fda人用单克隆抗体制品生产及检定考虑要点
人用单克隆抗体制品生产及检定考虑要点
前言
生物制品评价和研究中心（CBER）正在修订1987年的“人用单克隆抗体的生产和检定考虑要点（PTC）”。该最新修订本的目的是向开发单克隆抗体制品的发起人和研究人员提供帮助，包括研究性新药（IND）和产品许可证申请时应提交的资料。
此文件取代了1987年的文件，并反映了在多次国内、国际会议上讨论过的值得重视的经验，这些会议包括：
1．FDA疫苗和相关生物制品咨委会于1990年8月召开的“生物制品潜在逆转录病毒污染”讨论会。
2．由国际生物标准化学会（IABS）发起并于1990年11月在伦敦召开的“生物制品安全性的病毒学方面会议”。
3．由FDA、IABS、NIH、国家疫苗规划办公室、HHS和WHO发起，于1991年3月在Bethesda召开的“传代细胞系当前所面临的问题”的国际性会议。
4．由FDA和NIH联合发起，于1992年1月在Bethesda召开的”单克隆抗体的临床前安全性试验工作会议”。
单克隆抗体和其他生物制品一样都有可供参考的法规（21 CFR部分200～299和600～680）。与CBER制定的其他考虑要点一样，单克隆抗体考虑要点亦不试图包容所有问题。当特殊制品产生特殊的未包括在“考虑要点”中的问题时，则应根据具体情况进行评估。本文及相应的法规本对生产和生产设施进行讨论，发起人应与治疗药物研究和评审办公室及生产企业许可证发放和产品监督办公室磋商。
某些单克隆抗体可由CDER负责主要审查工作，或由CDRH与CBER联合复审，各中心的管辖权依据1991年10月CBER和CDER及CBER和CDRH的内部协议执行。本考虑要点适合于按此协议联合复审的单克隆抗体。
主档案
在研究性新药申请初始阶段不需要全部完成本文中讨论的所有资料，而应在临床开发阶段，由适当的中心以对话方式指导下，使资料不断完善。在某些情况下，在同一设施内以相同的方法制备及检定的单克隆抗体时，资料应归于单一主档案
（Master File）中。一般说来，对提交IND主档案，企业或生产许可证申请中的生产数据、信息及所引用的文献均予保密。
范围
用于活体外净化骨髓去除免疫或肿瘤细胞或与活体外净化骨髓装置相结合使用的单克隆抗体，用于收集细胞（如红细胞生成素干细胞）或纯化其他制品的单克隆抗体应与直接用于病人单克隆抗体的纯度、效力、安全性及无外源病毒污染标准相符合。另外，活体外骨髓处理（如补体）通常与单克隆抗体结合使用的试剂亦应符合同一直接用于患者的单克隆抗体标准。
单克隆抗体的组合
CBER认为以有前途的临床前评估及临床理论为基础提出进行的联合单克隆抗体临床试验和许可证申请尚待讨论。目前预期有两种组合单克隆抗体类型：杂合型（cocktails和系列型（panels）。
在此文件中，cocktail定义为以固定比例混合而成的两种或多种单克隆抗体。相关的靶抗原包括位于传染性病原体上的多种抗原及多种肿瘤相关抗原。制品的组合理论应有清楚的临床环境或临床资料为依据。另外，应证明组合单克隆抗体间无干扰作用，并鉴定其协同或增强效应。有必要设定每种成份的剂量，剂量设定应根据临床前或临床资料证明某一剂量是必需量或是上限，以及组合物中单抗的比例而定。
在此文中所用panelse的定义为直接抗相关抗原（如肿瘤抗原，HLA型抗原）的单克隆抗体系列，根据靶抗原的特性，可将其中一种或多种单抗用于单个患者。这些可按单一产品申请许可证。举例来说，单抗系列可以包括淋巴瘤的抗独特型单克隆抗体，及直接抗不同细菌或病毒血清型的单克隆抗体。必须设定每种成分的剂量。在证明全系列有效性的重要临床试验中，应首先获得系列中各成员某些临床经验资料。
制品的生产和检定
I．单克隆抗体的生产
目前，大多数单克隆抗体是抗体产生细胞与骨髓瘤细胞经化学诱导融合后获得的可无限传代的杂交瘤细胞系生产的。在某些情况下，杂交瘤与其他细胞系的再次
融合会产生三重或四重杂交瘤。我们预料将来重组抗体及人抗体会有所增加。一般说来，下面所述的原则可适用于所有杂交瘤及异源杂交瘤产品，不考虑来源的种类。所有的生产程序应符合现行GMP标准。
A．细胞系
应提供下列材料
1亲本（骨髓瘤）细胞系的来源，名称和特征，包括其合成及/或分泌的重链或轻链免疫球蛋白；
2动物种类，品系，特性及免疫细胞的组织来源；
3获得可无限传代细胞系程序的描述，如在建立细胞系时采用；
4 免疫原的鉴定及特性；
5．免疫方案的描述；对于人源单克隆抗体，无论是体外还是体内（如严重联合免疫缺陷（SCID）鼠模型）免疫程序均应描述；
6．所用筛选程序的描述；对于人源单克隆抗体，应描述富集抗原特异性B细胞群所用步骤。
7细胞克隆程序的描述（当细胞由含血清培养液适应无血清培养液时，应重新克隆）；
8建立及运用主细胞库及生产用细胞库所采用种子批系统的描述。
参照文献（1）。
B．组织培养法制备
应提供下列材料
1组织培养程序的描述，如果制品完全在体外制备或细胞在接种小鼠前经过体外传代；
2．所用培养液的描述，包括合格证明及检定结果（用于杂交瘤增殖的血清应无污染物及外源因子）；
3．防止或控制病毒，细菌，真菌及支原体污染的措施；
4．用于进一步生产的细胞或组织培养上清的合格标准。
C．腹水法制备
1应提供有关接种细胞的资料（见B．1）。
2．动物的管理应符合NIH （有关实验动物的饲养与使用指南》，为保证获得生
产单克隆抗体用稳定一致高质量的腹水，应建立起动物健康监控规划，包括检疫程序、前哨动物及内部卫生监测计划（包括支原体筛检）。我们亦建议使用无特定病原体（SPF）小鼠。应确定对前哨小鼠进行血清学检测的频率，通常根据病毒污染情况确定检测频率。
3. 制备腹水的所有记录还应包括下列内容：
a．所用动物的种属，性别及年龄；
b．动物供应者；
c．降植烷用量；
d．接种细胞量及浓度；
e．初次免疫、细胞接种及腹水采集的时间；
f．腹水采集次数及方法；
g．”批”的定义；
h．动物垫料、饲料及水；
i．同笼动物的数量；
3．各流程的环境条件。
D．纯化
单克隆抗体的纯化工艺应具备下列特征：
1生产技术应能防止引入并可去除污染物；包括动物蛋白及材料、DNA、内毒素、其他热原质、培养液成分，层析柱析出成分及病毒等；
2．纯化前测定病毒污染程度；
3．应包括一个或一个以上已知可去除或灭活逆转录病毒的步骤（见参考文献2及第六章去除病毒验证的讨论）；
4纯化方法去除各种外源因子能力的验证。建议在验证试验中采用多种模拟病毒，包括大和小颗粒病毒，DNA和RNA基因组病毒，以及对化学敏感和有耐受性的类脂包膜和无包膜病毒株。这些试验应在实行最后生产工艺时进行。
Ⅱ．纯化未修饰单克隆抗体的鉴定
单克隆抗体在用于人体试验前，应对其抗体特异性，结构完整性及效力等进行精确而全面的鉴定。单克隆抗体应尽可能无非免疫球蛋白污染物。应以一套适当的合格的内部参比品作为批间比较的标准。此套参比品应为己知结构、特异性及效力，在适当条件下保存，并定期检测其结构完整性。当产品改进时，参比品亦应
相应改变，到Ⅲ期临床效力试验开始时应最终确定下来。
A．结构完整性
应联合使用SDS－PAGE、IEF、HPLC或其他适当的理化方法证明纯化抗体未断裂。未聚合，末修饰（如：碳水化合物侧链缺失），应将生产批与内部参比品进行并列比较。
B 特异性
试验应证明单克隆抗体与靶抗原特异结合。一旦抗体的特异性得到鉴定，则应用人的组织进行交叉反应性筛检（见第Ⅵ章）。
1．直接结合试验应包括阴、阳性抗体及抗原对照。至少应检测一种同型匹配但不相关的（阴性）对照抗体。阴性抗原对照应包括一种化学结构相似，但抗原性无关的复合物（如具有相似的化学性质、大小、电荷及电荷密度）。
2．只要有可能，对蛋白，糖蛋白，脂多糖，或其他含有反应表位的分子进行生化测定，并测定自身的抗原表位，若抗原决定簇为碳水化合物，则应确定糖的组分、连接键及正位异构体构型。
3．若有可能，应利用具有确定结构的抗原制品（如寡搪或肽），采用抑制法或其他技术鉴定抗体的特异性。对于复杂的生物混合物，对直接结合试验所用的被试抗原或抑制剂批应进行标化。应定量测定抗体结合被可溶性抗原或其他抗体抑制。
4．一旦确定某一抗体的特异性，重要的是定量测定抗体的结合活性，可以采用一切可行的方法，如亲和力测定，亲合性测定，免疫反应性测定或联合使用这些方法。目前已有许多已发表的方法适用于抗体结合活性的测定。
C．抗独特型疫苗
l．如果是抗独特型疫苗（Ab2疫苗），应鉴定Ab2免疫原，例如是传统型（Ab2 α）还是抗原模拟型（Ab2 β）（5a)。
2．苦可以获得人Abl抗体（名义抗原），则应证明Ab2 β疫苗与适当的Abl群抗体具有反应性。
3．应用远交系及近交系动物对Ab2制品免疫应答（对靶抗原）的适当性进行研
D．效力试验及标准规格
效力试验可用于鉴定产品，监测批间变异和确保产品的稳定性。可通过结合试验，血清学试验，在动物模型中的活性试验，体内或体外功能试验进行效力测定。最理想的情况是，试验方法与制品公认的生理活性具有最相近的关系，并有足够的敏感性，以检测出制品临床功能差异。由于效力试验用于保证制品批间一致性，因此效力试验应可靠，可重复并敏感。
1．抗体结合活性可用ELISA，RIA，放免沉淀反应，细胞毒性反应，流式血细胞计数或其他适宜标准方法定量测定。活性应以每mg抗体的特异性抗原结合活性表示。产品应与内部参比品对比，若已建立起适当的抗体亲和力测定方法，则该方法将有助于其他试验。在计算效力时应采用平行线性生物测定法或类似的有效统计方法。
2．单克隆抗体的效力亦可用测定动物模型测定活体内功能的方法测定，尽管该法常常较繁琐且难以标准化。当体内及体外测定抗体活性相关时，动物模型有助于验证体外效力测定方法。
3．在效力试验中，充分反映制品生物学活性的允许值范围应以特定抗体的经验为依据。较理想的是，临床结果应与效力试验相关，以发展有意义的替代的体外效力测定法。这意味着应在临床开发阶段使用大批制品。
Ⅲ．与毒素、药物、放射性核素或其他试剂偶联单克隆抗体的特殊考虑
除对先前讨论的有关末偶联单克隆抗体（裸露单克隆抗体）的建议外，免疫结合物的生产厂家应注意下列内容：
A．免疫结合物的构建
应提供构建免疫结合物所用试剂的详细资料，包括：
1．单克隆抗体部分的同种型，结构，纯度及结合特异性；
2，描述与单克隆抗体连接的成分如：毒素，药物．酶及细胞因子，包括：a．所有成分的来源，结构，制法，纯度（包括证明无外源因子）及特征（若所用成分是购进的，应提供厂家的分析证书）。每种成分的毒性描述应充分说明可能出现不良作用的发生率及严重性；
b．来源于传代细胞或用遗传工程方法制备的产品［（如转染瘤；细菌合成的，嵌合的，易形的，互补决定区（cdr）接合的及单链Fv抗体；以及重组免疫毒素等］应符合参考文献（1），（17）和（18）中所提出的建议。
3．制备免疫结合物所用化学试剂的描述，如连接剂和螫合剂。这些资料应该包括试剂来源，制备方法，以及合成或纯化时残留杂质的测定等内容。还应提供合成反应途径的图解，以及与免疫结合物制备中所用化学试剂毒性有关的已公开发表或内部相关资料。活性中间体应被灭活或去除。
B．免疫结合物的纯度
1．应采取特殊措施保证抗体制品尽可能无外源免疫球蛋白或非免疫球蛋白污染物，因这些物质在构建免疫结合物过程中，能与核素，毒素或药物发生反应。2．应规定最终产品中游离抗体或游离组分的限量，并进行测定。
3．为建立成品批签发标准及探索免疫球蛋白置换数量，效力及稳定性间关系，首先应测定偶联物与抗体的平均比率及每个抗体被结合部分的数量及结合位置。
C．免疫结合物的免疫反应性，效力及稳定性
毒素或药物偶联至抗体上会改变其中任一成分的活性。
1．应采用适当的方法评估偶联前后的免疫反应性（3，4）。
2．除放射造影能力以外应评估免疫结合物的效力。
3．免疫结合物构建后，应确定免疫反应性变化的百分率限值，并作为产品规格的组成部分。
4．应检测免疫结合物的体外稳定性，将免疫结合物在合并的人血清中37℃孵育至少2个人用产品的半衰期，经过规定间隔时间分析等分样品中完整免疫结合物及分解产物的浓度。应详细说明评估产品稳定性的条件及所用的阴、阳性对照。5．应检测免疫结合物的体内稳定性
a．在用动物进行药物动力学及组织分布试验中，应测定某一免疫结合物的单个成分，并与未修饰单克隆抗体的组织分布进行比较。
b．应证明各种成分的靶组织及可能引起的潜在毒性。
D．与放射性核素偶联单克隆抗体的特殊问题
1．放免结合物应用标准化的、严格控制并经过验证的方法制备。应建立检测游离同位素、结合单克隆抗体、标记的非免疫球蛋白物质的放射性百分率的方法。a．建议，放射性标记单克隆抗体的初始研究用新药申报包含2～3次放射标记试生产的分析结果，应证明所制备的产品具有免疫反应性，无菌，无热原质。此项工作应由将使用这种试剂进行研究工作的同一人员来作。
b．制备免疫结合物时应使用放射药物级同位素。药物主档案中应有提交的每种同位素无菌及无热原质的分析证书及横向参比的信函。
C．在标记试生产过程中，应测定最终产品中共价结合的和游离的同位素的浓度，以及标记试剂及其分解产物的残留水平。
d．应描述给每一个病人应用前后进行的质控试验。
2．动物试验
a．动物的生物分布资料可用于I期临床前人用剂量的估定。
b．表达靶抗原的动物模型更可能揭示抗原沉积点或非预期抗原表达的组织。C．异源移植模型可以评估组织靶位和抗原非特异性放射免疫结合物的分布问题．但无助于鉴定无关正常抗原的表达或组织交叉反应性的分布。
d．应对足量的动物进行研究以获得具有可接受的变异系数（通常小于20％）的放射性剂量估算。
e．应对所用的放免活性和充分的时间点进行全过程计量，以确定放免试剂早期及晚期清除期。
f．应用将放免结合物置血清中培育的方法测定其体外稳定性（参见第Ⅲ章C．4）。应建立起估测游离同位素、结合单克隆抗体及标记的非免疫球蛋白物质的各自放免活性百分率的方法。
IV．质量控制及产品检定
A．细胞系鉴定
若单克隆抗体用作生物治疗用制剂，生产单抗用的细胞系的鉴定，应按表1文献（1）中所述试验方法，对主细胞库（MCB和生产用细胞库（MWCB）分别筛检一次，包括内源及外源因子。常规电镜检查有助于检出细胞系中潜在高水平的病毒污染。因MWCB来源于MCB，且只是经过了几次组织培养传代，因此，采用新引入污染物的简化检查法是可行的。任何病毒污染都应进行鉴定并定量，以确定纯化过程应达到的清除病毒指标。若纯化过程发生改变，厂家应该重新评估病毒污染程度并重新验证的。应采用适当的感染试验确定每种病毒对人细胞的
亲嗜性。如采用组织培养或发酵生产，应检测生产终末细胞（EPC），以评估新的污染物是引入或是生长环境滋生的作出评估。当培养基或生产规模发生变化时，应重新检测EPC。
表1细胞系鉴定检测试验
试验MCB MWCB EPC
无菌试验+ + +
支原体检查+ + +
病毒检查
常规+ + +
种特异病毒* + - +
逆转录病毒** + - +
可靠性检测+ + +
*：检查啮齿类；灵长类或人的病毒（不包括逆转录病毒）等。
**：除鼠源杂交瘤外，所有其他的细胞基质均应检查逆转录病毒。
1．应通过无菌试验证明细胞系无细菌及真菌污染。推荐的支原体（可培养的和不可培养的）检查方法参见参考文献1。
2外源病毒检查应包括文献1所述的常规的体内及体外试验。
3．种特异病毒检查(非逆转录病毒）：
a．小鼠细胞系（见附录2）应采用小鼠抗体产生（MAP）试验法，地鼠细胞系采用地鼠抗体产生（HAP）试验法，大鼠细胞系采用大鼠抗体产生（RAP）试验法。对于淋巴细胞绒性脉络膜脑膜炎病毒（LCM）包括非致死株，推荐进行体内试验。HAP试验应包括小鼠的微小病毒（见第Ⅲ章B．1．C）。
b．污染过LCM、呼肠孤病毒、轮状病毒、仙台病毒或汉坦病毒的原料不应用于单克隆抗体生产。
C．猴细胞系应进行下列病毒的检查：疮疹病毒（狼疱疹及SA－8）、巨细胞病毒（sCMV）、脑心肌炎病毒、猴出血热病毒（SHF）、猴水痘病毒（sVZV）、腺病毒、SV－40、猴痘病毒、麻疹病毒及Ebola病毒。
d．人细胞系应进行下列病毒的检查：EB病毒、巨细胞病毒（CMV)、乙肝（HBV)及丙肝（HCV）病毒、人疱疹病毒6型（HHV－6）以及由细胞供者病史或建立原代细胞系所用组织类型提示的其他任何病毒。
e．其他种类细胞系的检查请向CBER咨询。
4．细胞系的逆转录病毒检查：来源于不同种类的细胞污染逆转录病毒有所不同，在设计逆转录病毒检查时，应考虑以下各点：
a．应考虑到制备单克隆抗体所用的鼠源细胞本身有的能够产生有传染性的鼠源逆转录病毒。因此，不必再证实小鼠逆转录病毒的存在。但是，应按收获物的系列测定原材料的逆转录病毒量，并证明各批之间均衡一致（1）。应通过试验证明纯化工艺能有效去除逆转录病毒（亦见第IV章D）。
b．大鼠骨髓瘤细胞系及其杂交瘤可能不表达逆转录病毒（6）。因此，应将检测样品与一种对广谱逆转录病毒敏感的细胞系共同培养；并与敏感检测试验方法相结合，证明不存在逆转录病毒，包括检查EPC及若干批产品。若感染性试验或电镜均未检查出逆转录病毒，则不必进行进一步的验证。由大鼠细胞系制备单克隆抗体的纯化工艺要求包含一个或一个以上灭活或去除逆转录病毒的步骤。C．地鼠细胞系表达缺陷型逆转录病毒颗粒（7）。该细胞是否能够表达感染性逆转录病毒尚不可知。发起人应用现有最敏感的感染性试验证明不存在感染性地鼠逆转录病毒，包括待检样品与广谱逆转录病毒易感细胞系共同培养，并与敏感检测方法相结合。当制品进入Ⅱ期临床和关键性临床试验阶段，则有必要利用广谱指示性细胞（包括人细胞系（8，9））进一步检查潜在感染性病毒。由于检查地鼠逆转录病毒感染性试验的有效性尚未确定，故应通过试验证实纯化工艺能充分去除逆转录病毒颗粒（见第Ⅳ章）。
d．猴细胞系应检测SIV、STLV、SRV、FV和HIV及HTLV。
e．人细胞系应检测HIV-1，2、HTLV、SIV、STLV及FV。
5．确认试验应证实细胞系的物种来源、典型特征，并证明无细胞系交叉污染。B．原材料、纯化半成品及成品批的质控及标准规格
应对每一批产品进行质量监控[21(FR600，3（x）］，该要求同样适用于末加工材料及纯化材料。
表2每批产品的安全性试验
试验原材料半成品成品
无菌试验＋＋＋
支原体检查＋—一
病毒检查
常规＊十——
种特异病毒＊＊＋—一
逆转录病毒。＊＊十——
多核苷酸一十—
一般安全性试验—一＋
内毒素—－＋
＊：对于非腹水原料，应进行含有三种指示细胞的体外常规试验，体内试验通常只做一次，但若生产方法改变，则需重复检查
＊＊：MAP RAP和HAP试验仅用于检查腹水原料。
＊＊＊：逆转录病毒的定量[感染试验或电镜检查（TEM）］对鼠源杂交瘤很重要；而对于其他杂交瘤，若MCB或EPC为阳性；则进行TEM、RT DNA杂交及共同培养试验很重要。
1．原材料
a. 收获的组织培养液应无细菌污染。若无菌试验证明所收获的合并腹水中存在活的污染物，则应进行定量，并根据生产经验规定细菌污染的允许范围。应定期鉴定污染细菌的种类。当污染量反复超过允许范围时，也应鉴定细菌种类。建议在贮存前收获的腹水用经0.45 μm的滤膜过滤（亦见第Ⅸ章B，1．b）。
b．末纯化的杂交瘤上清在澄清过滤前应进行可培养的及不可培养的支原体检查（l）。末加工腹水在进行支原体检查前经0.45μm滤膜过滤；随后贮存于≤-60℃，同时，以同样方式处理已知抗体滴度的阳性对照，若阳性对照的抗体滴度下降小于10倍，则这种处理腹水的方法是允许的。若动物群或末纯化腹水或杂交瘤上清中检查出支原体污染物，则这些材料不应使用，或进一步加工。
c应常规用三种指示细胞系进行体外病毒检查，体内试验通常只做一次（作为细胞系鉴定的一部分，见第IV章A），但是当生产方法改变时，则应重新进行（1）。含地鼠细胞的生物反应罐会被常规体外试验漏检的小鼠微小病毒污染，用MAP 试验检查此病毒较为敏感。总的来说，连续生产而不是单批生产时，应根据实际经验规定调整监测频率。当某一生产设施污染了某一特定病毒时，应考虑修改常规检查计划，以便检出该病毒。
d．应进行种特异病毒检查（见第Ⅲ章A.3）。
e．收获的腹水应进行小鼠逆转录病毒污染物常规定量检查。应对若干批组织培
养物进行逆转录病毒污染定量检查，以确定特定细胞系及生产过程的病毒污染水平（l）（见第IV章D）。为检查非小鼠逆转录病毒，应用能支持广范围逆转录病毒[包括人及非人灵长类的病毒（l）］生长的试验细胞系检查原材料。
f．若用不同组小鼠制备腹水，则在用其生产腹水前，对每一组小鼠应重复进行种特异病毒的血清学监测。
2纯化半成品
末修饰及修饰单克隆抗体纯化半成品的常规检定应包括下列检定（免疫结合物的讨论见第Ⅷ章）：
a．化学纯度包括外源动物蛋白的残留量，如成品中的白蛋白，免疫球蛋白或其他污染物。应在还原及非还原处理条件下，用考马斯亮蓝染色和银染方法对递增量纯化物进行SDS－PAGE分析。只要可能，应以检出灵敏度为1ppm（相对于单克隆抗体重量）的方法检测，将污染控制在可检出水平以下；
b．分子完整性：包括是否含有聚合、变性或断裂产物；
c．免疫球蛋白的类及亚类；
d．可与内部参考品标准相比的每批半成品单克隆抗体（或其重链或轻链）的IEF 图谱；
e．无菌试验；
f．在检查细胞库细胞（见第Ⅲ章A）中，若检出传染因子，应验证单克隆抗体纯化工艺将其去除的效果。应对最初连续的3～5批纯化半成品进行检查，以证实纯化工艺已去除污染物。若在细胞库细胞中检出人的感染因子，则每批纯化制品应进行检测，并建议在扩大生产前，向CBER人员咨询；
g．在加赋形剂前，建议对每批产品进行DNA含量检定，如果可能，成品中细胞DNA含量应不超过100pg／剂量。
h．潜在污染物或添加剂（如抗生素、试剂、防腐剂或亲合柱析出成分如蛋白A）的检测及定量试验。应无青霉素或其他β内酸胺类抗生素。用标准方法不能去除的痕量污染物，在提出IND申请前，可接受值应与CBER讨论。若在腹水制备中使用了降植烷，则应证明用敏感方法检测不出来。
3．分装的成品
应对每批分装成品进行下列检定（21CFR，600，3（y））。在某些特定情况下（如放射性标记用），应就成品检定的特殊事宜与CBER讨论，并依情况而定。
a．蛋白浓度；
b．效力（21 CFR 610.10）；
C在还原及非还原条件下，产品在聚丙烯酰胺电泳中的移行，与内部参考标准对比进行。
d．无菌试验（21 CFR 610，12）；
e．一般安全试验（21，CFR 610．11）；
f内毒素测定：如鲎试剂试验（LAL）用21CFR 610．13中所述的家兔热原试验验证过，可认为是一种可行的等同检定方法（21 CFR 610.9）。应用美国批准的试验系统进行LAL试验。若所用的LAL源于不同厂家，则应重复比较性试验。家兔热原与LAL检测程序比较试验的必要条件应根据实际情况讨论确定。亦请参见文献（11）。
g.适当的鉴别试验（21 CFR 610．14）；
h．水分（21 CFR 610．13）测定；
i．防腐剂（21 CFR 610．15）测定。
C．产品稳定性
产品稳定性应满足临床方案制定的要求。快速的稳定性试验资料可作为产品审批及标定的辅助材料，但不能代替实时资料。
1．应制定稳定性检定规划，包括在规定效期全过程中，每间隔一定时间进行制品的化学完整性试验（如断裂或聚合）及效力试验。亦参见文献（11b）。若临床试验的制品，在贮存期间发生显著变化，应向CBER报告。如申请产品生产许可证，最好在研究的每一阶段前，用销售时用的容器和封盖分装的成品进行支持效期的稳定性试验。
2．确保制品生物活性的稳定性试验应包括厂内参比品。只要可能在试验的全过程中只使用一批试验抗原（如：纯化的抗原、细胞或组织）。定量试验应用于比较效力所界定的生物活性。
3．快速稳定性试验有助于鉴定及建立稳定性指示试验，重要的参数是对每一批制品用趋向分析方法进行指示稳定性监测。
D．某一已知污染物的定量及去除
应估测原料中污染物含量，例如：末纯化的单克隆抗体经常污染小鼠逆转录病毒。若污染物为病毒，则应探讨对人细胞的任何可能或可疑亲嗜性（如通过共同培养法），然后，在模拟纯化系统中，利用污染物自身或已知污染物的典型相似物（如逆转录病毒模型）证明纯化工艺会除污染物的效果（1）。
除低速离心澄清外，在进行任何其他加工之前，应先对未纯化的浓缩上清液或腹水进行检查。我们建议，对用啮齿动物细胞系生产的污染逆转录病毒的腹水或上清，应用浓缩样品以电镜检查法定量。若TEM法检出病毒颗粒，应假定其具有感染性，以便制定去除逆转录病毒的指标。若TEM结果为阴性，就假定逆转录病毒的效价为1×106/ml。由非啮齿动物或杂交瘤细胞制备的腹水或上清不仅应用TEM检查，而且还应用灵敏、现代水平的感染性试验检测，此类试验可检出由细胞基质产生的所有已知类型的逆转录病毒。
验证纯化工艺去除或灭活逆转病毒的效果是最重要要求。参考文献1和2亦讨论了去除逆转录病毒验证试验设计，该试验的目的在于证明与初期污染相比，纯化工艺使病毒量最低限度减少了3 log，第V章提供了验证Ⅰ期单抗临床去除咽齿动物逆转录病毒的简化方法。应在制品开发的初期，与CBER讨论去除或灭活病毒工序的设计及验证。
V．某些Ⅰ期临床用单抗的简化验证程序
只在就去除病毒程序选择向CBER人员咨询后，实施简化的验证方法。
A．一般考虑
以下程序可代替目前的大规模生产技术证明在下列特定条件下啮齿动物逆转录病毒的充分去除。尽管简化验证程序在逆转录病毒污染物的检测及鉴定方面不如大规模生产中所采用的全面，但对原料中逆转录病毒的含量测定及证明病毒的去除仍是简化程序的关键环节。
1．简化验证程序适用于以啮齿动物细胞，无论是腹水或组织培养制备的单抗，但不适用于用其他细胞基质制备的单抗。
2简化验证程序仅用于临床适应症为患者生命直接受到威胁或严重衰弱性疾病（主要发病），且无治疗方法或当前治疗手段不理想时。21CFR 34．生命直接受到威胁疾病的定义为：在几个月内可能将会发生死亡或因无早期治疗造成过早死亡的疾病过程。
3．如本文前文及文献（1）所述，关于外源因子检查的建议不应简化。
4．简化验证程序不能用于支持Ⅰ期临床以后的试验；也不能用于支持以正常人或大量人群为对象的试验。
B．用简化验证程序证明逆转录病毒的去除
1．一般考虑
a．原料中逆转录病毒的滴度（见第IV章D）应用于指导和量化任一纯化过程。
b．建议所有的纯化工艺应包括一个或一个以上强化的去除或灭活病毒工序。强化工序定义为在不同条件下（如柱层析缓冲液pH或离子强度），对多种单抗均有效。强化工序包括低pH，加热，溶媒或去污剂处理，过滤。可用下列方法证明强化方法去除病毒的有效性：a)模拟系统（同属验证）；b）与替代抗体（通常源于同种及同种型）去除病毒程序相比较，两种方法由同一发起人完成；c）用单克隆抗体产品自身去除逆转录病毒。
C. 亲和及离子交换层析，以及去污剂处理不认为是强化方法。以上处理方法应
用单克隆抗体制品本身，或由同一人员用另一单克隆抗体对比进行纯化和去除逆转录病毒的方法进行验证。单克隆抗体制品及替代单克隆抗体的结果应符合B．3项应用法则系统项下的相似性规则。
2．同属验证
同属验证是一种适用于各群及各类别分子的病毒灭活或去除的综合方案。这些方法在主文件中能横向参比。适当的已发表的资料应只包括高质量及被广泛承认的科学研究结果。若CBER判定某项资料符合科学质量的高标准，则以发起人或其他实验室提供的资料为依据建立的尚未发表的病毒去除方法是同样可接受的。
3．应用法则系统
a．同属病毒去除验证程序中所用的替代单克隆抗体应与Ig单克隆抗体制品在类/同种型／种（如lgG-lgM）、电荷及其他主要的生化特征方面相一致。一般说来，替代单克隆抗体与制品抗体为同种同源（即均源于腹水或杂交瘤／转染瘤上清）。
b．同属病毒去除系统中所用的去除及灭活病毒步骤若与纯化单克隆抗体所用的方法不同，则应与其相类似。在所有病毒灭活及去除步骤中，应特别注意层析柱洗脱缓冲液条件，包括pH和离子强度、过柱顺序、蛋白浓度、保留时间、压力条件、湿度及与伴随规模扩大出现的潜在问题。纯化及病毒去除步骤的相似性应以发起人产品验证实验室提供的资料为依据。
4。其他考虑事项
a．当制品进入扩大Ⅰ期或Ⅱ期临床阶段，应提供证明逆转录病毒被充分去除（见第Ⅵ章D）的全面的或完整的验证资料。资料不仅要通过在模拟纯化中用现实抗体制品证明单克隆抗体纯化程序自身可去除已知的或高度可疑的病毒污染物，同时应证明每一步骤去除或灭活病毒的作用。
b．采用简化验证程序生产的单克隆抗体Ⅰ期临床被试人同意文件，要准确反映出鼠源逆转录病毒偶然感染人的潜在危险。
C．由于担心鼠源和人源逆转录病毒基因序列间潜在的相互作用，简化验证程序不适用于预定给已知逆转录病毒感染（如HIV-1，2;HTLV－1，2)患者用的抗体。此程序亦不适用于预定给患有实质性细胞免疫缺陷病人用的抗体。
d．表3列出了采用各种强化的或非强化的灭活／去除步骤预测的逆转录病毒的去除范围（以log表示），其目的在于帮助生产者设计单克隆抗体的纯化工艺。任何特定步骤去除逆转录病毒的效果取决于多种因素，因此应根据实际经验并考虑这些因素。
表3(2)
灭活步骤强化步骤报导去除病毒log
pH3～4．5 是3－4
加热是 4
溶媒／去污剂是 5
过滤（0．02～0.04μm）是4－8
去污剂不是 4
亲和／离子交换不是1－5
Ⅵ．与生产改变有关的问题（证明产品相当性）
A．临床试验期间生产的改变
在单克隆抗体临床开发期间，制品生产工艺经常改变。发起人应预先考虑这些改变并制定一份计划证明新、旧工艺生产的产品是相当的，尤其是在生产改变前已取得支持深入的临床试验及市场销售权申请的临床前或临床资料时。证明产品相当性的计划应及时提交CBER审批。
只要生产中发生改变，应对单克隆抗体进行严格的体外生化及功能特性鉴定（见第Ⅰ章产品生产及检定）。根据体外试验及动物试验类型和资料质量，可能不必用扩大临床资料证明产品的相当性。但在某些情况下，对两种不同生产工艺下的产品进行扩大对比临床评估的必要性增大。这些情况包括：
1．不能用分析试验充分鉴定产品的活性。
2．生化试验证明产品间存在差异。
3．动物试验揭示产品间存在药物动力学或其他方面的差异。
在早期临床开发期间生产发生变化时，正在进行的临床试验应包括临床相当性试验，如生产变化发生于临床试验晚期（2／3期），如果产品的生化及功能特性分析表明新旧产品有差异，则可能需要补充进行临床评价。这些临床试验的设计及范围将取决于所提出的问题。例如，提出的问题是修改清除率，则可能只需进行比较性药物动力学试验。在所有的情况下，用预定患者人群进行对比试验应有适当的设计方案，包括充分的统计方法，以解决特定问题（12）。许多周密计划的试验都可纳入单克隆抗体的全面药物开发项目中。
B．产品批准后的生产改变
当细胞库或已上市产品的生产显著改变时，厂家应提交产品许可证修正件，包括提供保证在产品标签上说明产品系用新工艺制备的资料。通常仅需对新、旧工序生产的单克隆抗体进行生化及功能特性分析，重新进行外源因子检定及病毒去除的验证。在其他情况下（如上述A．1-3）还需进行比较性临床试验（12）。发起人应根据生化及动物试验结果及统计结果制定推荐的试验计划，并提交CBER 以备复审的征求意见。
临床前试验
Ⅶ．交叉反应性试验
当相同或相关抗原决定簇在人的细胞或非预定的靶组织表达，可观察到抗体与这种组织的结合。交叉反应性具有严重后果，特别是使用药理活性抗体或细胞毒性免疫结合物时。因此，一般在Ⅰ期；临床试验前应经常进行交叉反应性的实验室检测。对于双特异性抗体，除检测双特异性产品外，还应对每株母本抗体进行逐个评估。
A体外试验
目前，人细胞或组织是用免疫细胞化学及免疫组织化学技术进行检测的，若可能，最好用较新的技术检测，
1．应用附录1中所列速冻成人组织测定抗体或免疫结合物的反应性，最好是外科手术样本，也允许采用组织保存良好的尸检样本。因检测存在多形性，至少应对王个无相互关系供者的组织进行评估，应以已知阳性组织评估固定液的影响，以保证在组织处理过程中靶抗原得到保护。
2．在特殊情形下，可以通过检测有代表性的培养细胞系、干细胞及胚／胎儿组织来测定交叉反应性。
3．应测定若干种浓度的制品，交叉反应的检测能力可能取决于抗体浓度，当选择适当的浓度进行组织结合研究时，应考虑到抗体的亲和力以及预期能达到的最大血浆浓度，也应尽可能比较单克隆抗体与靶组织及与交叉反应组织结合的比率。由于可能观察到非特异性结合现象，有可能时，应用纯化抗原进行抑制试验评估潜在交叉反应的特异性。
4．为阐述试验结果，必需有阳性及阴性对照，对照证实了组织的可用条件及方法能否满足要求。因转铁蛋白是正常和肿瘤细胞表面一种普通而又大量存在的分子，可以用抗转铁蛋白受体单克隆抗体作为阳性对照。
5．若临床使用衍生的抗体或抗体片段，应就所用类型进行检测。不要用与被检单抗有相似特异性的替代抗体进行交叉反应性测定。
6．当还有交叉反应且靶抗原可能存在多形性时，则试验应扩大到较大系列组织，以确定其频率。
7．比较来源于不同种类动物组织的体外交叉反应性，对于确定最相关的毒性试验动物具有重要意义。
B体内试验
综合体内试验应显示某单克隆抗体与非靶人组织的交叉反应性，首先在动物体内，然后在人体内进行。对于溶细胞性免疫结合物或具ADCC活性抗体的研究，通常要求进行较详细的临床前试验，包括用一种以上动物及重复剂量进行动物试验。
Ⅷ. 临床前药理学、安全性和毒性试验
单克隆抗体临床前安全试验的目的在于鉴定及估量可能出现的人体不良反应发生率及严重程度，如可能，并确定安全的起始剂量及逐步提高的剂量。单克隆抗体制品临床前试验内容包括其免疫原性、稳定性、组织交叉反应性和有效性。动
物种类的差异会使临床前试验的设计及解释复杂化。
A．一般考虑
1．生产或产品配制的改变可导致生物活性重大变化。因此建议，临床前试验用材料应与临床试验用产品批的制备程序相同。在某些情况下，可适当修改临床前试验的载体系统的成分，用同源动物血清白蛋白代替人血清白蛋白作为载体，可防止在动物体内形成抗-白蛋白抗体，因而增加了临床前试验的有效性。
2．临床前试验方案应尽最大可能与建议的临床使用剂量浓度、时间表、途径及次数相同。剂量范围选择应至少包括两个剂量，一个为等效剂量，另一个为最高预期的临床剂量。进行安全性试验时，应对大范围的使用剂量进行测试，以保证最高剂量的体内分布及清除差异不会产生不良作用。对于毒性试验，所检测的最高剂量应显示不良作用，应建立以三个剂量为最低值的最佳剂量范围。通过对几种剂量及用药间隔的试验确定剂量反应曲线的线性关系及总体状态。
B．动物安全性试验
当准备进行单克隆抗体的毒性试验时，应考虑下列因素：
1．若被试样品为无修饰抗体，且无疾病活性的动物模型或无携带相关抗原的动物，且与人组织交叉反应性试验阴性，则检测项目可以限于“一般安全性试验”所述内容（21 CFR 610．11）。
2 若有动物模型，则应尽可能证明生物学效应的剂量依赖性，使用较高剂量可以较好地预测治疗指数。
3 体内活性模型在提供使用推荐产品的理论说明并确定安全性和毒性方面已证明是有意义的。例如，异源移植模型可用于评估抗体与人肿瘤细胞的结合力。动物疾病模型则能研究单克隆抗体在许多炎症反应，自身免疫性疾病及异体移植排斥等方面的作用。
4 动物体内相关抗原的性质与人体内相关抗原的生物学分布、功能及结构应具有可比性。例如：可以在狒狒体内研究CD34+前体细胞，因狒狒及人体内相同的细胞组分均表达CD34+抗原，并产生造血细胞。但是，对于所用的动物模型，不必要求单克隆抗体的抗原密度或亲和力绝对相等。例如，结合力差异可通过增
单克隆抗体的制备及应用
单克隆抗体的制备及应用 单克隆抗体是由淋巴细胞杂交瘤产生的、只针对复合抗原分子上某一单个抗原决定簇。单克隆抗体技术(monoclonal antibody technique)：一种免疫学技术，将产生抗体的单个B淋巴细胞同骨髓肿瘤细胞杂交，获得既能产生抗体，又能无限增殖的杂种细胞，并以此生产抗体。是仅由一种类型的细胞制造出来的抗体，对应于多克隆抗体、多株抗体——由多种类型的细胞制造出来的一种抗体。 1 单克隆抗体的优点与局限性： 单克隆抗体的优点：(1)杂交瘤可以在体外“永久”地存活并传代，只要不发生细胞株的基因突变，就可以不断地生产高特异性、高均一性的抗体。(2)可以用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗体。(3)由于可能得到“无限量”的均一性抗体，所以适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法，如IRMA和ELISA等。(4)由于单克隆抗体的高特异性和单一生物学功能，可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗。 总体来说，即：高特异性、高纯度、重复性好、敏感性强、成本低和可大量生产等。 单克隆抗体的局限性：(1)单克隆抗体固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围。由于单克隆抗体不能进行沉淀和凝集反应，所以很多检测方法不能用单克隆抗体完成。 (2)单克隆抗体的反应强度不如多克隆抗体。(3)制备技术复杂，而且费时费工，所以单克隆抗体的价格也较高。 2 单克隆抗体的制备： 单克隆抗体的制备原理：应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞二者合二为一，得到杂种的骨髓瘤细胞。这种杂种细胞继承两种亲代细胞的特性，它既具有B淋巴细胞合成专一抗体的特性，也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性，用这种来源于单个融合细胞培养增殖的细胞群，可制备抗一种抗原决定簇的特异单克隆抗体。 单克隆抗体的制备过程：抗原准备、动物的选择与免疫、细胞融合、选择杂交瘤细胞及抗体检测、杂交瘤的克隆化、杂交瘤细胞的冻存与复苏、单克隆抗体的纯化等步骤。 抗原准备 抗原，是指能够刺激机体产生（特异性）免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞在体外结合，发生免疫效应（特异性反应）的物质。抗原的基本特性有两种，一是诱导免疫应答的能力，也就是免疫原性，二是与免疫应答的产物发生反应，也就是抗原性。很多物质都可以成为抗原，抗原的具体分类可以参见抗原，在进行单克隆抗体制备过程中，很多物质都可以成为抗原，在常规的科研实验中，科研者经常选用每只小鼠/大鼠每次注射10~50ug 重组蛋白、偶联多肽、偶联小分子等作为抗原产生特异性的单克隆抗体。 动物的选择与免疫
原料药稳定性试验报告
L- 腈化物稳定性试验报告 一、概述 L-腈化物是L- 肉碱生产过程中的第一步中间体（第二步中间体： L-肉碱粗品；第三步中间体：L-肉碱潮品），由于L- 肉碱生产工艺为 间歇操作，即每生产一步中间体，生产完毕并出具合格检测报告后，存 入中间体仓库，以备下一步生产投料所需。根据本公司L- 肉碱产品的 整个生产周期，L- 腈化物入库后可能存放的最长时间为4 周（约28 天）。以此周期为时间依据制定了L- 腈化物稳定性试验方案，用于验 证L-腈化物在再试验期限内的各项质量指标数据的稳定性，并且能否符 合L- 腈化物的质量标准，此次稳定性试验的整个周期为28 天，具体 的稳定性试验方案以ICH 药物稳定性指导原则为基础制定，以确保L- 腈化化物稳定性试验的可操作性。 二、验证日期 2010 年1 月13 日- 2010 年2 月10 日 三、验证方案 1）样品储存和包装： 考虑到L- 腈化物今后的贮藏、使用过程，本次用于稳定性试验的样品 批次与最终规模生产所用的L- 腈化物的包装和放置条件相同。 2）样品批次选择：此次稳定性试验共抽取三批样品，且抽取样品的批次与 最终规模生产时的合成路线和生产工艺相同
3）抽样频率和日期：从2010.1.13 起，每隔7 天取样一次，共取五次，具体日期为：2010.1.13 、2010.1.20 、2010.1.27 、 2010.2.3 、2010.2.10 ，以确保试验次数足以满足L- 腈化物的稳 定性试验的需要。。 4）检测项目：根据L- 腈化物的质量标准的规定，此次稳定性试验的检测项目共五项，分别为外观、氯含量、熔点、比旋度、干燥失重。这 些指标在L- 腈化物的储存过程中可能会发生变化，且有可能影响 其质量和有效性。 5）试样来源和抽样：L- 腈化物由公司102 车间生产，经检测合格后储存于中间体仓库，本次稳定性试验的L- 腈化物均取自于该中间体仓 库，其抽样方法和抽样量均按照L- 腈化物抽样方案进行抽样。抽 样完毕后直接进行检测分析，并对检测结果进行登记，保存，作为稳 定性数据评估的依据。 四、稳定性试验数据变化趋势分析及评估 通过对三批L- 腈化物的稳定性试验，对其物理、化学方面稳定性资料进行评价，旨在建立未来相似情况下，大规模生产出的L- 腈化物是否适用 现有的再试验期（28天）。批号间的变化程度是否会影响未来生产的
人用单克隆抗体质量控制技术指导原则
人用单克隆抗体质量控制技术指导原则 本要点适用于供治疗的体内诊断用的利用杂交瘤技术制备的单克隆抗体，适用于在人体内应用的利用重复DNA技术制备的基因工程抗体一、杂交瘤技术制备的单克隆抗体 （一）杂交瘤细胞 1．亲本细胞 （1）骨髓瘤细胞 SP2/0或其他适宜的骨髓瘤细胞系。应为不合成或不分泌免疫球蛋白链型，具有符合骨髓瘤细胞的染色体特征，并有明确的来源历史及符合要求的保存条件。 （2）免疫亲代细胞 经抗原免疫的鼠脾B淋巴细胞或外周血B淋巴细胞。 应有明确的免疫原来源、性质及动物种系，免疫原详细的制备过程。适宜的免疫方案及免疫淋巴细胞制备的方法。 2．细胞融合与克隆化 采用适宜的方法进行融合、筛选及克隆化。 3．杂交瘤细胞检定 （1）抗体分泌稳定性 连续克隆化后抗体阳性率达100%，经体外连续传代3个月以上和反复冻存、复苏，细胞系能保持稳定分泌特异性抗体。 （2）细胞核学特征
检查细胞分裂中期染色体，应符合杂交瘤细胞特征。 4．鼠源病毒检查 按附录要求检测鼠源病毒。 5．支原体检查 按现行《中国药典》生物制品无菌试验规程进行。 6．无菌试验 按现行《中国药典》生物制品无菌试验规程进行。 （二）单克隆抗体的检定 1．免疫球蛋白类及亚类 用免疫双扩散法或其他适宜的方法测定。 2．亲和力 用可靠、准确的方法测定单克隆抗体（以下简称为单抗）的亲和常数或相对亲和力。一般情况下，对于免疫原为可溶性的单抗，测其亲和常数，对于免疫原为颗粒性抗原的单抗，测其相对亲和力。 3．特异性 测定单抗对靶抗原的特异性；对多株单抗识别的抗原决定簇进行相关性分析。 4．交叉反应 按附录要求。 免疫组织化学法测定单抗与人体组织交叉反应，用冰冻及石蜡包埋的各种正常脏器组织测定。来源于肿瘤相关抗原的单抗应进行与各种肿瘤
单克隆抗体制备的基本原理
单克隆抗体制备的基本原理 一、单克隆抗体的概念 抗体（antibody）是机体在抗原刺激下产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白。常规的抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的方法产生的，因而抗血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分。一般的抗原分子大多含有多个不同的抗原决定簇，所以常规抗体也是针对多个不同抗原决定簇抗体的混合物。即使是针对同一抗原决定簇的常规血清抗体，仍是由不同B细胞克隆产生的异质的抗体组成。因而，常规血清抗体又称多克隆抗体（polyclonal antibody），简称多抗。由于常规抗体的多克隆性质，加之不同批次的抗体制剂质量差异很大，使它在免疫化学试验等使用中带来许多麻烦。因此，制备针对预定抗原的特异性均质的且能保证无限量供应的抗体是免疫化学家长期梦寐以求的目标。随着杂交瘤技术的诞生，这一目标得以实现。 1975年，Kohler和Milstein建立了淋巴细胞杂交瘤技术，他们把用预定抗原免疫的小鼠脾细胞与能在体外培养中无限制生长的骨髓瘤 细胞融合，形成B细胞杂交瘤。这种杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征，既像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能无限地快速增殖且永生不死，又能像脾淋巴细胞那样合成和分泌特异性抗体。通过克隆化可得到来自单个杂交瘤细胞的单克隆系，即杂交瘤细胞系，它所产生的抗体是针
对同一抗原决定簇的高度同质的抗体，即所谓单克隆抗体（monoclonal antibody，McAb），简称单抗。 与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。单抗技术的问世，不仅带来了免疫学领域里的一次**，而且它在生物医学科学的各个领域获得极广泛的应用，促进了众多学科的发展。 德国科学家柯勒（Georges Ko1er）和英国科学家米尔斯坦（Cesar Milstein）两人由此杰出贡献而荣获1984年度诺贝尔生理学和医学奖。 二、杂交瘤技术 （一）杂交瘤技术的诞生 淋巴细胞杂交瘤技术的诞生是几十年来免疫学在理论和技术两方面 发展的必然结果，抗体生成的克隆选择学说、抗体基因的研究、抗体结构与生物合成以及其多样性产生机制的揭示等，为杂交瘤技术提供了必要理论基础，同时，骨髓瘤细胞的体外培养、细胞融合与杂交细胞的筛选等提供了技术贮备。1975年8月7日，Kohler和Milstein 在英国《自然》杂志上发表了题为“分泌具有预定特异性抗体的融合细胞的持续培养”（Continuous cultures of fused cells secreting antibody of
原料药稳定性试验报告
L-腈化物稳定性试验报告 一、概述 L-腈化物是L-肉碱生产过程中的第一步中间体（第二步中间体：L-肉碱粗品；第三步中间体：L-肉碱潮品），由于L-肉碱生产工艺为间歇操作，即每生产一步中间体，生产完毕并出具合格检测报告后，存入中间体仓库，以备下一步生产投料所需。根据本公司L-肉碱产品的整个生产周期，L-腈化物入库后可能存放的最长时间为4周（约28天）。以此周期为时间依据制定T L-腈化物稳定性试验方案，用于验证L-腈化物在再试验期限内的各项质量指标数据的稳定性，并且能否符合L-腈化物的质量标准，此次稳定性试验的整个周期为28天，具体的稳定性试验方案以ICH药物稳定性指导原则为基础制定，以确保L-腈化化物稳定性试验的可操作性。 二、验证日期 2010 年1月13日----2010 年2月10日 三、验证方案 1）样品储存和包装： 考虑到L-腈化物今后的贮藏、使用过程，本次用于稳定性试验的样品批次与最终规模生产所用的L-腈化物的包装和放置条件相同。 2）样品批次选择：此次稳定性试验共抽取三批样品，且抽取样品的批次与 最终规模生产时的合成路线和生产工艺相同 3）抽样频率和日期：从2010.1.13起，每隔7天取样一次，共取五次，具体日期
为：2010.1.13、2010.1.20、2010.1.27、2010.2.3、2010.2.10，以确保试验 次数足以满足L-腈化物的稳定性试验的需要。。 4）检测项目：根据L-腈化物的质量标准的规定，此次稳定性试验的检测项目共五项，分别为外观、氯含量、熔点、比旋度、干燥失重。这些指标 在L-腈化物的储存过程中可能会发生变化，且有可能影响其质量和有效 性。 5）试样来源和抽样：L-腈化物由公司102车间生产，经检测合格后储存于中间体仓库，本次稳定性试验的L-腈化物均取自于该中间体仓库，其抽样方法和抽样量均按照L-腈化物抽样方案进行抽样。抽样完毕后直接进行检测分析，并对检测结果进行登记，保存，作为稳定性数据评估的依据。 四、稳定性试验数据变化趋势分析及评估 通过对三批L-腈化物的稳定性试验，对其物理、化学方面稳定性资料进行评价，旨在建立未来相似情况下，大规模生产出的L-腈化物是否适用现有的再试验期（28天）。批号间的变化程度是否会影响未来生产的L-腈化物在再试验期内是否仍符合其质量规范。本次试验数据以表格、图解的形式给出，从而对L-腈化物的稳定性数据进行有效的评估。
常用的单克隆抗体检测方法
常用的单克隆抗体检测方法 通过杂交瘤技术制备单克隆抗体，在杂交瘤制备完成后，需要对抗体进行一个检测，本文介绍了几种常用的抗体检测的方法（1）免疫酶技术免疫酶技术是将抗原抗体反应的特异性和酶对底物显色反应的高效催化作用有机结合而 成的免疫学技术。由于它特异性强，灵敏度高，现已广泛用于筛选和鉴定单抗。①器材和试剂a、包被缓冲液：碳酸盐缓冲液：取0.2mol/L Na2CO3 8ml，0.2mol/L NaHCO3 17ml 混合，再加75ml蒸馏水，调PH至9.6。Tris-HCl缓冲液（PH8.0，0.02mol/L）：取0.1mol/L Tris 100ml，0.1mol/L HCl 58.4ml混合，加蒸馏水至1000ml。b、洗涤缓冲液（PH7.2的PBS）：KH2PO4 0.2g，KCl 0.2g，Na2HPO4·12H2O 2.9g，NaCl 8.0g，Tween-20 0.5ml，加蒸馏水至1000ml。c、稀释液和封闭液：牛血清白蛋白（BSA）0.1g，加洗涤液至100ml；或用洗涤液将小牛血清配成5-10%使用。d、酶反应终止液（2mol/L H2SO4）：取蒸馏水178.3ml，滴加浓硫酸（98%）21.7ml。e、底物缓冲液（PH5.0，磷酸盐-柠檬酸缓冲液）：取0.2mol/L Na2HPO4 25.7ml，0.1ml/L柠檬酸24.3ml，再加50ml蒸馏水。柠檬酸溶液及配成的底物缓冲液不稳定，易形成沉淀，因此一次不宜配制过多。f、底物使用液：OPD底物使用液（测490nm的OD值）：OPD 5mg，底物缓冲液10ml，3% H2O2
0.15ml。TMBS或TMB底物使用液（测450nm的OD值）：TMBS或TMB（1mg/ml）1.0ml，底物缓冲液10ml，1% H2O2 25ul。ABTS底物使用液（测410nm的OD值）：ABTS 0.5mg，底物缓冲液1ml，3% H2O2 2ul。g、抗体对照：以骨髓瘤细胞培养上清作为阴性对照，以免疫鼠血清作为阳性血清。h、抗原：可溶性抗原：尽量纯化，以获得高特异性。病毒感染的传代细胞或全菌抗原。淋巴细胞等悬液。i、酶标抗鼠抗体或酶标SPA或其他类似试剂。j、细胞固定液：-20℃丙酮；或丙酮-甲醛固定液：Na2HPO4 100mg，KH2PO4 500mg，蒸馏水150ml，丙酮225ml，甲醛125ml；或丙酮-甲醛溶液（1；1）；或-20℃甲醇。k、聚苯乙烯微孔板：40孔、96孔、或条孔；硬板或软板均可使用。l、酶联免疫阅读仪；或光镜。m、吸管、加样器及水浴箱、离心机等。②可溶性抗原的酶联免疫吸附试验（ELISA）a、纯化抗原用包被液稀释至1-20ug/ml。 b、以50-100ul/孔量加入酶标板孔中，置4℃过夜或37℃吸附2小时。 c、弃去孔内的液体，同时用洗涤液洗3次，每次3-5分钟，拍干。 d、每孔加200ul封闭液4℃过夜或37℃封闭2小时；该步骤对于一些抗原，可省略。 e、洗涤液洗3次；此时包被板可-20℃或4℃保存备用。 f、每孔加50-100ul 待检杂交瘤细胞培养上清，同时设立阳性、阴性对照和空白对照；37℃孵育1-2小时；洗涤，拍干。 g、加酶标第二抗体，每孔50-100ul，37℃孵育1-2小时，洗涤，拍干。 h、加底物
单克隆抗体的制备、纯化及鉴定
单克隆抗体的制备、纯化及鉴定 一、实验目的： 单克隆抗体制备是细胞免疫学的一个重要里程碑，它涵盖了细胞培养、细胞融合、免疫动物和抗体效价检测等各个方面内容。了解单克隆抗体制备的原理、主要步骤和方法。 二、实验原理： 骨髓瘤细胞在体外培养能大量无限增殖，但不能分泌特异性抗体；而抗原免疫的B淋巴细胞能产生特异性抗体，但在体外不能无限增殖。将免疫脾细胞与骨髓瘤细胞融合后形成的杂交瘤细胞，继承了两个亲代细胞的特性，既具有骨髓瘤细胞能无限制增殖的特性，又具有免疫B细胞合成和分泌特异性抗体的能力。经在HAT培养基[含有次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)]中进行选择性培养，未融合的脾细胞因不能在体外长期存活而死亡；未融合的骨髓瘤细胞合成DNA的主要途径被培养基中的氨基蝶呤阻断，又因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶（HGPRT），不能利用培养基中的次黄嘌呤完成DNA的合成过程而死亡。只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，因此能在HAT培养基中存活和增殖。经过克隆选择，可筛选出能产生特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞，在体内或体外培养，即可无限制地大量制备单克隆抗体。 三、试剂与器材： 细胞培养板、解剖器械、平皿、酶标仪、加样器、细胞计数板、CO2培养箱、倒置显微镜等。 四、操作方法： 1、抗原制备； 一般而言，抗原的纯度不很重要，特别是免疫原性较强的抗原。 A．可溶性抗原（蛋白质）以1mg/ml～5mg／ml的溶液加等量的弗氏完全佐剂乳化，分多点小鼠皮下注射，总量为0.3ml～0.6ml，间隔３～５周再同样注射一次，１０天后，断尾取血一滴，测抗体效价，选滴度高的小鼠做融合试验。
稳定性试验总结教程文件
稳定性试验总结
复方双氢青蒿素片稳定性试验总结报告 张美义、肖文中、林燕芳、詹利之 摘要:复方双氢青蒿素片是由双氢青蒿素、磷酸派喹、甲氧苄啶三种主要成分组成。本品经过强光照射试验、高温试验、高湿试验、室温空气放置试验等影响因素试验，以及加速试验、室温留样考察等试验，证明本品除在高温80℃下，双氢青蒿素不稳定外，其他成分在各种试验条件下均比较稳定。 关键词：稳定性影响因素加速试验室温放置 一、试验材料与方法 1.样品来源：复方双氢青蒿素片，批号：由重庆通 和制药有限公司提供，批号：。981020批、981021 批、981022批共三批（影响因素试验使用981020 批），按临床用药质量标准（草案）检验符合规定。 2.主要试验仪器： 高效液相色谱仪：岛津LC-10AT 色谱柱：YWG C18 10μm 250×46mm 紫外可见分光光度计：TU-1901 电子分析天平：SHINKO SH-210R 智能溶出度试验仪：ZRS-6型 3.试验方法： （1）影响因素试验样品除去外包装，样品在裸露条件下进行观察。 收集于网络，如有侵权请联系管理员删除
①强光照射试验：将复方双氢青蒿素片置于平皿中，于室 温3600Lx光下照射，并于5、10天各取样测定一次。 ②高温试验：把复方双氢青蒿素片置于密闭器皿中，分别 置于40℃、60℃、80℃的恒温箱中，在3天、5天、10天各取样测定一次。试验前供试品先准确称重，样品取出时再准确称重。 ③高湿试验：把复方双氢青蒿素片置于平皿中，放在相对 湿度分别为75%及92.5%条件下的封闭干燥器中，恒温 25℃，分别于5、10天取样观察和检测。 ④室温空气放置试验：供试品置于室温空气中，第5、10 天各取样测定一次。 （2）加速试验：将铝箔包装的复方双氢青蒿素片（模拟上市包装）3个批号的样品放置在40℃，相对湿度为 75%的条件下三个月，每月每批样品检测一次 （3）室温留样观察试验：将铝箔包装的复方双氢青蒿素片（模拟上市包装）3个批号的样品置于室温条件下，定期分别于0、3、6、12、18、24、36个月，按考察项目进行检测。 4.考察项目：①外观色泽；②片芯性状；③溶出度；④含量；⑤色谱检查分（降）解产物。 5.考察项目的检测方法： （1）、外观色泽、片芯性状用肉眼观察。 （2）、含量： 双氢青蒿素取本品10片，精密称定，研细，精密称取适量（约相当于双氢青蒿素0.1g）置研钵中，加适量无水乙醇充分研磨，使双氢青蒿素溶解，以无水乙醇约75ml将研钵中的供试品定量移入100ml量瓶中，超声振荡15分钟，放至室温， 收集于网络，如有侵权请联系管理员删除
单克隆抗体制备过程中经过两次筛选
单克隆抗体制备过程中经过两次筛选 单克隆抗体制备过程中，总共有两次筛选，第一次筛选出杂交瘤细胞，第二次筛选出能产生特异性抗体的杂交瘤细胞，两次筛选的原理和方法是不相同的。 第一次筛选的原理与方法：细胞融合后，杂交瘤细胞的选择性培养是第一次筛选的关键。普遍采用的HAT选择性培养液是在普通的动物细胞培养液中加入次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶核苷酸（T）。其依据是细胞中的DNA合成有两条途径：一条途径是生物合成途径（“D途径”），即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，为DNA分子的合成提供原料。在此合成过程中，叶酸作为重要的辅酶参与这一过程，而HAT培养液中氨基喋呤是一种叶酸的拮抗物，可以阻断DNA合成的“D途径”。另一条途径是应急途径或补救途径（“S途径”），它是利用次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相应的核苷酸，两种酶缺一不可。因此，在HAT培养液中，未融合的效应B细胞和两个效应B细胞融合的“D途径”被氨基喋呤阻断，虽“S途径”正常，但因缺乏在体外培养液中增殖的能力，一般10d左右会死亡。对于骨髓瘤细胞以及自身融合细胞而言，由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型（HGPRT）细胞，因此自身没有“S途径”，且“D途径”又被氨基喋呤阻断，所以在HA T培养液中也不能增殖而很快死亡。惟有骨髓瘤细胞与效应B细胞相互融合形成的杂交瘤细胞，既具有效应B细胞的“S途径”，又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性，因此能在HA T培养液中选择性存活下来，并不断增殖。 第二次筛选的原理和方法：在实际免疫过程中，由于采用连续注射抗原的方法，且一种抗原决定簇刺激机体形成相对应的一种效应B淋巴细胞，因此，从小鼠脾脏中取出的效应B淋巴细胞的特异性是不同的，经HA T培养液筛选的杂交瘤细胞特异性也存在差异，所以必须从杂交瘤细胞群中筛选出能产生针对某一预定抗原快定簇的特异性杂交瘤细胞。通常采用有限稀释克隆细胞的方法，将杂交瘤细胞多倍稀释，接种在多孔的细胞培养板上，使每一孔含一个或几个杂交瘤细胞（理论上30%的孔中细胞数为0时，才能保证有些孔中是单个细胞），再由这些单细胞克隆生长，最终选出分泌预定特异抗体的杂交细胞株进行扩大培养。因此，单克隆抗体制备过程中，两次筛选的原理和方法是不相同的。 单克隆抗体制备的基本原理与过程 原理： B淋巴细胞在抗原的刺激下，能够分化、增殖形成具有针对这种抗原分泌特异性抗体的能力。B细胞的这种能力和量是有限的，不可能持续分化增殖下去，因此产生免疫球蛋白的能力也是极其微小的。将这种B细胞与非分泌型的骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，再进一步克隆化，这种克隆化的杂交瘤细胞是既具有瘤的无限生长的能力，又具有产生特异性抗体的B淋巴细胞的能力，将这种克隆化的杂交瘤细胞进行培养或注入小鼠体内即可获得大量的高效价、单一的特异性抗体。这种技术即称为单克隆抗体技术。 过程： 1）免疫脾细胞的制备制备单克隆抗体的动物多采用纯系Balb/c小鼠。免疫的方法取决于所用抗原的性质。免疫方法同一般血清的制备，也可采用脾内直接免疫法。 2）骨髓瘤细胞的培养与筛选在融合前，骨髓瘤细胞应经过含8-AG的培养基筛选，防止细胞发生突变恢复HGPRT 的活性（恢复HGPRT的活性的细胞不能在含8-AG的培养基中存活）。骨髓瘤细胞用10%小牛血清的培养液在细胞培养瓶中培养，融合前24h换液一次，使骨髓瘤细胞处于对数生长期。 3）细胞融合的关键: 1技术上的误差常常导致融合的失败。例如，供者淋巴细胞没有查到免疫应答。这必然要失败的。 2融合试验最大的失败原因是污染，融合成功的关键是提供一个干净的环境，以及适宜的无菌操作技术。 4）阳性克隆的筛选应尽早进行。通常在融合后10天作第一次检测，过早容易出现假阳性。检测方法应灵敏、准确、而且简便快速。具体应用的方法应根据抗原的性质，以及所需单克隆抗体的功能进行选择。常用的方法有RIA法、ELISA法和免疫荧光法等。其中ELISA法最简便，RIA法最准确。阳性克隆的筛选应进行多次，均阳性时才确定为阳性克隆进行扩增。 5）克隆化克隆化的目的是为了获得单一细胞系的群体。克隆化应尽早进行并反复筛选。这是因为初期的杂交瘤细胞是不稳定的，有丢失染色体的倾向。反复克隆化后可获得稳定的杂交瘤细胞株。克隆化的方法很多，而最常用的是有限稀释法。 （1）显微操作法：在显微镜下取单细胞，然后进行单细胞培养。这种方法操作复杂，效率低，故不常用。 （2）有限稀释法：将对数生长期的杂交瘤细胞用培养液作一定的稀释后，按每孔1个细胞接种在培养皿中，细胞增值后成为单克隆细胞系。第一次克隆化时加一定量的饲养细胞。由于第一次克隆化生长的细胞不能保证单克隆化，所以为获得稳定的单克隆细胞株需经2～3次的再克隆才成。应该注意的是，每次克隆化过程中所有有意义的细胞都
稳定性试验sop
目录 1.目的：--------------------------------------------------------------------2 2.范围：--------------------------------------------------------------------2 3.职责：--------------------------------------------------------------------2 4.内容：--------------------------------------------------------------------2 4.1需做稳定性试验的样品范围：----------------------------------------------2 4.2需做稳定性试验的样品包装：----------------------------------------------2 4.3稳定性试验的考察量： ----------------------------------------------------3 4.4稳定性试验频率：---------------------------------------------------------3 4.5稳定性试验方式及条件：---------------------------------------------------4 4.6稳定性试验检验方法及考察项目：-------------------------------------------5 4.7稳定性试验前准备：-------------------------------------------------------5 4.8稳定性试验检测：--------------------------------------------------------5 4.9稳定性试验后的总结：-----------------------------------------------------6 4.10有效期的计算：---------------------------------------------------------6 5.参考资料：----------------------------------------------------------------7 6.附件：--------------------------------------------------------------------7 1.目的：建立稳定性试验管理程序，考察公司药品在加速试验和长期试验中随时间变化的规律，为药品的生产、包装、贮存、运输条件和考察检验方法提供科学依据，同时通过试验确立药品的有效期，以及中间产品、半成品贮存期。 2.范围：适用于公司内所有品种的成品以及中间产品、半成品的稳定性试验。 3.职责： 3.1稳定性试验管理人员负责对稳定性试验样品的日常管理，对试验到期品种的稳定性进行评价报告，并对相关记录汇总归档； 3.2质量控制部部长指定的化验人员负责按计划定期试验及检验； 3.3质量控制部部长对本管理程序的实施负责，对稳定性试验中出现的异常情况进行处理和总结的审核，监督、检查执行情况。 3.4质量保证部部长负责审核稳定性试验计划表、稳定性试验草案及稳定性试验报告。 3.5质量负责人负责批准稳定性试验计划表、稳定性试验草案及稳定性试验报告。 3.6药品放行受权人应了解稳定性试验报告的结果，并根据相关的稳定性试验结果履行产品的放行程序。 4.内容：
fda人用单克隆抗体制品生产及检定考虑要点
人用单克隆抗体制品生产及检定考虑要点 前言 生物制品评价和研究中心（CBER）正在修订1987年的“人用单克隆抗体的生产和检定考虑要点（PTC）”。该最新修订本的目的是向开发单克隆抗体制品的发起人和研究人员提供帮助，包括研究性新药（IND）和产品许可证申请时应提交的资料。 此文件取代了1987年的文件，并反映了在多次国内、国际会议上讨论过的值得重视的经验，这些会议包括： 1．FDA疫苗和相关生物制品咨委会于1990年8月召开的“生物制品潜在逆转录病毒污染”讨论会。 2．由国际生物标准化学会（IABS）发起并于1990年11月在伦敦召开的“生物制品安全性的病毒学方面会议”。 3．由FDA、IABS、NIH、国家疫苗规划办公室、HHS和WHO发起，于1991年3月在Bethesda召开的“传代细胞系当前所面临的问题”的国际性会议。 4．由FDA和NIH联合发起，于1992年1月在Bethesda召开的”单克隆抗体的临床前安全性试验工作会议”。 单克隆抗体和其他生物制品一样都有可供参考的法规（21 CFR部分200～299和600～680）。与CBER制定的其他考虑要点一样，单克隆抗体考虑要点亦不试图包容所有问题。当特殊制品产生特殊的未包括在“考虑要点”中的问题时，则应根据具体情况进行评估。本文及相应的法规本对生产和生产设施进行讨论，发起人应与治疗药物研究和评审办公室及生产企业许可证发放和产品监督办公室磋商。 某些单克隆抗体可由CDER负责主要审查工作，或由CDRH与CBER联合复审，各中心的管辖权依据1991年10月CBER和CDER及CBER和CDRH的内部协议执行。本考虑要点适合于按此协议联合复审的单克隆抗体。 主档案 在研究性新药申请初始阶段不需要全部完成本文中讨论的所有资料，而应在临床开发阶段，由适当的中心以对话方式指导下，使资料不断完善。在某些情况下，在同一设施内以相同的方法制备及检定的单克隆抗体时，资料应归于单一主档案
破伤风类毒素单克隆抗体的制备及初步鉴定
破伤风类毒素单克隆抗体的制备及初步鉴定作者：张秀昌刘芳崔萍孙黎罗强贾天军 【摘要】目的：制备并鉴定破伤风类毒素单克隆抗体杂交瘤细胞株，为破伤风的快速检测及致病机制的研究提供实验材料。方法：用破伤风类毒素做抗原免疫BALB/C小鼠，取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，获得分泌高滴度针对破伤风类毒素的杂交瘤细胞株，测定单抗免疫球蛋白亚类及单抗效价，用间接ELISA 和Western blot检测单克隆细胞株的特异性。结果：通过细胞融合和克隆化，筛选出3株持续分泌抗破伤风类毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株1E12、1E11、1G10。间接ELISA和Western blot检测结果表明1E12、1E11、1G10可以和破伤风类毒素发生特异性反应。结论：成功制备了抗破伤风类毒素单克隆抗体，为制备免疫诊断试剂盒和抗体药物的开发奠定了基础。【关键词】破伤风类毒素；杂交瘤；单克隆抗体 【ABSTRACT】 Objective: To establish and prepare hybridoma cell line secreting monoclonal antibody (McAb) against tetanic toxoid, to develop a rapid assay for Tetanus and investigate the pathogenesis of the virus. Methods: BALB/c mouse was immunized by purified tetanic toxoid. Hybridoma cell lines secreting monoclonal antibodies (McAbs) against tetanic toxoid were screened after the fusion of mouse splenic cells with SP2/0 cells. The Ig subtypes and titer of the McAbs were assayed with EL ISA and Western blot assay. Results: After cell fusion and
项目性能测试报告
XXX项目or府门户网站性能测试报告
目录 第一章概述 (4) 第二章测试活动 (4) 2.1测试用具 (4) 2.2测试范围 (4) 2.3测试目标 (5) 2.4测试方法 (5) 2.4.1基准测试 (5) 2.4.2并发测试 (6) 2.4.3稳定性测试 (6) 2.5性能指标 (6) 2.6性能测试流程 (6) 2.7测试术语 (7) 第三章性能测试环境 (8) 3.1服务器环境 (8) 3.2客户端环境 (9) 3.3网络结构 (9) 第四章测试方案 (10) 4.1基准测试 (11) 4.2并发测试 (13) 4.3稳定性测试 (15) 第五章测试结果描述和分析 (16) 6.1基准测试性能分析 (16) 6.2并发测试性能分析 (21) 6.3稳定性性能测试分析 (28) 第六章测试结论 (29)
摘要 本文档主要描述XXXX网站检索和页面浏览性能测试中的测试内容、测试方法、测试策略等。 修改历史 注释：评审号为评审记录表的编号。更改请求号为文档更改控制工具自动生成的编号。
第一章概述 由于当前对系统要接受业务量的冲击，面临的系统稳定、成熟性方面的压力。系统的性能问题必将成为焦点问题，海量数据量的“冲击”，系统能稳定在什么样的性能水平，面临业务增加时，系统抗压如何等这些问题需要通过一个较为真实的性能模拟测试来给出答案，通过测试和分析为系统性能的提升提供一些重要参考数据，以供后期系统在软硬件方面的改善和完善。 本《性能测试报告》即是基于上述考虑，参考当前的一些性能测试方法而编写的，用以指导即将进行的该系统性能测试。 第二章测试活动 2.1测试用具 本次性能测试主要采用HP公司的Loadrunner11作为性能测试工具。Load runner主要提供了3个性能测试组件：Virtual User Generator, Controller,Analysis。 ●使用Virtual User Generator修改和优化脚本。 ●使用Controller进行管理，控制并发的模拟并发数，记录测试结果。 ●使用Analysis进行统计和分析结果。 2.2测试范围 此次性能测试实施是对吴忠市门户网站系统性能进行测试评估的过程，我们将依据系统将来的实际运行现状，结合系统的设计目标和业务特点，遵循着发生频率高、对系统或数据库性能影响大、关键和核心业务等原则选取需要进行测试的业务，模拟最终用户的操作行为，构建一个与生产环境相近的压力场景，对系统实施压力测试，以此评判系统的实际性能表现。 根据与相关设计，开发人员的沟通和交流，本次测试主要就是针对大量用户在使用吴忠市门户网站进行信息查询，而选取的典型事务就是用户使用检索进行关键字搜索以及界面浏览和反馈回搜索结果，这是用户使用最频繁，反应最多的地方，也是本系统当前以及以后业务的一个重要压力点所在。所以本次测试只选取检索业务的性能情况和界面浏览进行记录和
稳定性试验报告范文
摘要：xxx是，研究其稳定性是在考察其在温度、湿度、光线的影响下随时间变化的规律，为其生产、包装、贮存、运输条件和有效期的确定提供科学依据。本试验采用高温、高湿、光照等试验方法，通过测定其含量，得出其稳定性较好，产品有效期以上，暂定其有效期为年。 关键词：稳定性试验、xxx、 正文 1 前言 1.1 xxx简介 1.2 xxx生产工艺（如工艺保密，可改为质量标准） 1.3 取样信息： 批号生产日期生产地点批量包装试验类型1.4 稳定性试验指导：化学药物稳定性研究技术指导原则2005年版
2考察项目及检测方法2.1性状 2.1.1 外观 2.1.2 熔点 2.13 水分 等等 2.2 含量测定 检测方法： 样品制备： 实验条件： 2.3 有关物质
3 试验方法 3.1高温试验 试验设备 取本品，在60℃条件下放置10天，于第5天、第10天取样，检测相关指标。 3.2高湿试验 试验设备 取本品，于25℃、RH90%±5%条件下放置10天，在第0天、第5天和第10天取样检测。 3.3光照试验 取本品，在光强度为4500lx的光源下，距光源30cm，放置10天，在0天、5天和10天取样测定。 3.4加速试验 试验条件 包材类型、来源及相关证明文件 项目容器 包材类型 包材生产商 包材注册证号 包材注册证有效期 包材质量标准编号 取采用包装的三批次样品，试验条件为
40℃±2℃、RH75%±5%，试验时间从开始，为6个月，分别于0、1、2、3、6个月取样检测。 3.5长期试验 试验条件 包材类型、来源及相关证明文件 项目容器 包材类型 包材生产商 包材注册证号 包材注册证有效期 包材质量标准编号 取采用包装的三批次样品，试验条件为25℃±2℃、RH60%±10%，试验时间从开始，取样时间点为第一年每3个月末一次，第二年每6个月末一次，以后每年末一次。（如为阶段性试验报告，可如下描述：试验时间从开始，已完成月试验，接下来将持续到年月，此报告为阶段性试验报告。）
动物细胞融合与单克隆抗体(教案)
授课人：曾屏珊 班级：高二（3）班 时间：20XX年5月3日（星期四）上午第2节 【教学目标】 1．知识目标： 举例说出动物细胞融合与单克隆抗体的原理和应用。 (1) 能简述动物细胞融合的概念。 (2) 能简述动物细胞融合的基本过程。 (3) 能列出动物细胞融合与植物细胞融合的异同。 (4) 能列举细胞融合技术的优点及实际应用。 (5) 能描述单克隆抗体的含义。 (6) 能简述单克隆抗体的制备过程。 (7) 能列举单克隆抗体的优点及实际应用。 2．能力目标： 偿试设计单克隆抗体的制备过程。 3.情感态度价值观 体验科学研究过程是科学、技术、社会三者之间的关系。 【教学重点】单克隆抗体的制备和应用 【教学难点】单克隆抗体的制备过程 【课时安排】1课时 【学情分析】 学生已经学习了植物体细胞杂交的知识，动物细胞融合与植物原生质体融合的原理及方法基本相同，对这部分知识学生学起来应该较轻松。单克隆抗体的制备过程是本节的重点和难点，学生在学习过程中会产生疑问：“为什么要进行两次筛选”、“怎样进行筛选”、“为什么这种抗体叫单克隆抗体”，所以在教学中应把更多的精力放在“单克隆抗体的制备”上。【教学策略】 以问题和任务驱动教学，组织学生进行自学学习，在问题的解决中、习题的反馈中完成本节教学任务。 【教学程序】
【教学反思】 通过学案引导学生自学，在课堂上根据教学目的创设教学情境，敢于放手，给学生充足 的学习时间，调动学生的主动性，让学生充分地交流；在学生的交流的同时，能适时地引导 学生彼此沟通和相互理解；有效地促进了学生学习方式的转变，锻炼了学生敏捷的思维能力 和准确的语言表达能力，拓展延伸了学生的视野，提高了学生的生物科学素养。 课堂上学生交流的时间没把握好，导致未完成本节课全部内容。以后课堂上应注意这方 面的问题，将课堂还给学生的同时，还要做好引导者的工作。 提出问题：该方案能达到预期效果吗?为什么？
单克隆抗体制备过程中的两次筛选
单克隆抗体制备过程中的两次筛选 动物细胞工程中动物细胞融合的主要应用是制备单克隆抗体。在单克隆抗体制备过程中，有两次筛选，这地方学生很容易弄混了。第一次筛选的目的是筛选出杂交瘤细胞，第二次筛选的目的是筛选出能产生特异性抗体的杂交瘤细胞，两次筛选的原理和方法并不相同。 第一次筛选： 细胞融合后，杂交瘤细胞的选择性培养是第一次筛选的关键。普遍采用的HAT选择性培养液是在普通的动物细胞培养液中加入次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶核苷酸（T）。 其依据是细胞中的DNA合成有两条途径：一条途径是生物合成途径（“D途径”），即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，为DNA分子的合成提供原料。在此合成过程中，叶酸作为重要的辅酶参与这一过程，而HAT培养液中氨基喋呤是一种叶酸的拮抗物，可以阻断DNA合成的“D途径”。另一条途径是应急途径或补救途径（“S途径”），它是利用次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相应的核苷酸，两种酶缺一不可。因此，在HAT培养液中，未融合的效应B细胞和两个效应B细胞融合的“D途径”被氨基喋呤阻断，虽“S途径”正常，但因缺乏在体外培养液中增殖的能力，一般10d左右会死亡。对于骨髓瘤细胞以及自身融合细胞而言，由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型（HGPRT）细胞，因此自身没有“S途径”，且“D途径”又被氨基喋呤阻断，所以在HAT培养液中也不能增殖而很快死亡。惟有骨髓瘤细胞与效应B细胞相互融合形成的杂交瘤细胞，既具有效应B细胞的“S途径”，又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性，因此能在HAT培养液中选择性存活下来，并不断增殖。 第二次筛选： 在实际免疫过程中，由于采用连续注射抗原的方法，且一种抗原决定簇刺激机体形成相对应的一种效应B淋巴细胞，因此，从小鼠脾脏中取出的效应B淋巴细胞的特异性是不同的，经HAT培养液筛选的杂交瘤细胞特异性也存在差异，所以必须从杂交瘤细胞群中筛选出能产生针对某一预定抗原快定簇的特异性杂交瘤细胞。通常采用有限稀释克隆细胞的方法，将杂交瘤细胞多倍稀释，接种在多孔的细胞培养板上，使每一孔含一个或几个杂交瘤细胞（理论上30%的孔中细胞数为0时，才能保证有些孔中是单个细胞），再由这些单细胞克隆生长，最终选出分泌预定特异抗体的杂交细胞株进行扩大培养。 因此，单克隆抗体制备过程中，两次筛选的原理和方法是不相同的。
最新软件测试报告模板分析
(OA号：OA号/无)XXX产品名称XX版本（提测日期：YYYY.MM.dd） 第XX轮 功能/性能/稳定性/兼容性测试报告
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1.概述 (4) 1.1 测试目的 (4) 1.2 测试背景 (4) 1.3 测试资源投入 (4) 1.4 测试功能 (5) 1.5 术语和缩略词 (5) 1.6 测试范围............................................................................................ 错误!未定义书签。 2.测试环境 (6) 2.1 测试软件环境 (6) 2.2 测试硬件资源 (7) 2.3 测试组网图 (6) 3.测试用例执行情况 (7) 4.测试结果分析（大项目） (8) 4.1 Bug趋势图 (8) 4.2 Bug严重程度 (9) 4.3 Bug模块分布 (9) 4.4 Bug来源............................................................................................ 错误!未定义书签。 5.测试结果与建议 (10) 5.1 测试结果 (10) 5.2 建议 (11) 5.3 测试差异分析 (11) 6.测试缺陷分析 (11) 7.未实现需求列表 (11) 8.测试风险 (12) 9.缺陷列表 (12)
1.概述 1.1 测试目的 本报告编写目的，指出预期读者范围。 1.2 测试背景 对项目目标和目的进行简要说明，必要时包括该项目历史做一些简介。 1.3 测试资源投入 //针对本轮测试的一个分析 //测试项：功能测试、性能测试、稳定性测试等