毒理学研究中的体外细胞毒性评价_刘涛

第26卷 第3期2014年3月V ol. 26, No. 3Mar., 2014

生命科学

Chinese Bulletin of Life Sciences

文章编号：1004-0374(2014)03-0319-06

DOI: 10.13376/j.cbls/2014047

收稿日期：2013-07-11；修回日期：2013-08-11

基金项目：北京市教委科技发展计划重点项目(KZ2012-11417041)

*通信作者：E-mail: xiaohong@https://www.wendangku.net/doc/63576247.html,

毒理学研究中的体外细胞毒性评价

刘　涛1，郭　辰2，赵晓红2*

(1 首都师范大学生命科学学院，北京 100048；2 北京联合大学功能食品研究院，北京 100191)

摘　要： 体外细胞毒性评价作为传统动物模型毒性评价的替代方法正在得到越来越多的研究和应用，而其向高通量阶段的迈进则为新毒物和新药物的检测与目的物的筛选提供了更加快捷、高效的手段。将对体外细胞毒性评价常用细胞类型、体外细胞毒性评价的指标，及其检测技术方法的研究现状、进展和存在问题进行阐述，希望能为相关的研究提供一定的参考。关键词：毒理学；体外试验；细胞毒性评价；高通量筛选

中图分类号：Q256；R99 文献标志码：A

In vitro cytotoxicity evaluation in toxicology

LIU Tao 1, GUO Chen 2, ZHAO Xiao-Hong 2*

(1 School of Life Science, Capital Normal University, Beijing 100048, China; 2 Research Institute for Science and Technology of Functional Foods, Beijing Union University, Beijing 100191, China)

Abstract: In vitro cytotoxicity evaluation, as an alternative of traditional toxicity evaluation using animal models, has been widely studied and applied. The development of cell-based high-throughput detecting and screening assays will provide fast and efficient means for detecting new toxic substances and drugs and screening target ingredients. The current research status, scientific progress, and existing problems of commonly used cell types, different test indexes and methods for in vitro cytotoxicity assessments are reviewed, which will provide some reference for related research.

Key words: toxicology; in vitro assay; cytotoxicity evaluation; high-throughput screening

毒性评价的传统方法主要是动物体内实验，通过解剖检查、称量重量、计算脏器指数、血液生化学检查及病理形态学检查等来发现受试物的器官毒性，即利用啮齿类动物和非啮齿类动物进行不同时间段的生物测定。虽然这种方法在评估化学物对人类潜在危害的实际应用中发挥了重要的作用，但随着科学技术的发展，其局限性也逐渐显露出来。细胞试验正是在这一基础上发展起来的。近年来，体外细胞毒性评价由于其周期短、成本低和作用机制易于探明等优势得到快速的发展。目前在体外试验很难监控全身生理效应的前提下，大多数试验都是测定细胞水平的效应，即体外细胞毒性。在限定条件下，可根据药物代谢动力学模型将体外细胞毒性

检测的结果外推并应用到体内研究中[1]

。相对于复

杂的体内反应，所有体外细胞毒性试验都是简化了

的监测事件，但由于其经济、快速、易于量化和可重复性好，且符合替代(replacement )、减少(reduction )和优化(refinement )，即3R 的原则[2]，它不仅提高了毒理学检测的效率，减少了动物的使用，而且将会使基于人类细胞或细胞系的体外毒理学检测途径的定量自动化高通量检测与筛选得到更广泛

的应用[1]。

随着社会科学技术的发展和人类需求的不断扩大，新的药品、化学佐剂、食品添加剂、化工原料以及环境污染物等化学物不断地被发现和制造出来，并且要求快速得到实际的检测和应用，以满足

? 技术与应用 ?

生命科学第26卷320

人类的需求[3]。简单的检测评估与筛选手段已不能满足这一需求，这就对检测评估技术和筛选方法提出新的挑战。而融合多种新技术和新方法并应用简便快速的体外试验对大量化学物进行检测与筛选的高通量体外细胞毒性评价，恰好符合这一要求，并且近年来高通量体外细胞毒性评价的快速发展使问题正在得到逐步解决。目前，高通量细胞毒性评价已成为毒理学和药理学等领域的研究热点，并且在理论研究和实际应用中都发挥着重要的作用。因此，本文对细胞毒性评价相关方面的发展及其最新的研究现状进行介绍，希望能对相关领域的研究提供一定的参考信息。

1　体外细胞毒性评价常用细胞类型

体外细胞毒性评价所用的细胞根据受试物的不同而不同，但其基本原则是一致的，即能够尽量精确地反映毒物毒性、易于培养、连续操作性强等。在体外细胞毒性评价中，受试物多与高等生物，尤其是与人密切相关。因此，体外细胞毒性评价常用的细胞主要为直接来自人体组织的细胞，或与人类亲缘关系较近的模式生物的细胞，常用的细胞株/系类型见表1，但在环境毒物体外细胞毒性评价中，也常用到一些低等生物细胞，如酵母[4]、单细胞藻类[5]等。

来源于正常组织的细胞是体外细胞毒性评价中常用的细胞类型，其功能特点和结构特性使体外细胞毒性评价更具针对性和明确性，更易于探明毒物引起细胞损伤的作用机制。Shoham等[6]利用来自金色仓鼠胚胎的正常细胞测定刀豆蛋白A (concan-avalin A, ConA)的细胞毒性，并将其与转化后的细胞相比较，以研究ConA对体内肿瘤产生的抑制作用。利用正常细胞可检测药物对生物体特定器官的损伤作用。Jo等[7]利用大鼠、小鼠、恒河猴和人的肝细胞评估肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand, TRAIL)诱导正常细胞凋亡的敏感性，结果显示TRAIL可诱导人正常肝细胞的凋亡，经TRAIL处理10 h，细胞凋亡和死亡比率达到60%以上，且出现明显的细胞质收缩、caspases活化和DNA片段化等典型的凋亡特征，而其他几个物种的肝细胞却没有出现以上现象。这些结果表明，细胞对TRAIL的敏感性存在种间差异，若将TRAIL应用于人类癌症治疗，可能会出现肝毒性。来源于肿瘤组织的细胞是体外细胞毒性评价中另一种常用的细胞类型，它们可在体外培养条件下无限地增殖传代，这使其在体外细胞毒性评价中得到广泛的应用。Davoren等[8]利用A549细胞评估单壁碳纳米管(single walled carbon nanotubes, SWCNT)对肺细胞的细胞毒性，从而评价其对人体的毒性，结果显示SWCNT 对A549细胞的急性毒性非常低。Nakagawa等[9]

表1 体外细胞毒性评价中常用细胞株/系类型

来源细胞株/系形态学起源种属年龄倍性

来源于正常组织的有限细胞系IMR-90 成纤维细胞肺人胚胎期二倍体

MRC-9 成纤维细胞肺人胚胎期二倍体

WI-38 成纤维细胞肺人胚胎期二倍体

MRC-5 成纤维细胞肺人胚胎期二倍体来源于正常组织的连续细胞系MDCK 上皮样细胞肾家犬成年非整倍体

L929 成纤维细胞皮下/脂肪小鼠成年非整倍体

3T3-L1 成纤维细胞胚胎Swiss小鼠胚胎期非整倍体

CHO-K1 成纤维细胞卵巢中国仓鼠成年二倍体

COS 成纤维细胞肾非洲绿猴成年非整倍体

Vero 上皮样细胞肾非洲绿猴成年非整倍体

H9c2 成肌细胞心脏大鼠胚胎期二倍体来源于肿瘤组织的连续细胞系A549 上皮细胞肺人成年非整倍体

Caco-2 上皮细胞结肠人成年非整倍体

Hela 上皮细胞子宫颈人成年非整倍体

HepG2 上皮样细胞肝细胞瘤人成年非整倍体

HL-60 悬浮细胞髓系白血病人成年非整倍体

MCF-7 上皮细胞乳腺癌胸膜人成年非整倍体

刘　涛，等：毒理学研究中的体外细胞毒性评价

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利用人乳腺癌MCF-7细胞检测二苯甲酮在细胞内代谢及其代谢物对细胞的影响，结果表明二苯甲酮可在细胞内代谢，并且其代谢物具有雌激素作用，可刺激MCF-7细胞的增殖。此外，体外细胞毒性评价中也常用到其他类型的细胞，如具有回复突变性状的中国仓鼠肺细胞株V79被用于检测药物遗传毒性，以评价其安全性；梨形四膜虫(Tetrahymena pyriformis)被用于环境遗传毒理学，以研究环境诱变物等[10]。

2　体外细胞毒性评价的指标及其检测技术方法体外细胞毒性评价指标一般是基于细胞的数量、形态、结构及生理特征来评价细胞毒性变化特征的指标，并针对不同的指标建立了不同的检测方法。2.1　细胞水平

2.1.1　细胞生长抑制

细胞经受试物作用后，会出现因毒性作用而生长抑制或死亡，或者因激活作用而增殖速率加快的现象，这直接反映在细胞数量的变化上。检测细胞数量，计算变化比率即可得出受试物对细胞的效应。细胞数量可通过仪器检测绝对数量，计算细胞的增殖或死亡率；也可通过化学试剂检测细胞活性，计算细胞的激活或抑制率。活细胞计数仪可对受试细胞群的活细胞进行计数，但应用较多的是化学比色法，如MTT法[11]及类似原理的WST-1法[12]、CCK8 法[13]、MTS法[14]和XTT法[15]等，利用细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶将检测试剂内的唑盐还原为甲臜(formazan)，甲臜的生成量与琥珀酸脱氢酶的活性呈正相关，琥珀酸脱氢酶活性又反映了细胞活性，因此，对甲臜溶液进行比色测定即可求得受试物对细胞的激活或抑制率；结晶紫染色法[12]和中性红染色法[12]等都是利用活细胞特定的生理条件(局部酸性)以对其特定的部位(细胞核和溶酶体)进行染色，从而达到对活细胞进行计数的目的，它们都可测得受试细胞中活细胞的相对数量；而ATP检测法[11]和磺酰罗丹明B(sulforhodamine B, SRB)检测法[16]对细胞相对数量的测定则更加灵敏且可重复性强。在这些细胞增殖测定方法的基础上，就可以建立细胞增殖筛选模型，从而可从正或负相关性评价受试物对细胞的效应。Wodnicka等[17]基于对细胞整体状况变化的检测，建立了一种新型的荧光-氧生物传感器技术平台，该技术适用于许多应用领域的药物开发和检测，特别是基于细胞的检测，如可用于检测细胞的活力、增殖和死亡，也适合于研究细胞在增殖或毒性刺激时的动力学反应。

2.1.2　细胞膜完整性

细胞经毒物作用后，膜结构会受到破坏，出现细胞膜完整性受损或渗漏现象。这一指标可通过外源物的渗入或细胞内源物的渗出来检测。台盼蓝拒染率检测[11,18]利用台盼蓝可透过受损细胞膜而无法透过完整细胞膜的特点，对膜受损细胞进行染色，从而通过镜检计算出细胞膜受损的比率。乳酸脱氢酶漏出率检测[19]是利用胞浆乳酸脱氢酶可通过受损细胞膜漏出的特点，通过检测细胞培养基中乳酸脱氢酶的活性来评价细胞膜受损程度。而通过特定的荧光物质与细胞膜或细胞内分子结合的荧光检测法则具有更高的敏感性和稳定性。

2.1.3　细胞代谢活性

细胞代谢活性检测可从细胞的能量代谢、氧化还原状态和生物大分子合成状态三个方面进行。细胞能量代谢最直接的体现就是ATP的生成与消耗速度，通过特异性试剂或专门的ATP检测试剂盒检测细胞内ATP的状态和含量，即可得知细胞的能量代谢状态[20]。细胞氧化还原状态多以细胞内还原性物质或氧化产物的多少来衡量，如细胞内还原型谷胱甘肽(GSH)含量[21]，脂质过氧化产物，如4-羟基壬烯酸和丙二醛的生成量等。此外，细胞色素P450 (cytochrome P450, CYP450)酶系对细胞内的脂质与甾体激素的代谢中间产物以及药物与其他毒性化学物等非生物物质的代谢起着重要作用，是药物代谢与生物激活作用的主要酶类，约占到各种代谢反应总数的75%，是毒理学研究中毒物毒性的生物标志物[22]。通过乙氧基异酚噁唑酮反应、Western blotting、酶联免疫分析(ELISA)、直接免疫荧光反应、单克隆抗体技术等方法研究细胞内CYP450，从而可对受试物在细胞内的代谢进行评价。

2.2　亚细胞水平

细胞经毒物作用受损或死亡时，其内部则表现为细胞器的损伤或病变，如能量中心——线粒体的损伤，溶酶体、内质网等细胞器的损伤。线粒体的损伤常表现为膜电位的改变，这一改变可通过JC-1[23]、四甲基罗丹明甲酯和罗丹明123[24]等荧光染料进行检测。这些荧光染料能根据线粒体膜电位的不同而发出不同的荧光，通过荧光成像技术分析，就可评估线粒体的受损程度。中性红可经胞膜内吞而进入细胞，在溶酶体的酸性环境中会出现变色反应，从而可用来检测溶酶体损伤；与其他检测方法

生命科学第26卷322

联合应用，可用于区分不同的细胞毒性和细胞器损伤[25]。荧光成像技术(fluorescence imaging techno-logy)在细胞和亚细胞水平的检测和筛选中应用日益广泛，它利用固定细胞或细胞器与荧光标记的抗体、配体或核酸探针的结合进行检测，或利用活细胞与荧光指示剂和生物传感器相结合的方法进行检测[26]。该技术的出现促进了高内涵筛选(high content scree-ning, HCS)的发展[27]。然而，HCS在诸如检测敏感性和荧光探针对细胞活性的影响等方面仍有许多有待解决的技术难题。因此，在开展HCS时需谨慎选择荧光探针，这也是HCS成功的关键。随着研究的不断深入，目前已经有多种新型荧光蛋白被用于许多受试物的HCS中[28]。

2.3　离子通道水平

近年来，离子通道已经成为药物发现和筛选中备受关注的研究目标，在各种不同疾病，尤其是在中枢神经系统和心血管系统疾病的治疗中发挥着重要的作用。而且，新化学药物对心脏离子通道活性影响的评估已成为药物研发过程中重要的组成部分，以评估其对心血管系统潜在的毒副作用[29]。近年来，由于离子通道模型的细胞毒性评价具有灵敏、简便，并可反映活细胞内离子通道活性的特点，离子通道功能性离子的通量检测(flux assays)作为有效的药物筛选手段正在受到越来越多的关注。在优化的通量检测中，离子通道活性的改变更容易产生可检测的放射性或非放射性离子流变化[30]。

2.4　受体水平

随着对受体研究的深入，许多高灵敏度检测技术被应用于受体药物的筛选，这使得基于受体的药物细胞毒性评价能够高效、快速地进行，从而推动了药物筛选的发展。蛋白质家族结构信息的快速增加，大众化可访问网络信息的增长，以及如何有效应用筛选技术等都为这些新技术的发展做出了贡献。然而，更好地理解蛋白质的流动性(mobility)却是进一步改进检测与筛选技术的关键[31]。Schapira 等[32]对甲状腺激素受体(thyroid hormone receptor, TR)拮抗剂的结构多样性的研究表明，基于受体的细胞毒性评价能用于检测和筛选不同的符合TR拮抗作用结构规则的化学物质，同时还表明基于受体的筛选与并行合成相耦合能显著加速先导物的优化过程。但是，基于受体的细胞毒性评价也有其自身的缺陷。与兼具结构-活性和结构-运输关系的传统筛选相比，虽然它能够合理且高效地对数千种化合物进行筛选，但这些被筛选出的目标物与目标受体之间仅具有结构-活性的关系。若这样的药物用于治疗，由于其膜通透性较差，就会被体内的血-脑屏障阻滞于脑毛细血管内皮细胞外，从而失去意义。2.5　基因水平

基因水平的细胞毒性评价主要是基于报告基因技术对受试物进行的检测和筛选。报告基因(reporter gene)筛选模型是利用转基因技术将目的基因与报告基因嵌合后导入受体细胞，然后检测受试物作用于这些细胞时基因的表达状况，以评价受试物对细胞的影响并筛选出目标物。Durocher等[33]通过研究G蛋白偶联受体(G-protein-coupled receptors, GPCRs)在HEK293-EBNA细胞(即293E)内的表达，建立了一种对与Gαs和Gαq相偶联的GPCRs进行报告基因检测的方法，并可适合于兴奋剂和拮抗剂的细胞毒性评价。Goetz等[34]利用能够表达6×CRE (cAMP response elements)荧光素酶的CHO细胞进行报告基因检测，结果显示被表达的报告基因能对细胞内cAMP水平的改变做出反应，进而证明该细胞系可用于药物筛选以及与Gas受体和Gas偶联的七次跨膜受体相关的药理学分析。Nagy等[35]利用稳定整合了TCDD (2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin)和 AhR (aryl hydrocarbon receptor)响应的增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)报告基因的小鼠肝癌细胞系重组体(H1G1.1c3)，在由155种同源氨基酸和12 090种药物组成的化学品库中进行筛选，仅用不到7 d的时间就筛选出了新型AhR激动剂。而报告基因检测技术(reporter gene detection technology)是在报告基因筛选模型的基础上发展而来的，用于高通量筛选的技术平台。随着新方法的出现，报告基因技术向微型化发展，应用更加高效、简便、快捷，如荧光素酶(luciferase)和β2半乳糖苷酶报告基因系统，无需裂解分离就可直接在微孔板内进行检测。活细胞应用较多的报告基因是GFP 基因，无需其他底物和辅因子即可自发荧光且荧光稳定，即使与其他蛋白嵌合也不影响其自身荧光特性。GFP及其变体作为报告基因可用于细胞水平的蛋白质定位和转位、蛋白质的降解、蛋白质-蛋白质的相互作用及细胞周期的实时动态研究，并可检测目的基因表达的变化。常用的报告基因还有β2内酰胺酶，通过对荧光能量共振转移(FRET)底物CCF4/AM的水解，可用于定量检测，或作为核因子调节指示蛋白用于受体功能的筛选[36]。

刘　涛，等：毒理学研究中的体外细胞毒性评价

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3　结论与展望

细胞毒性评价是从细胞类型的选择，到评价指标的确定，进而选择适合的检测方法的过程。在这一过程中，根据受试物的不同选择适合类型的细胞，如检测大气颗粒物毒性常选择肺组织相关的细胞；根据检测毒性的不同选择不同的评价指标，如检测线粒体毒性常选择亚细胞水平的指标；不同的指标又有不同的检测方法，如线粒体膜电位的改变可采用流式细胞仪检测[37]，这一过程具有周期短、成本低和作用机制易于探明等优点。细胞培养所需器材和原料的成本与动物养殖相比较低廉，且不像动物养殖那样需要大量的人力投入，相对地易于操作和管理，节省人力物力。而且，细胞的结构和代谢途径已相对清楚，通过现有检测技术就可探知药物在细胞分子水平上的作用机制，如所参与的信号通路[38]等。虽然它有诸多优点，但也有其不足之处。由于细胞毒性评价只是在体外单细胞水平上做出的毒性评估，而受试动物相对于单个细胞要复杂得多，其代谢、免疫等系统相互联系，即使单一毒物的测试也面临不可预测的干扰。因此，没有生物整体水平上代谢动力学的验证，就不能准确地推得体内环境下经各系统作用后的整体毒性。

高通量细胞毒性评价是在综合传统方法和新技术的基础上，实现对受试物毒性的高效快速检测以及对目标物的高通量、有目的的检测与筛选。离子通道模型、受体模型和报告基因模型等筛选模型的建立使细胞毒性评价更具针对性，从而利用不同模型的靶点检测不同种类的目标毒物。针对不同的模型又有不同的检测手段，荧光技术的应用大大提高了细胞毒性评价的效率，增加了检测和筛选的通量。虽然相对于传统方法，高通量细胞毒性评价大大提高了细胞毒性检测和目标物筛选的效率，但其在检测及筛选精度方面仍有需解决的问题，如假阴性和假阳性现象，筛选目标物活性等就是其中常遇到的，而HCS的出现使这些问题得到改善。高通量的细胞毒性评价也需适合类型的细胞，一般要求健康、稳定且丰富的细胞系，而干细胞恰恰具有这些优点，因为其可分化为任何类型的细胞且保持原有基因型，而且其来源不受限制，更重要的是干细胞可以分化形成3D球状体，从而模拟体内模型进行检测[2,39]。若能利用人工技术设计出一种多模型和多靶点的新型细胞，那么它将能够同时对多种受试物进行更加高效快速的多靶点检测与筛选。相信随着新的技术与方法的不断出现，体外细胞毒性评价将会更加高效、快速、成本低廉，检测与筛选的精度更高，操作也会更简便，并且会不断向着微型化、自动化、高效化、低廉化和微量化方向发展。

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医疗器械生物学评价第五部分体外细胞毒性试验

医疗器械生物学评价 第5部分：体外细胞毒性试验 1 范围 GB/T 16886 的本部分阐述了评价医疗器械体外细胞毒性的试验方法。 这些方法规定了下列供试品以直接或通过扩散的方式与培养细胞接触和进行孵育； a）用器械的浸提液，和／或 b）与器械接触。 这些方法是用相应的生物参数测定哺乳动物细胞的体外生物学反应。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过GB/T 16886 的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。 GB/T 16886. 1 医疗器械生物学评价第1部分：评价与试验（GB/T 16886.1-2001,idt ISO 10993- 1:1997）CB/ T 16886. 12-2000 医疗器械生物学评价第12部分：样品制备和参照材料（idt ISO 10993- 12 :1996） 3 术语与定义 GB/ T 16886. 1/ ISO 1993-1中确立的以及下列术语和定义适用于本部分。 3.1 阴性对照材料negative control material 按照本部分试验时不产生细胞毒性反应的材料。 注：阴性对照的目的是验证背景反应，例如高密度聚乙烯1）已作为合成聚合物的阴性对照材料，氧化陶瓷棒则用作牙科材料的阴性对照物。 3.2 阳性对照材料 pos itive control material 按照本部分试验时可重现细胞毒性反应的材料。 注：阳性对照的白目的是验证相应试验系统的反应，例如用有机锡作稳定剂的聚氯乙烯2）已用作固体材料和浸提液的阳性对照，酚的稀释液用于浸提液的阳性对照。 _____________________________________ 1)高密度聚乙烯可从美国药典委员会（Rockvillie, Maryland, USA）和Hatano研究所食品和药品安全中心（Ochiai 729-5 ,Hanagawa.257-Japan）获得。提供这一信息是为本部分的使用者提供方便，但ISO对使用该产品不提供担保。 2)有机锡聚氯乙烯阳性对照材料可从SIMS Portex Ltd,Hythe, Kent,CT21 6JL,UK（产品号码499-300-000）获得。ZDEC和ZDBC 聚氨甲酸乙酯可从Hatano 研究所食品和药品安全中心（Ochiai 729-5 , Hanagawa257-Japan) 获得。提供这一信息是为本部分的使用者提供方便，但ISO 对使用该产品不提供担保。

细胞毒性实验方案

细胞毒性实验设计方案 1.准备材料：DMEM(高糖) 胰酶双抗(青霉素/链霉素）DAPI MTT(5mg/mL) DMSO PBS 4%多聚甲醛指甲油 6孔培养板 96孔培养板超薄载玻片培养瓶(25mL) 一包0.45μm滤膜 灭菌： 50mL，10mL，5mL离心管两种枪头 2.实验方案 本实验所用的材料为载药的通过二硫键桥连透明质酸的夹心二氧化硅 （SiO 2 -SS-HA/DOX），在高谷胱甘肽条件下，二硫键断裂，透明质酸脱离，同时 夹心二氧化硅中药物得以释放。本实验的目的为测定透明质酸修饰的夹心二氧化 硅（SiO 2-SS-HA/DOX）的细胞毒性。实验组为SiO 2 -SS-HA/DOX、SiO 2 -SS-HA、DOX， 空白对照组为纯细胞,分别采用HepG2人肝癌细胞为肿瘤细胞模型和L929成纤维 细胞为正常细胞模型。 采用HepG2人肝癌细胞为肿瘤细胞模型，实验组为SiO 2 -SS-HA/DOX、 SiO 2 -SS-HA、DOX，空白对照组为纯细胞。培养基中含有10% (v/v) FBS和1% (w/v) 双抗(青霉素/链霉素)。配制不同浓度的SiO 2-SS-HA/DOX、SiO 2 、HA、DOX药物载 体培养基溶液。 (1).以HepG2人肝癌细胞为肿瘤细胞模型: 培养基的配置：双抗 1% 血清12% DMEM 87% 具体操作步骤： 细胞的复活： ①将冻存于液氮中的细胞取出，迅速放入37℃温水中，使细胞快速溶解。 ②将悬浮的细胞移至离心管中，加5mL无血清培养基，1000rmp,5min离心去上清，再加5mL有血清培养基，转移至培养瓶中。（每次转移时，将之前的离心管洗涤，并用移液枪来回吸，使液体混合均匀。） ③将培养瓶放入培养箱中培养。 细胞的传代： 将0.25%的胰酶分装至小离心管中，每个管中2mL，冻存于-20℃，每次使用一管，避免反复冻融。 ①将培养瓶从培养箱中取出，盖子旋紧，喷75%的酒精放入超净台。 ②将培养液倒入废液缸，残留培养基用吸管吸干净，操作完成后，培养瓶口

毒理学名词解释

名词解释 1、毒理学（Toxicology）：研究外源性化学物质对生物机体的损害作用的学科（传统定义）。 2、现代毒理学（modern Toxicology ）：研究所有外源因素（如化学、物理和生物因素）对生物系统的损害作用、生物学机制、安全性评价与危险性分析的科学。 1、外源化学物（Xenobiotics）：是在人类生活的外界环境中存在、可能与机体接触并进入机体，在体内呈现一定的生物学作用的化学物质，又称为“外源生物活性物质”。 2、毒性（toxicity）：化学物引起有害作用的固有能力，毒性是一种内在的、不变的性质，取决于物质的化学结构。 3、毒物（poison， toxicant）：在较低的剂量下可导致机体损伤的物质称为毒物。 4、损害作用（adverse effect）：（毒效应）指影响机体行为的生物化学改变，功能紊乱或病理损害，或者降低对外界环境应激的反应能力。 5、靶器官（target organ）：外源化学物直接发挥毒作用的器官。 6、生物学标志（biomarker）：外源化学物通过生物学屏障并进入组织或体液后，对该外源化学物或其生物学后果的测定指标。通常把生物学标志分为暴露标志、效应标志和易感性标志。 7、毒物兴奋效应（Hormesis）：指毒物在低剂量时有刺激作用，而在高剂量时有抑制作用。其基本形式是U型，双相剂量- 反应曲线。 8、半数致死剂量/浓度（median lethal dose or concentration， LD50/LC50 ）：引起半数动物死亡所需的剂量。通过统计处理计算得到，常用以表示急性毒性的大小，最敏感。化学物质的急性毒性越大，其LD50的数值越小。 9、阈值（threshold）：一种物质使机体（人或实验动物）开始发生效应的剂量或浓度，即低于阈值时效应不发生，而达到阈值时效应将发生。 10、急性毒作用带（acute toxic effect zone，Zac）：半数致死剂量与急性阈剂量的比值，表示为：Zac=LD50/Limac。Zac值小，说明化学物质从产生轻微损害到导致急性死亡的剂量范围窄，引起死亡的危险性大；反之，则说明引起死亡的危险性小。 11、慢性毒作用带（chronic toxic effect zone，Zch）：为急性阈剂量与慢性阈剂量的比值，表示为：Zch= Limac /Limch。Zch值大，说明Limac 与Limch 之间的剂量范围大，由极轻微的毒效应到较为明显的中毒表现之间发生发展的过程较为隐匿，易被忽视，故发生慢性中毒的危险性大；反之，则说明发生慢性中毒的危险性小。 12、毒效应（toxic effect）：又称为毒作用，是化学物质对机体所致的不良或有害的生物学改变。毒效应是化学物质或代谢产物在作用部位达到一定数量并停留一定时间，与组织大分子成分互相作用的结果。当改变暴露条件时，毒效应会相应改变。毒性是一种能力，中毒是一种状态，而毒效应是一种表现。 13、毒效应谱（spectrum of toxic effect）：是指机体接触外源化学物后，由于化学物的性质和剂量不同，可引起机体多种变化。 13、量反应（graded response）：属于计量资料，有强度和性质的差别，可用某种测量数值表示。14、质反应（quantal response）：属于计数资料，没有强度的差别，不能以具体的数值表示，而只能以“阴性或阳性”、“有或无”来表示。 15、不确定系数（LIF）：根据所得的有害作用阈值量或最大无有作用剂量提出的安全限值时，为解决由动物资料外推至人的不确定因素及人群毒性资料本身所包含的不确定因素而设置的转换系数。1、生物转运（biotransport）：外源化学物穿越生物膜的过程，且其本身的结构和性质不发生变化。 2、生物转化（biotransformation）：又称代谢转化，是指外源化学物转化为新的衍生物的过程，形成的产物结构与性质均发生了改变。特点：反应的连续性、反应类型的多样性、解毒与致毒的双重性。 3、蓄积（accumulation）：外源化学物以相对较高的浓度富集于某些组织器官的现象，包括物质蓄积和功能蓄积。 4、肠肝循环（enterohepati circulation）：一部分如葡萄糖醛酸结合物可为肠道菌群水解，脂溶性增强，被肠道重吸收，返回肝脏，形成肠肝循环。毒理学意义：排泄速度减慢、延长生物半减期、毒作用持续时间延长。 5、代谢活化（metabolic activation）：又称生物活化（bioactivation），一些外源化学物经过生物转化后，毒性非但没有减弱，反而明显增强，甚至产生致突变、致癌和致畸作用，这种现象称为代谢活化。 6、脂水分配系数：脂水分配系数=脂相中溶解度/水相中溶解度，当一种物质在脂相和水相之间的分配达到平衡时，其在脂相和水相中溶解度的比值。8：血气分配系数：气态物质在血液中的浓度与在肺泡气中的浓度之比为 7、首过消除：经胃肠道吸收的外源化学物通过门 静脉系统首先到达肝脏，进行生物转化后，再进入 体循环，这种现象称---- 1、终毒物（ultimate toxicant）：指与直接内源 靶分子反应或引起机体生物学微环境的改变、导 致机体结构和功能紊乱并表现毒物毒性的物质。 2、自由基（free radicals）：是在其外层轨道中 含有一个或多个不成对电子的分子或分子片段。特 点：①化学性质十分活泼②反应性极高，半减期 极短，作用半径短。 3、增毒（toxication）或代谢活化：外源化学物 在体内经生物转化为终毒物的过程称为增毒。 4、解毒（detoxication）：消除终毒物或阻止终毒 物生成的生物转化过程；在某些情况下，解毒可能 与中毒竞争同一外源化学物。 1、毒物的联合作用：同时或先后接触两种或两种 以上外源化学物对机体产生的毒性效应。 2、相加作用（addition joint action）：剂量相 加作用指化学物对机体产生的毒性效应等于各个 外源化学物单独对机体所产生效应的算术总和。它 们每一化学物以同样的方式、相同的机制，作用于 相同的靶，仅仅效力不同。 3、独立作用（independent action）：各外源化 学物不相互影响彼此的毒性效应，作用的模式和作 用的部位可能（但不是必然）不同，各化学物表现 出各自的毒性效应。 4、协同作用（synergistic effect）：外源化学 物对机体所产生的总毒性效应大于各个外源化学 物单独对机体的毒性效应总和，即毒性增强。 5、拮抗作用（antagonistic joint action）：外 源化学物对机体所产生的联合毒性效应低于各个 外源化学物单独毒性效应的总和，即为拮抗作用。 6、加强作用（potentiation joint action）：一 种化学物对某器官或系统并无毒性，但与另一种化 学物同时或先后暴露时使其毒性效应增强。 1、蓄积作用（accumulation）：外源化学物连续 地、反复地进入机体，而且吸收速度或总量超过代 谢转化排出的速度或总量时，化学物质就有可能在 体内逐渐增加并贮留，这种现象称为化学物质的蓄 积作用。 2、物质蓄积（material accumulation）：当实验 动物反复多次接触化学毒物后可以用分析方法在 体内测出物质的原型或其代谢产物时，称为物质蓄 积。 3、损伤蓄积（damage accumulation）：如果在机 体内不能测出其原型或代谢产物，却出现了慢性毒 性作用，称之为损伤蓄积（功能蓄积）。 4、一般毒性：指外源化学物在一定的接触剂量， 一定的接触时间和一定的接触方式下对动物产生 综合效应的能力。 5、急性毒性（acute toxicity）机体一次或24 小时内接触多次一定剂量外源化学物后在短期内 所产生的毒作用及死亡。 1、突变（mutation）：遗传结构本身的变化及引起 的变异称为突变，是一种可遗传的变异，可分为自 发突变（spontaneous mutation）和诱发突变 （induced mutation）。 2、致突变作用或诱变作用（mutagenesis）：外来 因素引起细胞核中的遗传物质发生改变的能力，而 且此种改变可随同细胞分裂过程而传递。 4、基因突变（gene mutation）：基因中DNA序列 的变化，因基因突变限制在一特定的部位，也称为 点突变（point mutation ）。 DNA中发生碱基 对的缺失、增添或改变而引起基因结构的改变。 5、染色体畸变（chromosome aberration）：指染 色体的结构改变，是遗传物质大的改变，一般 可用光学显微镜检查细胞有 丝分裂中期的染色体来发现。 6、S9混合液：经多氯联苯处理后制备的肝匀浆， 再经9000g离心分离所得上清液，加上适当的缓冲 液和辅助因子。主要含有 混合功能氧化酶（MFO），是国内常规应用于体外致 突变试验的代谢活化系统。 7、遗传负荷（genetic load）：指一种物种的群体 中每个个体所携带的可遗传给下一代的有害基因 的平均水平。 1、化学致癌物（chemical carcinogen）：是指具 有化学致癌作用的化学物质。大多数是亲电子活性 产物。 2、化学致癌作用（chemical carcinogenesis）： 是指化学物质引起或诱导正常细胞发生恶性转化 并发展成为肿瘤的过程。 3、直接致癌物（direct carcinogens）：本身直 接具有致癌作用，在体内不需要经过代谢活化即可 致癌。 4、间接致癌物（indirect carcinogens）：本身 并不直接致癌，必须在体内经代谢转化，其所形成 的代谢产物才具致癌作用。 5、终致癌物（ultimate carcinogen）：指不需代 谢活化的直接致癌物和间接致癌物经代谢活化所 形成的具有致癌作用的代谢物的统称。 1、畸形（malformation）：指出生前因素引起发育 生物体的严重的解剖学上形态结构的缺陷（异常）。 2、畸胎（terate）：具有畸形的胚胎或胎仔。 3、致畸性（teratogenicity）和致畸作用 （teratogenic effect）：均指在妊娠期（出生前） 接触外源性理化因素引起后代结构畸形的特性或 作用。（致畸作用所表现的形态结构异常，在出生 后立即可被发现） 4、致畸物或致畸原（t eratogen）：凡在一定剂量 下，能通过母体对胚胎或胎儿正常发育过程造成干 扰，使子代出生后具有畸 形的化学物。 5、胚胎毒性（embryotoxicity）：通常是指外源 性因素造成的孕体着床前后直到器官形成期结束 的所有的毒性。表现为：胚胎 期染毒而出现畸胎、生长迟缓、着床数减少和吸收 胎，也偶有晚死胎。 6、发育毒理学（deve1opmenta1 toxico1ogy）： 研究出生前暴露于环境有害因子导致的异常发育 结局及有关的作用机制、发病 原理、影响因素和毒物动力学等。 7、发育毒性（developmental toxicity）：出生 前后接触有害因素，子代个体发育为成体之前诱发 的任何有害影响。 8、致畸作用敏感期：器官形成期的胚胎对致畸物 最为敏感，一般称为危险期（critical period） 或致畸敏感期。 9、致畸指数：致畸指数=母体LD50/胎体最小致畸 作用剂量。 10、出生缺陷:婴儿出生前已形成的发育障碍。 1、安全性（safety）：即在规定条件下化学物暴露 对人体和人群不引起健康有害作用的实际确定性。 （化学物在规定的使用方式和用量条件下，对人体 健康不产生损害）。 2、安全性评价（safety evaluation）：利用规定 的毒理学程序和方法评价化学物对机体产生有害 效应（损伤、疾病或死亡），并 外推和评价在规定条件下化学物暴露对人体和人 群的健康是否安全。 4、可接受的危险度：是指公众和社会在精神、心 理等各方面均能承受的危险度。 3、危险度：指在具体条件下，某一种因素对机体、 系统或（亚）人群产生有害作用的概率，可分为绝 对危险度和相对危险度。 5、危险度评定（risk assessment）：以损害作用 评定、剂量－反应关系评定和接触评定的各种参数 为依据，对外源化学物对人 群健康的危害程度作出估计。 6、VSD：实际安全剂量，相应于可接受危险度的外 源化学物暴露剂量称为实际安全剂量。 7、管理毒理学（regulatory toxicology)收集， 处理和评价流行病学和实验毒理学数据，以及基 于毒理学针对化学物有害效应保护健康和环境的 决策。 8、基准剂量BMD：依据动物试验剂量-反应关系的 结果，用一定得统计学模型求得的受试物引起一定 比例动物出现阳性反应剂量的95%可信限区间下 限值。 9危险性管理：依据危险性评价的结果，权衡出管 理决策的过程，必要时，选择并实施适当的控制措 施。 简答题 1、简述毒理学的基本功能以及三大领域。 答：⑴毒理学两个基本功能：①检测理化因素产生 的有害作用的性质（危害性鉴定功能）； ②评价在特殊暴露条件下出现毒性的可能性（危险 度评价功能）； ⑵三大研究领域：①描述毒理学②机制毒理学③管 理毒理学 1、生物学标志有哪几类？ 答：暴露生物学标志：测定组织、体液或排泄物中 吸收的外源化学物、其代谢物或与内源性物质的反 应产物，作为吸收剂量或靶剂量的指标，提供关于 暴露于外源化学物的信息。效应生物学标志：机 体中可测出的生理、生化、行为或其它改变的指标。 反映与不同靶剂量的化学物质或其代谢产物有关 的健康有害效应的信息。易感生物学标志：反映 机体先天具有或后天获得的对暴露外源性物质产 生反应能力的指标。 2毒作用分类：速发性或迟发性作用，局部或全身 作用，可逆或不可逆作用，超敏反应，特异质反应 1、简述经胃肠道、呼吸道和皮肤吸收的主要特点 及影响因素。答：⑴经胃肠道吸收：吸收方式主 要通过简单扩散，还可以通过主动转运、滤过、胞 饮或吞噬；吸收部位主要在小肠。影响胃肠道吸 收的因素：①化学物的脂溶性和水溶性；②胃肠道 的酸碱度；③消化道内容物的数量和性质、胃肠的 蠕动和排空速度以及肠道菌丛等也可对吸收产生 一定的影响。⑵经呼吸道吸收：吸收对象气态物 质（气体、蒸汽）气溶胶（烟、雾、粉尘）；吸 收的方式——简单扩散；主要的吸收器官—— 肺；经肺吸收的特点经肺吸收十分迅速，仅次于静 脉注射；不经过肝脏的生物转化，直接进入体循环 而分布全身。影响因素：①主要取决于脂溶性和 浓度；外源化学物在肺泡气中与肺毛细血管血液中 的浓度差；③血气分配系数；④肺通气量和经肺血 流量；⑤气溶胶颗粒的直径大小⑶经皮肤吸收：外 源化学物经表皮分为两个阶段，第一阶段为穿透阶 段，第二阶段为吸收阶段。主要的影响因素：① 化学物溶解性：既有脂溶性，又有水溶性，脂/水 分配系数接近于 1，易被吸收进入血液。光有水溶 性或光有脂溶性吸收困难；②皮肤条件表皮损伤 可促进外源化学物吸收。皮肤潮湿，促进吸收充 血和炎症。 2、简述体内主要的贮存库及分布的毒理学意义。 答：⑴毒物在组织中的贮存：①血浆蛋白作为贮存 库（清蛋白）；②肝和肾作为贮存库；③脂肪组织 作为贮存库；④骨骼组织作为贮存库。⑵意义： 外源化学物在体内的贮存具有两重意义，一方面对 急性中毒具有保护作用，可减少靶器官中外源化学 物的量，毒效应强度降低；另一方面贮存库是不断 释放毒物的源头，使毒物在机体作用的时间延长， 并可能引起毒性反应，故认为贮存库中蓄积的毒物 是慢性毒性作用发生的物质基础 4、简述生物转化的意义、主要类型以及影响生物 转化的因素。 答：⑴毒物经过生物转化可以：①多数化学物经 生物转化后毒性降低，毒效应减弱，水溶性增加， 易于排泄； ②一些化学物经过生物转化后，毒性明显增强，甚 至产生致突变、致癌和致畸作用；生物转化是机体 对外源化学物处置的重要的环节，是机体维持稳态 的主要机制。⑵生物转化反应类型：I相反应和 II相反应；①I相反应的类型：氧化、还原和水 解反应。②II相反应主要——结合反应。⑶影 响生物转化因素：①代谢酶的诱导和抑制；②代 谢酶的种属差异和个体差异；③遗传与代谢酶的多 态性；④代谢饱和状态；⑤其他。 1、简述终毒物的四种类型。答：⑴亲电子剂：指 含有一个缺电子原子（带部分或全部正电荷）的分 子。⑵自由基：在其外层轨道中含有一个或多个 不成对电子的分子或分子片段。⑶亲核物；⑷活 性氧化还原反应物：一种特殊的产生氧化还原活性 还原剂的机制。 2、简述靶分子反应的几种类型。答：⑴非共价结 合：通过非极性交互作用或氢键与离子键的形成， 具有代表性的是毒物与膜受体、细胞内受体、离子 通道以及某些酶等靶分子的交互作用。⑵共价结 合：亲电子剂以共价结合方式与靶分子结合。⑶ 去氢反应：自由基可迅速从内源化合物去除氢原 子，将这些化合物转变为自由基。⑷电子转移。⑸ 酶促反应。 3、多数毒物发挥毒性作用经历的4个过程：1、 经吸收进入机体的毒物通过多种屏障转运至一个 或多个靶部位；2、进入靶部位的终毒物与内源靶 分子发生交互作用（反应）；3、毒物引起机体分子、 细胞和组织水平功能和结构的紊乱； 4、机体启动不同水平的修复机制应对毒作用，当 机体修复功能低下或毒物引起的功能和结构紊乱 超过机体修复能力时，机体即出现组织坏死、癌症 和纤维化等毒性损害。（无法修复） 1、简述影响毒作用的主要因素。答：影响毒作用 的主要四类因素：⑴化学物因素：①化学结构（取 代基不同毒性不同；异构体和立体构型的影响；同 系物的碳原子数和结构的影响）；②理化性质（脂 /水分配系数；大小；挥发性；气态物质的血/气分 配系数；比重；电离度和荷电性）；③不纯物和外 源化学物的稳定性。⑵机体因素：①物种、品系 及个体的遗传学差异；②宿主其他因素对于毒性作 用敏感性的影响⑶环境因素：①气象条件；②季 节或昼夜节律；③动物宠养形式；④外源化学物的 接触特征和赋形剂。⑷联合作用：①非交互作用； ②交互作用 2、试述联合作用的类型。答：⑴非交互作用：① 相加作用：剂量相加作用指化学物对机体产生的毒 性效应等于各个外源化学物单独对机体所产生效 应的算术总和。每一化学物以同样的方式，相同的 机制，作用于相同的靶，仅仅它们的效力不同；② 独立作用：各外源化学物不相互影响彼此的毒性效 应，作用的模式和作用的部位可能（但不是必然） 不同，各化学物表现出各自的毒性效应

医疗器械生物学评价 第5部分：体外细胞毒性试验(标准状态：现行)

I C S11.100.20 C30 中华人民共和国国家标准 G B/T16886.5 2017/I S O10993-5:2009 代替G B/T16886.5 2003 医疗器械生物学评价 第5部分:体外细胞毒性试验 B i o l o g i c a l e v a l u a t i o no fm e d i c a l d e v i c e s P a r t5:T e s t s f o r i n v i t r o c y t o t o x i c i t y (I S O10993-5:2009,I D T) 2017-12-29发布2018-07-01实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局

目 次 前言Ⅲ 引言Ⅴ 1 范围1 2 规范性引用文件1 3 术语和定义1 4 样品和对照品制备2 5 细胞系4 6 培养基4 7 贮存培养细胞制备4 8 试验步骤5 9 试验报告8 10 结果评定8 附录A (资料性附录) 中性红摄取(N R U )细胞毒性试验性9 附录B (资料性附录) 集落形成细胞毒性试验15 附录C (资料性附录) MT T 细胞毒性试验19 附录D (资料性附录) X T T 细胞毒性试验23 参考文献27

前言 G B/T16886‘医疗器械生物学评价“,由下列部分组成: 第1部分:风险管理过程中的评价与试验; 第2部分:动物福利要求; 第3部分:遗传毒性二致癌性和生殖毒性试验; 第4部分:与血液相互作用试验选择; 第5部分:体外细胞毒性试验; 第6部分:植入后局部反应试验; 第7部分:环氧乙烷灭菌残留量; 第9部分:潜在降解产物的定性与定量框架; 第10部分:刺激与迟发型超敏反应试验; 第11部分:全身毒性试验; 第12部分:样品制备与参照材料; 第13部分:聚合物降解产物的定性与定量; 第14部分:陶瓷降解产物的定性与定量; 第15部分:金属与合金降解产物的定性与定量; 第16部分:降解产物与可沥滤物毒代动力学研究设计; 第17部分:可沥滤物允许限量的建立; 第18部分:材料化学表征; 第19部分:材料物理化学二形态学和表面特性表征; 第20部分:医疗器械免疫毒理学试验原则和方法三 本部分为G B/T16886的第5部分三 本部分按照G B/T1.1 2009给出的规则起草三 本部分代替G B/T16886.5 2003‘医疗器械生物学评价第5部分:体外细胞毒性试验“,与G B/T16886.5 2003相比,主要技术变化如下: 修改了 材料浸提液的制备 试验步骤 结果评价 等相关内容,给出了细胞毒性定性和定量 评价指标(见4.2二第8章和第10章,2003版的4.2二第8章和第10章); 增加了性红摄取(N R U)细胞毒性试验(见附录A); 增加了集落形成细胞毒性试验(见附录B); 增加了MT T细胞毒性试验(见附录C); 增加了X T T细胞毒性试验(见附录D)三 本部分使用翻译法等同采用I S O10993-5:2009‘医疗器械生物学评价第5部分:体外细胞毒性试验“三 与本部分中规范性引用的国际文件有一致性对应关系的我国文件如下: G B/T16886.1 2011 医疗器械生物学评价第1部分:风险管理过程中的评价与试验(I S O10993-1:2009,I D T) G B/T16886.12 2017医疗器械生物学评价第12部分:样品制备与参照材料(I S O10993-12: 2012,I D T) 本部分由国家食品药品监督管理总局提出三

细胞毒性检测方法总结!

细胞毒性检测方法总结！ 细胞毒性(cytotoxic)是由细胞或者化学物质引起的单纯的细胞杀伤事件，不依赖于凋亡或坏死的细胞死亡机理。有时需要进行特定物质细胞毒性的检测，比如药物筛选。 细胞毒性检测主要是根据细胞膜通透性发生改变来进行的检测，常用以下几种方法： MTT、XTT法：利用线粒体内部酶的活性，可以将特定的四唑盐类进行转化，然后通过酶标仪进行检测 一.LDH的方法：通过检测细胞培养上清中LDH的酶活性，来检测细胞毒性 其它酶方法：如检测上清中碱性磷酸酶、酸性磷酸酶的活性等 细胞增殖能力分析试剂 原理：正常细胞代谢旺盛，其线粒体内的琥珀酸脱氢酶，可将四唑盐类物质（如MTT、XTT、WST-1等）还原为紫色的结晶状的物质，沉积在细胞周围，然后通过酶标仪读取OD值，从而检测到细胞增值状态 优点：1）快速：96孔培养板形式，可进行高通量检测。2）灵活：可直接通过显微镜观察，也可通过酶标仪进行定量检测。 二.荧光素发光法细胞生存能力检测 原理：腺苷酸激酶（AK）存在于所有真核和原核细胞的胞浆中，AK具有激活ADP 生成ATP。当细胞受损后，细胞膜发生破损，AK会释放到培养上清中。该试剂盒利用荧光素酶和荧光素在ATP作用下可以发光，通过化学发光仪可以定量进行检测。 特点： 1）简单、快速。2）板式检测，可进行高通量 。 三.LDH法细胞毒性检测 原理：LDH（乳酸脱氢酶）是一种稳定的蛋白质，存在于正常细胞的胞质中，一旦细胞膜受损，LDH即被释放到细胞外； LDH催化乳酸形成丙酮酸盐，和INT（四唑盐类）反应形成紫色的结晶物质，可通过500nm酶标仪进行检测。通过检测细胞培养上清中LDH的活性，可判断细胞受损的程度 特点：1）方法简单，安全，不使用放射性物质2）可进行高通量检测

毒理学

毒理学飞升神卷 一．名词解释 1.毒物 在一定条件下，以较小剂量进入机体就能干扰正常的生化过程或生理功能，引起暂时或永久的病理改变，甚至危及生命的化学物 2.毒性 外源化学物在一定条件下造成机体损害的能力 3.接触生物学标志物 测定组织、体液或排泄物中吸收的外源化学物、其代谢物或与内源性物质的反应产物 4.LD0 指一组受试实验动物中，不引起动物死亡的最大剂量或浓度 二．填空题 1.经生物转化大部分外源化合物的代谢产物，毒性降低，易于排出体外，此现象称

为代谢排毒，经生物转化其毒性增强的显现称为活化。 2.实验动物染毒方法主要包括经口染毒，经呼吸道染毒，经皮肤涂抹染毒和注射染毒四种。 3.毒理学主要分为描述毒理学，机制毒理学，管理毒理学三个研究领域。 4.有些有机溶剂的LD50值相似，即其绝对毒性相当，但由于其各自的挥发度不同，所以实际毒性可以相差很大，将物质的挥发度考虑在内的毒性称为相对毒性。该毒性指数对有机溶剂来说，更能反映化合物经呼吸道途径吸收的危害程度。 5.非整倍体指细胞丢失或增加一条或几条染色体。缺失一条染色体时称为单倍体，增加一条染色体时称为三倍体。 6.外源化合物可以直接发挥毒作用的器官就称为该物质的靶器官。 7.引起一组受试实验动物全部死亡的最低剂量或浓度称为绝对致死剂量或浓度。 8.外源化学物在体内的吸收，代谢，排泄过程称为生物转运。 9.I 相反应主要包括氧化还原和水解反应。 10.毒作用带是表示化学物质和毒作用特点的重要参数之一，分为急性毒作用带与慢性毒作用带。 11.经呼吸道染毒包括人工染毒和自行吸入染毒，其中自行吸入染毒又分为静式吸入和动式吸入两种形式。

毒理学研究中的体外细胞毒性评价_刘涛

第26卷 第3期2014年3月V ol. 26, No. 3Mar., 2014 生命科学 Chinese Bulletin of Life Sciences 文章编号：1004-0374(2014)03-0319-06 DOI: 10.13376/j.cbls/2014047 收稿日期：2013-07-11；修回日期：2013-08-11 基金项目：北京市教委科技发展计划重点项目(KZ2012-11417041) *通信作者：E-mail: xiaohong@https://www.wendangku.net/doc/63576247.html, 毒理学研究中的体外细胞毒性评价 刘　涛1，郭　辰2，赵晓红2* (1 首都师范大学生命科学学院，北京 100048；2 北京联合大学功能食品研究院，北京 100191) 摘　要： 体外细胞毒性评价作为传统动物模型毒性评价的替代方法正在得到越来越多的研究和应用，而其向高通量阶段的迈进则为新毒物和新药物的检测与目的物的筛选提供了更加快捷、高效的手段。将对体外细胞毒性评价常用细胞类型、体外细胞毒性评价的指标，及其检测技术方法的研究现状、进展和存在问题进行阐述，希望能为相关的研究提供一定的参考。关键词：毒理学；体外试验；细胞毒性评价；高通量筛选 中图分类号：Q256；R99 文献标志码：A In vitro cytotoxicity evaluation in toxicology LIU Tao 1, GUO Chen 2, ZHAO Xiao-Hong 2* (1 School of Life Science, Capital Normal University, Beijing 100048, China; 2 Research Institute for Science and Technology of Functional Foods, Beijing Union University, Beijing 100191, China) Abstract: In vitro cytotoxicity evaluation, as an alternative of traditional toxicity evaluation using animal models, has been widely studied and applied. The development of cell-based high-throughput detecting and screening assays will provide fast and efficient means for detecting new toxic substances and drugs and screening target ingredients. The current research status, scientific progress, and existing problems of commonly used cell types, different test indexes and methods for in vitro cytotoxicity assessments are reviewed, which will provide some reference for related research. Key words: toxicology; in vitro assay; cytotoxicity evaluation; high-throughput screening 毒性评价的传统方法主要是动物体内实验，通过解剖检查、称量重量、计算脏器指数、血液生化学检查及病理形态学检查等来发现受试物的器官毒性，即利用啮齿类动物和非啮齿类动物进行不同时间段的生物测定。虽然这种方法在评估化学物对人类潜在危害的实际应用中发挥了重要的作用，但随着科学技术的发展，其局限性也逐渐显露出来。细胞试验正是在这一基础上发展起来的。近年来，体外细胞毒性评价由于其周期短、成本低和作用机制易于探明等优势得到快速的发展。目前在体外试验很难监控全身生理效应的前提下，大多数试验都是测定细胞水平的效应，即体外细胞毒性。在限定条件下，可根据药物代谢动力学模型将体外细胞毒性 检测的结果外推并应用到体内研究中[1] 。相对于复 杂的体内反应，所有体外细胞毒性试验都是简化了 的监测事件，但由于其经济、快速、易于量化和可重复性好，且符合替代(replacement )、减少(reduction )和优化(refinement )，即3R 的原则[2]，它不仅提高了毒理学检测的效率，减少了动物的使用，而且将会使基于人类细胞或细胞系的体外毒理学检测途径的定量自动化高通量检测与筛选得到更广泛 的应用[1]。 随着社会科学技术的发展和人类需求的不断扩大，新的药品、化学佐剂、食品添加剂、化工原料以及环境污染物等化学物不断地被发现和制造出来，并且要求快速得到实际的检测和应用，以满足 ? 技术与应用 ?

细胞毒性药物配制方法及使用时注意事项

抗肿瘤药物的用药顺序及溶媒选择 原则 （1）药物相互作用原则 有的化疗药物之间会发生相互作用，从而改变药物的体内过程，可能影响疗效或毒性。 如顺铂影响紫杉醇的清除率，先用紫杉醇再用顺铂。 （2）刺激性原则 使用非顺序依赖性化疗药物时，应先用对组织刺激性较强的药物，后用刺激性小的药物。由于治疗开始时静脉尚未损伤，结构稳定性好，药业渗出机会少，药物对静脉引起的不良 反应较小如长春瑞滨和顺铂合用时，长春瑞滨刺激性强，宜先给药。 （3）细胞动力学原则 生长较慢的实体瘤处于增殖期的细胞较少，G0期细胞较多，先用周期非特异性药物杀 灭一部分肿瘤细胞，使肿瘤细胞进入增殖期再用周期特异性药物。顺铂和依托泊苷合用时，先用顺铂后用VP-16。 生长快的肿瘤先用周期特异性药物大量杀灭处于增殖周期的细胞，减少肿瘤负荷，随后用周期非特异性药物杀灭残存的肿瘤细胞。 用药顺序 1、联用顺铂化疗 化疗方案联用药物用药顺序原因 GP 吉西他滨先用GEM 顺铂会影响吉西他滨的体内过程，加重骨髓抑制。TP 紫杉醇先用PTX 顺铂对细胞色素P450酶有调节作用，可使PTX清除 率大约降低33%,产生更为严重的骨髓抑制 FP 5-FU 先用DDP 小剂量DDP能够增加细胞内蛋氨酸, 使细胞内活性叶酸生成增加, 从而增加5-FU的抗肿瘤作用。 PP 培美曲塞先用Alimta，30min后用顺铂说明书 2、联合长春新碱化疗 化疗方案联用药物用药顺序原因 CHOP 环磷酰胺先用VCR，6-8小时后在给CTX VCR具有同步化作用，使细胞停滞在M期，约6~8h后细胞同步进入G1期，再用CTX可增效 VCM 甲氨蝶呤先用VCR VCR阻止甲氨蝶呤从细 胞内渗出而提高细胞内浓度 VDLP 门冬酰胺酶先用VCR 合用加重神经系统血液系统毒性，先于门冬12~24小时给药 3、甲氨蝶呤 化疗方案联用药物用药顺序原因 CMF 5-FU 用MTX4～6h后用5-FU 序贯抑制 MTX----二氢叶酸还原酶抑制 剂 5-FU-----胸腺嘧啶合成酶抑制剂

USP87细胞毒性体外试验

87 BIOLOGICAL REACTIVITY TESTS, IN VITRO The following tests are designed to determine the biological reactivity of mammalia n cell cultures followi ng con tact with the elastomeric plastics and other polymeric materials with direct or in direct patie nt con tact or of specific extracts prepared from the materials under test. It is essential that the tests be performed on the specified surface area. When the surface area of the specime n cannot be determ in ed, use 0.1 g of elastomer or 0.2 g of plastic or other material for every mL of extraction fluid. Exercise care in the preparation of the materials to preve nt con tam in ati on with microorga nisms and other foreign matter. Three tests are described (i.e., the Agar Diffusi on Test , the Direct Con tact Test and the Elution Test ).1 The decision as to which type of test or the number of tests to be performed to assess the potential biological response of a specific sample or extract depends upon the material, the final product, and its inten ded use. Other factors that may also affect the suitability of sample for a specific use are the polymeric composition; processing and cleaning procedures; con tact ing media; in ks; adhesives; absorptio n, adsorptio n, and permeability of preservatives; and con diti ons of storage. Evaluatio n of such factors should be made by appropriate additi onal specific tests before determining that a product made from a specific material is suitable for its in ten ded use. Materials that fail the in vitro tests are can didates for the in vivo tests described in Biological Reactivity Tests, In Vivo 88 . USP R EFERENCE S TANDARDS 11 —USP High-Density Polyethylene RS. USP Positive Bioreaction RS. Cell Culture Preparation —Prepare multiple cultures of L-929 (ATCC cell line CCL 1, NCTC clone 929; alternative cell lines obtained from a standard repository may be used with suitable validation) mammalian fibroblast cells in serum-suppleme nted minimum esse ntial medium hav ing a seedi ng den sity of about 10 5 cells per mL. Incubate the cultures at 37 1 一in a h±midified

毒理学名词解释

毒物：是指在较低的剂量下可导致生物体损伤的物质 增毒：外源化学物在体内经生物转化为终毒物的过程称为增毒。 解毒：消除终毒物或阻止终毒物生成的生物转化过程称为解毒。 治疗指数：是指半数致死量与半数有效量的比值,表示为TI=LD50/ED50。因此一般说,治疗指数大者,药物的安全度就大,反之则小。生物转化：是指化学毒物在细胞内发生一系列化学结构和理化性质改变而转化为新的衍生物的过程。即代谢。 终毒物：指直接与内源靶分子反应或引起机体生物学微环境改变、导致机体结构和功能紊乱、表现毒物毒性作用的化学物。 细胞应激：指细胞处于不利环境和遇到有害刺激时所产生的防御或适应性反应。 氧化应激：是指由于氧自由基过量生成而导致细胞内抗氧化防御系统受损，导致氧自由基及其相关代谢产物过量聚集，从而对细胞产生多种毒性作用的病理状态。 急性毒性：是指实验动物在一次接触或24小时内多次接触一定剂量的某种外源化学物短期内所产生的健康损害作用和致死效应。突变：遗传物质本身的变化及引起的变异，一般指基因的变化。 致突变作用：广义概念是外来因素特别是化学物引起细胞核遗传物质发生改变的能力，且该改变可随同细胞分裂过程而传递。 致突变物：能够引起突变的物质。 基因突变：是基因中DNA序列的变化。基因突变可分为碱基置换和移码突变。 AP位点：丧失碱基的DNA留下一个无嘌呤或无嘧啶的位点 微核：与染色体损伤有关，是染色体或染色单体的无着丝点断片或纺锤丝受损伤而丢失的整个染色体，在细胞分裂后期遗留在细胞质中，末期之后，单独形成一个或几个规则的次核，包含在子细胞的胞质内，比主核小，故称微核。 促癌剂：本身不致癌但对致癌物有促进作用。促癌剂单独用时不致癌，却可使启动的突变细胞克隆扩增，促进肿瘤的发展。 胚胎毒性：对孕体器官形成期结束以后的有害影响叫胎体毒性或胎儿毒性，在实验动物发育毒性试验中，往往笼统地称为胚胎毒性。 发育毒性：指出生前后接触有害因素，子代个体发育为成体之前诱发的任何有害影响。 管理毒理学：是现代毒理学的重要组成部分，是将毒理学研究成果应用于外源化学物质危害管理的应用学科 良好实验室规范（GLP）：是针对药品、食品添加剂、农药、化妆品及其他医用物品的毒性评价制定的管理法规。 标准操作规范（SOP）：:标准作业程序是指在有限时间与资源内，为了执行复杂的事务而设计的内部程序。 危险性分析：是指对机体、系统或（亚）人群可能暴露于某一危险的控制过程。它由三部分构成，即危险度评定、危险性管理与交流。 危险评定：是指特定的靶机体、系统或（亚）人群暴露于某一危害，考虑到有关因素固有特征和特定靶系统的特征，计算或估计预期的危险的过程，包括确定伴随的不确定性。它由4个步骤组成:危害识别、危害表征（剂量-反应评价）、暴露 评价、危害表征(包括定量的和定性的危险度和不确定性)。 转化医学：是连接基础学科与临床学科的桥梁，是从实验室到床边，又从床边到实验室的双向进程、循环式的研究体系。 转化毒理学：是研究如何将毒理学的基础研究成果发展转化为能应用于环境与人群监测、环境相关疾病的早期诊断治疗和预防、安全性评价、危险度评定和危险性管理的理论、方法、技术、产品和防控措施的一门新兴的毒理学分支学科，是 “组成”、计算生物学、遗传-表观遗传学等创新的产物。 血液毒理学：是研究药物、非治疗性化学物以及其他环境因素对血液和造血器官有害效应的一门科学。 造血作用：即血细胞的生成，是指为了满足运送氧气、宿主防御反应、修复损伤、止血及其他机体重要功能，血细胞前体增殖分化为血细胞的过程。 免疫应答：是机体特异性和非特异性的识别并排除异己成分以维持自身稳定的全过程，因而免疫应答是整个免疫学得核心。 生殖毒理学：是生殖医学与毒理学结合而形成的一门重要交叉学科，主要研究对生殖系统产生损害的原因、机制和后果。 内分泌干扰化学物：是环境中天然存在或污染的，可模拟生物体内激素的生理、生化作用，干扰内分泌系统功能，对亲体或其后代产生不良健康效应的外源化学物。 中毒性肺水肿：是指肺损伤后由于急性渗出，使呼吸膜增厚，致使肺脏间质和实质有过量水分潴留。 哮喘：是由于摄入某种哮喘原或其他不明因素所引起的大气道狭窄，临床表现为气管，支气管对各种刺激因子的高敏感性而发生痉挛，导致反复发作的气短，呼吸困难和哮鸣等器道梗阻。 慢性阻塞性肺病（COPD）：是一种慢性，进行性阻塞性肺病，表现为慢性支气管炎和肺水肿。 支气管肺泡灌洗：是用等渗的盐溶液冲洗和气管肺泡区表面的过程，并回收采集支气管和肺泡表面脱落细胞核液体进行分析 血液毒理学：是研究药物、非治疗性化学物以及其他环境因素对血液和造血器官有害效应的一门学科，是随实验血液学的发展而迅速发展起来的毒理学分支，汲取了血液学和毒理学的基本理论。 中毒性表皮溶解坏死（TEN）：常由药物或化学物引起，发生非常迅速，可危及生命。（例子：卡马西平） 免疫应答：是指从一个抗原刺激开始，机体内抗原特异性淋巴细胞识别抗原（感应）后，发生活化、增殖和分化，表现出一定的体液免疫和细胞免疫效应的过程。 肾小球滤过率（GFR）：肾小球的滤过量大小，即单位时间内两肾生成的滤液量。 肾脏清除率：肾脏在单位时间内（每分钟）将多少毫升血浆中的某物质清除，表示为C=UV/P