乙型肝炎病毒基因分型方法简述
乙型肝炎病毒基因分型方法简述
邵 玲 张 男
【摘要】乙型肝炎病毒是一种嗜肝脱氧核糖核酸病毒,属于一种复合体DNA病毒。乙型肝炎病毒可按两种方法分型:血清型和基因型。随着分子生物学的发展以及对乙型肝炎病毒研究的深入,乙型肝炎病毒血清分型法已不能适应对该病毒感染研究的需要,而出现的基因分型法则引起广泛的重视。
【关键词】乙型肝炎病毒;基因分型方法
H epatitis B virus gene minute method summ ary
S HA O L in Z HA N G N an
【Abstract】The hepatitis B virus is one kind is addicted to the liver deoxyribonucleic acid virus,belongs to one kind of complex DNA virus.The hepatitis B virus may according to two method minutes:Blood serum and genotype.Along with molecular biology’s development as well as to hepatitis B virus research’s thorough,a hepatitis B virus blood serum minute law has not been able to adapt to this virus infection research need,but appears a gene minute principle brings to the widespread attention.
【K ey w ords】Hepatitis B virus;Gene minute method
乙型肝炎病毒是一种嗜肝脱氧核糖核酸病毒,属于一种复合体DNA病毒。乙型肝炎病毒可按两种方法分型:血清型和基因型。随着分子生物学的发展以及对乙型肝炎病毒研究的深入,乙型肝炎病毒血清分型法已不能适应对该病毒感染研究的需要,而出现的基因分型法则引起广泛的重视。1988年Ok2 mamoto[1]对18株不同亚型的HBV基因序列两两进行比较后,根据核苷酸序列异源性>8%的原则,将18株HBV DNA序列分为A～D4个基因型,提出了HBV基因型的概念。1992年Norder[2]发现ayw4和adw4q-两旧亚型之间及基因型A～D 之间S基因差异>4%,提出了两种新的基因型E,F,1994年Norder通过全基因序列P3测定加以证实。2000年Stuyver[3],在研究来自法国和美国的慢性乙肝病人血清样本时,发现有13株病毒无法归入A～F型,命名为G型。随后,日本和德国也相继发现了G基因型。2002年Arauz～Ruiz[4]对10株HBV进行基因型研究,发现其中3株虽与F型相近,但与F型又有明显的不同,进而命名为H型。截止现今,HBV基因型可分为A～H八型。
目前,国内外对HBV进行基因分型主要有“基因序列测定法、聚合酶链反应———限制性片段长度多态性分析法、基因型特异性表位单克隆抗体的EL ISA、基因型特异性线形探针检测法、基因型特异性引物PCR法和基因芯片技术”。
1 基因分型原理
1.1 全基因序列测定。全基因序列测定是根据HBV所有病毒核苷酸异源性>8%进行分型的。Okamoto对从日本及印度尼西亚adw2慢性携带者中分离出的3株HBV进行全序列测序及比较,其核苷酸的异质性为3.9%～5.6%,而与美国2株相同血清亚型HBV序列比较,异质性达8.3%～9.3%,达到甚至超过不同血清亚型HBV的异质性,从而说明血清学分型不能真正反映HBV基因变异。再经对18株HBV DNA进行两两比较分析,根据同源性<92%、异质性>8%,将其分为A, B,C及D4个基因型,初步建立了基因分型体系。12年后Stuyver使用该方法,发现了一种新的3248bp的HBV基因型G 。
1.2 S基因序列测定。由于乙型肝
炎病毒基因可分为p基因、前s基因、编
码HBs4的s基因、C基因及X基因(如
图),可分别对它们进行研究,从而找出各
个基因型在各个基因之间的差异。Nor2
der[5]对32例HBV患者s基因测序结果
进行分析,并建立进化树,基因型间异质
性>4%。除证实了Okamoto的A～D分型外,还发现了2个新的基因型E和F,使HBV基因型达到6个(A～F)。在其后对28例HBV全基因组、p基因、前s基因、编码HBs4的s基因、C 基因及X基因分别比较并建立进化树,进一步证实根据s基因序列分型最接近全基因组,从而证明了单独使用S基因进行分型的可靠性。目前,此法尚在使用,主要有SSP和SSO[6],即基因型特异性引物PCR法和基因型特异性线形探针检测法。
2 基因分型方法
2.1 序列测定法。即直接测定核苷酸序列,根据差异分型。自Okamoto据HBV基因型之间的全序列异质性8%进行分型以来,测序由于方法直接、可靠而成为主要鉴定HBV基因型的方法。同全序列进化树图比较,发现S基因的序列变化同全基因序列的变化一致,可用S基因序列代替全基因序列进行分型,界限为核昔酸序列的异质性4.0%。该法虽较为可靠但操作繁琐、费用昂贵,不适于临床大量标本检测。
2.2 聚合酶链反应———限制性片段长度多态性分析法(PCR～RFL P)。目前常用的基因分型方法,通过PCR扩增出目标基因片段(通常为S基因或Pres/s基因),用特定的限制性内切酶进行酶切,根据酶切图谱进行基因分型。Mizokami[7]通过分子进化方法对已知基因型的68例HBV患者全基因、106例HBV患者s基因序列进行分析,发现并确认基因型特异性酶切位点区域。Lindh[8]对不同基因型S基因的特异酶切位点进行分析,设计使用限制性内切酶Trp509I和Hinf I使S基因PCR产物产生不同长度的酶切片段,成功地将166/180例患者HBV实现A-F基因分型。RFL P敏感性高,但酶切位点易受基因变异影响,且遇混合感染或酶切不完全,会出现复杂条带,影响分型结果判断。
2.3 基因型特异性表位单克隆抗体的酶联免疫吸附法(EL ISA)PreS2多肽有多组抗原表位。基因型不同抗原表位也不同,从而可以鉴定不同基因型。Usuda[9]等用此法制备前S2区域基因型特异性表位的单克隆抗体,并用辣根过氧化酶进行标记,对68例HBV阳性患者血清检测,分型结果与S基因测序分型完全一致。在后期实验中发现,适用于大规模的流行病学调查,使较大范围的HBV的研究成为可能。
2.4 基因型特异性线形探针检测法。该方法是设计型特异的探针,检测HBV扩增产物,以产物的不同长度或与探针的反应性来区分不同型别。Kato[10]利用G基因型的病毒在核心区有36个核苷酸的插入,设计引物用PCR的方法可以对G基因型进行特异的筛查。早在1983年Wu用酶切的方法研究血清型的酶切图谱,来区分不同的血清型。王虹[11]等采用PCR2核酸杂交/EL ISA检测,主要是联合利用PCR、核酸杂交和酶联免疫技术,设计前C和C区的探针,可以快速准确的区分HBV的基因型。另外Van G eyt[12]根据A～F基因型的保守序列设计了18种型特异性探针与HBV S (下转12页)
腹和餐前为阴性。故临床送检时要注明采集时间。在糖尿病肾病时由于肾小球硬化,使肾小球滤过率和肾小管对糖的重吸收下降,肾糖阈升高,此时即使血糖很高但尿糖可为阴性。不能以此作为病情控制的指标。老年人可以出现肾糖阈升高,妊娠及肾性糖尿病可以出现肾糖阈降低,前列腺肥大或膀胱疾病等造成残余尿增多,尿糖均不能反映血糖水平。对肾糖阈正常时,尿糖结果可以作为糖尿病诊疗的参考。维生素C 是糖尿病病人的常用药物。但可使尿糖出现假阴性。为了不影响糖尿病病人的正常治疗,在化验血糖、尿糖前2～3d ,应停用维生素C ,这样就可以消除其对化验结果的影响。
同样道理,在化验前1～2d ,最好也不要大量食用富含维生素C 的蔬菜和果。如菠菜、柿子椒等深色蔬菜和花菜,以及柑橘、红果、柚子等。野生的苋菜、苜蓿、刺梨、沙棘、猕猴桃、酸枣等含维生素C 量颇丰,也应注意停止食用。3 尿液酮体的检测应注意的问题
①对于重症糖尿病酮症患者,尿酮体检验对病情判断及治疗都很重要,为保证检验结果的准确可靠应充分了解以下酮体检测的影响因素:尿酮体中的丙酮和乙酰乙酸都具有挥发性,乙酰乙酸更易受热分解成丙酮,易导致强阳性标本的反应减弱;②尿液标本被细菌污染后,酮体消失,易导致假阴性,因此,尿液标本必须新鲜,及时送检;③糖尿病酮症酸中毒早期病例中,主要酮体成分是β-羟丁酸,很少或缺乏乙酰乙酸。仪器专用试
纸仅与酮体中的乙酰乙酸和丙酮发生反应(不与占酮体绝大部
分的β-羟丁酸反应),产生紫色颜色,根据颜色的深浅判断阳性的强弱。对乙酰乙酸的敏感性是对丙酮敏感性的7倍左右。此时测得结果可导致对总酮体量估计不足;④糖尿病酮症酸中毒症状缓解之后,β-羟丁酸转变为乙酰乙酸,反而使乙酰乙酸含量比初始急性期增高,易对病情估计过重;⑤糖尿病酮症酸中毒者肾功能严重损伤而肾阈值增高时,尿酮体亦可减少,甚至完全消失,易导致假阴性;⑥服用双胍类降糖药:如降糖灵等,由于药物有抑制细胞呼吸作用,可出现血糖已降,但尿酮阳性的现象。⑦缺氧时,较多的已酰乙酸被还原为β-羟丁酸,尿液酮体反而减弱。
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作者单位:511450 广东省广州市番禺区石碁人民医院
(上接8页) 基因的PCR 产物杂交而实现分型。Stuyver [13]使
用该方法对来自法国里昂的36份、来自美国亚特兰大的82份
HBV 阳性血清分型。此法检测时需要的PCR 产物量较多,费用较高。
2.5 基因型特异性引物PCR 法。该方法是设计型特异的引物,检测HBV 扩增产物,以产物的不同长度或与探针的反应性来区分不同型别。Naito [14]根据A ～F 基因型中特异性的保守序列设计引物并进行套式PCR ,将HBV 进行A ～F 分型。另外,可根据C 基因、前S 基因长度多态性以及HBV 特定部位上与基因型密切相关的核苷酸而确定。此法需要进行多管PCR ,费用也较高。
2.6 基因芯片技术。基因芯片,又称基因微矩阵,其原理[15]
是将大量特定的基因片段或寡核苷酸片段作为探针有序地和高密度地排列固定于玻璃或硅等载体上,然后与待测的有荧光标记的样品核酸按碱基配对的原则进行杂交,通过激光共聚焦系统检测杂交信号强度,经计算机分析处理数据资料,获取样品分子的数量和序列信息,从而可对核酸序列进行大规模、高通量的研究。
基因芯片[16]是将基因分型用的型特异性探针点样到玻片上,直接与标记有荧光的PCR 扩增产物杂交,漂洗后通过荧光扫描来判断结果。操作时先抽提检测样本中的HBV -DNA ,应用PCR 进行基因扩增,在扩增液中加入一种荧光标记的dN TP ,使PCR 产物与HBV 基因分型芯片杂交,如在某一种型特异性探针之处出现荧光,即可确定HBV 属于这一基因类型。
目前,对HBV 基因型的研究越来越深入,但存在许多的问题尚未解决,对基因型的研究也缺乏简便、有效、价廉的方法。但随着分子生物学的发展,对基因型的研究将更加深入,从而对HBV 的发病机制及治疗,提供有益的帮助。
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作者单位:110001 中国医科大学
(推荐)乙型肝炎病毒耐药基因及分型检测
乙型肝炎现状如何？ 乙型病毒性肝炎是由乙肝病毒（hepatitis B virus，HBV）感染引起的、以肝脏炎性病变为主，并可引起多器官损害的一种疾病，主要存在于肝细胞内，可引起肝细胞炎症、坏死和纤维化。 乙型肝炎病毒(HBV)感染呈世界性分布，全球约有3.6亿感染者，每年约有100万人死于与HBV相关的肝脏疾病。我国属于感染的高发区，现有的慢性HBV感染者约9300万例。 乙型肝炎病毒（HBV）基因分型的临床意义 HBV根据DNA差异可分为A、B、C、D、E、F、G、H八种类型，不同型别在流行特征，致病性，对药物治疗反应等方面存在差异，其中，我国以B型和C型为主，感染HBV基因型B的患者发生肝纤维化及肝细胞癌的平均年龄要比感染HBV基因型C的患者的年龄大。 通过分型检测，可判断病毒复制活跃程度及突变发生率情况。研究表明，与HBV-B型相比，C型复制较活跃，不易发生HBeAg血清转换；HBV-B型易产生前C区突变，C型核心启动子区变异发生率更高，与重型肝炎发病机制密切相关，可作为肝癌高危指标之一。同时，HBV-B、C型患者易产生拉米夫定耐药突变，通过分型检测，可指导临床治疗方案制定，有针对性进行临床治疗，更大程度上提高患者的生活质量。 乙肝的治疗方式有哪些？ HBV感染主要的治疗方法是抗病毒治疗，国内外普遍使用的药物有干扰素和核苷（酸）类。由于干扰素需要反复注射，且副作用较多，近年来，核苷(酸)类似物(NA)已成为抗HBV感染的主要方法之一，NA因其抑制病毒复制能力强、使用方便、耐受性好且疗效确切，适用于不同阶段的肝病患者，是长期治疗的合理选择。但随着治疗时间的延长，往往会出现病毒耐药株，从而需要监测乙型肝炎病毒耐药基因型，指导临床用药。 乙肝病毒产生耐药的机理是什么？ HBV对某种药物的耐药性一般是指由HBV基因组上某些位点的变异导致这种药物对HBV的抑制作用减弱或无作用。通常分为以下几种： （1）原发性耐药变异：指药物作用靶位的基因及其编码的氨基酸发生变异，导致变异病毒株对治疗药物的敏感度下降； （2）继发性耐药变异(又称补偿性耐药变异)：指由于原发性耐药变异病毒株复制能力下降，在原发性耐药变异的基础上，病毒株也可在其他位点发生变异，这些变异可部分恢复变异病毒的复制能力或可导致变异病毒对药物敏感度的进一步下降； （3）基因型耐药：指检测到已在体外的表型分析研究中被证实与抗病毒药物耐药相关的HBV变异； （4）表型耐药：通过体外复制系统证实检测到的HBV变异会降低其对抗病毒药物的敏感度。 HBV属于嗜肝DNA病毒科，基因组长约3.2kb，是部分双链环状DNA结构。HBV基因组含有4个部分重叠的开放读框(open reading frame，ORF)，分别为S基因区、C基因区、P基因区和x基因区。产物为含末端蛋白、间隔区、逆转录酶区和RNA酶H区4部分的HBV聚合酶。 HBV虽然属于DNA病毒，但其复制过程并非DNA—DNA的直接复制过程，而是经过前基因组RNA的中间过程，即DNA—RNA—DNA的复制过程。在前基因组RNA逆转录为负链DNA的过程中，HBV逆转录酶由于缺乏严格的校正机制，导致HBV复制过程中核苷酸错配率较高，发生变异的频率为每年(1.4～3.2)X105核苷酸替换／位点。HBV复制的这种过程和特点，决定了同一患者体内不同的HBV株基因序列之间也存在差别。 核苷（酸）类药物主要通过抑制HBV聚合酶的逆转录酶区活性，阻止HBV复制过程中以HBV的前基因组RNA为模板逆转录生成新的病毒DNA，从而发挥抑制病毒复制的作用，HBV前基因组RNA是以HBV的cccDNA 为模板合成的，即NA的药效靶点在cccDNA的下游，所以NA不能直接清除已经存在的cccDNA。
丙型病毒性肝炎基因分型及临床意义
第４８卷 第５期２０１２年１０月 青岛大学医学院学报 ＡＣＴＡ ＡＣＡＤＥＭＩＡＥ ＭＥＤＩＣＩＮＡＥ ＱＩＮＧＤＡＯ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＡＴＩＳＶｏｌ．４８，Ｎｏ．５Ｏｃｔｏｂｅｒ ２ ０１２［收稿日期］２０１２－０４－１２； ［修订日期］２０１２－０８－０９［基金项目］青岛市卫生科技发展计划资助项目（２０１０ＷＳＺＤ０８）［作者简介］黄艳秋（１９７９－），女，硕士研究生，主治医师。［通讯作者］史昌河（１９６３－） ，男，副主任医师，硕士生导师。丙型病毒性肝炎基因分型及临床意义 黄艳秋，史昌河 （青岛大学医学院传染病学教研室，山东青岛 ２６６０７１ ）［摘要］ 丙型病毒性肝炎病原体为丙型肝炎病毒（ＨＣＶ），以输血为主要传播途径。ＨＣＶ基因组为单股正链ＲＮＡ病毒，有较高的复制率及变异率，在人体内呈准种分布。目前根据Ｓｉｍｍｏｎｄｓ命名系统可将其分为６个基因型。ＨＣＶ基因分型在丙型病毒性肝炎的流行病学研究、病毒载量、病情转归及抗病毒治疗等方面均有重要意义。特别在抗病毒治疗方面，ＨＣＶ基因分型是制定抗病毒治疗方案， 预测抗病毒疗效的重要依据。［关键词］ 肝炎， 丙型；基因分型；综述［中图分类号］ Ｒ５１２．６ ［文献标志码］ Ａ ［文章编号］ １６７２－４４８８（２０１２）０５－０４６８－ ０３ 丙型病毒性肝炎是临床工作中较为常见的一种病毒性肝炎，病原为丙型肝炎病毒（ＨＣＶ），感染后可引起肝脏急、慢性炎症，极少数发展为重症肝炎。输血及血制品曾是丙型病毒性肝炎最重要的传播途径，但近年来，随着筛查方法的改进， 此种传播方式已得到明显控制，目前注射、器官移植、血液透析、性传播及母婴传播亦较常见。人类对ＨＣＶ普遍易感，而且感染后高达８０％的病人转为慢性感染，如果不进行及时和正确的抗病毒治疗，有相当比例的病人会发展为肝硬化、肝癌和肝衰竭，产生严重的临床后果。丙型病毒性肝炎在全球感染率为３％，因此全世界约有１．７亿人曾感染过 ＨＣＶ［１］ ，但各国的感染率不尽相同，我国ＨＣＶ感染率约为 ３．２％，属于高流行区。１ ＨＣＶ基因组的结构和功能１．１ ＨＣＶ基因组的基本结构 ＨＣＶ基因组为单股正链ＲＮＡ，可分为３′非编码区、５′非编码区及编码区（ＯＲＦ）３个区域，ＯＲＦ可编码一个病毒蛋白前体， 在宿主和蛋白酶裂解的共同作用下该蛋白前体可生成至少１０种蛋白。根据所编码蛋白的功能不同，编码区又分为结构基因和非结构基因，其中结构基因编码的４种蛋白包括核心蛋白、包膜蛋白１（Ｅ１）、Ｅ２、Ｐ７，这些蛋白参与病毒的组装，又被称为结构蛋白。非结构基因翻译编码的蛋白有非结构蛋白２（ＮＳ２）、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、ＮＳ５Ｂ，这些蛋白主要参与病毒复制，故又称非结构蛋白或功能蛋白。ＨＣＶ基因组的变异率高，这一特点使之在人体内呈现准种分布，基因组中Ｅ１和Ｅ２区是变异率最高的区域，而５′及３′非编码区则是最保守的区域。 １．２ ＨＣＶ各区段基因组的结构和功能 ①５′ＵＴＲ：它是ＨＣＶ基因组中最保守的区域。ＨＣＶ ５′ＵＴＲ包括４个保守的结构区域，其中结构域Ⅱ～Ⅳ构成内部核糖体进入位点（ＩＲＥＳ），ＩＲＥＳ能够在不依赖于ＨＣＶ蛋 白作用的前提下启动下游ＨＣＶ编码区基因的翻译，因而抗病毒药物的靶向定位点常为丙型病毒性肝炎病毒的ＩＲＥＳ。②３′ＵＴＲ：３′ＵＴＲ位于ＨＣＶ ３′末端，由２００～２３５个核苷酸组成。其中可变区具有基因型的特异性，在此区域内不同基因型之间存在核苷酸序列的差异。不同的基因型其ＨＣＶ多聚Ｕ区的长度亦不相同。部分研究结果显示，不同的ＨＣＶ型甚至同型不同株型之间３′ＵＴＲ的交换都会导致ＨＣＶ不能复制。因而得出结论，只有当病毒具有完整的３′ＵＴＲ才能发挥其正常的作用。另有研究结果显示，宿主细胞内部所固有的多聚嘧啶束结合蛋白或自身抗原若与ＨＣＶ基因组中的３′ＵＴＲ结构部分（尤其是Ｘ尾）结合，丙型病毒性肝炎病毒核糖核酸的翻译效率和稳定性均可增强。③核心蛋白：丙型病毒性肝炎病毒基因组的３４２～９１４核苷酸位点系核心蛋白基因的位点。编码核心蛋白，核心蛋白的功能之一是与糖蛋白作用组装出完整的ＨＣＶ病毒颗粒。在核心蛋白的氨基端内，高度保守的抗原表位含量非常丰富。核心蛋白在与病毒ＲＮＡ靶向结合的前提下可调节ＨＣＶ基因组的翻译， 并且核心蛋白的基因调节作用与原发性肝癌的发生关系密切，主要因为核心蛋白可抑制Ｐ５３启动因子这一重要肿瘤抑制基因的活性。核心蛋白在人体感染ＨＣＶ后通过对大量基因的调控作用抑制了机体的免疫应答，从而促进了ＨＣＶ对肝细胞及外周血单核细胞等人体细胞的持续感染，此外核心蛋白能加速感染细胞内脂质小体的形成，诱导肝细胞变性。④包膜区：在ＨＣＶ结构中，病毒的外膜常由包膜蛋白构成。第９１５～１４９０ｎｔ位点和１４９１～２７８９位点共同构成了包膜区基因，分别编码Ｅ１和Ｅ２蛋白。其中，Ｅ２氨基端具有高度变异性，ＨＶＲ１和ＨＶＲ２均为Ｅ２氨基端的两个高变区。丙型病毒性肝炎病人的Ｅ２突变增加常由干扰素治疗诱发，ＨＶＲ１序列也会在慢性感染的形成过程中不断改变。Ｅ２结构中还含有若干个中和抗体表位，至少有一个中和抗体表位位于ＨＶＲ１。由此可知，免疫反应常以Ｅ２为主导靶向目标。此外，病毒受体、ＣＤ８１、低密度脂蛋白等物质的受体均可与Ｅ２蛋白发生相互作用，故Ｅ２蛋白具备的另一个重要作用就是介导病毒附着和进入感染细胞内部。因此，在研究和开发ＨＣＶ疫苗这一方向上， 深入地研究膜
ABO血型分型方法
华科基因ABO血型分型方法 按照Bernstein三复等位基因学说，ABO基因座主要有三个等位基因A、B和O。A、B对O为显性，O为隐性。ABO血型的表型与基因型的关系是：A型为AA或AO；B型为BB 或BO；AB型为AB；O型为OO。因为隐性基因O存在，ABO基因型不能直接用凝集反应来确定，但可通过DNA分型技术直接检测基因型，或通过表型的家系调查来推定。 ABO血型分型方法 一、ABO血型血清学分型方法 ABO血型是根据红细胞与特异性抗体的反应来分型。即用抗A抗体判定A抗原，用抗B抗体判定B抗原，这种检查法称作正定型试验(direct grouping)。同时依据血清中的凝集素与标准型别红细胞膜上的凝集原反应的性质来检验结果。即用标准的A型红细胞判定抗A抗体，用标准的B型红细胞判定抗B抗体，称作反定型试验（reverse grouping)。为使结果准确，应进行正反两个试验来分型，同时也应用抗H抗体判定H抗原。当正反试验的结果与常规的ABO分型原则不符的时候,提示可能是弱亚型或变异型。 二、ABO血型DNA分型方法 分子生物学技术将ABO血型分型由血清学水平深入到基因水平。DNA分型方法都是针对核苷酸顺序差异而设计的。常用的有序列特异性引物PCR技术与PCR-RFLP技术等。序列特异性引物PCR(PCR-sequence-specific primers,PCR-SSP)是根据等位基因的序列，设计具有序列特异性的引物，对样本进行DNA分型。该方法是以引物决定分型特异性，具有特异性强、重复性好、结果易于判定的优点。 ABO血型分型可提供以下样本： 常用样本：血液，血痕，带毛囊的毛发，口腔粘膜细胞（口腔拭子）等。 特殊检材：如精斑、混合斑、肌肉、烟蒂、胎儿的羊水等都可以采用。 采样建议： 1.我们建议您采用血痕或口腔棉签作为检测样本，或采用毛发（带毛囊）作为检测样本。 2.如果您的孩子未满四周岁，请采用血痕、口腔棉签作为样本。 3.如果孩子还未出生，则参考羊水样本抽取方法。
乙型肝炎病毒基因型检测的临床意义
乙型肝炎病毒基因型检测的临床意义 乙型肝炎病毒（HBV）基因型分为A～H八个型，不同基因型与病情的严重程度、预后、抗毒治疗效果等方面都可能有一定的相关性[1-3]。本文对上海市165例乙肝患者的HBV基因型布及与病情严重程度的关系，进行了初步的研究。另外，HBV的前C区变异会影响抗病毒药物选择及治疗的效果，本文就HBV基因型与这些变异及病毒的复制能力是否相关，进行了探讨。材料与方法 1. 研究对象：165份血清标本来自上海市传染病医院的住院和门诊乙肝患者包括114例慢性乙型肝炎（CHB），26例慢性重型乙型肝炎（CHG），22例肝硬化（LC），2例性乙型肝炎（AHB），1例肝癌（HCC）。疾病的诊断依据2000年全国病毒性肝炎和肝病会议拟的方案。并从上述收集的部分标本进行HBV血清学标志物、前C区1896位变异及HBV DNA定检测。 2. 方法：HBV基因型检测：以特异性引物套式PCR法检测不同的HBV基因型[4]取部分不同基因型的扩增产物进行测序分析，证实二种分型方法的结果一致。前C 变异检测：以特异性引物PCR法进行检测，部分结果也经测序证实。 HBV DNA载测定：以TaqMan探针实时荧光PCR法定量检测。 3. 统计学处理：用卡方检验分析所得数据。结果 1. HBV感染者的基因型分析结果：从表1可以看出，A型1例（0.6%），型55例（33.3%），C型105例（63.6%），D型2例（1.2%）A/B和B/C混合型各1例（0.6% 0.6%），没有发现E、F、G、H型及其混合型。基因型在不同临床型患者中的分布情况其总体成比中，LC与CHB患者的基因型分布有统计学差异，C型在CHB和LC患者中所占百分比明高于B型，分别为61.4%比36.8%（P<0.01）和90.9%比9.1%（P<0.001）。CHG患者的基型分布无显著差异。因HCC 、AHB患者病例数少难以进行统计学分析。仅有的2例AHB患者为D型。 2. 乙肝患者的HBV基因型与血清标志物分析结果：在CHB中，B与C基因型比较，HBeA 抗HBe的检出率间的差异在统计学上无显著性，而HBeAg/抗HBe双阳性的检出率B型高于C基型，分别为9.5%和4.3%（P<0.05）。在CHG患者中，B与C基因型相比，HBeAg、抗HBe和HBeA 抗HBe双阳性检出率的差异在统计学上有显著性，前者以C基因型为主，后两者以B型为主。患者在B型中病例数太少，没有统计意义，结果见表2。
SNP基因分型的高通量方法
Chapter16 High-Throughput Methods for SNP Genotyping Chunming Ding and Shengnan Jin Abstract Single nucleotide polymorphisms(SNPs)are ideal markers for identifying genes associated with complex diseases for two main reasons.Firstly,SNPs are densely located on the human genome at about one SNP per approximately500–1,000base pairs.Secondly,a large number of commercial platforms are available for semiautomated or fully automated SNP genotyping.These SNP genotyping platforms serve different purposes since they differ in SNP selection,reaction chemistry,signal detection,throughput,cost,and assay flexibility.This chapter aims to give an overview of some of these platforms by explaining the technologies behind each platform and identifying the best application scenarios for each platform through cross-comparison.The readers may delve into more technical details in the following chapters. Key words:Whole genome association,fine mapping,single nucleotide polymorphism,copy number variation,haplotyping. 1.Introduction Single nucleotide polymorphisms(SNPs)are best known as genetic markers in disease-association studies to identify genes associated with complex diseases(1,2).However,SNPs are also used in many other clinically and biologically important applica- tions(3).A large variety of commercial platforms are available for semiautomated or fully automated SNP genotyping analysis.On the basis of the purposes of the study,SNP genotyping can be divided into two domains:whole genome association(WGA)and fine mapping(Fig.16.1).Most of the genotyping platforms can be classified accordingly.This chapter aims to briefly explain the principles behind various platforms which lead to a comparison of these platforms so that the readers will get a quick overview before delving into the technical details of some of these methods in the following chapters. A.A.Komar(ed.),Single Nucleotide Polymorphisms,Methods in Molecular Biology578, DOI10.1007/978-1-60327-411-1_16,aHumana Press,a part of Springer Science+Business Media,LLC2003,2009 245
乙型肝炎病毒分型(B型、C型、D型)和耐药突变基因检测.doc
乙型肝炎病毒分型(B型、C型、D型)和耐药突变基因检测 一．检验项目：乙型肝炎病毒分型(B型、C型、D型)和耐药突变基因检测 二．检验目的：在进行抗病毒治疗前和抗病毒治疗中进行乙型肝炎病毒分型和耐药突变基因检测，能够：1). 区分中国和其他亚洲国家常见的HBV-B、C、D基因型； 2). 检测HBV抗病毒药物5个热点突变位点的6种突变类型； 3). 对HBV实行动态监控，辅助确定个性化的临床诊疗方案，进行HBV流 行病学研究。 三．临床意义： HBV基因型分为9种（A-I），其分布具有地域性，中国乃至亚洲流行的乙型肝炎病毒几乎都是B、C型，此外还有少量D型，不同的基因型易发生的突变类型不同，与病情转归也密切相关，如基因型C较B更容易引起严重的肝炎或肝癌，对干扰素的应答率A型高于D型，B型高于C型，C型高于D型。与C型患者相比，B型患者较早出现HBeAg血清学转换，较少进展为慢性肝炎，肝硬化和原发性肝细胞癌。 核苷（酸）类似物，如拉米夫定（Lamivudine，LMV），替比夫定（Telbivudine,LdT），阿德福韦酯（Adefovir,ADV）和恩替卡韦（Enticavir,ETV）等是抗HBV常见药物。但这些药物都无法彻底清除大多数乙肝病人体内的HBV，患者需要长期维持治疗。HBV在宿主体内感染以及抗病毒治疗的过程中会发生基因变异，并在宿主体内免疫系统的压力下和在治疗干预过程中进行变异的优势选择，以达到逃逸免疫、对抗药物、实现物种生存的目的，进而发生耐药。乙肝病人一旦出现耐药突变，其肝功能恶化的比例将显著增高，甚至快速进展至肝衰竭。 四．标本送检要求：4ml黄色帽血清管，空腹采集后立即送检，室温放置不宜超过2小时，如不能立即送检可于4℃保存一周，如需长期保存请放入－20℃冻存，运输过程中请注意保持低温。 五．开单名称：乙型肝炎病毒分型和耐药突变基因检测 进入本科室“医生工作站”→选择开单病人“姓名”→选择“项目类别”→选择“检验” →选择“乙型肝炎病毒分型和耐药突变基因检测”→确定 或进入本科室“医生工作站”→选择开单病人“姓名”→选择“项目类别”→选择“检验”→选择“实验室”→选择“乙型肝炎病毒分型和耐药突变基因检测”→确定六．收费：570元/例 七．送检时间：周一至周日8：00am－12：00am 八．送检地点：检验科三楼服务台 九．报告时间：抽血后，7个工作日后进入我院计算机检查报告系统，查看检测结果。 联系电话：84206146 检验科
62例丙型肝炎病毒基因分型结果分析
62例丙型肝炎病毒基因分型结果分析 发表时间：2017-07-13T15:16:33.613Z 来源：《世界复合医学》2017年第4期作者：张威威[导读] 所以在病毒学研究特别是病毒基因表达谱研究、病毒感染的诊断、病毒流行病学研究等方面有广泛应用前景。 牡丹江市肿瘤医院黑龙江牡丹江 157011 【摘要】目的：对慢性丙型肝炎患者的丙型肝炎病毒（HCV）基因分型情况进行分析，为HCV诊断和治疗地区提供有力的依据。方法：利用门诊及住院患者血清HCV抗体阳性标本，经荧光定量PCR检测HCV RNA阳性的62例标本用基因芯片进行不同基因分型检测。结果：检测HCV感染标本62例，共检出7种基因亚型，分别为1b、6型、2a、1b+ 2a、1b+ 3a、3a和3b，其中1b占72.6%，6型占8.8%，2a 占7.8%，1b+ 2a占5.9%，1b+ 3a占2.9%，3a占1.0%，3b占1.0%。结论：HCV基因型主要为1b与中国南方地区HCV基因型分布比较一致。按照年龄分组20岁以下4例，占6.45%，20～ 30岁12例，占28.6%，30～ 40岁15例，35.7%，40～ 50岁5例，占11.9%，50～ 60岁8例，占19.5%，60岁以上18例，占42.8%。青壮年和有吸毒史、外伤手术史、输注血液制品史的人群阳性率较高。【关键词】丙型肝炎病毒；基因芯片；基因分型【中图分类号】R512.6+3【文献标识码】A【文章编号】1276-7808（2017）04-146-01 Analysis of Hepatitis C Virus Genotyping in 62 Cases Abstract：Objective：To analyze the genotype of hepatitis C virus（HCV）in patients with chronic hepatitis C，and to provide a strong basis for HCV diagnosis and treatment. Methods：62 samples of HCV RNA positive were detected by fluorescence quantitative PCR. The genotypes were detected by cDNA microarray. RESULTS：A total of 62 HBV subtypes were detected，including 1b，6，2a，1b + 2a，1b + 3a，3a and 3b，of which 1b accounted for 72.6%，type 6 accounted for 8.8%，2a 7.8%，1b + 2a 5.9%，1b + 3a 2.9%，3a 1.0%，3b 1.0%. Conclusion：HCV genotype is mainly consistent with the distribution of HCV genotype in southern China. According to the age group under the age of 20 in 4 cases，accounting for 6.45%，20 to 30 years old in 12 cases，accounting for 28.6%，30 to 40 years old in 15 cases，35.7%，40 to 50 years old in 5 cases，11.9% Cases，accounting for 19.5%，over 60 years of age in 18 cases，accounting for 42.8%. Young adults and the history of drug addiction，trauma surgery history，infusion of blood products in the history of the positive rate of high population. Key words：hepatitis C virus；gene chip；genotyping 前言：丙型病毒性肝炎的发病率比较高，非常容易造成慢性病毒性肝炎、肝硬化等疾病，而这些病变的形成与其病原丙型肝炎病毒（HCV）的某些重要生物学特性有关。我国感染丙型肝炎病毒及新发患者数是非常多的，大部分HCV患者会逐步演变为慢性感染，并根据病程轻重发展为肝硬化或肝癌。HCV病毒基因有较强的变异性，变异位点可以发生在基因组的各个区域，根据变异位点的不同将HCV分为不同型别。由于HCV基因型别不仅与疾病严重性存在相关性，而且与抗病毒治疗和肝细胞癌的发生也密切相关。 1.资料与方法1.1一般资料本次研究采用的是我院2015～ 2017年门诊及住院患者血清HCV抗体阳性标本，荧光定量PCR检测HCV RNA阳性的62例标本（其中男31例，女31例，年龄8～81岁）进行基因分型检测。阴性对照为10例健康体检者血清。仪器用的是ABI7300型全自动PCR扩增仪，美国1285REL#6生物安全柜，日本三洋VIP SERIES- 86℃超低温冰箱。试剂用的是丙型肝炎病毒HCV RNA荧光定量检测试剂盒，购于中山大学达安基因股份有限公司，丙型肝炎病毒基因芯片检测技术由中科院上海微系统与信息技术研究所和瑞芯生物科技有限公司提供。 1.2方法 方法用到的是HCV RNA定量检测法，医护人员严格按照丙型肝炎病毒HCV RNA荧光定量检测试剂盒说明书进行操作，先进行RNA提取；逆转录；PCR扩增及荧光检测；然后再对检测结果进行分析，HCV基因分型检测也需要严格按照HCV基因检测芯片说明书进行操作，RNA提取与逆转录；PCR扩增；HCV芯片杂交与显色。 2.结果 62例HCV RNA荧光定量检测阳性结果与HCV基因分型检测结果相符合，10例健康体检者血清检测结果均为阴性，说明基因芯片结果可靠。检测HCV感染标本62例，共检出7种基因亚型，分别为1b、6型、2a、1b+ 2a、1b+ 3a、3a和3b，其中1b占72.5%，6型占8.8%，2a 占7.8%，1b+ 2a占5.9%，1b+ 3a占2.9%，3a占1.0%，3b占1.0%，1b为主要的流行型别，基因型6型已经取代2a成为第二常见亚型，混合基因型感染较多。 3.讨论HCV是一种全球性传染病、给人类健康带来极大威胁的病原体，HCV以血液和性传播为主要传播手段，发病隐匿，症状不典型，加之公众对其认知水平较低，因此病毒的传播不易控制，患者也容易因不能及时诊断而错过治疗的最佳时机。HCV基因型主要为1b与中国南方地区HCV基因型分布比较一致。按照年龄分组20岁以下4例，占6.45%，20～ 30岁12例，占28.6%，30～ 40岁15例，35.7%，40～ 50岁5例，占11.9%，50～ 60岁8例，占19.5%，60岁以上18例，占42.8%。青壮年和有吸毒史、外伤手术史、输注血液制品史的人群阳性率较高。国内外研究表明，HCV不同的基因型对肝脏损伤的程度不同，1b型对肝脏的损伤要比其他型严重得多。HCV对干扰素的应答率也不同，Kandi等，报道HCV 1b型感染多为慢性活动性肝炎，2a型比1b型对干扰素敏感。已证明HCV的基因型能影响抗病毒治疗的效果，感染HCV基因1型或基因4型的患者对使用干扰素和病毒唑的标准治疗反应较差，至少需延长治疗期1年，而且感染基因1型和基因4型的患者比其他基因型者能更快地发展成慢性肝病。HCV是引起人类慢性肝炎、肝硬化及肝癌的主要病原之一。基因分型芯片法，又称基因微矩阵，这种方法是近年来分子生物学及医学诊断技术发展的重要产物，具有非常明显的优点，比如说准确性好，灵敏度高，特异性强，而且简便快速，不需要荧光标记。由于基因芯片可以一次性对大量序列进行检测分析，具有高通量、并行、快速等特点，解决了传统核酸印迹杂交技术操作繁杂、自动化程度低、检测序列少、效率低的缺点，所以在病毒学研究特别是病毒基因表达谱研究、病毒感染的诊断、病毒流行病学研究等方面有广泛应用前景。参考文献：
高通量SNP基因分型技术研究进展
10 Sheng W et al.J Virol,2003;77(6):3859 11 C ohen J I,et al.J Virol,1999;73(9):7627 12 Wei MX et al.Cancer Res,1994;54(7):1843 13 G ao Y et al.Oncogene,2002;21(5):825 14 T anner J E et al.J In fect Dis,1997;175(1):3815 Decaussin G et al.Cancer Res,2000;60(19):5584 16 Brink AA et al.J Clin M icrobiol,1998;36(11):3164 17 Hayes DP et al.M ol Pathol,1999;52(2):97 18 zur Hausen A et al.Cancer Res,2000;60(10):2745 (2002211201 收稿) 高通量SNP基因分型技术研究进展 方唯意综述 姚开泰审阅 中南大学湘雅医学院肿瘤研究所(长沙,410078) 摘要 在后基因组时代,单核苷酸多态性研究已迅速成为了生物医学许多领域的焦点。发展可靠、敏感、经济、稳定、高通量的S NP基因分型技术已迫在眉睫。本文主要着重于高通量S NP基因分型技术的原理、利弊以及这些技术在这个领域过去几年中的进展。 关键词 高通量;单核苷酸多态性;基因分型 单核苷酸多态性(S NPs)是最普遍的遗传变异形式。通过开展具有明显表型特征的S NPs基因分型大规模相关研究,有助于鉴定许多复杂疾病原因,了解个体对各种药物的耐受性和对环境因子的反应。人类基因组测序的完成和142万个S NPs在基因组上的定位[1],为首次在全基因组水平上进行S NPs研究打开了方便大门。经典的S NPs分析方法是PCR 扩增后用凝胶电泳检测,虽然可靠性好,但缺乏效率。寡核苷酸微阵列和其他高通量筛选技术效率有了明显的提高,但临床应用绝非可靠,因此,有必要改进和发展新的可靠、敏感、高通量、经济、稳定的S NPs基因分型技术。在本文中,我们主要阐述高通量S NPs基因分型方法,包括一步均质法、焦磷酸测序、DNA芯片/阵列分析法、微球法、MA LDI2T OF质谱基因分型分析法等,讨论这些技术的目前状态和将来潜力。 1 一步均质法 T aqman、Scorpion分析和分子灯塔组成了微滴定平板荧光阅读系统。T aqman和分子灯塔都依赖于等位基因特异性寡核苷酸杂交在PCR期间对等位基因进行区分。而Scorpion分析能使用等位基因特异性PCR或是等位基因特异性杂交反应[2]来区分等位基因。它们作为一个末端分析能在一个完全均质的反应条件下进行分析。在反应起始,所有试剂和基因组DNA都混合在一起,经热循环步骤后,荧光信号能被检测到。该反应既没有单独的预扩增步骤,也没有中间的处理过程,因此它们是一种最简单的分析方法。由于没有适合这些方法的384孔荧光检测器,以及荧光标记探针的价格过高和缺乏可靠的自动化基因型呼叫软件,因此阻碍了这些方法的发展。最近,Applied Biosystems公司新开发的7900HT型高通量荧光定量PCR仪,使得进行384孔微滴定平板荧光检测成为了可能,这主要归因于高通量能力的增加和反应容积的减少。当如果要发展更高的基因分型通量时,一个可靠的自动化等位基因呼叫能力是必须的,它不只是纠正基因型呼叫信号更快,而且在处理和加工数据上必须更迅速,更准确。近来研究表明,自动化基因型呼叫在无阳性对照情况下进行聚类分析是可行的[3]。 2 焦磷酸测序Pyrosequencing 焦磷酸测序是对短到中等长度的DNA序列样品进行高通量、精确和重复性好的分析方法。其反应原理是当测序引物与PCR扩增的,单链DNA模板杂交,和各种酶包括DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶、三磷酸腺苷双磷酸酶、以及底物、荧光素一起共同孵育。4种dNTP之一被加入反应体系,如与模板配对,该dNTP与引物的末端形成共价键,dNTP 的焦磷酸基团释放出来。ATP硫酸化酶在APS存在的情况下催化焦磷酸生成ATP,ATP驱动荧光素酶介导的荧光素向氧化荧光素的转化,氧化荧光素发出的可见光信号与ATP量成正比。ATP和未掺入的dNTP由三磷酸腺苷双磷酸酶降解,光信号淬灭,并再生反应体系,然后再加另一种dNTP继续反应。焦磷酸测序最初作为DNA测序方法而发展起来的,其化学反应与Sanger双脱氧二核苷酸法完全不同。它无需灌胶、毛细管电泳,也无需同位素或荧光染料
乙型肝炎病毒基因分型方法简述
乙型肝炎病毒基因分型方法简述 邵 玲 张 男 【摘要】乙型肝炎病毒是一种嗜肝脱氧核糖核酸病毒,属于一种复合体DNA病毒。乙型肝炎病毒可按两种方法分型:血清型和基因型。随着分子生物学的发展以及对乙型肝炎病毒研究的深入,乙型肝炎病毒血清分型法已不能适应对该病毒感染研究的需要,而出现的基因分型法则引起广泛的重视。 【关键词】乙型肝炎病毒;基因分型方法 H epatitis B virus gene minute method summ ary S HA O L in Z HA N G N an 【Abstract】The hepatitis B virus is one kind is addicted to the liver deoxyribonucleic acid virus,belongs to one kind of complex DNA virus.The hepatitis B virus may according to two method minutes:Blood serum and genotype.Along with molecular biology’s development as well as to hepatitis B virus research’s thorough,a hepatitis B virus blood serum minute law has not been able to adapt to this virus infection research need,but appears a gene minute principle brings to the widespread attention. 【K ey w ords】Hepatitis B virus;Gene minute method 乙型肝炎病毒是一种嗜肝脱氧核糖核酸病毒,属于一种复合体DNA病毒。乙型肝炎病毒可按两种方法分型:血清型和基因型。随着分子生物学的发展以及对乙型肝炎病毒研究的深入,乙型肝炎病毒血清分型法已不能适应对该病毒感染研究的需要,而出现的基因分型法则引起广泛的重视。1988年Ok2 mamoto[1]对18株不同亚型的HBV基因序列两两进行比较后,根据核苷酸序列异源性>8%的原则,将18株HBV DNA序列分为A～D4个基因型,提出了HBV基因型的概念。1992年Norder[2]发现ayw4和adw4q-两旧亚型之间及基因型A～D 之间S基因差异>4%,提出了两种新的基因型E,F,1994年Norder通过全基因序列P3测定加以证实。2000年Stuyver[3],在研究来自法国和美国的慢性乙肝病人血清样本时,发现有13株病毒无法归入A～F型,命名为G型。随后,日本和德国也相继发现了G基因型。2002年Arauz～Ruiz[4]对10株HBV进行基因型研究,发现其中3株虽与F型相近,但与F型又有明显的不同,进而命名为H型。截止现今,HBV基因型可分为A～H八型。 目前,国内外对HBV进行基因分型主要有“基因序列测定法、聚合酶链反应———限制性片段长度多态性分析法、基因型特异性表位单克隆抗体的EL ISA、基因型特异性线形探针检测法、基因型特异性引物PCR法和基因芯片技术”。 1 基因分型原理 1.1 全基因序列测定。全基因序列测定是根据HBV所有病毒核苷酸异源性>8%进行分型的。Okamoto对从日本及印度尼西亚adw2慢性携带者中分离出的3株HBV进行全序列测序及比较,其核苷酸的异质性为3.9%～5.6%,而与美国2株相同血清亚型HBV序列比较,异质性达8.3%～9.3%,达到甚至超过不同血清亚型HBV的异质性,从而说明血清学分型不能真正反映HBV基因变异。再经对18株HBV DNA进行两两比较分析,根据同源性<92%、异质性>8%,将其分为A, B,C及D4个基因型,初步建立了基因分型体系。12年后Stuyver使用该方法,发现了一种新的3248bp的HBV基因型G 。 1.2 S基因序列测定。由于乙型肝 炎病毒基因可分为p基因、前s基因、编 码HBs4的s基因、C基因及X基因(如 图),可分别对它们进行研究,从而找出各 个基因型在各个基因之间的差异。Nor2 der[5]对32例HBV患者s基因测序结果 进行分析,并建立进化树,基因型间异质 性>4%。除证实了Okamoto的A～D分型外,还发现了2个新的基因型E和F,使HBV基因型达到6个(A～F)。在其后对28例HBV全基因组、p基因、前s基因、编码HBs4的s基因、C 基因及X基因分别比较并建立进化树,进一步证实根据s基因序列分型最接近全基因组,从而证明了单独使用S基因进行分型的可靠性。目前,此法尚在使用,主要有SSP和SSO[6],即基因型特异性引物PCR法和基因型特异性线形探针检测法。 2 基因分型方法 2.1 序列测定法。即直接测定核苷酸序列,根据差异分型。自Okamoto据HBV基因型之间的全序列异质性8%进行分型以来,测序由于方法直接、可靠而成为主要鉴定HBV基因型的方法。同全序列进化树图比较,发现S基因的序列变化同全基因序列的变化一致,可用S基因序列代替全基因序列进行分型,界限为核昔酸序列的异质性4.0%。该法虽较为可靠但操作繁琐、费用昂贵,不适于临床大量标本检测。 2.2 聚合酶链反应———限制性片段长度多态性分析法(PCR～RFL P)。目前常用的基因分型方法,通过PCR扩增出目标基因片段(通常为S基因或Pres/s基因),用特定的限制性内切酶进行酶切,根据酶切图谱进行基因分型。Mizokami[7]通过分子进化方法对已知基因型的68例HBV患者全基因、106例HBV患者s基因序列进行分析,发现并确认基因型特异性酶切位点区域。Lindh[8]对不同基因型S基因的特异酶切位点进行分析,设计使用限制性内切酶Trp509I和Hinf I使S基因PCR产物产生不同长度的酶切片段,成功地将166/180例患者HBV实现A-F基因分型。RFL P敏感性高,但酶切位点易受基因变异影响,且遇混合感染或酶切不完全,会出现复杂条带,影响分型结果判断。 2.3 基因型特异性表位单克隆抗体的酶联免疫吸附法(EL ISA)PreS2多肽有多组抗原表位。基因型不同抗原表位也不同,从而可以鉴定不同基因型。Usuda[9]等用此法制备前S2区域基因型特异性表位的单克隆抗体,并用辣根过氧化酶进行标记,对68例HBV阳性患者血清检测,分型结果与S基因测序分型完全一致。在后期实验中发现,适用于大规模的流行病学调查,使较大范围的HBV的研究成为可能。 2.4 基因型特异性线形探针检测法。该方法是设计型特异的探针,检测HBV扩增产物,以产物的不同长度或与探针的反应性来区分不同型别。Kato[10]利用G基因型的病毒在核心区有36个核苷酸的插入,设计引物用PCR的方法可以对G基因型进行特异的筛查。早在1983年Wu用酶切的方法研究血清型的酶切图谱,来区分不同的血清型。王虹[11]等采用PCR2核酸杂交/EL ISA检测,主要是联合利用PCR、核酸杂交和酶联免疫技术,设计前C和C区的探针,可以快速准确的区分HBV的基因型。另外Van G eyt[12]根据A～F基因型的保守序列设计了18种型特异性探针与HBV S (下转12页)
浅析乙肝病毒基因突变检测及治疗(一)
浅析乙肝病毒基因突变检测及治疗(一) 一、概况 由于我国人民生活水平低和卫生资源溃乏，造成乙肝泛滥。据统计：我国有乙肝病毒携带者约1.5亿、慢性迁延性肝炎约2500万、慢性活动性肝炎约1000万、重症肝炎约150万、肝硬化约100万和肝癌16～30万。肝硬化和肝癌80%以上是由乙肝病毒引起，而且80%左右来源于家族性垂直传播、与病人接触而感染机率很少。乙肝传染病已被国家疾病预防控制中心列为重点监控的疾病之一。 乙型肝炎病毒（HBV）属嗜肝病毒科，基因结构复杂，根据HBV-DNA核苷酸序列异质性≧8%为一种基因型的规定，HBV目前分为A～H8个基因型，其中A、B、C、F4个基因型存在不同的亚型，且分布呈区域性。由于其在复制过程中HBV-DNA聚合酶缺乏校正功能，导致易于变异，有报导HBV的基因型与基因型变异可能与HBV相关性肝癌的发生发展有关。HBV 变异给疾病的预防、诊断、治疗和预后带来了新问题，不同基因型的基因变异、临床表现及对抗病毒、肝移植等的治疗反应存在差异。 二、变异及区域 HBV受自然压力、个体免疫力和药物治疗作用出现变异。HBV有四个开放阅读框架（ORE）即S、C、P、X区。 1、C区变异：用基因芯片检测HBV前C区和C基因启动子（BCP）区4位点突变，发现前C 区A1896、前C区A1814、BCP区nt176 2、BCP区nt1764突变检出率分别是58.57%、12.86%、54.29%、52.86%。突变的发生依次是慢重肝、慢乙肝重度、中度、轻度，血清病毒标志是HBeAg(-)HBeAb(+)、HBV-DNA定量在104-106copy/ml之间的突变发生率最高。可以解释小三阳DNA阳性之原因：HBeAg前C区A1896位的G变异成A，密码子UGG变为终止UAG，使HBeAg不能合成，但不影响病毒复制。 2、S区变异：前S1有识别功能，前S2是介导受体进入功能。前S区的变异可能是病毒逃避宿主免疫的一种方法，前S区的变异决定不同的HBV亚型。124、131位变异或122-124间插入变异可改变S抗原决定簇的构型，致HBsAg假阴性。145、141、126、133位氨基酸的改变，用常规试剂仍可检出HBsAg，但可能削弱HBsAg的无免疫性，使高效价的乙肝免疫球蛋白或接种诱生的HBsAb难与变异株的HBsAg结合，缺乏中和特性，使HBsAg与HBsAb 同时阳性。在HBV-DNA阳性时，无论是乙肝病毒基因变异株或野毒株，前S1抗原是判断乙型肝炎病毒复制的重要指标。 3、P区变异：用微孔板核酸杂交法检测乙肝病毒P基因区变异，突变位点主要位于HBV-DNA 聚合的区域（YMDD），M1（蛋氨酸）可被VC（缬氨酸）或IC（异亮氨酸）替代。研究用拉米夫啶（LMV）治疗慢性乙肝而发生耐药的有关变异可见：LMV本身可引起HBV的变异即YMDD变异，用LMV四周后50-70%的病人出现YMDD变异。 4、X区变异：HBV-X蛋白对信号转导通路及细胞凋亡有影响，X蛋白对核转运影响和对线粒体直接作用。X区变异引起X蛋白（HBXAg）过度表达，激活体内癌基因和抑制抑癌基因，导致肝癌的发生。有报导：用聚合酶链反应检测原发性肝细胞癌（HCC）患者癌组织及癌周组织中HBV-X基因，检出率分别为68%和77%。