标准的PCR反应体系
标准的PCR反应体系
PCR反应体系与反应条件
标准的PCR反应体系:
10X扩增缓冲液10ul
4种dNTP混合物各200umolL
引物各10?100mol
模板DNA01 ?2ug
TqDNA聚合酶25u
g2+15mmolL
加双或三蒸水至100ul
PCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTR模板和g2+
引物：引物是PCR寺异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。
设计引物应遵循以下原则：
①引物长度：15-30b ，常用为20b 左右。
②引物扩增跨度：以200-500b为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。
③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异
条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形
成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。
⑤引物3' 端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCF失败。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶
切分析或分子克隆很有好处。
⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量：每条引物的浓度01?lumol或10?100mol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏
高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。
酶及其浓度目前有两种TqDNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2。5U（指总反应
体积为100ul 时），浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。
dNTP的质量与浓度dNTP的质量与浓度和PCR T增效率有密切关系，dNTP粉呈颗
粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP 溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1NH或ITris。HCL的缓冲液将其PH调节到70?75，小量分装，-20C冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50?200umolL，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等（等摩尔配制），如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏低），就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与g2+结合，使游离的g2+浓度降低。
模板（靶基因）核酸模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，
传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS还能与蛋白质
结合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR T增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍
或蛋白酶K法，
要防止RNse降解RNA
g2+浓度g2+对PCR F增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各
种dNTP浓度为200umolL时,g2+浓度为15?20mmolL为宜。g2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低TqDNA聚合酶的活性，使反应产物减少。
PCR反应条件的选择
PCR反应条件为温度、时间和循环次数。
温度与时间的设置：基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90?95C变性，再迅速冷却至40?60C,引物退火
并结合到靶序列上，然后快速升温至70?75C,在TqDNA聚合酶的作用下，使引物链沿模
板延
伸。对于较短靶基因（长度为100?300b 时）可采用二温度点法，除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94C变性，65C左右退火与延伸（此温度TqDNA酶仍有较高的催化活性）。
①变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般
情况下，93C?94C lmin 足以使模板DNA变性，若低于93C则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCF产物完全变性，就会
导致PCR失
败。
②退火(复性)温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度
快速冷却至40C?60C，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA比引物复杂得多，引物
和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物
的长度
、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55 C为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的
温度：
Tm值(解链温度)=4(G+C) + 2(A+T)
复性温度=Tm值-(5?10C)
在Tm值允许围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30?60se，足以使引物与模板之间完全结合。
③延伸温度与时间：TqDNA聚合酶的生物学活性：
70?80C 150核苷酸S酶分子
70 C 60核苷酸S酶分子
55 C 24核苷酸S酶分子
高于90C时，DNA合成几乎不能进行。
PCR反应的延伸温度一般选择在70?75C之间，常用温度为72C,过高的延伸温
度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb 以内的DNA片段，延伸时间1min是足够的。3?4kb的靶序列需3?4min；扩增10Kb需延伸至
15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。
循环次数循环次数决定PCR F增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓
度。一般的循环次数选在30 ?40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。
PCR技术概论
聚合酶链反应(PolymerseCinReion,PCR) 是80 年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管
内将所要研究的目的基因或某一DNA 片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍，使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。过去几天几星期才能做到的事情，用PCR几小时便可完成。PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。
PCR技术简史
PCR的最早设想核酸研究已有100多年的历史，本世纪60年代末、70年代初人们致力于研究基因的体外分离技术，Korn于1971年最早提出核酸体外扩增的设想：“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆RNA基因”。
PCR的实现1985年美国PE-Ceus公司人类遗传研究室的ullis 等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给DNA的体外合成提供以致一种合适的条件---摸板DNA寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲体系，DNA变性、复性及延伸的温度与时间。
PCR勺改进与完善ullis 最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶的Kleno片段，
其缺点是：①Kleno酶不耐高温，90C会变性失活，每次循环都要重新加。②引物链延伸反应在37C 下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配，其PCR产物特异性较差，合成的DNA片段不均一。此种以Kleno酶催化的PCF技术虽较传统的基因扩增具备许多突出的优点，但由于Kleno酶不耐热，在DNA模板进行热变性时，会导致此酶钝化，每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期，给PCR技术操作程序添了不少困难。这使得PCR技术在一段时间内没能引起生物医学界的足够重视。1988年初，Keo nog改用T4DNA聚合酶进行PCR其扩增的
DNA片段很均一，真实性也较高，只有所期望的一种DNA片段。但每循环一次，仍需加入新
酶。1988 年Siki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(ermusquius) 中提取到一种耐热DNA 聚合酶。此酶具有以下特点：①耐高温，在70C下反应2后其残留活性大于原来的90%在93C下反应2后其残留活性是原来的60%在95C下反应2后其残留活性是原来的40%② 在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。③大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度(20Kb) 。由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。为与大肠杆菌多聚酶Kleno片段区别，将此酶命名为TqDNA多聚酶(TqDNAPolymerse)。此酶的发现使PCR广泛的被应用。
PCR技术基本原理
PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补
的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93C左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR T增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性): 模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55C左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对
结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原
料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保
留复制链重复循环变性-- 退火-- 延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2?4分钟，2?3小时就能将待扩目的基
因扩增放大几百万倍。到达平台期(Pleu) 所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。
PCR的反应动力学PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最
终的DNA扩增量可用Y= （1 + X）n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平（Y）均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这
种效应称平台期数、PCR扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。
PCR扩增产物可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限定
在两个引物链5'端之间，是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中，以两条互补的DNA为模板，引物是从3'端开始延伸，其5'端是固定的，3'端则没有固定的止点，长短不一，这就是“长产物片段”。进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链（即“长产物片段” ）结合。引物在与新链结合时，由于新链模板的5'端序列是固定的，这就等于这次延伸的片段3'端被固定了止点，保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的“短产物片段” 。不难看出“短产物片段” 是按指数倍数增加，而“长产物片段”则以算术倍数增加，几乎可以忽略不计，这使得PCR的反应产物不需要再
纯化，就能保证足够纯DNA片段供分析与检测用。
PCR反应体系与反应条件
标准的PCR反应体系：
10X扩增缓冲液10ul
4种dNTP混合物各200umolL
引物各10?100mol
模板DNA 01?2ug
TqDNA聚合酶25u
g2+ 15mmolL
加双或三蒸水至100ul
PCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTR模板和g2+
引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。
设计引物应遵循以下原则：
①引物长度：15-30b，常用为20b左右。
②引物扩增跨度：以200-500b为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。
③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非
特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则
会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。
⑤引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这
对酶切分析或分子克隆很有好处。
⑦引物的特异性：弓I物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。
引物量：每条引物的浓度01?lumol或10?100mol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。
酶及其浓度目前有两种TqDNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然
酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量25U（指总反应体
积为100ul 时），浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。
dNTP的质量与浓度dNTP的质量与浓度和PCR T增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP 溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1NH或1Tris。HCL的缓冲液将其PH调节到70?75，小量分装，-20C冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50?200umolL，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等（等摩尔配制），如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏低），就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与g2+结合，使游离的g2+浓度降低。
模板（靶基因）核酸模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，
传统的DNA屯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR 反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR F增。RNA莫板提取一般采用异硫氰
酸胍或蛋白酶K法，要防止RNse降解RNA
g2+浓度g2+对PCR F增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各
种dNTP浓度为200umolL时,g2+浓度为15?20mmolL为宜。g2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低TqDNA聚合酶的活性，使反应产物减少。
PCR反应条件的选择
PCR反应条件为温度、时间和循环次数。
温度与时间的设置：基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90?95C变性，再迅速冷却至40?60C,引物退火
并结合到靶序列上，然后快速升温至70?75C,在TqDNA聚合酶的作用下，使引物链沿模
板延伸。对于较短靶基因（长度为100?300b 时）可采用二温度点法，除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94C变性，65C左右退火与延伸（此温度TqDNA酶仍有较高
的催化活性）。
①变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般
情况下，93C?94C lmin 足以使模板DNA变性，若低于93C则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCF产物完全变性，就会
导致PCR失败。
②退火（复性）温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度
快速冷却至40C?60C，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA比引物复杂得多，引物
和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%勺引物，55 C为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合
适的温度：
Tm值（解链温度）=4（G+C）+ 2（A+T）
复性温度=Tm值-（5?10C）
在Tm值允许围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30?60se，足以使引物与模板之间完全结合。
③延伸温度与时间：TqDNA聚合酶的生物学活性：
70?80C 150核苷酸S酶分子
70 C 60核苷酸S酶分子
55 C 24核苷酸S酶分子
高于90C时，DNA合成几乎不能进行。
PCR反应的延伸温度一般选择在70?75C之间，常用温度为72C,过高的延伸温
度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb 以内的DNA片段，延伸时间1min是足够的。3?4kb的靶序列需3?4min；扩增10Kb需延伸至
15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。
循环次数循环次数决定PCR F增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓
度。一般的循环次数选在30 ?40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。
PCR反应特点
标准的PCR反应体系
标准的PCR反应体系 PCR反应体系与反应条件 -------------------------------------------------------------------------------- 标准的PCR反应体系： 10×扩增缓冲液10ul 4种dNTP混合物各200umolL 引物各10～100mol 模板DNA 01～2ug TqDNA聚合酶25u g2+ 15mmolL 加双或三蒸水至100ul PCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和g2+ 引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。 设计引物应遵循以下原则： ①引物长度：15-30b，常用为20b左右。 ②引物扩增跨度：以200-500b为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。 ③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 ④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。 ⑤引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。 ⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。
⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量：每条引物的浓度01～1umol或10～100mol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。 酶及其浓度目前有两种TqDNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2。5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。 dNTP的质量与浓度dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1NH或1Tris。HCL的缓冲液将其PH调节到70～75，小量分装，-20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50～200umolL，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等(等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与g2+结合，使游离的g2+浓度降低。 模板(靶基因)核酸模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS还能与蛋白质 结合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法， 要防止RNse降解RNA。 g2+浓度g2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umolL时，g2+浓度为15～20mmolL为宜。g2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低TqDNA聚合酶的活性，使反应产物减少。 PCR反应条件的选择 PCR反应条件为温度、时间和循环次数。 温度与时间的设置：基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在TqDNA聚合酶的作用下，使引物链沿模板延 伸。对于较短靶基因(长度为100～300b时)可采用二温度点法，除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸(此温度TqDNA酶仍有较高的催化活性)。
PCR反应条件体系总结
PCR反应体系与反应条件 -------------------------------------------------------------------------------- 标准的PCR反应体系： 10×扩增缓冲液10ul 4种dNTP混合物各200umol/L 引物各10～100pmol 模板DNA 0.1～2ug Taq DNA聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L 加双或三蒸水至100ul PCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+ 引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板D NA在体外大量扩增。 设计引物应遵循以下原则： ①引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。 ②引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。
③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最 好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 ④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生 非特异的扩增条带。 ⑤引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PC R失败。 ⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克 隆很有好处。 ⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量：每条引物的浓度0.1～1u mol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增， 且可增加引物之间形成二聚体的机会。 酶及其浓度目前有两种Taq DNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2。5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高 可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。 dNTP的质量与浓度dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris。HCL的缓冲液将其PH调节到7.0～7.5，小量分装，-20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不
PCR反应体系
PCR反应体系 2007-07-20 11:04:33 PCR反应体系与反应条件 标准的PCR反应体系： 10×扩增缓冲液 10ul 4种dNTP混合物各200umol/L 引物各10～100pmol 模板DNA 0.1～2ug Taq DNA聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L 加双或三蒸水至 100ul PCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+ 引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。 设计引物应遵循以下原则： ①引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。 ②引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。 ③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 ④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3’端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。 ⑤引物3’端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。 ⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。 ⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。 引物量：每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。 酶及其浓度目前有两种Taq DNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。 dNTP的质量与浓度dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP 粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris。HCL的缓冲液将其PH调节到7.0～7.5，小量分装， -20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降
关于PCR总结
PCR总结 若模板为环状质粒，最好先用酶将其切开成线性分子。 酵母、细菌及质粒基因组，每次反应的模板最大加入量分别为10ng，1ng和1pg。 引物的设计原则 1．引物的长度应适宜，一般要求18~25bp，一对引物中两个引物之间的长度差异应小于3bp。 2．基本成分：G+C的含量一般为40%~60%。四种碱基应随机的分布，避免碱基堆积的现象。尤其引物的3’端，不应有连续的3个G或C，否则会使引物与核酸的G或C富集区互补从而影响PCR的特异性。 3．引物自身：引物自身不应有反向重复序列或者大于3bp 的自身互补序列，否则引物自身会折叠形成发夹结构，将影响引物与待增DNA中的靶序列的杂交结合。 4．引物之间：引物之间不应存在互补序列，尤其应避免3’端的互补重叠以免形成引物二聚体。由于PCR反应体系中含有高浓度的引物，即使引物之间存在极为微弱的互补作用也会使引物相互杂交，最终得到引物二聚体的扩增产物。若引物二聚体在PCR反应的早期形成，它们将通过竞争DNA聚合酶、引物及四种单核苷酸从而抑制待增DNA的扩增。通过精心设计引物、应用热启动PCR(hot start PCR)或者降落PCR(touch down PCR)及特制的DNA聚合酶，可以减少引物二聚体的生成。 5．3’末端：引物的3’端（羟基端）是引发延伸的起点，因此一定要与模板准确配对，应尽量避免在引物3’端的第一位碱基是A。引物3’端最佳碱基的选择是G和C，因为他们形成的碱基配对比较稳定。 6．溶解温度：3’端引物和5’端引物应有相似的T m值（不同序列的DNA，Tm值不同。DNA中G-C含量越高，Tm值越高，成正比关系。），其差别不应大于5℃。扩增产物与引物的T m值的差别应小于10℃，以确保PCR循环中的扩增产物有
PCR反应体系有关的过程
PCR反应体系有关的过程 姓名：于烨敏学号：11243220 班级：113 第一部分 1、 PCR原料： DNA模板: 模板包含要用来扩增的靶基因区域，适当提高模板浓度，可减少循环次数，从而减少突变的发生和非特异性产物的形成；但过高的模板浓度会降低反应效率。 上游引物和下游引物： 是人工合成的短的单链DNA片段（寡核苷酸），经常由18-30个碱基组成，用来确定扩增区域的起止位点从而确定扩增的DNA片段大小；物与要扩增的双链DNA的两端精确互补，在退火中可以与DNA模板链特异性地结合。当引物与模板链结合后，DNA聚合酶就开始从引物链的结合位点催化合成新的DNA链。引物的量不能太多，过多的引物导致非特异性扩增的发生和引物二聚体的形成。 聚合酶： 聚合酶从引物结合位点开始沿DNA链移动，阅读DNA编码信息，填充正确的匹配核苷酸，催化DNA新链的合成；来源于生活在热泉中的一种细菌Thermus aquaticus的Taq聚合酶是目前使用最广泛的聚合酶。由于Taq酶没有3'-5'外切酶活性，在复制DNA的过程中可能会随机的引入错误的碱基。对于一般的PCR实验来讲，错误的产生不影响实验的结果；但特定的实验，如扩增的序列是用在测序或蛋白表达等用途时最好使用有较读活性的高保真酶，如Tli或Pfu。由于Taq酶相比其它酶要求的反应条件简单，扩增效率较高，因此可同其它酶混合起来以提高扩增长片段时的保真性。单独使用高保真酶扩增的产物如果与具有黏性末端的载体相连前，通常利用Taq酶在产物的3'末端增加一个多余的A碱基。 四种dNTP（dATP，dCTP，dGTP和dTTP）： 是合成DNA新链的原料。dNTP的量与合成产物的大小有关，越长的片段需要越多的dNTP，但过多的dNTP能增加复制的错误率并可能抑制Taq酶活性。 缓冲液： 为维持DNA聚合酶的活性提供必要的pH值和离子浓度。 Mg离子： Mg离子对于维持聚合酶的活性是必须的，它通过稳定引物－模板相互作用而影响退火进程；同时也能稳定聚合酶同引物－模板形成的复制复合物，因此可以增加非特异性退火，进而形成非特异性产物。许多成分如EDTA和dNTP可以结合一部分Mg离子，所以Mg离子准确的用量需要实验来确定。一般来讲，低浓度的Mg离子增加复制的可信度，而高量的Mg离子降低特异性、引入突变。一般反应可通过变化温度、模板质和量而规避提高Mg量的操作。 添加剂： 1. 7-deaza-dGTP, Glycerol (5-10%), formamide (1-5%) or DMSO (2-10%)：当模板GC
PCR反应中基本成分(引物、dNTP、模板等)的作用
PCR反应中基本成分（引物、dNTP、模板等）的作用 PCR(聚合酶链式反应)反应包括三个基本步骤，即：模板DNA的变性、模板DNA 与引物的退火复性、引物的延伸。PCR反应体系包括5种基本成分，依次为：引物、DNA聚合酶、dNTP、模板DNA、Mg2+。 PCR(聚合酶链式反应)反应包括三个基本步骤，即：模板DNA的变性、模板DNA 与引物的退火复性、引物的延伸。PCR反应体系包括5种基本成分，依次为：引物、DNA聚合酶、dNTP、模板DNA、Mg2+。 1、引物 引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板 DNA在体外大量扩增。 设计引物应遵循以下原则： ①引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。 ②引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。 ③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 ④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3’端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。 ⑤引物3’端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。 ⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。 ⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量：每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。 2、酶 目前有两种Taq DNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反
PCR反应体系中各种成分的作用
PCR反应体系中各种成分的作用 不同模板浓度的实验结果 用相同的引物、两种不同的模板,对6种不同模板量进行ＰＣＲ扩增,发现在模板量<25ｎｇ的条件下,扩增产物强度相应减弱,大约到2ｎｇ左右时无扩增产物;当模板量在25ｎｇ～200ｎｇ之间时,扩增产物基本稳定,条带清晰、稳定,分辨率高;当模板量>200ｎｇ时,会出现大片段扩增产物的缺失或无扩增产物,且点样孔至泳道会出现相应增强的弥散背景。综合考虑,在25μｌ的ＰＣＲ反应体系中,模板ＤＮＡ以25～100ｎｇ为最适用量。同时模板ＤＮＡ在200ｎｇ以下不影响扩增结果,但为降低ＴＥ缓冲液中ＥＤＴＡ对反应体系中Ｍｇ2+的不良影响程度,应该尽量降低ＤＮＡ模板用量。 不同Ｍｇ2+浓度时实验结果 设置不同Ｍｇ2+浓度,当Ｍｇ2+浓度为1 0ｍＭ时,无ＰＣＲ扩增产物;Ｍｇ2+浓度为1 5～2 5ｍＭ时,随着Ｍｇ2+浓度的增加,ＰＣＲ扩增产物带型基本一致,但以2 0ｍＭ的扩增效果最好 不同引物浓度对ＰＣＲ结果的影响 设置5种不同浓度的引物进行ＰＣＲ扩增,当引物浓度在0 1～0 2μＭ时,扩增结果基本一致;但随着引物浓度的逐渐增加,开始出现弥散背景增强的趋势,并且有些扩增带发生减弱或缺失。为了保证反应结果的稳定性和特异性,引物浓度以0 .2μＭ左右为宜。 不同ｄＮＴＰ浓度对ＰＣＲ结果的影响
采用2种引物(ＯＰＢ17、ＯＰＡ16),分别以4种不同的ｄＮＴＰ浓度进行ＰＣＲ反应,发现ｄＮＴＰ浓度在100μＭ、150μＭ、200μＭ、300μＭ时,随着浓度的减小,扩增带明显减少或扩增强度减弱,当ｄＮＴＰ浓度<200μＭ时,扩增产物丰富、清晰、带浓,扩增片段产率与ｄＮＴＰ浓度呈正相关。综合考虑,以100～200μＭ的ｄＮＴＰ浓度为佳。 ＴａｑＤＮＡ聚合酶对扩增结果的影响 设置5个梯度的ＴａｑＤＮＡ聚合酶浓度,结果表明随着ＴａｑＤＮＡ聚合酶浓度的增高,扩增产物量呈增多趋势。在0 5ｕ～2 5ｕ浓度间均有扩增产物,但随着ＴａｑＤＮＡ聚合酶浓度增加的同时,弥散背景也相应增强。综合考虑,ＴａｑＤＮＡ聚合酶浓度以1 0～1 5ｕ结果较好 不同退火温度下的扩增效果 引物用ＯＰＤ16和ＯＰＡ01,按照优化的ＰＣＲ反应体系将退火温度分别设置为33℃、36℃、39℃、42℃。结果表明随着退火温度降低,非特异性产物增加,有弥散背景;退火温度升高,特异性相对增加。 Ｍｇｃｌ2与ｄＮＴＰ互相作用及对ＰＣＲ反应的影响用同一引物ＯＰＤ07、相同模板ＤＮＡ比较3种ＭｇＣｌ2浓度与3种ｄＮＴＰ浓度完全随机相结合的9个处理的ＰＣＲ结果,研究了Ｍｇｃｌ2与ｄＮＴＰ的相互作用。结果表明,Ｍｇｃｌ2在低浓度时,
PCR反应程序
PCR反应程序 1．常规程序 将PCR 反应所需的成分配置完后，在PCR 仪上于94-96℃预加热几十秒至几分钟，使模板DNA 充分变性，然后进入扩增循环。在每一个循环中，先于94℃保持30 秒钟使模板变性，然后将温度降到复性温度（一般50-60℃之间），一般保持 30 秒钟，使引物与模板充分退火；在72℃保持1 分钟（扩增1kb 片段），使引物在模板上延伸，合成DNA ，完成一个循环。重复这样的循环25～35 次，使扩增的DNA 片段大量累积。最后，在72℃保持3-7min ，使产物延伸完整，4℃保存。 2．复性（退火）和延伸温度 复性的温度是PCR 扩增是否顺利的关键因素，通常在50-60℃ 之间。具体的温度主要由引物的Tm 值决定。延伸温度绝大多数设定为72℃。如果复性的温度很高，可以将延伸温度和复性温度设置成同一温度，变成二步法PCR 。 3．反应时间 变性步骤一般使用30 秒钟，如果模板的G+C 含量较高，或直接用细胞做模板，变性时间可适当延长。复性时间有30 秒种一般是足够的。延伸时间由扩增产物的大小决定，一般采用1kb 用1 分钟来保证充足的时间。 4．循环次数 循环次数主要与模板的起始数量有关，在模板拷贝数为104～105 数量级时，循环数通常为25～35 次。 平台效应（plateau effect）：PCR 扩增过程后期会出现的产物的积累按减弱的指数速率增长的现象。原因：底物和引物的浓度已经降低，dNTP 和DNA 聚合酶的稳定性或活性降低，产生的焦磷酸会出现末端产物抑制作用，非特异性产物或引物的二聚体出现非特异性竞争作用，扩增产物自身复性，高浓度扩增产物变性不彻底。 5．PCR 反应液的配制 PCR反应体系的配置方式有时也会影响反应的正常进行。常规方法与其它酶学反应一样，在最后加入DNA 聚合酶。早期的PCR 仪没有带加热的盖子，要求在反应液上覆盖一层矿物油，防止水分蒸发。对于使用具3’-5’ 外切活性的高温DNA 聚合酶时，有时会扩增不出产物。在遇到这个问题时，如果将反应成分分开配制，A 管含模板、引物和dNTP ，以及调整体积的H2O ，B 管含缓冲液、DNA 聚合酶和水，然后再将两管溶液混合起来，可较好地克服这个问题。 按照常规的方法配制反应体系，有时会出现非特异性扩增的问题。
PCR反应体系与反应条件
PCR反应体系与反应条件 标准的PCR反应体系： 10×扩增缓冲液 10ul 4种dNTP混合物各200umol/L 引物各10～100pmol 模板DNA 0.1～2ug Taq DNA聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L 加双或三蒸水至100ul PCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+ 引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。 设计引物应遵循以下原则： ①引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。 ②引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。 ③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 ④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。 ⑤引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。 ⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量：每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。 酶及其浓度目前有两种Taq DNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2。5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。 dNTP的质量与浓度dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP 粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris。HCL的缓冲液将其PH调节到7.0～7.5，小量分装， -20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR 产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。 模板(靶基因)核酸模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质 结合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取
酶切体系及PCR体系
酶切反应体系 1．反应体系尽可能的小。 2．酶切缓冲液为整个体系的十分之一，本实验室内切酶为NEB公司，缓冲液的选择，可参照该公司的使用说明。 3．内切酶的用量为反应体系的十至二十分之一（若为双酶切，则两种酶的总量占总反应体系的十至二十分之一），酶用量过大可能反而不利于酶切（因为内切酶中含有甘油）。4．DNA总量不宜大于2-3ug，否则在进行琼脂糖凝胶电泳时，会产生拖尾现象。 5．一般酶切温度为37℃水浴1-2h (小样鉴定1-2h，如要酶切回收，应切5-8h,特别是单酶切的载体，一定要切全,还应加去磷酸酶1-2h)。 6．一般小样鉴定为20ul总体系（酶一般用0.5ul），酶切回收为50-100ul总体系(酶一般用2-3ul，酶切3-4h后，可补加酶1ul)。 7．一般65℃水浴15分钟，灭活内切酶（也可不灭或，因为加入溴酚蓝后酶就失活了）。8．用0.8-1.2%的琼脂糖凝胶电泳。 PCR反应体系 1．反应体系一般为20-25ul 2．摸板：菌液2-5ul,质粒0.5-1ul,病毒DNA3-5ul 3．引物：25umol/l 各0.5ul 4．dNTP : 0.5ul 5．10X Buffer: 如含Mgcl2的为总体系的十分之一（2-2.5ul）,如不含Mg cl2，应加入Mgcl2溶液1.5ul 6．Taq酶：0.5ul 7．加入Milli Q水，补齐至20-25ul PCR参数 1．95-96℃3-5 min 2. 95-96℃30-40 Sec 3. (TM-5℃)一般为45-60℃30-40 Sec 4．72℃ 30-180 Sec（一般一分钟为1000个碱基）5．72℃链延伸10 min 6. 10℃保存 以上只用于普通PCR，一般为鉴定用。
PCR体系优化
由于Taq DNA聚合酶是目前PCR反应体系中应用最广泛的酶，因此此文主要讨论使用该 酶的PCR反应体系。 A镁离子浓度 镁离子是热稳定DNA聚合酶的辅因子，其浓度对PCR至关重要。模板DNA的浓度，鳌合物（如EDTA和柠檬酸盐）、dNTP浓度和蛋白都会影响反应体系中游离镁离子的量。如果游离的镁离子含量不够，那么Taq DNA聚合酶则无法行使功能（figurel）。过多的游离镁离子 则会降低酶的保真度，可能会增加非特异性扩增。因此，研究者应当根据实际的实验结果来 优化每一反应中镁离子的浓度。可以用一系列的镁离子浓度梯度来验证，镁离子浓度范围为 1~4mM每次增加或降低 0.5~1 mM扩增产量最高，非特异性产物最低时的镁离子浓度即为最优。最优镁离子的浓度范围跟DNA聚合酶的类型相关，例如， Pfu DNA聚合酶似乎对镁离 子的依赖性更低，但其优化范围通常为2~6mM 许多DNA聚合酶产品提供 Mg-free reaction buffer和单独一管 25mMMgCl2，这样就可以自行调节 Mg+浓度，优化反应体系。MgC2溶液在反复冻融后会出现浓度分层，为获得均 一的溶液，在配液的时候，要确保MgCb溶液完全溶解并充分震荡混匀。非常简单的两步， 溶解和混匀，常常会造成实验失败。 有些科学家倾向于使用包含MgCb的buffer , MgC2的终浓度为1.5mM。值得注意的是有 文献报道发现使用此类buffer的结果并不稳定，有时体系内游离镁离子的浓度会有0.6mM 的变化，如果在90C加热10min，则结果趋于稳定，因此作者假设反复冻融的buffer中MgCb 可能会有沉淀现象发生。 M12345678 2.645 1.605 1.198- 0 0.5 10 1.5 2,0 2.5 3,0 3.5
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理论上，只要知道任何一段模板dna序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用pcR就可将模板dna在体外大量扩增。 设计引物应遵循以下原则： ①引物长度：15-30b，常用为20b左右。 ②引物扩增跨度：以200-500b为宜，特定条件下可扩 增长至10kb的片段。 ③引物碱基：g+c含量以40-60%为宜，g+c太少扩增效 果不佳，g+c过多易出现非特异条带。atgc最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 ④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。 ⑤引物3端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致pcR失败。 ⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。 ⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量：每条引物的浓度01～1umol或10～100mol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。