叶绿体的分离与荧光观察

叶绿体的分离与荧光观察

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实验五 叶绿体的分离与荧光观察

实验五叶绿体的分离与荧光观察 叶绿体是植物细胞所特有的能量转换细胞器，光合作用就是在叶绿体中进行的。由于具有这一重要功能，所以它一直是细胞生物学、遗传学和分子生物学的重要研究对象。叶绿体是植物细胞中较大的一种细胞器，利用低速离心即可分离集中进行各种研究。 实验目的 一、通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法。 二、观察叶绿体的自发荧光和次生荧光，并熟悉荧光显微镜的使用方法。 实验原理 将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的粘度有关。在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速率不同。依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。 叶绿体的分离应在等渗溶液(0.35 mol／L氯化钠或0.4 mol／L蔗糖溶液)中进行．以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。将匀浆液在1000 r／min的条件下离心2min，以去除其中的组织残渣和一些未被破碎的完整细胞。然后，在3000 r／min的条件下离心5min，即可获得沉淀的叶绿体（混有部分细胞核）。分离过程最好在0～5℃的条件下进行；如果在室温下，要迅速分离和观察。 荧光显微术是利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行观测的一种技术。某些物质在一定短波长的光(如紫外光)的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光(如可见光)，这种光就称为荧光。若停止供能荧光现象立即停止。有些生物体内的物质受激发光照射后可直接发出荧光，称为自发荧光(或直接荧光)，如叶绿素的火红色荧光和木质素的黄色荧光等。有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光．这种荧光称为次生荧光(或间接荧光)，如叶绿体吸附吖啶橙后可发桔红色荧光。 利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行检测时，将受到许多因素的影响，如温度、光、淬灭剂等。因此在荧光观察时应抓紧时间．有必要时立即拍照。另外，在制作荧光显微标本时最好使用无荧光载片、盖片和无荧光油。 实验用品 一、器材 1．主要设备：普通离心机、组织捣碎机、粗天平、荧光显微镜。 2．小型器材：500ml烧杯2个，250ml量筒1个，滴管10支，10ml刻度离心管20支，纱布若干，无荧光载片和盖片各4片。 二、材料 新鲜菠菜。 三、试剂 0.35 mol／L氯化钠溶液，．0.01％吖啶橙(acridine orange)。 实验方法 一、叶绿体的分离与观察 1. 选取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除叶梗及粗脉，称30g于150ml 0.35 mol／L NaCI 溶液中，装入组织捣碎机。 2. 利用组织捣碎机低速(5 000 r／min)匀浆3~5min。 3. 将匀浆用6层纱布过滤于500ml烧杯中。

实验三 叶绿体的分离与荧光观察

实验三叶绿体的分离与荧光观察 一、实验目的 1．了解差速离心法分离细胞成分的一般原理和方法。 2．掌握从植物叶组织中分离叶绿体的方法。 3．熟悉荧光显微镜的使用方法，并观察叶绿体的自发荧光和次生荧光。 4．熟悉利用叶绿体得率来测量叶绿素含量。 二、实验原理 叶绿体是是植物细胞中由双层膜围成，含有叶绿素能进行光合作用的能量转换细胞器。由于具有这一重要功能，所以它一直是植物学、细胞生物学和遗传学等的重要研究对象。 植物细胞被细胞壁所包围，因此实验中必须破碎细胞壁的同时保持叶绿体的完整。叶绿体是植物细胞中较大的一种细胞器。将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离叶绿体等细胞器的常用方法。 差速离心就是根据一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，及离心力以及悬浮介质的粘度等因素进行的。在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速率不同。依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。 叶绿体的分离应在等渗溶液（0.35 mol/L氯化钠或0.4 mol/L蔗糖溶液）中进行，以免渗透压的改变使叶绿体受到损坏。先将匀浆液在1 000 rpm的条件下离心2 min（以去除其中的组织残渣和一些未被破碎的完整细胞），然后在 3 000 rpm的条件下离心5 min，即可获得沉淀的叶绿体（混有部分细胞核）。分离过程最好在0～4℃的条件下进行；如果在室温下，要迅速分离和观察。 有些生物体内的物质受激光照射后可直接发出荧光，称为自发荧光（或直接荧光），有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光，这种荧光为次生荧光（或间接荧光）。叶绿体含有的叶绿素发出火红色荧光属于自发荧光，叶绿体吸附吖啶橙后可发桔红色荧光属于次生荧光。 三、实验仪器、材料和试剂 1．设备与器材

实验一 叶绿体的分离与荧光观察

实验一叶绿体的分离与荧光观察 一、实验目的： （1）通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法。 （2）观察叶绿体的自发荧光和次生荧光，并熟悉荧光显微镜的使用方法。 二、实验原理： 将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的黏度有关。在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速率不同。一次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。 叶绿体的分离应在等身溶液（0.35mol/L氯化钠或0.4mol/L蔗糖溶液）中进行，以免渗透压的改变使叶绿体损伤。将匀浆液在1000r/min的条件下离心2 分钟，以去除其中的组织残渣和未被破碎的完整细胞。然后，在3000r/min的条件下离心5分钟，即可获得沉淀的叶绿体（混有部分细胞核）。分离过程最好在0℃~5℃的条件下进行；如果在室温下，要迅速分离和观察。 利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行检测时，将受到许多因素的影响，如温度、光、淬灭剂等。因此在荧光观察时应抓紧时间，有必要时立即拍照。另外，在制作荧光显微标本时最好使用无荧光载玻片、盖玻片和无荧光油。 三、实验用品： 1、材料：新鲜菠菜 2、试剂： （1）0.35mol/L氯化钠溶液 （2）0.01%吖啶橙（acridine orange） 3、器材： （1）主要设备：普通离心机，组织捣碎机，粗天平，荧光显微镜。 （2）小型器材：500ml烧杯2个，250ml量筒1个，滴管20支，10ml刻度离心管20支，试管架5个，纱布若干，无荧光载玻片和盖玻片各4片等。 四、实验方法： 1、叶绿体的分离与观察： （1）选取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除叶梗脉，称30g于150ml 0.35mol/L NaCl溶液中，装入组织捣碎机。 （2）利用组织捣碎机低速（5000r/min）匀浆2~3分钟。 （3）将匀浆用6层纱布过滤于500ml烧杯中。 （4）取滤液4ml在1000r/min下离心2min。弃去沉淀。 （5）将上清液在3000r/min下离心5分钟。弃去上清液，沉淀即为叶绿体（混

叶绿体的分离和观察

生命科学学院 Life Scie nee College 细 胞 生 物 学 实验报告 姓名：柳伟雄班级：2013级生科一班

山东大学实验报告 2015年5月10日 学号：2同组者：曾玮璠 姓名：柳伟雄 系年级：生科一班2013级 科目：细胞生物学实验 题目：叶绿体的分离和观察 一、目的和要求 1. 通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法 2. 观察叶绿体的自发荧光和次生荧光，并熟悉荧光显微镜的使用方法 、原理 将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心， 是分离细胞器的常用方法。 一个颗粒在离心场中的 沉降速率取决于颗粒的大小、 形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的黏度有关。 在一给定的离心场中， 同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速率不同。 一次增加离心力和离心时间， 就能够使非均一悬 浮液中的颗粒按其大小、 密度先后分批沉降在离心管底部， 分批收集即可获得各种亚细胞组分。 叶绿体 的分离应在等身溶液（0.35mol/L 氯化钠或0.4mol/L 蔗糖溶液）中进行，以免渗透压的改变使叶绿体 损伤。将匀浆液在1000r/min 的条件下离心2分钟，以去除其中的组织残渣和未被破碎的完整细胞。 然 后，在3000r/min 的条件下离心5分钟，即可获得沉淀的叶绿体（混有部分细胞核） 。分离过程最好在 0C — 5C 的条件下进行；如果在室温下，要迅速分离和观察。 利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行检 测时，将受到许多因素的影响，如温度、光、淬灭剂等。因此在荧光观察时应抓紧时间，有必要时立即 拍照。另外，在制作荧光显微标本时最好使用无荧光载玻片、盖玻片和无荧光油。 三、试剂和器材 1. 材料：新鲜菠菜 2. 试剂：（1） 0.35mol/L 氯化钠溶液（2） 0.01%吖啶橙（acridine orange ） 3、 器材：（1 ）主要设备：普通离心机，组织捣碎机，粗天平，荧光显微镜 （2）小型器材：500ml 烧杯2个，250ml 量筒1个，滴管20支，10ml 刻度离心管 纱布若干，无荧光载玻片和盖玻片各 4片等 四、实验步骤 1. 选取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除叶梗脉，称 30g 于150ml 0.35mol/LNaCI 溶液中，装入组织捣 碎机 2. 利用组织捣碎机低速（5000r/min ）匀浆2— 3分钟 3. 将匀浆用6层纱布过滤于500ml 烧杯中 4. 取滤液4ml 在1000r/min 下离心2min ,弃去沉淀 同组者：曾玮皤 20支，试管架5个,

叶绿体的分离及荧光染色观察

叶绿体的分离及荧光染色观察 泮力菁 2011级生物基地 201100140091 同组者：商倩倩【实验目的】 1、通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离与纯化的原理和方法； 2、熟悉荧光显微镜的使用方法，观察叶绿体的自发荧光和间接荧光； 3、复习巩固制片及染色的基本技术。 【实验原理】 1、真核细胞由细胞膜、细胞核和细胞质组成。细胞质中含有若干细胞器和细胞骨架，这些结构被称为亚细胞组分。分离亚细胞组分的方法主要有差速离心和密度梯度离心两种。 2、差速离心和密度梯度离心： 差速离心法是在密度均一的介质中由低速到高速的逐级离心用于分离不同大小的物体。离心速度逐渐提高，样品会按先大后小的顺序沉淀。在差速离心中细胞器沉降的顺序为：细胞核、线粒体、溶酶体和过氧化物酶体、内质网和高尔基体。最后为核糖核蛋白复合体。由于各种细胞器在大小和密度上可能相互重叠。一般差速离心2-3次，分离效果会好一些。差速离心只用于分离密度和大小悬殊的细胞或细胞器，并且得到的产物纯度较低。若对产物纯度的要求较高，则需要密度梯度离心来分离纯化。 密度梯度离心法是利用一定的介质在离心管内形成连续的密度梯度，将细胞悬浮液或匀浆置于介质的顶部，通过离心力的作用使细胞或细胞器分层、分离，最后不同密度的细胞或细胞器位于与自身密度相同的沉降区带中。这种离心技术又可分为速度沉降和等密度沉降两种。速度沉降主要用于分离密度相近而大小不同的物体，而等密度沉降用于分离密度不同的物体。 叶绿体是植物细胞所特有的能量转换细胞器。它是一种比较大的细胞器，利用差速离心即可分离收集，然后用密度梯度离心纯化，便可用于各种研究。 3、荧光： 光致发光：某些物质在照射下，吸收光能进入激发态，当从激发态进入基态时，可以以电磁辐射的形式释放出吸收的光能，这种现象称之为“光致发光”。紫外辐射，可见光及红外辐射均可引起光致发光，如磷光与荧光。 荧光：在光致发光中，如果一定波长的短波光（如紫外光）照射某种物质，这种物质吸收光能后进入激发态，并立即激发在极短的时间内能发射出比照射光波长更长的光（如可见光），这种光就称为荧光。一旦停止入射光，发光现象也随之立即消失。 荧光的性质：A、吸收光，必须有激发光源；B、荧光波长大于激发波长（损失热能）；C、荧光强度小于激发光的强度；D、有不同程度的衰减（影响因素：如温度、光。猝灭剂等，因此可以先拍照，后观察）；E、荧光强度取决于激发光强度，被检物浓度、荧光效率（在制作荧光显微标本时最好使用无荧光载玻片、盖玻片和香柏油）。 荧光显微镜的光源有汞灯光源（提供激发光：U,V,B,G），疝灯光源：高峰值更宽，更稳定）。

实验1叶绿体的分离与荧光分析

中国海洋大学实验报告姓名：系年级：**级专业：生物科学 科目：分子细胞生物学实验学号：** 一、实验目的： （1）、通过对植物叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法 （2）、观察叶绿体的间接荧光，并了解荧光显微镜的使用方法 二、实验原理 颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的黏度有关。在一定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速率不同，一次增加离心力和离心时间，就能使非均一悬浮液中的颗粒按其大小。密度的先后分批沉降在离心管的底部分批收集，即可获得各个亚细胞的组分。 叶绿体的分离应该在等渗溶液中进行，以免渗透压影响叶绿体，对其造成损伤。 在荧光显微镜下可以观察叶绿体的自发荧光和间接荧光。 三、实验材料 新鲜菠菜。 等渗溶液：0.35mol/L氯化钠溶液， 试剂：0.01%吖啶橙(acridine orange)

四、实验方法 １、叶绿体的分离 2、菠菜叶手撕片的制备 ①、下表皮因海绵组织较疏松，可以直接手撕下表皮的薄膜在显微镜下观察。

②、上表皮因栅栏组织较致密，可以用刀片将下表皮刮掉，在显 微镜下观察上表皮的细胞和气孔。 3、菠菜的叶绿体的观察 在普通光学显微镜下，将制得的手撕片放在载玻片的等渗溶液中，游离的叶绿体悬浊液点在在载玻片上，轻轻地盖上盖玻片（防止气泡 产生），即可观察。 在荧光显微镜下，将游离叶绿体悬浊液的的标本放在荧光显微镜下，先后用绿光、蓝光对其进行照射，在电脑上观察其产生的自发荧 光。 向手撕片的标本、游离叶绿体悬浊液的的标本中加入1-2滴 0.01% 吖啶橙染液，先后用绿光、蓝光对其进行照射，在电脑上观察 其产生的间接荧光。 五、实验结果 气孔保卫细胞 叶绿体 图1菠菜手撕片的标本中，上表皮及其气孔

高中生物实验 叶绿体的分离和荧光观察 实验报告

实验十一叶绿体的分离和荧光观察 一．实验目的 了解细胞匀浆和差速离心分级分离细胞组分的原理。了解提取叶绿体的基本原理及其过程，通过光学显微镜的观察了解体外分离的叶绿体的一般 形态，增加对叶绿体的感性认识。 掌握吖啶橙染色叶绿体的方法。 掌握显微数码拍照的方法。 二．实验内容 提取叶绿体，吖啶橙染色，观察染色结果。 显微数码拍照。 三．实验原理 将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。 在一定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速度不同。依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部。叶绿体的分离应在等渗溶液（0.35mol/LNacl或0.4mol/L 蔗糖溶液）中进行。离心后可得沉淀的叶绿体。 四．实验方法与步骤 1．取嫩叶3g，洗净去柄去叶脉，剪碎放入研钵中。 2．加4ml0.35mol/LNacl，研磨匀浆，尼龙布过滤于离心管中1ml。 3．1000rpm离心2分钟弃去沉淀。 4．3000rpm离心15分钟，弃去上清液，将沉淀用少量0.35mNacl悬浮。 5．提取叶绿体观察：①普通光镜②荧光光镜③加吖啶橙。 6．撕取叶表皮观察：①普通光镜②荧光光镜③加吖啶橙。 a．在普通光镜下，可看到叶绿体为绿色椒榄形，在高倍镜下看到叶绿体内部含有较深的绿色的绿色小颗粒即基粒。 b．在荧光显微镜下，叶绿体发出火红色荧光。 c．加入吖啶橙染后，叶绿体可发也桔红色荧光。而其中混有的细胞核发

出绿色荧光菠菜叶手切片观察。 d．在普通光镜下可以看到三种细胞：表皮细胞：为边缘吐锯齿表的鳞片状细胞。保卫细胞：为构成气孔的成对存在的肾形细胞。叶肉细胞：为排成栅状的长形和椭圆形细胞。 5．显微数码拍照。 五．实验结果

叶绿体的分离与荧光观察

实验二叶绿体的分离与荧光观察 一、实验目的 了解叶绿体分离的一般原理和方法，并熟悉应用荧光显微镜方法观察叶绿体荧光现象。 二、实验原理 1、叶绿体的分离应在等渗溶液L氯化钠或L蔗糖溶液)中进行,以免渗透压 的改变使叶绿体受到损伤。利用差速离心法将匀浆液离心，从而使叶绿体得到分离。分离过程最好在0～5℃的条件下进行；如果在室温下，要迅速分离和观察。 2、有些生物体内的物质受激发光照射后直接发出荧光，称为自发荧光(或直 接荧光)，如叶绿素的火红色荧光和木质素的黄色荧光等。有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光，这种荧光称为次生荧光(或间接荧光)，如叶绿体吸附吖啶橙后可发桔红色荧光。本实验利用荧光显微镜对叶绿体的荧光进行观察。 三、实验步骤 1.选取新鲜的嫩白菜叶片，洗净擦干后去除叶梗和粗脉，撕成小碎块，称 3g放于玻璃研钵中，加入LNaCl溶液，匀浆3～ 5min。 2.匀浆液用2层尼龙布过滤于50ml烧杯中。 3.将滤液平分到2个离心管中，天平配平，1000r/min下离心2min。弃去沉 淀。 4.将上清液在3000r/min下离心5min。弃去上清，沉淀即为叶绿体。 5.将沉淀用LNaCl溶液悬浮，做两张临时装片：①取一滴叶绿体悬液滴于 载片上，加盖片观察；②取一滴叶绿体悬液滴于载片上，再滴加1-2滴%吖啶橙荧光染料，加盖片观察： ①在普通光镜下观察； ②在荧光显微镜下观察：先用明视野（白炽光灯下）和用低倍镜头观察， 找到适当的标本后，再转高倍镜头，并将白炽光灯转换成以汞灯激发光 作光源，用暗视野观察。 6.撕取白菜叶片下表皮一小片置于滴有清水的载片上，盖上盖玻片，在普通 光镜下观察气孔的形状，保卫细胞里面的叶绿体；随后转置荧光显微镜下观察。 四、结果与分析

玉米和水稻叶绿体的分离及叶绿素含量的测定

玉米和水稻叶绿体的分离及叶绿素含量的测定 摘要：利用高盐低pH值法对C 3植物和C 4 植物进行叶绿体的分离与提取，经研磨-差 速离心-裂解-纯化，可获得完整的叶绿体,进而用丙酮溶解叶绿素，测定光密度值，推算出总叶绿素含量。本方法快速简便、省去传统的蔗糖密度梯度离心和氯化铯 密度梯度离心等昂贵、耗时的步骤，对仪器的要求不高，成本低，适用于实验教 学和科研活动。 关键词：叶绿体；叶绿素；分离；含量测定 Abstract :Plant chloroplast were extracted by the high-salt and low pH method. after skiving, differential centrifugation, cracking and purification we got eligible chloroplast. dissolved the chlorophyl by acetone and calculate the total content of chlorophyl after the absorbency mensurated. The method is fast and simple, it elide some expensive, time-consuming steps such as traditional sucrose density gradient centrifugation and cesium chloride density gradient centrifugation, it suit for teaching and research. Key words：Chloroplast, Chlorophyl，Separate，Content mensurate 1 前言 叶绿体是植物进行光合作用极为重要的细胞器，它具有独立复制的遗传物质。20世纪 初，人们根据植物叶片的花斑现象具有母性遗传的特征，推断在叶绿体上可能存在着核外 的遗传因子。直到20世纪60年代初，随着核酸检测与镜技术发展，叶绿体基因组的存在 才最后由Ris等人证实[1]。目前，cpDNA被广泛地用于细胞质遗传、植物雄性不育、植物 的系统发育、遗传多样性和亲缘关系等方面的研究[2]。然而，叶绿素是在叶绿体中得到的 一种色素，它广泛存在于植物的叶和茎中的绿色色素，它与蛋白质结合在于叶绿体中，是 绿色植物进行光合作用所必需的催化剂。一般叶绿素是泛指叶绿素类的总称。叶绿素及其 衍生物可广泛用作食品的食用色素，还可用于化妆品的着色剂、脱臭剂等；在医药上可用 来治疗创伤、传染性肝炎、胃及十二指肠溃疡、慢性肾炎及急性胰腺炎，它还能增进造血 机能及促进放射线损害机体的康复，外科上用于治疗灼伤、痔疮及子宫疾患，并有降低胆 固醇、改善便秘等作用[3]。由于叶绿体中的重要功能，所以一直是细胞生物学、遗传学和 分子生物学的重要研究对象。 人们根据光合作用碳素，同化中CO2固定的最初光合产物日不同，把高等植物分成2 类:1)C3植物。这类植物的最初光合产物是3-磷酸甘油酸(三碳化合物),这种反应途径C3途 径,如水稻、小麦、棉花、大豆等大多数植物。2）C4植物。这类植物以草酰乙酸（四碳化 合物）等为光合最初产物，所以这种途径称为C4途径，如玉米、甘蔗、高粱等。一般来说，

实验1 叶绿体的分离与荧光观察

中国海洋大学实验报告 2019年 3 月30 日姓名杨慧慧学号17050031803 系年级海洋生命学院2017 专业生物技术科目细胞生物学实验上课时间周六12节题目实验一叶绿体的分离和荧光观察 一、实验目的 1. 通过植物细胞叶绿体的分离, 了解细胞器分离的一般原理和方法。 2. 观察叶绿体的自发荧光和次生荧光, 并熟悉荧光显微镜的使用方法。 二、实验原理 1. 将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。 2. 叶绿体的分离应在等渗溶液中进行, 以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。 3. 因为叶绿体有自发荧光，因此用荧光显微镜进行观察。 三、实验用品 1. 材料：新鲜菠菜。 2. 试剂：0.35mol/L氯化钠溶液，0.01%吖啶橙(acridine orange)。 3. 器材： (1)主要设备: 普通离心机、组织捣碎机、粗天平、荧光显微镜。 (2)小型器材: 烧杯, 量筒, 滴管, 刻度离心管, 纱布，无荧光载片和盖片。 四、实验步骤与方法 一、叶绿体的分离与观察 1.选取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除叶梗脉，称30g于150ml 0.35mol/L NaCl溶液中，装入组织捣碎机。 2.低速匀浆3~5min。 3.将匀浆用6层纱布过滤于500ml烧杯中。 4.每组取滤液4ml，1000r/min下离心2min，弃去沉淀。 5.将上清液在3000r/min下离心5min，弃去上清液，沉淀即含叶绿体(混有部分细胞核)。 6.将沉淀用0.35mol/L NaCl溶液悬浮。 7.取叶绿体悬液一滴滴于载玻片上，加盖玻片后即可在普通光镜和荧光显微镜下观察。 (1)在普通光镜下观察。 (2)在荧光显微镜下观察叶绿体的直接荧光。 (3)在荧光显微镜下观察叶绿体的间接荧光：取叶绿体悬液一滴滴在无荧光载片上，再滴加一滴0.01%吖啶橙荧光染料, 加盖片后即可在荧光显微镜下观察。 二、菠菜叶手撕片观察 轻轻撕取新鲜嫩菠菜叶的表皮，展平置于载玻片上，滴加1~2滴0.35mol/L NaCl溶液，加盖片后置显微镜下观察。 (1)在普通光镜下观察。 (2)在荧光显微镜下观察其直接荧光。 (3)观察其间接荧光：向所制手撕片上滴加1~2滴0.01%吖啶橙染液，染色1min，洗去余液, 加盖片后即可在荧光显微镜下观察其间接荧光

叶绿体分离与荧光染色观察

叶绿体分离与荧光染色观察

日 姓名系年级组别同组者 科目细胞生物学实验题目叶绿体分离与荧光染色观察学号 叶绿体分离与荧光染色观察 一．实验目的 1．通过植物细胞叶绿体的分离与纯化，了解细胞器分离与纯化的原理和方法。 2．熟悉荧光显微镜的使用方法，观察叶绿体的自发荧光和次生荧光。 二．实验原理 1．叶绿体分离的原理 匀浆破碎细胞，利用差速离心方法分离等渗介质中的悬浮颗粒，收集类叶绿体大小的颗粒，得到叶绿体。 差速离心：颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的粘度有关。在一给定的离心场中，同一

日 姓名系年级组别同组者 科目细胞生物学实验题目叶绿体分离与荧光染色观察学号 时间内，密度和颗粒大小不同的颗粒其沉降速率不同。 依次增加离心力和离心时间，就能使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。 叶绿体的分离应在等渗溶液（0.35mol/L的氯化钠或0.4mol/L的蔗糖溶液）中进行，以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。分离过程最好在0-5℃的条件下进行，如果在室温下，要迅速分离和观察。 2．差速离心 特点：介质密度均一，速度由高到低，逐级离心；

日 姓名系年级组别同组者 科目细胞生物学实验题目叶绿体分离与荧光染色观察学号 用途：分离大小相差悬殊的细胞和细胞器； 沉降顺序：核----线粒体----溶酶体与过氧化物酶体----内质网与高尔基体---核蛋白体，可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯度离心再行分离纯化。 3．荧光的概念 光致发光：某些物质在照射下，吸收光能进入激发态，当从激发态回到基态时，可以以电磁辐射的形式释放出吸收的光能，这种现象称为“光致发光”。紫外辐射、可见光及红外辐射均可引起光致发光，如磷光与荧光。 荧光：在光致发光中，如果一定波长的短波光（如紫外光）照射某种物质，这种物质吸收光能后进入激发态，并且立即退激发在极短的时间

实验三 叶绿体的分离、提取、观察

实验三叶绿体的分离、提取、观察2011.03.23 班级：姓名：一．试验目的 1．学习使用差速离心方法分离获取叶绿体。 2．理解叶绿体的分离与保存环境。 3．叶绿体的形态观察、测量、叶绿体悬液的荧光现象观察。 二．实验原理 1．叶绿体是植物叶肉细胞内重要的细胞器，是植物光合作用的场所。分离提取得到的活体叶绿体，既能进行光合作用速率测定，也能进行叶绿体色素的分离提取。 2．差速离心法常用于获取细胞中的某一物质，其原理是在一定转速条件下，不同密度大小的物质沉降速度不一样，最终使有密度差异的物质得以分离。 三．实验用具 1．材料与试剂：菠菜叶、0.35mol/L NaCL、95%乙醇、石英砂。 2．器具：离心机、天平、量筒、研钵、玻棒、纱布等 四．实验步骤 1．选用生长健壮的菠菜叶片洗净后去除中脉，然后放入0—4 ℃冰箱或冰瓶中预冷。2．取叶片经滤纸吸干水后，称取5g剪成碎片，于10—15 mL0.35mol/L氯化钠溶液中，置于研钵中，加少量石英砂，手工快速研磨，(注意不要用力过猛，也不必研磨过细)。 3．研磨后将匀浆用2层新纱布过滤，滤液盛于烧杯中。 4．将滤液装入预冷过的离心管，经天平平衡后，以1200r/min离心2min，弃去沉淀。5．上清液再经3000 r/min离心5 min ，倾去上清液，沉淀即为叶绿体。 6．沉淀用2 mL 0.35mol/L氯化钠溶液悬浮，备用。 7．用滴管取少量悬浮液于载玻片上，加盖玻片后，吸水纸吸去多余的溶液，置显微镜下镜检观察。可看到叶绿体为绿色橄榄形，在高倍镜下可看到叶绿体内部含有较深的绿色小颗粒，即基粒。测量叶绿体的长轴和短轴，分别测量5~10个叶绿体，求其平均值。 8．称取叶片5g剪成碎片，加10—15 mL95%乙醇及少量石英砂，于研钵中快速研磨，然后2层纱布过滤，取滤液，将其装入离心管，以2500r/min离心3min，收集上清液于试管中。9．叶绿体荧光现象的观察：用强的柱状光源照射盛装叶绿素提取液的试管，然后顺着光源方向观察提取液颜色，并和对着光管观察是的情况进行比较。 五．实验结论与思考 1．两次离心的沉淀物颜色有什么不同？过滤的滤渣和第一次离心弃去的沉淀有那些主要成分？ 2．0.35mol/L NaCL溶液的作用是什么？能否将其用蒸馏水代替？ 3．实验用品冷冻以及实验操作在冰浴中进行的目的是什么？ 离心机使用注意事项： （1）离心管必须等量、对称放入套管中，防止机身振动，若只有一支样品管另外一支要用等质量的水代替。 （2）启动离心机时，应盖上离心机顶盖后，方可慢慢启动。 （3）电动离心机如有噪音或机身振动时，应立即切断电源，即时排除故障。 （4）分离结束后，先关闭离心机，在离心机停止转动后，方可打开离心机盖，取出样品，不可用外力强制其停止运动。 背景知识： 组织细胞的破碎方法很多，有破碎技术中细胞破碎法包括机械法（研磨法、匀浆法、胶体磨法）和非机械法（超声波法、有机溶法、溶胀法、酶解法）。除了某些细胞外的多肽

叶绿体的分离、纯化及荧光观察

科目细胞生物学实验姓名*** 系年级2011级生物基地学号***日期2013.05.16 同组者*** 叶绿体的分离、纯化及荧光观察 【实验目的】 1.通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法。 2.观察叶绿体的自发荧光和次生荧光，并熟悉荧光显微镜的使用方法。 【实验原理】 将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的粘度有关。通过控制离心力和离心时间等因素，不同的细胞器可以通过阶梯离心的方式得到分离。在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速度不同。依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部．分批收集即可获得各种亚细胞组分。 叶绿体是植物细胞中较大的一种细胞器，利用低速离心即可分离集中进行各种研究。叶绿体的分离应在等渗溶液(0.35mol/L氯化钠或0.4mol/L蔗糖溶液)中进行，以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。将匀浆液在1000r/min的条件下离心2min，以去除其中的组织残渣和一些未被破碎的完整细胞。然后，3000r/min 的条件下离心5min，即可获得沉淀的叶绿体(混有部分细胞核)。分离过程最好在0—5℃的条件下进行：如果在室温下，要迅速分离和观察。 荧光显微术是利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行观察的一种技术。某些物质在—定短波长的光(如紫外光)的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光(如可见光)，这种光就称为荧光．若停止供能荧光现象立即停止。有些生物体内的物质受激发光照射后直接发出荧光，称为自发荧光(或直接荧光)，如叶绿素的火红色荧光和水质素的黄色荧光等。有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光，这种荧光称为次生荧光(或间接荧光)，如叶绿体吸附吖啶橙后可发桔红色荧光。 叶绿素吸收的光能主要用于光合作用。多余的能量可能以热的形式散发，也可能以激发光的形式散发。这种激发光就称为叶绿素荧光。叶绿素荧光检测技术作为一种强大的工具，广泛应用于生态学和植物生理学研究。 利用荧光显微镜对可发荧光物质进行检测时，将受到许多因素的影响，如温度、光、淬灭剂等。因此在荧光观察时应抓紧时间，有必要时立即拍照。另外，

叶绿体的分离与荧光观察

叶绿体的分离及荧光观察 【实验目的】 1.学习使用差速离心法获取叶绿体 2.通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法。 3.观察叶绿体的自发荧光和次生荧光，并熟悉荧光显微镜的使用方法。 【实验原理】 1.高等植物中叶绿体象双凸或平凸透镜，长径5—10um，短径2-4um，厚2-3um。 高等植物的叶肉细胞一般含50-200个叶绿体，可占细胞质的40%。、 叶绿体的数目因物种细胞类型，生态坏境，生理状态而有所不同。在藻类中叶绿体形状多样，有网状，带状，裂片状和星形等等，而且体积巨大，可达100um. 叶绿体由叶绿体外被，类囊体和基质3部分组成。 叶绿体含有3种不同的膜：外膜，膜，类囊体膜和三种彼此分开的腔：膜间隙，基质和类囊体腔。 2.匀浆破碎细胞，利用差速离心方法分离等渗介质中的悬浮颗粒。收集类叶绿体大小的颗 粒，得到叶绿体。 差速离心法：颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的粘度有关。在一给定的离心场中，同一时间，密度和大小不同的颗粒其沉降速度不同。 依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部．分批收集即可获得各种亚细胞组分。 叶绿体的分离应在等渗溶液(0.35mol/L氯化钠或0.4mol/L蔗糖溶液)中进行，以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。 分离过程最好在0—5℃的条件下进行：如果在室温下，要迅速分离和观察。 3.差速离心法 特点：介质密度均一；速度由低向高，逐级离心 用途：分离大小相差悬殊的细胞核细胞器 沉降顺序：核——叶绿体，线粒体——溶酶体与过氧化物体——质网与高尔基体——核蛋白体 可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯度离心再行分离纯化。 【实验材料】 1. 试剂：0.35mol/L氯化钠溶液，0.01％吖啶橙。 2. 器具：粗天平、组织捣碎机、普通离心机、普通光学显微镜、荧光显微镜、500ml 烧 杯、量筒、滴管、10ml刻度离心管、纱布若干，试管架、无荧光载玻片和盖玻片。 3. 材料：新鲜菠菜。 【实验步骤】 1.选取新鲜嫩滤菠菜叶，去除叶梗及粗脉，洗净擦干，称30g于150ml0.35mol/L NaCI溶液中； 2.将叶和液同装入组织捣碎机中，匀浆3-5min，转速5000r/min； 3.将匀浆液用6层纱布过滤到500ml烧杯中；

叶绿体的分离、纯化及荧光观察实验报告

叶绿体的分离、纯化及荧光观察 实验目的：1、通过植物细胞叶绿体的分离与纯化，了解细胞器分离与纯化的原理和方法 2、熟悉荧光显微镜的使用方法，观察叶绿体的自发荧光和间接荧光实验原理：差速离心法用于分离大小不同的物体。在差速离心中细胞器沉降的顺序为：细胞核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网与高尔基体、 醉后为核糖核蛋白复合体。 密度梯度离心法是用一定的介质在离心管内形成连续的密度梯度，将 细胞悬浮液或匀浆置于介质的顶部，通过离心力的作用使细胞或细胞 器分层、分离，最后不同密度的细胞或细胞器位于与自身密度相同的 沉降区带中。 叶绿体是一种比较大的细胞器，利用差速离心即可分离收集，然后用 密度梯度离心纯化，便可用于各种研究。 实验用品：新鲜菠菜、提取缓冲液、蔗糖溶液、0.01%吖啶橙、离心机、电子天平、荧光显微镜、剪刀、研钵、移液管、漏斗、滴管、10ml离心管实验步骤：1、选取新鲜嫩绿菠菜叶，去叶梗及粗脉，洗净擦干，称30克放于150ml 0.35M.Nacl溶液中 2、将液、叶同装入组织捣碎机中，匀浆3-5分钟，转速5000r/min 3、将匀浆用纱布（6层）过滤于500ml烧杯中 4、取滤液4ml在1000r/min下离心2min 5、取上层清液在3000r/min下离心5min（沉淀为叶绿体和细胞核混 合物） 6、将沉淀用2-3mlMnacl液悬浮 7、取一滴悬液滴片，加盖玻片后显微镜下观察 8、另取一滴悬液滴片，再滴加一滴0.01%吖啶橙染料，混匀，盖上 盖玻片，在荧光显微镜下观察 实验结果：普通显微镜下，叶绿体呈橄榄形，绿色，高倍镜下可看到基粒（深绿色小颗粒）。荧光显微镜下，叶绿体自发荧光为“火红色”，次生荧光 为“橘红色” 分析与讨论：1、捣碎叶片式时时间不宜过长，否则会破坏叶绿体 2、用荧光显微镜找到物象后，要先拍照后观察，因为荧光会逐渐 变弱

叶绿体的分离与荧光观察实验报告

山东大学实验报告 姓名：徐静班级：10级生命基地学号：201000140121 科目：细胞实验题目：叶绿体的分离与荧光观察同组者：张姗田娜王安琪 一．实验目的 1、通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法。 2、观察叶绿体的自发荧光和次生荧光，并熟悉荧光显微镜的使用方法。二．实验原理 叶绿体是植物细胞所特有的能量转换细胞器，光合作用就是在叶绿体中进行的。由于具有这一重要功能，所以它一直是细胞生物学、遗传学和分子生物学的重要研究对象。叶绿体是植物细胞中较大的一种细胞器，利用低速离心即可分离集中进行各种研究。 叶肉细胞中的叶绿体内含叶绿素，使植物呈现绿色。叶绿体是细胞内扁平的椭球形或球形的三个双层膜细胞器之一，叶绿体内基粒是光合作用的场所。高等植物（如葫芦藓）的叶绿体呈椭球状，在不同的光照条件下，叶绿体可以运动，改变椭球体的方向，这样既能接受较多的光照，又不至于被强光灼伤。在弱光下，叶绿体以其椭球体的正面朝向光源；在强光下，叶绿体以其椭球体的侧面朝向光源。因此，在不同光照条件下采集的葫芦藓,观察到其小叶内叶绿体的形状不完全一样。 将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的粘度有关。在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速率不同。依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。沉降顺序为：细胞核线粒体溶酶体与过氧化氢酶体内质网与高尔基体核蛋白体。 叶绿体的分离应在等渗溶液(0.35 mol／L氯化钠或0.4 mol／L蔗糖溶液)中进行．以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。将匀浆液在1000 r／min的条件下离心2min，以去除其中的组织残渣和一些未被破碎的完整细胞。然后，在3000 r／min的条件下离心5min，即可获得沉淀的叶绿体（混有部分细胞核）。分离过程最好在0～5℃的条件下进行；如果在室温下，要迅速分离和观察。 荧光显微术是利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行观测的一种技术。某些物质在一定短波长的光(如紫外光)的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光(如可见

叶绿体分离和荧光观察

叶绿体的分离及荧光观察 XXX,YYY,ZZZ 一、实验目的： 1通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法 2观察叶绿体的自发荧光和次生荧光，并熟悉荧光显微镜的使用方法 二、实验原理： 将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。一个颗粒在离心场中的沉降速度取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的黏度有关。在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速率不同。以此增加离心力和离心时间，就能使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。 叶绿体分离应在等渗溶液中进行，以免渗透压改变使叶绿体损伤。将匀浆在1000r/min 的条件下离心2分钟，以除去其中的组织残渣和未被破碎的完整细胞。然后，在3000r/min 的条件下离心5min，即可获得沉淀的叶绿体。分离过程最好在0~5℃的条件下进行；如果在室温下，要迅速分离和观察。 利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行检测时，受到许多因素的影响，如温度、光、淬灭剂等。因此在荧光观察时应抓紧时间，有必要时立即拍照，；另外，在制作荧光显微镜标本时最好使用无荧光载玻片、盖玻片和无荧光油。 三、实验用品： 1、材料：新鲜菠菜 2、试剂：0.35mol/L氯化钠溶液、0.01％吖啶橙。 3、器材：离心机、组织捣碎机、粗天平、荧光显微镜、盖玻片、载玻片、烧杯等 四、实验步骤： 1、叶绿体的分离与观察： （1）取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除叶梗，称30g于150mL0.35mol/L NaCl溶液中，装入组织捣碎机。 （2）利用组织捣碎机低速（5000r/min）匀浆3~5分钟。 （3）将匀浆用六层纱布过滤于500mL烧杯中。 （4）取滤液4ml在1000r/min下离心2分钟。弃去沉淀。 （5）将上清液在3000r/min下离心5min。弃去上清液，沉淀即为叶绿体（混有部分细胞核）。 （6）将沉淀用0.35mol/L氯化钠溶液悬浮。 （7）取滤液制片，分别在普通光景和荧光显微镜下直接观察，再用吖啶橙染色，在荧光显微镜下观察。 2、菠菜叶手切片观察 用剃须刀片将新鲜的菠菜叶切出一斜面至于载玻片上，滴加1~2滴氯化钠溶液，加盖玻片后轻压，置显微镜下观察：在普通光镜下观察；在荧光显微镜下直接荧光观察； 用吖啶橙染色1分钟，在荧光显微镜下观察其间接荧光。 实际中，采用手撕片。将手撕成的薄片铺在载玻片上，滴加0.35mol/L NaCl溶液。 盖上盖玻片，制成片。先在普通光镜下观察；再在荧光显微镜下直接荧光观察；最后用吖啶橙染色1分钟，在荧光显微镜下观察其间接荧光。

菠菜叶绿体的分离及荧光观察

菠菜叶绿体的分离及荧光观察 实验目的： 1.学习荧光显微镜的基本原理。 2.普通光镜下观察植物叶片中的叶绿体形态特征，并利用荧光显微镜观察叶绿 体的自发荧光。 3.吖啶橙染色后观察叶绿体及核碎片中的DNA。 实验原理： 荧光显微镜的激发滤片能使标本产生的特定波长的光通过，阻止对激发荧光无关的光。阻挡滤片可以阻挡掉没有别标本吸收的激发光，有选择地透过荧光。有些生物体内的物质受激发光照射后可直接发出荧光，称为自发荧光(或直接荧光)，如叶绿素的火红色荧光和木质素的黄色荧光等。有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光，这种荧光称为次生荧光(或间接荧光)，如叶绿体吸附吖啶橙后可发桔红色荧光。 将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的粘度有关。在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速率不同。依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。沉降顺序为：细胞核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体溶酶体、内质网与高尔基体、核蛋白体。叶绿体的分离应在等渗溶液(0.35 mol／L氯化钠或0.4 mol ／L蔗糖溶液)中进行．以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。将匀浆液在1000 r ／min的条件下离心2min，以去除其中的组织残渣和一些未被破碎的完整细胞。然后，在3000 r／min的条件下离心5min，即可获得沉淀的叶绿体（混有部分细胞核）。分离过程最好在0～5℃的条件下进行；如果在室温下，要迅速分离和观察。 实验步骤： 1.选取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除叶梗及粗脉，称30g于150ml0.35mol ／L NaCI溶液中，装入组织捣碎机。 2.利用组织捣碎机低速(5000r／min)匀浆3~5min。 3.将匀浆用6层纱布过滤于500ml烧杯中。 4.取滤液4ml在1000r／min下离心2min。弃去沉淀。 5.将上清液在3000r／min下离心5min，弃去上清液，沉淀即为叶绿体(混有部 分细胞核)。 6.将沉淀用0.35mol／L NaCl溶液悬浮。 7.取叶绿体悬液一滴滴于载片上，加盖片后即可在普通光镜和荧光显微镜下观 察：①在普通光镜下观察；②在荧光显微镜下观察；③取叶绿体悬液一滴滴在无荧光载片上，再滴加一滴0．01％吖啶橙荧光染料，在荧光显微镜下观察。 8.在叶片反面沿叶脉撕一片透明薄膜，滴一滴生理盐水，观察叶片表面的气孔。实验结果：