酶与酶工程实验

暨南大学本科实验报告专用纸

课程名称酶与酶工程实验成绩评定

实验项目名称从植物材料中提取过氧化氢酶指导教师李任强

实验项目编号实验项目类型实验地点

学生姓名郑子豪学号 2010052045

学院生命科学技术学院系生物工程学专业生物技术

实验时间2012年9月20日下午~ 9月27日下午温度 25 ℃湿度

一实验目的

1.1 学习从植物材料中制备过氧化物酶的方法。

1.2 了解纯化酶的一些基本步骤。

1.3 掌握酶含量与活性测定的方法。

二实验原理

过氧化物酶是一类以铁卟啉环为辅基的氧化酶，可溶于水，溶解度约为5％（w/v)，溶液棕色透明，许多植物如辣根、柑橘叶子、白萝卜等含有较多的过氧化物酶，在这些植物材料的溶出物中，加入不同浓度的硫酸铵进行分段盐析，由于该酶可溶于0.58饱和度以下的硫酸溶液，而在0.62饱和度以上则不溶，可由此对过氧化物酶进行粗提，然后用有机溶剂沉淀、结晶等方法可对该酶进行纯化、得到较纯的制品。过氧化物酶能催化愈创木酚瓜产生有色物质，以此可用分光光度计测其含量及活性，对实验结果进行检测。

三实验器材

3.1材料：新鲜柑橘叶

3.2试剂：愈创木酚、0.2mol/l磷酸缓冲液、0.004％过氧化氢、硫酸铵

3.3仪器：高速组织捣碎机、冰箱、紫外可见分光光度计、离心机

四实验步骤

4.1粗酶提取液的制备

取新鲜柑橘叶剪碎后用捣碎机捣烂（加少许纯净水使总体积少于200ml),转移到500ml烧杯中（冰浴）加水至200ml，于冰箱中浸提约1小时（中间多次搅动）。

4.2第一次盐析纯化

上述样品经多层纱布挤压过滤后以4000r/min离心15min，10ml上清液用来测酶活力，其余上清液测体积后按226g/l加硫酸铵盐析，冰箱中静置半小时以上。

4.3第二次盐析纯化

以上上清液以4000r/min离心15min后去沉淀，再按258g/l加硫酸铵盐析，冰箱中静置。

4.4透析去盐

离心收集沉淀，用水溶解至约10ml，用水透析去盐，离心去沉淀，取部分酶液稀释后测活力，其余酶液用作精制样品。

暨南大学本科实验报告专用纸（附页）

4.5第一次丙酮纯化

在搅动下沿着杯壁加入一倍体积预冷（-15℃）的丙酮于酶液中，混匀，静置10min，低温离心（8000r/min,4℃) 去沉淀。

4.6第二次丙酮纯化

按上清液与丙酮之比为1: 0.8 ，再次加入预冷丙酮，静置10min 后离心（8000r/min,4℃),收集沉淀，溶于少量水中。

4.7透析去丙酮

将上述样液透析去丙酮，然后测定其酶活力，最后冷冻干燥酶液得较纯的酶制品。

4.8酶活性测定方法

按下表于试管中加入试剂（ml):

管号0.2mol/l磷酸缓冲液

pH6.0

0.05％愈创木酚酶液0.04％过氧化氢水

1 1 1 1 0 1

2 1 1 1 0 0

3 0 0 0 1 0

在37℃保温10min，管1作为对照在时间扫描470nm调好零点，混合管2与3，即倒入比色杯中进行470nm的时间扫描，读取30s或60s时（直线部分）的OD值，测定OD280和OD260，计算出蛋白含量。以OD470/毫克蛋白质×分表示酶比活和以OD470/克鲜重×分表示酶活性。

五数据处理

5.1 数据记录

5.1.1 新鲜柑橘叶30.11 g , 得到粗酶提取液V= 225.00 ml

5.1.2 第一次盐析中，除去10 ml用于测活后：

实际加入硫酸铵48.59 g

5.1.3 第二次盐析中，上清液V= 242.00 ml

实际加入硫酸铵62.43 g

5.1.4 沉淀经溶解透析后为11.00 ml,其中1.00 ml用于测活，其余经丙酮沉淀纯化：

第一次丙酮沉淀：样品V= 10.00 ml 丙酮V’= 10.00 ml

第二次丙酮沉淀：样品V= 17.30 ml 丙酮V’= 13.84 ml

最后沉淀溶于2.50 ml水中

5.1.5 酶活性和酶含量测定结果：

含量活性(OD470)

稀释倍数OD260 OD280 稀释倍数30s 60s 粗酶提取液300 0.177832 0.181087 50 0.130962 0.244384 经两次盐析纯化并透析200 0.334881 0.370269 200 0.216246 0.385715 经两次丙酮沉淀并透析30 0.111658 0.116403 200 0.474748 0.776141

5.2 数据计算与分析

5.2.1 数据计算.含有核酸的蛋白质溶液，可分别测定其A280和A260，由此吸收差值，用下面的

经验公式，即可算出蛋白质的浓度,蛋白质浓度=1.45×A280－0.74×A260(mg/ml)。而蛋白质含

量(mg/ml)= 蛋白质浓度×稀释倍数。而酶的比活=OD470/(毫克蛋白质×min) ,克鲜重=新鲜柑橘

叶质量/粗酶提取液V ,活性= OD470/(克鲜重×min) 。

经计算:

粗酶提取液经两次盐析纯化并透析经两次丙酮沉淀并透析蛋白含量(mg/ml) 41.91 57.82 2.586

酶比活(mg×min) 0.2706 1.172 46.62

酶活性(g×min) 84.77 25.92 11.52 纯化倍数 4.331 39.78

活性回收率0.3058 0.4444 总纯化倍数=纯化后酶比活/粗酶酶比活=46.62/0.2706=172.28,

总活性回收率=纯化后酶活性/粗酶酶活性=11.52/84.77=0.1359。

5.2.2 结果分析.

经实验证明,本次提取的酶具有活性.而本实验的纯化倍数达172.28倍,纯化效果良好.而总活性回收率为0.1359,酶活性下降说明在操作过程中有大部分的酶损失或失活,而这些损失或失活有可能是在离心或盐析的过程中造成的.另一方面,本实验是通过使用紫外分光光度计来测定酶和蛋白质的浓度的,随着纯化和浓缩的进行,样品中的杂蛋白也在不断被除去,这也是导致溶液OD值大幅降低的重要原因,同时它也在酶活性下降的结果中体现出来。

通过实验的结果来比较盐析和丙酮沉淀的纯化效果,不难看出,丙酮沉淀法的纯化效果更好,但其活性回收率则比盐析法要低,说明两种方法的优点各异,若要得到纯度高的酶制剂,则应选用丙酮沉淀法提纯;而若要得到活性高的酶制剂,则应选用硫酸铵等盐进行分段盐析。

六思考题

6.1纯化前后酶比活的变化说明了什么?

答:纯化后酶比活的提高说明单位质量的酶蛋白在一分钟内使OD470增大的能力提高了,也就说明了纯化后的酶制剂的纯度更高。单位质量酶制剂的酶浓度提高了,酶制剂的效价就提高了。

6.2 纯化前后酶活性(OD470/克鲜重×min)的变化又说明什么?这些数据有何意义?

答:纯化后酶活性在不断下降,说明纯化的过程中大部分杂蛋白都被除去了,而酶也有部分被除去或在纯化过程中失活,从而使0D260和0D280下降.这些数据的意义在于,显示一次纯化过程的效果,即杂蛋白去除效果和活性酶的保留效果。

基因工程中常用的三种工具酶

一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease） 1．定义：凡能识别和切割双链DNA分子内特定核苷酸序列的酶，也称为限制酶（restriction enzyme，RE）。 2．类型：来自原核生物，有三种类型。 Ⅰ型：兼具甲基化修饰和ATP参与的核酸内切酶活性，随机切割。 Ⅱ型：大多能特异识别4～6个核苷酸序列（回文结构），最大识别序列为8个核苷酸，如SfiI、NotI；但有近10种Ⅱ型限制酶的识别序列为非回文结构，如SfaNI、MnlI等，Ⅱ型限制酶均可作为基因工程的工具酶。另有一些来源不同的限制酶的识别位点是相同的核苷酸序列，将这类酶特称为同工异源酶（isoschizomers）或同裂酶。同工异源酶切割产生相同的末端；有一些同工异源酶对于切割位点上的甲基化碱基的敏感性有所差别，故可用来研究DNA 甲基化作用，如SmaI和XmaI；HpaII和MspI；MboI和Sau3AI是成对的同工异源酶；其中HpaII和MspI是一对同工异源酶，其识别位点是CCGG。与同工异源酶对应的一类限制酶，它们虽然来源各异，识别序列也各不相同，但都产生出相同的粘性末端，称为同尾酶（isocaudamers）。常用的限制酶BamHI、BclI、BglII、Sau3AI和XhoII就是一组同尾酶，它们切割DNA之后都形成由GATC4个核苷酸组成的粘性末端。显而易见，由同尾酶所产生的DNA片段，是能够通过其粘性末端之间的互补作用而彼此连接起来的，因此在基因克隆实验中很有用处。但必须指出，由两种同尾酶消化产生的粘性末端，重组之后所形成的序列结构再不能被原来的任何一种同尾酶所识别。 Ⅲ型：功能基本同Ⅰ型，但为特定位点切割。 三种限制酶的区别如下表所示： Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型 DNA底物dsDNA dsDNA dsDNA 辅助因子Mg2+,A TP,SAM Mg2+ Mg2+,A TP 识别序列特异特异特异 切割位点非特定（于识别序列前后100~1000bp范围之内）特定（切割于识别序列之中或近处，固定位点）特定（切割点在识别序列后25~75bp处） 与甲基化作用的关系内切酶蛋白同时具有甲基化酶的作用酶蛋白不具有甲基化作用内切酶蛋白同时具有甲基化酶的作用 3．命名：第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株。另外用罗马数字代表同一菌株中不同限制酶的编号，现在常用来表示发现的先后次序。如HindⅢ是来自Haemophilus influenzae D（嗜血流感杆菌D 株第三种限制酶）。 4．切割位点和结果：限制酶位点在DNA链上是随机分布的，若识别位点为4bp，则44（256）个核苷酸可遇一个切点。若为6bp，则平均46（4096）个核苷酸才遇到一个切点。限制酶沿回文结构的对称轴切开，则产生平头末端（flush or blunt ends）如BalⅠ。多数限制酶错位

酶工程实验(2010)

酶工程实验(2010)

实验一植物体内过氧化物酶活性的测定 一、目的 过氧化物酶普遍存在于植物组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能有一定关系，它在代谢中调控IAA水平，并可作为一种活性氧防御物质，消除机体内产生的H2O2的毒害作用。故在科研上常加以测定。 二、原理 在过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶竭色4－邻甲氧基苯酚，在470nm 波长处测定生成物的吸光度（A）值，即可求出该酶活性。 三、材料、仪器设备及试剂 1. 材料：植物叶片 2. 仪器设备：分光光度计；离心机；离心管；研钵；移液管；移液管架；试管；试管架；洗耳球。 3. 试剂及配制： 0.1mol·L－1磷酸缓冲液（pH7）。

反应液（100ml 0.1mol·L－1磷酸缓冲液（pH6）中加入0.5ml 愈创木酚、1ml 30﹪H2O2，充分摇匀）。 四、实验步骤 1. 酶液提取 称取植物叶片1g，剪碎置于已冷冻过的研钵中，加入少量石英砂，分两次加入总量为10ml pH7磷酸缓冲液，研磨成匀浆后，倒入离心管中，在8000 r / min离心15min，上清液即为粗酶提取液，倒入小试管低温下放置备用。 2. 酶活性测定 吸取反应液3ml 于试管中，加入酶提取液0.02ml（视酶活性可增减加入量），迅速摇匀后倒入光径1cm的比色杯中，以未加酶液之反应液为空白对照，在470nm波长处，以时间扫描方式，测定3min内吸光度值变化，取线性变化部分，计算每分钟吸光度变化值（△A470）。 五、酶活性计算 按下式计算酶的相对活性 △A470 ×酶提取液总量（ml）

酶活性（△A470·g－1Fw·min－1）= ------------------- 样品鲜重（g）×测定时酶液用量（ml） 实验二尿液淀粉酶活力测定(Winslow氏法) 原理】 临床上通常用Winslow氏法测定尿或血清中淀粉酶活力.该法对 淀粉酶活性单位的规定是:在37℃,30分钟,恰好能将0,1%淀粉 溶液1ml水解(指加入碘液后不再呈蓝色或红色)的酶量定为一个活 力单位. 试剂和器材】 1,0.9%氯化钠 2,0.1%淀粉 3,碘化钾-碘溶液(20克碘化钾和10克碘溶于100毫升水中,使 用前稀释10倍)

酶工程习题

第一章 习题: 1、根据分子中起催化作用得主要组分得不同,酶可以分为_______与_______两大类别。 2、核酸类酶分子中起催化作用得主要组分就是________,蛋白类酶分子中起催化作用得主要组分就是___________。 3、进行分子内催化得核酸类酶可以分为_______,_______。 4、酶活力就是_____得量度指标;酶得比活力就是__________得量度指标;酶转换数就是________得量度指标。 5、某酶得分类编号就是EC2、2、1、10,其中EC就是指_______。此酶属于_______类型。 6、醇脱氢酶参与得反应表明无氧气参与( ) 7、酶工程就是_____________得技术过程。 8、酶得转换数就是指 A、酶催化底物转化为产物得数量 B、每个酶分子催化底物转化为产物得分子数 C、每个酶分子每分钟催化底物转化为产物得分子数 D、每摩尔酶催化底物转化为产物得分子数 9、酶得改性就是指____________________________、 第二章 1、名词解释 转录、组成型酶、酶得反馈阻遏、分解代谢物阻遏、生长偶联型 2、微生物产酶模式可以分为同步合成型________、中期合成型、________。 3、可以通过添加( )使分解代谢物阻遏作用解除。 A、诱导物 B 激活剂C、cAMP D、ATP 4、在酶发酵过程中添加表面活性剂可以 A、诱导酶得生物合成 B、阻遏酶得生物合成 C、提高酶活力 D、提高细胞通透性 5、为什么滞后合成型得酶要在细胞生长一段时间甚至进入平衡期以后才开始合成？ 6、操纵子就是由_________、_______与启动基因组成得。 7______________与______就是影响酶生物合成模式得主要因素。 8、RNA前体得加工就是指____________ ?6、从如下实验方法与结果分析酶生物合成得调节作用。 实验方法:将大肠杆菌细胞接种于营养肉汤培养基中,于37°C振荡培养,当OD550为0、3时,经培养液分装到4个小三角瓶中,每瓶17ml培养液。于4个三角瓶分别添加 (A)3ml无菌水 (B)1ml乳糖溶液(0、1mol/L)与2ml无菌水 (C)1ml乳糖溶液(0、1mol/L)、1ml葡萄糖溶液(0、1mol/L)与1ml无菌水 (D) 1ml乳糖溶液(0、1mol/L)、1ml葡萄糖溶液(0、1mol/L)与1mlcAMP钠盐溶液 ?然后在相同得条件下于37°C振荡培养2h,分别取样测定β半乳糖苷酶得活力。 ?实验结果(A)与(C)瓶得β半乳糖苷酶得活力为0,(B)瓶与(D)瓶β半乳糖苷

01【课堂笔记】《蛋白质与酶工程》-酶的分离与纯化02部分

第一章酶的分离提取与纯化 1.1离心分离和层析分离 1.1.1酶的提取方法 离心是利用离心机旋转所产生的的离心力以及物质的沉降系数或浮力密度的差异，进行分离浓缩和提纯生物样品的一种方法。 离心分离时，要根据待分离物质以及杂志的颗粒大小、密度和特性的不同，选择适当的离心机、离心方法和离心条件。 1.1.1.1离心机的种类与用途 常速离心机，高速离心机，超速离心机 1)常速离心机：转速<8000 r/min 用途：分离细胞、细胞碎片、培养基残渣 及粗结晶等较大颗粒 2)高速离心机：转速：1~2.5*104 r/min 用途：分离各种沉淀物、细胞碎片 及较大的细胞器 3)超速离心机：转速：2.5~12*104 r/min 用途：用于DNA、RNA、蛋白质 等生物大分子以及细胞器、病毒的分离纯化 1.1.1.2离心方法 差速离心，密度梯度离心，等密度梯度离心 1)差速离心：原理：是采用不同的离心速度和离心时间，是沉降速度不同的颗 粒分不分离的方法。用途：分离沉降系数相差较大的蛋白质分子 2)密度梯度离心原理：不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用 下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带的方法。 常用介质：蔗糖、甘油 3)等密度梯度离心：原理：当待分离的不同颗粒的密度范围在离心介质的密 度梯度范围内时，不同浮力密度的颗粒在离心力作用下一直移动到与各自浮力密度相等的位置，形成区带。介质：铯盐 1.1.1.3层析分离技术 又称色谱技术，是一种物理的分离方法。利用混合物中的各组分的物理化学性质（分子的大小和形状，分子极性，吸附力，分子亲和力）的不同，使各组分以不同的程度分布在两个相中，其中一个相为固定的（固定相），另一个相则流过固定相（流动相）并使各组分以不同速度一定，从而达到分离 根据分离原理分类 吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶层析和亲和层析等 1)吸附层析 原理：是利用吸附剂对不同物质的吸附力不同，而使混合物中各组分分离的方法。 2)分配层析 原理：在一个有两相同时存在的溶剂系统中，根据不同物质的分配系数不同而达到分离目的的一种层析技术。

酶工程实验大纲

湖北大学 酶工程实验 （0818800193）实验教学大纲 （第2版） 生命科学学院 生化教研室 2014年7月

前言 课程名称：酶工程实验实验学时：16学时 适用专业：生物工程课程性质：必修 一、实验课程简介 酶工程是生物工程的主要内容之一，是现代酶学和生物工程学相互结合而发展起来的一门新的技术学科。它将酶学、微生物学的基本原理与化工、发酵等工程技术有机结合起来，并随着酶学研究的迅速发展，特别是酶的广泛应用而在国民生产生活中日益发挥着越来越重要的作用。酶工程实验课是生物工程等本科实验教学的一个重要组成部分，通过实验教学可以加强学生对酶工程基本知识和基本理论的理解，掌握现代酶学与相关技术的有关的基本的实验原理与技能。在实验过程中要求学生自己动手，分析思考并完成实验报告。酶工程实验性质有基础性、综合性、设计（创新）性三层次。 二、课程目的 本实验课程主要根据酶工程的三大块内容即酶的生产、酶的改性与酶的应用来设计安排实验，通过这些实验内容，使学生深入理解酶工程课程的基本知识；巩固和加深所学的基本理论；掌握酶工程中基本的操作技能。同时，通过实验培养学生独立观察、思考和分析问题、解决问题和提出问题的能力，养成实事求是、严肃认真的科学态度，以及敢于创新的开拓精神；并在实验中进一步提高学生的科学素养。 三、考核方式及成绩评定标准 考核内容包括实验过程中的操作情况，实验记录及结果的准确性，实验报告的书写及结果分析，思考题的回答情况，仪器设备的使用情况及遵守实验室规章制度的情况等，根据这些方面进行成绩评判和记录，综合给出实验总成绩。 四、实验指导书及主要参考书 1．魏群：生物工程技术实验指导，高等教育出版社，2002年8月。 2．禹邦超：酶工程（附实验），华中师范大学出版社，2007年8月 五、实验项目

酶工程实验一

实验目的：①、了解掌握双酶法制备淀粉糖。 ②、掌握用3,5-二硝基水杨酸法测定葡萄糖含量的方法。 目前国内外淀粉糖的生产大都采用双酶法。双酶法生产淀粉糖是以淀粉为原料，先经α-淀粉酶液化成糊精，再用糖化酶催化生成淀粉糖浆。α-淀粉酶又称为液化型淀粉酶，它作用于淀粉时，随机地从淀粉分子内部切开α-1，4葡萄糖苷键，使淀粉水解成糊精和一些还原糖。糖化酶又称为葡萄糖淀粉酶，它作用于淀粉时，从淀粉分子的非还原端开始逐个地水解α-1，4葡萄糖苷键，生成葡萄糖和一些低聚糖。且糖化酶还有一定的水解α-1，6葡萄糖苷键和α-1，3葡萄糖苷键的能力。 1．仪器：恒温水浴器、烧杯、玻璃棒、天平、量筒及其他常规仪器用具。 2．试剂：生粉、α-淀粉酶、糖化酶、0。1mol/L HCI、无水CaCl2、。碘液、活性炭。1．液化： 取12g生粉，加150mL水配制成淀粉浆，加入0.1gCaCl2，2gα-淀粉酶，在75℃温度下保温45min，使淀粉液化成糊精。液化中可每隔3分钟搅拌一下, 每隔15分钟用碘反应检测，观察颜色变为褐色或棕色的情况，记录观察结果。45min后升温至100℃并保温10min。 2．糖化： 将液化淀粉液冷却至55℃～60℃，用0.1m1/LHCl调pH至4.5～5.0，加入0.5g糖化酶，将水浴槽温度升至60℃，保温糖化过夜，使糊精转变为葡萄糖和低聚糖(淀粉糖浆)。 3．脱色： 淀粉糖浆中加入1g活性炭，在80℃下搅拌15min后，抽滤，得浅黄色透明糖液。 4. 所得糖液中葡萄糖含量的测定。取1 m1滤液，加水稀释到10ml，用3,5-二硝基水杨酸法测定葡萄糖含量。

a=(0.406-0.0648)/0.5341=0.64 b=(0.395-0.0648)/0.5341=0.62 实验现象观察 1 6 7 思考题： 1液化时加入0.1gCaCl2的目的是什么？ 答：钙离子有提高热稳定性的作用。 2液化后冷却和调pH的目的是什么? 答：盐酸容易挥发，所以要冷却。 调ph是为了提供酶催化的环境。

酶工程实验碱性磷酸酶实验报告

猪肝中碱性磷酸酶的分离纯化及部分性质研究实验报告 摘要：碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，简称ALP)广泛存在于微生物和动物体内，是一种非特异性磷酸单酯酶。本实验材料取自猪肝，采用有机溶剂沉淀分离纯化其中所含的碱性磷酸酶，运用终止法和考马斯亮蓝法测定其酶活力和蛋白质含量。根据酶活力变化，进行不同温度，PH对该酶的影响的实验，得出最适温度和最适PH。 关键词：碱性磷酸酶；有机溶剂沉淀；酶活力；PH；温度 1 前言 碱性磷酸酶是广泛分布于人体肝脏、骨骼、肠、肾和胎盘等组织经肝脏向胆外排出的一种酶。碱性磷酸酶是一种能够将对应底物去磷酸化的酶，即通过水解磷酸单酯将底物分子上的磷酸基团除去，并生成磷酸根离子和自由的羟基，这类底物包括核酸、蛋白、生物碱等。而该脱去磷酸基团的过程被称为去磷酸化或脱磷酸化。本实验中所用的猪肝中的碱性磷酸酶含量颇高，且其活性可在较长时间内得以保持。 1.1实验目的 掌握以有机溶剂分离技术提取蛋白质及酶的原理和方法；酶蛋白纯化过程中的活性、比活性、得率及纯化倍数的概念及计算；了解AKP的临床意义及纯化蛋白质的一般方法。 1.2 实验试剂与仪器 1.2.1 实验仪器 电子天平；匀浆器；紫外可见分光光度计；高速冷冻离心机；PH计；磁力加热搅拌机 1.2.2实验试剂及配制 95%乙醇、丙酮、正丁醇、醋酸镁、醋酸钠、Tris、考马斯亮蓝G－250、硫酸镁、氢氧化钠 （1）0.01mol/L醋酸镁－0.01mol/L醋酸钠混合溶液：取0.5mol/L醋酸镁20mL 及0.1mol/L醋酸钠100mL，混匀后加蒸馏水稀释至1000mL。 （2）0.01mol/L Tris-硫酸镁缓冲液（pH8.8）：称取三羟甲基氨基甲烷（Tris）12.1g，用蒸馏水溶解，并稀释至1000mL，配制0.1mol/L Tris溶液；取0.1mol/L Tris溶

蛋白质与酶工程复习资料

酶工程复习提纲 第一章绪论 1.酶及酶工程的概念。 酶：是生物体内一类具有催化活性和特殊空间构象的生物大分子物质。 酶工程：利用酶的催化作用，在一定的生物反应器中，将相应的原料转化成所需产品的一门工程技术。(名词解释) 2.了解酶学的发展历史，尤其是一些关键事件。 1833年，Payen和Persoz发现了淀粉酶。1878年，Kuhne首次将酵母中进行乙醇发酵的物质称为酶。给酶一个统一的名词，叫Enzyme，这个词来自希腊文，其意思“在酵母中”。 1902年，Henri提出中间产物学说。1913年，Michaelis and Menton推导出酶催化反应的基本动力学方程，米氏方程：V=VmS/（Km+S）。1926年，Summer分离纯化得到脲酶结晶。人们开始接受“酶是具有生物催化功能的蛋白质”。Cech and Altman于1982和1983年发现具有催化活性的RNA即核酸类酶，1989年获诺贝尔化学奖。现已鉴定出5000多种酶，上千种酶已得到结晶，而且每年都有新酶被发现。 3.了解酶在医药、食品、轻工业方面的应用。 医药：（1）用酶进行疾病的诊断：通过酶活力变化进行疾病诊断，谷丙转氨酶/谷草转氨酶用于诊断肝病、心肌梗塞等，酶活力升高；葡萄糖氧化酶用于测定血糖含量，诊断糖尿病。 （2）用酶进行疾病的治疗：来源于蛋清、细菌的溶菌酶用于治疗各种细菌性和病毒性疾病；来源于动物、蛇、细菌、酵母等的凝血酶用于治疗各种出血病；来源于蚯蚓、尿液、微生物的纤溶酶用于溶血栓。 （3）用酶制造各种药物：来源于微生物的青霉素酰化酶用于制造半合成青霉素和头孢菌素；来源于动物、植物、微生物的蛋白酶用于生产L-氨基酸。 食品：生产低聚果糖，原料为蔗糖，所需酶为果糖基转移酶、蔗糖酶α（黑曲霉、担子菌）；生产低聚异麦芽糖，原料为淀粉，所需酶为α-淀粉酶、β-淀粉酶、真菌α-淀粉酶（米曲霉）、α-葡萄糖苷酶（黑曲霉）、普鲁兰酶、糖化型α-淀粉酶（枯草杆菌）。 轻工业：用酶进行原料处理；用酶生产各种轻工、化工产品；用酶增强产品的使用效果。

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酶工程的知识点总结 课题3 探讨加酶洗衣粉的洗剂效果 一、实验原理 1．加酶洗衣粉是指含有酶制剂的洗衣粉，目前常用的酶制剂有四类：蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纤维素酶，其中，应用最广泛、效果最明显的是碱性蛋白酶和碱性脂肪酶。b5E2RGbCAP 2．碱性蛋白酶能将血渍、奶渍等含有的大分子蛋白质水解成可溶性的氨基酸或小分子的肽， 使污迹从衣物上脱落。脂肪酶、淀粉酶和纤维素酶也能分别将大分子的脂肪、淀粉和纤维素水解为小分子物质，使洗衣粉具有更好的去污能力。p1EanqFDPw 3．在本课题中，我们主要探究有关加酶洗衣粉的三个问题：一是普通洗衣粉和加酶洗衣粉 对衣物污渍的洗涤效果有什么不同；二是在什么温度下使用加酶洗衣粉效果最好，三是添加不同种类的酶的的洗衣粉，其洗剂效果有哪些区别。DXDiTa9E3d 二、实验步骤 1探究用加酶洗衣粉与普通洗衣粉洗涤的效果的不同 ①在2个编号的烧杯里，分别注入500mL清水。②取2块大小相等的白棉布，用滴管在每 块白布上分别滴上等量的墨水，分别放入烧杯里，用玻璃棒搅拌。③将2个烧杯分别放入同等温度的温水中，保温5分钟。④称取5克加酶洗衣粉和5克普通洗衣粉2份，分别放入2个烧杯中，用玻璃棒均匀搅拌。保温10分钟。⑤观察并记录2个烧杯中的洗涤效果RTCrpUDGiT 2探究用加酶洗衣粉洗涤的最佳温度条件 ①在3个编号的烧杯里，分别注入500mL清水。②取3块大小相等的白棉布，用滴管在每 块白布上分别滴上一滴食用油、鸡血、牛奶，分别放入烧杯里，用玻璃棒搅拌。③将3个烧杯分别放入50摄氏度的热水、沸水和冰块中，保温5分钟。④称取5克加酶洗衣粉3份，分别放入3个烧杯中，用玻璃棒均匀搅拌。保温10分钟。⑤观察并记录3个烧杯中的洗涤效果。3探究不同种类的加酶洗衣粉洗涤的效果5PCzVD7HxA 污染物蛋白酶洗衣粉脂肪酶洗衣粉复合酶洗衣粉普通洗衣粉 油渍 汗渍 血渍 观察并记录四种洗衣粉分别洗涤三种污染的洗涤效果。三、注意事项 1．变量的分析和控制 影响加酶洗衣粉洗涤效果的因素有水温、水量、水质、洗衣粉的用量，衣物的质料、大 小及浸泡时间和洗涤的时间等。在这些因素中，水温是我们要研究的对象，而其他因素应在实验中保持不变。选择什么样的水温进行实验需要实验者根据当地一年中的实际气温变化来 确定水温，通常情况下，冬季、春季、秋季和夏季可分别选取 5 ℃、15 ℃、25 ℃和35 ℃的水温，因为这4个水温是比较符合实际情况的，对现实也有指导意义。jLBHrnAILg 2．洗涤方式和材料的选择。 在洗涤方式中有机洗和手洗两种方式，应考虑其中哪一种比较科学？哪一种更有利于控 制变量？再有，洗衣机又可以分为半自动和全自动两种，相比之下，采用全自动洗衣机比较好，并且应该尽量使用同一型号小容量的洗衣机，其机械搅拌作用相同。关于洗涤材料的选择也有一些讲究。用衣物作实验材料并不理想，这是因为作为实验材料的衣物，其大小、颜 色、洁净程度等应该完全一致，而这并不容易做到；此外，人为地在衣物上增加污物，如血 渍、油渍等，也令人难以接受。因此，选用布料作为实验材料比较可行。在作对照实验时，

酶工程实验试题及答案

1、酶的固定化方法：吸附法、包埋法、共价结合法、热处理法 2、提取酶的有机溶剂有：甲醇、乙醇、丙醇、丙酮、异丙醇、 3、酶生产的主要方式：固体发酵、液体深层通气发酵、固定化细胞或固定化原生质体发酵 4、酶的抽提剂有：稀酸、稀碱、稀盐、稀有机溶剂等 5、测定酶蛋白含量的方法： 凯氏定氮法、双缩尿法、Folin 酚法、紫外法、色素结合法、BCA法、胶体金测定法 6、影响酶活力的主要因素：温度、PH、底物浓度、酶浓度、抑制剂、激活剂 7、包埋固定化酶的凝胶有：聚丙烯酰胺、聚丙烯醇、光敏树脂、琼脂、明胶、海藻酸钙 8、酶的回收率：是指直接测定的固定化酶的活力占固定化之前的活力的百分比。 9、纯化倍数：就是经过纯化后得到的比活力与纯化前比活力之间的比值。 10、盐析的原理：蛋白质溶液在一定浓度范围内，加入无机盐，随着盐浓度增大，蛋白质的溶解度增大，但当盐浓度增到一定限度后，蛋白质将从溶液中析出。 11、在酶的反应过程中如何确保酶的最适反应温度和最适pH值。 保证最适温度的方法：通过发酵罐的热交换设施，控制冷源或热源流量；通过曲室的通风和加热设备控制。保证最适pH的方法：加酸或加碱，加碳源或氮源物质。 12、在发酵产酶过程中的准备工作： 收集筛选菌种，菌种保藏，细胞活化，扩大培养，培养基的配置，对发酵条件的控制。 13、为什么在测酶活实验中要连续不断的测酶活和酶蛋白含量 因为酶的活性会受温度和PH值的影响 14、终止酶反应的方法： 1、迅速升高温度； 2、加入强酸、强碱、尿素、乙醇等变性剂； 3、加入酶抑制剂； 4、调节反应液pH值。 15、固定化的优点： 1、可反复使用，稳定性高； 2、易与底物和产物分开，便于分离纯化； 3、可实现连续生产，提高效率。 16、培养基的成分：碳源、氮源、无机盐、生长因素、水。 17、菌种保藏方法： 1、斜面低温保藏法 2、液体石蜡油保藏法 3、砂土管保藏法 4、真空冷冻干燥法 5、液氮超低温保藏法。 18、发酵产酶的操作过程：配置培养基、分装、灭菌（112℃—115℃，20min）、孢子悬液（将无菌水加入斜面培养基）、接种、培养（32℃，180r/min，培养72h） 19、测定酶活的方法： 1、在一定时间内，让适量的底物与酶在最适合条件下； 2、加入酶抑制剂或升高温度等方法快速终止酶反应； 3、加一定量的显色剂与底物反应，测定液体的吸光度； 4、根据吸光度值计算出酶活 20、壳聚糖酶如何筛选：采用透明圈法，透明圈法直观、方便、根据壳聚糖不溶于水，以壳聚糖为唯一碳源，培养基浑浊。如果有该酶存在，即可降解壳聚糖为壳寡糖，壳寡糖容易被分解吸收，所以形成透明圈，从而可筛选出产生壳聚糖酶的菌株21、产壳聚糖酶初筛平板有什么现象，为什么 会出现透明圈，其原因是根据壳聚糖不溶于水，以壳聚糖为唯一碳源，培养基浑浊。如果有该酶存在，即可降解壳聚糖为壳寡糖，壳寡糖容易被分解吸收，所以形成透明圈 22、酶反应器： 分批式搅拌罐反应器、连续流搅拌罐反应器、填充床反应器、流化床反应器、模型反应器、鼓泡塔反应器 23、对产酶的菌种的要求是： 1、产酶量高；2、繁殖快，发酵周期短；3、产酶稳定性好，不易退化，不易被感染；4、能够利用廉价的原料，容易培养和管理；5、安全可靠，非致病菌。 24、在使用离心机时应注意事项 25、尿酶提取过程中为什么要在冰浴中进行 在冰浴中进行可以使尿酶处于低温条件下，低温能降低酶的活性，但不破坏酶的活性，在适合的温度下可恢复酶的活力 26、填充床的制备及应用的要点 装柱——平衡——应用——检测 装柱：均匀、无裂缝、无气泡、平整；平衡：1—2倍柱床体积缓冲液；应用：3%尿素溶液； 检测：定性：纳氏试剂（黄色或棕红色沉淀）——定量：取20ml流出液，用0.05mol/L标准HCL滴定（加2—3滴混合指示剂）

酶工程复习题及答案(1)

《酶工程》复习 一、名词解释…………………………………………… 1 酶工程：又称酶技术，是酶制剂的大规模生产和应用的技术，包括化学酶工程和生物酶工程。 2酶的诱导：由于加进某种物质，使酶的生物合成开始或者加速进行，称为酶的生物合成的诱导作用。 3 微滤：以压力差为推动力，截留水中粒径在0.02~ 10m之间的颗粒物的膜分离技术。 4固定化酶：通过物理的或化学的方法，将酶固定在载体上，能使酶发挥催化作用的酶。 5酶的非水相催化：通过改变反应介质，影响酶的表面结构和活性中心，从而改变酶的催化特性。 6 原生质体：脱去细胞壁的植物、真菌或细菌细胞。 7超滤：超滤是采用中空纤维过滤新技术，配合三级预处理过滤清除自来水中杂质；超滤微孔小于0.01微米，能彻底滤除水中的细菌、铁锈、胶体等有害物质，保留水中原有的微量元素和矿物质。 8 固体发酵：固态发酵是指没有或几乎没有自由水存在下，在有一定湿度的水下溶性固态基质中，用一种或多种微生物的一个生物反应过程。 二、填空题………………………………………………. 1酶的分类（氧化还原酶）、（转移酶）、（水解酶）、（裂合酶）、（异构酶）、（合成酶）。 2酶活力是（酶催化速度）的量度指标，酶的比活力是（酶纯度）的量度指标，酶转换数是（酶催化效率）的量度指标。 3微生物产酶模式可以分为同步合成型，（延续合成型），中期合成型，（滞后合成型）四种。 4动物细胞培养主要用于生产疫苗、激素、单克隆抗体、多肽因子、酶等（功能性蛋白质）。 5细胞破碎的主要方法有机械破碎法、物理破碎法、（化学破碎法）、（酶促破碎法）。 6有机溶剂的极性系数lgP越小，表明其极性（越强），对酶活性的影响（越大）。 7通常酶的固定化方法有：吸附法、包埋法、结合法、交联法、热处理法。

蛋白质与酶工程教学大纲

《蛋白质与酶工程》教学大纲 课程名称：蛋白质与酶工程 学分：2 学时：32 先修课程：生物化学 适用专业：生物工程 开课系部：生命科学学院 一、课程性质、目的和培养目标 课程性质：专业选修课 课程目的：本课程是生物工程本科专业选修课，目的是让学生在学习了普通生化的基础上，进一步对蛋白质和酶工程进行深入系统的学习。并对于酶在生产实践中的应用，也能有一些感性和理性的认识。 课程培养目标：采用多媒体课件和国内外最新的教学参考书、教案，灵活运用多种教学方法，因材施教，使学生在牢固掌握基础知识和基本概念的同时，得到科学研究、科学思维和科学方法的良好训练，为其他专业基础课和专业课的学习及日后的研究工作打下基础。 二、课程内容和建议学时分配 第一章绪 论 2课时 （一）教学基本要求 掌握蛋白质工程和酶工程的定义，了解其发展史，以及应用前景。 （二）教学内容 第一节蛋白质工程概论 第二节蛋白质工程的应用 第三节蛋白质工程展望 第四节酶工程简介 一酶工程 二组成：酶的产生；酶的分离纯化；酶的固定化；生物反应器。 三分类：化学酶工程；生物酶工程。 第五节酶与酶工程的发展简史 一酶学研究简史 二酶工程研究简史

（三）教学重点和难点 重点：蛋白质与酶工程定义; 难点：酶工程的组成分类 第二章蛋白质的结构与功能 2课时（一）教学基本要求 掌握蛋白质的基本结构组成及功能 （二）教学内容 第一节蛋白质的基本结构与功能 一蛋白质的组成 二蛋白质的一级结构 三蛋白质一级结构与功能的关系 第二节蛋白质的空间结构与功能 一蛋白质的二级结构 二超二级结构和结构域 三蛋白质的三级结构 四蛋白质空间结构与功能的关系 五蛋白质-蛋白质相互作用 （三）教学重点和难点 重点：蛋白质的空间结构；难点：蛋白质间的相互作用； 第三章蛋白质的修饰和表达4课时（一）教学基本要求 掌握蛋白质的化学修饰途经，了解蛋白质改造的一些途经等。 （二）教学内容 第一节蛋白质修饰的化学途径 一功能基团的特异性修饰 1多位点取代 2 3 二基于蛋白质片段的嵌合修饰 第二节蛋白质改造的分子生物学途径 一编码基因的专一性位点和区域性定向突变 1 2 二基因融合和基因剪接 三tRNA介导定点搀入非天然氨基酸 第三节重组蛋白质的表达

酶工程实验doc

酶工程实验指导 实验一从植物材料中提取制备过氧化物酶 一．实验目的 学习从植物材料中制备过氧化物酶的方法，了解纯化酶的一些基本步骤。比较不同植物材料过氧化物酶的含量与活性，掌握酶纯化的相关计算方法。 二．实验原理 过氧化物酶（EC 1. 11. 1. 7）是一类以铁卟啉为辅基的氧化酶，在细胞代谢的氧化还原过程中起重要作用，在工业上也广泛被应用。过氧化物酶可溶于水，溶解度约为5%（W/V），溶液呈棕红色，透明。此酶可溶于0.58饱和度以下的硫酸铵溶液，而在0.62饱和度以上则不溶。该酶能催化愈创木酚反应产生有色物质： 以此可进行酶活性的测定。 许多植物如辣根、柑桔叶子、白萝卜等含有较多的过氧化物酶，在这些植物材料的溶出物中，加入不同浓度的硫酸铵进行分段盐析，对过氧化物酶进行粗提，然后用有机溶剂沉淀、结晶等方法可对该酶进行纯化，得出较纯的制品。

三．主要仪器与试剂 仪器：组织捣碎机，冰箱，真空冷冻干燥机，离心机，紫外-可见分光光度计等。 试剂：愈创木酚，丙酮，过氧化氢，硫酸铵等。 四．实验步骤 （尽量在冰浴中进行）鲜植物样品约70克，剪碎或捣烂，加少许水研磨成浆（可用捣碎机），转移到500ml的烧杯中，加水至约200ml，于冰箱中浸提约2小时（中间多次搅动）。多层纱布挤压过滤后离心（4000rpm），10ml上清液用来测酶活力，其余上清液按226克/升加硫酸铵盐析，冰箱中静置1小时以上，离心(4000rpm)去沉淀。上清液再按258克/升加硫酸铵盐析，冰箱中静置4小时以上。离心收集沉淀，用水溶解至约10ml，用水透析去盐，离心去沉淀，取部分酶液稀释后测酶活。其余酶液用作精制样品。 在搅动下沿着杯壁加入一倍体积预冷(-15℃)的丙酮于酶液中，混匀，静置10分钟，低温离心(8000rpm, 4℃) 去沉淀。按上清液与丙酮之比为1比0.8再次加入预冷丙酮，静置10分钟后离心(8000rpm, 4℃) 收集沉淀，溶于少量水中，透析去丙酮。测酶液的酶活，冷冻干燥酶液得较纯的酶制品。 五．过氧化物酶活力测定 按下表于试管中加入试剂（ml） 管号0.2M磷 酸缓冲液 pH6.0 0.05% 愈创木酚 酶液0.04% 过氧化氢 水 1 2 3 1 1 1 1 1 1 1 1 在37℃保温10分钟。管1 作为对照在时间扫描470nm调好零点，混合管2

酶工程实验一的标准曲线

乙酸乙酯和苯甲醛的气相色谱图 # Time Area Height Width Area% Symmetry 1 2.748 5.3 2.5 0.0286 0.000 2.626 2 2.78 12.2 12.4 0.0154 0.000 0.95 3 2.827 4048.6 4776. 4 0.0139 0.074 0.844 4 2.859 5468212. 5 435181.4 0.2094 99.722 4.14E-2 5 3.673 332.1 96.2 0.0553 0.00 6 0.776 6 3.751 1864.5 282.5 0.099 0.034 0.339 7 4.295 195.5 26.4 0.1032 0.004 0.716 8 8.949 8753.3 1661.1 0.0715 0.160 0.193 9 13.198 23.7 81.1 0.0124 0.000 1.885

1 2.75 3.5 1.7 0.028 0.000 3.109 2 2.782 9.4 10.6 0.0144 0.000 1 3 2.831 3927.9 4558.8 0.0131 0.072 0.835 4 2.866 5380649 428421.7 0.2093 98.701 4.37E-2 5 3.675 314. 6 91. 7 0.052 0.006 0.781 6 3.752 1847.5 271.8 0.0993 0.034 0.333 7 4.298 178.7 22.3 0.1055 0.003 0.73 8 6.39 371.6 31.1 0.1585 0.007 0.386 9 11.325 460.8 31.7 0.1805 0.008 2.274 10 11.764 63716.1 10800.7 0.0798 1.169 0.248

酶工程习题96567

第一章 习题： 1、根据分子中起催化作用的主要组分的不同，酶可以分为_______和_______两大类别。 2、核酸类酶分子中起催化作用的主要组分是________，蛋白类酶分子中起催化作用的主要组分是___________。 3、进行分子内催化的核酸类酶可以分为_______，_______。 4、酶活力是_____的量度指标；酶的比活力是__________的量度指标；酶转换数是________的量度指标。 5、某酶的分类编号是EC2.2.1.10，其中EC是指_______。此酶属于_______类型。 6、醇脱氢酶参与的反应表明无氧气参与（） 7、酶工程是_____________的技术过程。 8、酶的转换数是指（） A、酶催化底物转化为产物的数量 B、每个酶分子催化底物转化为产物的分子数 C、每个酶分子每分钟催化底物转化为产物的分子数 D、每摩尔酶催化底物转化为产物的分子数 9、酶的改性是指____________________________. 第二章 1、名词解释 转录、组成型酶、酶的反馈阻遏、分解代谢物阻遏、生长偶联型

2、微生物产酶模式可以分为同步合成型________、中期合成型、________。 3、可以通过添加（）使分解代谢物阻遏作用解除。 A、诱导物 B 激活剂 C、cAMP D、ATP 4、在酶发酵过程中添加表面活性剂可以 A、诱导酶的生物合成 B、阻遏酶的生物合成 C、提高酶活力 D、提高细胞通透性 5、为什么滞后合成型的酶要在细胞生长一段时间甚至进入平衡期以后才开始合成？ 6、操纵子是由_________、_______和启动基因组成的。 7______________和______是影响酶生物合成模式的主要因素。 8、RNA前体的加工是指____________ 6、从如下实验方法和结果分析酶生物合成的调节作用。 实验方法：将大肠杆菌细胞接种于营养肉汤培养基中，于37°C振荡培养，当OD550为0.3时，经培养液分装到4个小三角瓶中，每瓶17ml培养液。于4个三角瓶分别添加 （A）3ml无菌水 （B）1ml乳糖溶液（0.1mol/L）和2ml无菌水 （C）1ml乳糖溶液（0.1mol/L）、1ml葡萄糖溶液（0.1mol/L）和1ml无菌水 （D） 1ml乳糖溶液（0.1mol/L）、1ml葡萄糖溶液（0.1mol/L）和1mlcAMP 钠盐溶液 然后在相同的条件下于37°C振荡培养2h，分别取样测定β-

酶工程复习要点

1、酶的催化作用特点：具有专一性，催化效率高和反应条件温和等显著特点。 2、酶研究的两个方向：理论研究方向和应用研究方向。理论研究方向：酶的理化性质、催化性质、催化机制等。应用研究：促进了酶工程的形成。 3、酶工程的定义：利用酶或者微生物细胞，动植物细胞，细胞器，借助于酶的催化作用，通过工程学手段生产产品或提供社会服务的科学体系。 4、酶工程的应用范围：①对生物资源中天然酶的开发和生产②自然酶的分离纯化与鉴定技术③酶的固定化技术④酶反应器的研制与应用⑤与其它生物技术领域的交叉与渗透。 5、酶工程的组成：①酶的发酵生产②酶的分离纯化③酶分子修饰④酶和细胞固定化⑤酶反应器和酶的应用等方面。 6、酶工程的主要任务：通过预先设计，经过人工操作控制而获得大量所需的酶，并通过各种方法使酶发挥其最大的催化功能。 8、酶的分类：第1类，氧化还原酶；第2类，转移酶；第3类，水解酶；第4类，裂合酶；第5类，异构酶；第6类，合成酶；第7类，核酸类酶。 9、酶的作用机制：酶的催化机理可能与几种因素有关：酶与底物结合时，两者构象的改变使它们互相契合，底物分子适当地向酶分子活性中心靠近，并且趋向于酶的催化部位，使活性中心这一局部地区额底物浓度大大增高，并使底物分子发生扭曲，易于断裂。在另一些情况中，可能还有一些其他的因素使酶反应速度稍有一些提高，如酶与底物形成有一定稳定度的过渡态中间物——共价的ES中间物，这种ES中间物又可迅速地分解成产物，又如酶活性中心的质子供体和质子受体对底物分子进行了广义的酸碱催化等。 10、酶的催化能力：酶仅能改变化学反应的速度，并不不能改变化学反应的平衡点。酶本身在反应前后也不发生变化例如肽键遇水自发地进行水解的反应极为缓慢，当有蛋白酶存在时，这个反应则进行得十分迅速，可降低反应的活化能。在一个化学反应体系中，反应开始时，反应物(S)分子的平均能量水平较低为“初态”，在反应的任何一瞬间反应物中都有一部分分子具有了比初态更高一些的能量，高出的这一部分能量称为活化能，使这些分子进入“过渡态”，这时就能形成或打破一些化学键，形成新的物质——产物（P）。即S变为P。这些具有较高能量，处于活化态的分子称为活化分子，反应物中这种活化分子愈多，反应速率就越快。活化能的定义是在一定温度下一摩尔底物全部进入活化态所需要的自由能，单位是焦耳/摩尔。 11、酶的专一性：酶的专一性是指一种酶只能催化一种或一类结构相似的底物进行某种类型的反应。如果没有酶的专一性，在细胞中有秩序的物质代谢将不复存在，而且酶的应用将如同其他非酶催化剂那样受到局限。酶的专一性可以分为两类：①绝对专一性：一种酶只能催化一种物质进行一种反应，这种高度的专一性称为绝对专一性。②相对专一性：一种酶能够催化一类结构相似的物质进行某种相同类型的反应，这种专一性称为相对专一性。 12、酶的专一性确定过程：首先要选择一种该酶可催化的物质作为该酶的作用底物，通过实验确定其最适PH、温度等反应条件，其次是实验底物浓度对反应速度的影响，确定其米氏常数K m，然后用其他有可能是该酶作用底物的物质，在相同条件下逐个进行实验，有时要在不同条件下逐个试验，观察是否有催化反应发生，从而确定该酶是属于绝对专一性还是相对专一性，可作用于一类物质，可以选择几种有代表性的底物，求出各自的值，在某些情况下，不同底物有不同的最适PH值，而PH对K m有一定的影响，此时必须作出不同底物各自的PH曲线。然后再在各自的最适PH值条件下进行试验，以确定各底物相对应的K m值，在进行酶的专一性试验时，所使用的酶和各种底物都要尽可能地纯。对于有对称碳原子的物质，应分别对不同的光学异构进行试验。 13、酶活力是酶的数量的量度指标，酶的比活力是酶纯度的量度指标，酶转换数是酶催化效率的量度指标，而酶结合效率是酶被固定比例的量度指标。

(整理)酶工程实验3

实验一过氧化氢酶米氏常数的测定 一、目的 了解米氏常数的意义，测定过氧化氢酶的米氏常数。 二、实验原理 H2O2被过氧化氢酶分解出H2O和O2，未分解的H2O2用KMNO4在酸性 环境中滴定，根据反应前后H2O2的浓度差可求出反应速度。 本实验以马铃薯提供过氧化氢酶，以1/ν~1/[S]作图求Km 三、实验器材 1.锥形瓶100～150ml（×6）。 2.吸管1.0ml（×2）、0.5ml（×2）、2.0ml（×2）、5ml（×2）、10.0ml（×1）。 3.温度计（0～100℃）。 4.微量滴定管5ml（×1）。 5.容量瓶1000ml（×1）。 四、实验试剂 1、0.02mol/L磷酸缓冲液（Ph7.0） 取磷酸二氢钾 0.68g，加0.1mol/L氢氧化钠溶液 29.1ml，用水稀释至100ml,即得。 2、酶液：称取马铃薯5g，加上述缓冲液10ml，匀浆，过滤。 3、0.02mol/L KMnO4：称取KMnO4（AR）3.2g，加蒸馏水1000ml，煮沸15min， 2d后过滤，棕色瓶保存。 4、0.004mol/L KMnO4：准确称取恒重草酸钠0.2g，加250ml冷沸水及10ml 浓硫酸，搅拌溶解，用0.02ml/L的KMnO4滴定至微红色，水浴，加 热至65℃，继续滴定至溶液微红色并30s不褪，算出KMnO4的准确 浓度稀释成0.004mol/L即可。 5、0.05 mol/L H2O2：取30% H2O2 23ml加入1000ml容量瓶中，加蒸馏水至刻

度（约0.2mol/L），用标准KMnO4（0.004mol/L）标定其准确浓度，稀释 成0.05mol/L（标定前稀释4倍，取2.0ml，加25% H2SO42.0ml，用0.004mol/L KMnO4滴定至微红色）。 6、25% H2SO4 五、操作 取锥形瓶6只，按下表顺序加入试剂： 表一过氧化氢酶米氏常数的测定 先加好0.05mol/L H2O2及蒸馏水，加酶液后立即混合，依次记录各瓶的起始反应时间。各瓶时间达5min时立即加 2.0ml25%硫酸终止反应，充分混匀。用 0.004mol/L KMnO4滴定各瓶中剩余的H2O2至微红色，记录消耗的KMnO4体积。 六、计算 分别求出各瓶的底物浓度[S]和反应速度v。 [S]=c1V1/10 式中[S]：底物物质的量浓度（mol/L）； c1：H2O2物质的量浓度（mol/L）； V1：H2O2体积（ml）； 10：反应的总体积（ml）； υ：反应速度（m mol/min）； c2：KMnO4物质的量浓度（mol/L）； V2：KMnO4体积（ml）； 以1/υ对1/[S]作图求出Km。

酶工程电子教案

酶工程电子教案 第一章绪论 1、酶的基本概念 酶的概念：具有生物催化功能的生物大分子，按照其化学组成，可以分为蛋白类酶（P酶）和核酸类酶（R酶）两大类别。 酶工程：酶的生产与应用的技术过程。 酶工程的主要内容包括：微生物细胞发酵产酶，动植物细胞培养产酶，酶的提取与分离纯化，酶分子修饰，酶、细胞、原生质体固定化、酶的非水相催化、酶反应器和酶的应用等。 2、酶的发展史 19世纪以前： 4000 多年前的夏禹时代就已经掌握了酿酒技术。 3000多年前的周朝，就会制造饴糖、食酱等食品。 2500多年前的春秋战国时期，就懂得用麴来治疗消化不良等疾病。 19 世纪30年以来： 1833年，佩恩（Payen）和帕索兹（Persoz）从麦芽的水抽提物中用酒精沉淀得到淀粉酶（Diastase）。 19 世纪中叶，巴斯德( Pasteur)认为在活酵母细胞内有一种可以将糖发酵生成酒精的物质。1878年昆尼（Kunne）首次将酵母中进行酒精发酵的物质称为酶（Enzyme ），这个词来自希腊文，其意思是“在酵母中”。 1896年，巴克纳（Buchner）兄弟发现酵母的无细胞抽提液也能将糖发酵成酒精。 1902年，亨利（Henri）根据蔗糖酶催化蔗糖水解的实验结果，提出中间产物学说。 k1k2 E ＋S ======== ES ========E ＋P

K－1 1913年，米彻利斯（Michaelis ）和曼吞（menten ）米氏方程： V m [S] v == K m + [S] “酶是生物体产生的具有生物催化功能的物质”。但是尚未搞清楚究竟是哪一类物质？ 1920年，德国化学家威尔斯塔特（Willstater）将过氧化物酶纯化12 000倍。 1926年，萨姆纳（Sumner）首次从刀豆提取液中分离纯化得到脲酶结晶，并证明它具有蛋白质的性质。 1960年，雅各（Jacob）和莫诺德（Monod）提出操纵子学说，阐明了酶生物合成的基本调节机制。 1982年，切克（Thomas Cech）等人发现四膜虫（Tetrahynena）细胞的26 S rRNA前体具有自我剪接功能（Self-splicing）。并将这种具有催化活性的RNA 称为ribozyme。1983年，阿尔特曼（Sidney Altman）等人发现核糖核酸酶P（RNase P）的RNA部分M1 RNA 具有核糖核酸酶P 的催化活性。 由此引出“酶是具有生物催化功能的生物大分子（蛋白质或RNA）”的新概念。 3、酶催化作用的特点 3.1酶催化作用的专一性强 酶的专一性是指在一定的条件下，一种酶只能催化一种或一类结构相似的底物进行某种类型反应的特性。 酶的专一性按其严格程度的不同，可以分为绝对专一性和相对专一性两大类。