脐基自由基）的甲醇溶液呈深紫色，可见光区最大吸收峰为492nm。当自由基清除剂加入到DPPH·溶液中时，DPPH·的单电子被配对而使其颜色变浅，在最大吸收波长处的吸光度减少，而且颜色变浅的程度与配电子数成化学计量关系，因此，可通过吸光度减弱的程度来评价自由基被消除的情况。 2. 羟基自由基（·OH） 1）邻二氮菲法[70]

实验原理：邻二氮菲可与Fe2+形成络合物，此络合物在510nm 处有最大吸收峰，是一常用的氧化还原指示剂，其颜色变化可敏锐地反映溶液氧化还原状态的改变。H2O2/ Fe2+体系可通过Fenton 反应产生羟自由基，邻二氮菲－Fe2+水溶液被羟自由基氧化为邻二氮菲－Fe3+后，其510nm 最大吸收峰消失。如果反应体系中同时存在羟自由基清除剂，则Fenton 反应产生的羟自由基将被此清除剂全部或部分清除，邻二氮菲－Fe2+络合物受到的破坏将会随之减少。根据这一原理，可建立以A510变化反映自由基清除剂对羟自由基清除作用的比色测定法。 2）水杨酸法[71] 实验原理：羟自由基易攻击芳环化合物产生羟基化合物，因此可用水杨酸捕集Fenton 反应体系中的·OH，生成的2,3－二羟基苯甲酸用乙醚萃取，用钨酸钠和亚硝酸钠显色，然后用分光光度计测定其在510nm 处的吸光值，此吸光值可反映体系中的羟自由基浓度。 3）甲基紫-Fe2+-H2O2反应体系 测定原理：在Fenton反应的基础上加入甲基紫作显色剂，反应式如下： Fe2++H2O2→Fe3++OH-+·OH 甲基紫在酸性溶液中呈现紫色[9],在578nm 处有强吸收。反应产生的·OH 具有高的反应活性，容易进攻高电子云密度点，会与甲基紫中具有高电子云密度的-C=C-基团发生亲电加成反应，使甲基紫褪色。通过测定甲基紫在578nm 处吸光度值的变化可间接测定出·OH 的生成量。当有清除自由基的物质存在时，会阻断甲基紫与·OH 的反应，从而使得甲基紫的颜色有所加重，因此可利用抗氧化剂加入前后溶液吸光度值的变化来评价物质的抗氧化性强弱。

羟基自由基清除能力测定法的简易操作图解-脱氧核糖降解法-脱氧核糖分析法

羟基自由基(·OH)清除能力测定法的简易操作图解 （适用于各种抗氧化剂） 文献来源 [1] Xican Li. Solvent effects and improvements in the deoxyribose degradation assay for hydroxyl radical-scavenging. Food Chemistry, 2013, 141(3):2082-2088. 操作图解 图1 羟基自由基(·OH)清除能力测定法（脱氧核糖降解法）的实验操作图 具体方法 1 溶液配制 0.2 MKH2PO4溶液: 100mL蒸馏水+2.7218g KH2PO4。 0.2 M Na2HPO4溶液: 500mL蒸馏水+35.814g Na2HPO4·12H2O。 磷酸盐KH2PO4－Na2HPO4缓冲液phosphate buffer（0.2M, pH7.4, 100mL）：19mL0.2 MKH2PO4+ 81mL 0.2 MNa2HPO4. （注意：19：81是大概的体积比，具体的比例以pH=7.4为准）。 Na2EDTA溶液：（1mM, 25mL）：8.4 mg+25mL蒸馏水。 FeCl3溶液：（3.2mM, 5mL）：4.2 mg+5mL蒸馏水。 抗坏血酸溶液：（1.8mM, 50mL）：15 mg+50mL蒸馏水。 H2O2溶液：（50 mM,5mL）：30 mg 30% H2O2+5mL蒸馏水。 脱氧核糖溶液：（50 mM, 2 mL）：15 mg脱氧核糖+2 mL蒸馏水(该用量约可做40个数据) 。 三氯乙酸溶液TCA（10%, 10 mL）：1 g + 10 mL蒸馏水。 硫代巴比妥酸溶液TBA：（5%, W/V, 20mL）:取1gTBA+20mL蒸馏水+20mgNaOH (临用时配，超声溶解. 该用量可做40个数据) 。 样品溶液：选合适的溶剂（如甲醇、无水乙醇等），先配成1mg/mL的溶液试试。 2 操作方法与注意事项 2.1 操作方法（见图1） 2.2 注意事项 1 测试前，一定要检查试管是否干净，不净的试管不能用。正式测试前,盛装样品的容器(小瓶或试管) 必须用铬酸洗液洗净。 2 样品溶液加入到试管后，先彻底挥干溶剂，再用样品的残渣，进行实验检测（见：操作图解）。这一步至关重要，因为有机溶剂都会产生数十倍的干扰。其原因中文献[1]已做详细说明。 3 最后显色时，如颜色太淡，可能是加热温度不够高； 4 加样：在10μL以下最好用进样针，插到瓶底；取样：力保均匀。 5 如平行样之间差别太大，系混合不均所致。两次水浴前，都要充分振荡。振荡时，用保鲜膜盖住管 口上下剧烈振荡。

超氧阴离子自由基清除

一．实验原理： 该方法利用NADH-PMS-NBT为超氧阴离子(O2·-)生成系统，超氧阴离子清除剂能减少NBT 的蓝色。通过检测560nm处吸光值可判断体系中还原物质的还原能力。 二．实验仪器：分光光度计 三．实验试剂： 一：液体40mL×1瓶； 二：液体1mL一瓶； 三：粉剂一支； 四：粉剂一支； 五：1mg/mL芦丁标准品，1mL 四．溶液配制： 一工作液：用时加双蒸水360mL，也就是10倍稀释，得到400mL试剂一工作液； 二工作液：用赠送的棕色瓶配制。试剂二工作液由试剂二加上100mL试剂一工作液配得，现配现用，注意避光； 三工作液：试剂三工作液由试剂三溶解于100mL试剂一工作液配得，现配现用； 四工作液：粉剂一支。用50mL双蒸水溶解，摇匀后，取10mL，加入90mL试剂一，配成试剂四工作液，现配现用，用赠送的棕色瓶盛装。注意避光，配好的试剂请于2小时内用完。五工作液：阳性对照，按需配制，-20℃保存。 五．实验步骤： 测定吸光值。

六．清除能力计算： 超氧阴离子自由基清除（%）=[空白孔吸光值-（测定孔吸光值-对照孔吸光值）]/空白孔吸光值*100 注： 1 如未做对照孔，可以将其视作为0； 2 阳性对照求值时将其视作测定孔进行计算即可。 七．注意事项： 1. 如样品中色素物质不是分析对象，建议先通过SEP C18柱进行脱色处理，处理后样品可不做对照孔； 2. 如不确定样品的超氧阴离子自由基清除能力，可先做不同浓度的稀释液进行摸索，并选择适宜浓度进行测定，高浓度下，浓度与清除率间并不线性相关。 3. 试剂三建议全程冰上操作。试剂四切记避光保存，特别是配制后，且应尽快用完。建议在做好一切其它准备工作后再配制试剂四应用液。试剂四正常颜色为黄色，强光照射下，5-10分钟内会变为绿色，随后变为蓝色，变色后试剂不可再用！ 4. 试剂二、三应用液和样品混匀后再加入试剂四，次序颠倒会导致不显色。 5. 部分物质会导致显色加深，导致求得的抑制率是负值，如遇到此类现象请先确定该物质是否具有超氧阴离子清除能力，再考虑更换方法，如邻苯三酚自氧化法等进行测试。

清除自由基能力的研究概况

清除自由基能力的研究概况 陶涛 （西南林业大学林学院农学（药用植物）昆明 650224） 摘要：自由基及其诱导的氧化反应是导致生物衰老和某些疾病如癌症、糖尿病、一心血管疾病等的重要因素。乳酸茵作为一种高效、低毒的生物源天然抗氧化荆，正逐步受到食品、制药、化工等领域的广泛关注。就目前国内外常用的乳酸茵抗氧化活性的筛选方法、乳酸茵抗氧化机理的国内外研究进展及未来的发展趋势作一综述。 关键词：自由基；乳酸茵；抗氧化． Study on the scavenging ability of lactic acid bacteria on free radical bstract：Free radical and its inducing oxiditative reaction may CaUSe biological doat and certain diseases such as Cancers，diabetes and the cat- diovascular．The lactic acid baaeria as one ofbiological SOUrCeS oxidation inhibitor is becoming more and more popular in the fields offood．，drug manufacture and chemical industry．This article mainly reviews the screening methods for antioxidative of lactic add bacteria among domestic and foreign countries，the advance of the research progress in lactic add bacteria antioxidative and r∞earch trends in future． 引言 氧化过程可以提供能量．对大多数生物体来说，是维持生命必不可少的一个能量转化过程。但过多的氧化过程会对生物大分子引起损伤．氧化损伤主要是由于自由基和过氧化产物作用于人体而产生的。 自由基(free radicals)27．．称游离基．为人体氧化代谢过程中形成含有一个不成对电子的原子或原子团。人体的自由基主要包括超氧阴离子自由基(o2)、