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第五章分子生物学常用技术习题

第五章常用分子生物学技术的原理及其应用习题（引自网络精品课程）

一、选择题

（一）A型题

1 ．分子杂交实验不能用于

A ．单链 DNA 与 RNA 分子之间的杂交

B ．双链 DNA 与 RNA 分子之间的杂交

C ．单链 RNA 分子之间的杂交

D ．单链 DNA 分子之间的杂交

E ．抗原与抗体分子之间的杂交

2 ．关于探针叙述错误的是

A ．带有特殊标记

B ．具有特定序列

C ．必须是双链的核酸片段

D ．可以是基因组 DNA 片段

E ．可以是抗体

3 ．下列哪种物质不能用作探针

A ． DNA 片段

B ． cDNA

C ．蛋白质

D ．氨基酸

E ． RNA 片段

4 ．印迹技术可以分为

A ． DNA 印迹

B ． RNA 印迹

C ．蛋白质印迹

D ．斑点印迹

E ．以上都对

5 ． PCR 实验延伸温度一般是

A ．90 ℃

B ．72 ℃

C ．80 ℃

D ．95 ℃

E ．60 ℃

6 ． Western blot 中的探针是

A ． RNA

B ．单链 DNA

C ． cDNA

D ．抗体

E ．双链 DNA

7 ． Northern blotting 与 Southern blotting 不同的是

A ．基本原理不同

B ．无需进行限制性内切酶消化

C ．探针必须是 RNA

D ．探针必须是 DNA

E ．靠毛细作用进行转移

8 ．可以不经电泳分离而直接点样在 NC 膜上进行杂交分析的是

A ．斑点印迹

B ．原位杂交

C ． RNA 印迹

D ． DNA 芯片技术

E ． DNA 印迹

9 ．下列哪种物质在 PCR 反应中不能作为模板

A ． RNA

B ．单链 DNA

C ． cDNA

D ．蛋白质

E ．双链 DNA

10 ． RT-PCR 中不涉及的是

A ．探针

B ． cDNA

C ．逆转录酶

D ． RNA

E ． dNTP

11 ．关于 PCR 的基本成分叙述错误的是

A ．特异性引物

B ．耐热性 DNA 聚合酶

C ． dNTP

D ．含有 Zn 2+ 的缓冲液

E ．模板

12 ． DNA 链末端合成终止法不需要

A ． ddNTP

B ． dNTP

C ．引物标记

D ． DNA 聚合酶

E ．模板

13 ． cDNA 文库构建不需要

A ．提取 mRNA

B ．限制性内切酶裂解 mRNA

C ．逆转录合成 cDNA

D ．将 cDNA 克隆入质粒或噬菌体

E ．重组载体转化宿主细胞

14 ．标签蛋白沉淀是

A ．研究蛋白质相互作用的技术

B ．基于亲和色谱原理

C ．常用标签是 GST

D ．也可以是 6 组氨酸标签

E ．以上都对

15 ．研究蛋白质与 DNA 在染色质环境下相互作用的技术是

A ．标签蛋白沉淀

B ．酵母双杂交

C ．凝胶迁移变动实验

D ．染色质免疫沉淀法

E ．噬菌体显示筛选系统

16 ．动物整体克隆技术又称为

A ．转基因技术

B ．基因灭活技术

C ．核转移技术

D ．基因剔除技术

E ．基因转移技术

17 ．目前主要克隆的致病基因是

A ．糖尿病致病基因

B ．恶性肿瘤致病基因

C ．单基因致病基因

D ．多基因致病基因

E ．高血压致病基因

18 ．基因疫苗主要是指

A ． DNA 疫苗

B ． RNA 疫苗

C ．反义核酸

D ．核酶

E ．小干扰 RNA

19 ．目前基因治疗中选用最多的基因载体是

A ．噬菌体

B ．脂质体

C ．逆转录病毒

D ．腺病毒相关病毒

E ．腺病毒

20 ．目前基因治疗多采用的方法是

A ．基因增补

B ．基因置换

C ．基因矫正

D ．基因灭活

E ．基因疫苗

（二）B型题

A ． Southern blotting

B ． Northern blotting

C ． Western blotting

D ． dot blotting

E ． in situ hybridization

1 ．不需要电泳、转膜等程序

2 ．电泳前不需进行限制性内切酶消化

3 ．靠电转移完成生物大分子的转移

4 ．直接在组织切片或细胞涂片上进行杂交

A ．逆转录 PCR

B ．原位 PCR

C ．实时 PCR

D ．多重 PCR

E ． RFLP

5 ．将目的基因扩增与定位相结合

6 ．能动态检测反应过程中的产物量

7 ．将 RNA 的逆转录和 PCR 反应联合应用的一项技术

8 ．在同一反应中采取多对引物

A ．功能克隆

B ．定位克隆

C ．转基因技术

D ．核转移技术

E ．基因剔除

9 ．也叫基因靶向灭活

10 ．该技术中，被导入的目的基因称为转基因

11 ．从对基因编码产物的功能的了解出发克隆致病基因

A ．基因疫苗

B ．基因矫正

C ．基因置换

D ．基因增补

E ．基因失活

12 ．目前基因治疗采用最多的方法是

13 ．将致病基因的异常碱基进行修正的基因治疗方法是

14 ．将正常基因经体内基因同源重组原位替换致病基因的基因治疗方法是

15 ．利用特定的反义核酸阻断变异基因异常表达的基因治疗方法是

A ．酵母双杂交技术

B ．标签蛋白沉淀

C ．电泳迁移率变动测定

D ．染色质免疫沉淀

E ．荧光共振能量转换效应分析

16 ．凝胶阻滞实验

17 ．需要设计诱饵基因

18 ．近年该技术与芯片技术结合在一起，成为一项鉴定特定核蛋白的 DNA 结合靶点的新技术

（三）X型题

1 ．核酸探针可以是

A ．人工合成寡核苷酸片段

B ．基因组 DNA 片段

C ． RNA 片段

D ． cDNA 全长或部分片段

E ．核苷酸

2 ．核酸分子杂交可以形成的杂化双链有

A ． DNA/DNA

B ． RNA/RNA

C ． DNA/RNA

D ．寡核苷酸 /RNA

E ．寡核苷酸 /DNA

3 ． PCR 技术主要用于

A ．目的基因的克隆

B ．基因的体外突变

C ． DNA 和 RNA 的微量分析

D ． DNA 序列测定

E ．基因突变分析

4 ．分子杂交技术的原理涉及

A ．分子杂交特性

B ．基因文库

C ．印迹技术

D ．生物芯片

E ．探针技术

5 ．关于 DNA 链末端合成终止法正确的是

A ．需加入的链终止剂 ddNTP

B ． dNTP 需要标记

C ．引物也需要标记

D ．又称 Sanger 法

E ． ddNTP 缺乏 5 ' -OH

6 ．基因组 DNA 文库建立需要

A ．基因组进行限制性内切酶消化

B ． DNA 片段克隆到相应载体中

C ．重组体感染宿主菌

D ．筛选目的基因可以通过核酸分子杂交的方法进行

E ．以λ 噬菌体为载体的人基因组 DNA 文库的克隆数目至少应在 10 6 以上

7 ．用于构建基因组 DNA 文库的载体有

A ．酵母人工染色体

B ．粘粒

C ．λ 噬菌体

D ．腺病毒

E ．脂质体

8 ．基因诊断较常规诊断其特点有

A ．属于病因诊断

B ．特异性强

C ．适用范围窄

D ．灵敏度高

E ．有放大效应

9 ．基因失活的常用技术包括

A ．基因疫苗

B ．核酶

C ．小干扰 RNA

D ．反义核酸

E ．基因置换

10 ．克隆羊多莉的产生属于

A ．同种异体细胞转移技术

B ．同种异体细胞核转移技术

C ．试管内受精

D ．无性繁殖

E ．同种异体细胞转基因技术

11 ．疾病动物模型可用于

A ．探讨疾病的发生机制

B ．克隆致病基因

C ．新治疗方法的筛选系统

D ．新药物的筛选系统

E ．新疾病模型的筛选系统

12 ．蛋白质芯片主要应用于

A ．蛋白质结构的研究

B ．蛋白质表达谱的研究

C ．蛋白质功能的研究

D ．蛋白质之间的相互作用研究

E ．疾病的诊断和新药的筛选

13 ．研究蛋白质相互作用的技术包括

A ．标签蛋白沉淀

B ．酵母双杂交

C ．凝胶阻滞实验

D ．噬菌体显示筛选系统

E ． DNA 印迹

14 ．基因治疗的基本程序包括

A ．治疗性基因的选择

B ．基因载体的选择

C ．靶细胞的选择

D ．基因转移

E ．回输体内

15 ．目前可用作基因治疗的基因载体包括

A ．腺病毒相关病毒

B ．噬菌体

C ．腺病毒

D ．逆转录病毒

E ．粘粒

二、是非题

1 ． Southern blot 主要用于 RNA 的定性和定量分析。

2 ．蛋白质印迹分析技术中蛋白质的转移，可以用电转移，也可以靠毛细作用转移。

3 ．实时 PCR 技术与普通 PCR 技术相比，它可以动态监测反应过程中产物的量。

4 ． Sanger 法在测定核酸序列时，反应管中加入的 dNTP 仅标记一种即可。

5 ．生物芯片可以是 DNA 芯片、 cDNA 芯片或蛋白质芯片。

6 ．酵母双杂交技术是分析 DNA—蛋白质相互作用的一项重要技术。

7 ．核转移技术，是指将动物体细胞核全部导入另一个体去除了胞核的卵细胞内，使之发育成个体。

8 ．基因矫正是用正常的基因通过体内基因同源重组，替换致病基因来达到治疗目的。

9 ．目前基因治疗多采用基因增补的方式。

10 ． RNA 印迹技术中， RNA 分子在转移前需进行限制性内切酶切割。

11 ． PCR 反应中变性主要是使模板 DNA 完全变性为单链。

12 ．实时 PCR 技术中， TagDNA 聚合酶在链延伸过程中遇到荧光探针，可发挥 3 ' →5 ' 核酸外切酶活性。

13 ．酵母双杂交系统可用于证明两种已知基因序列的蛋白质可以相互作用的生物信息学推测。

14 ．转基因技术即动物克隆技术，是无性繁殖。

15 ．内源基因结构突变发生在生殖细胞可引起恶性肿瘤。

16 ．基因转移和基因剔除技术在医学中最重要的用途是建立疾病动物模型。

17 ．定位克隆是指从对基因编码产物的功能的了解出发来克隆致病基因。

18 ．目前 DNA 序列分析是找出患者有关基因变异所在的最为直接和确切的基因诊断法。

三、填空题

1 ．分子杂交是利用 DNA 和这一基本性质来进行 DNA 或 RNA 定性、定量分析的。

2 ．在印迹技术中，将 DNA 片段在琼脂糖凝胶中使其成为，利用使胶中的生物大分子转移到膜上，使之成为固相化分子。

3 ．印迹技术的基本流程依次为、、和。

4 ． Southern blotting 主要用于定性和定量分析，亦可用于和的分析。

5 ． Northern blotting 主要用于检测的表达水平，敏感性较 PCR ，但其具有和的优点。

6 ． Western blotting 主要用于检测样品中的存在、细胞中以及的相互作用研究等。

7 ． PCR 的基本反应步骤包括、、。

8 ．基因芯片适用于分析不同组织细胞或同一细胞不同状态下的，其原理是基于。

9 ．在转基因技术中，被导入的目的基因称为，目的基因的受体动物称为。

10 ．标签融合蛋白结合实验主要用于证明是否存在直接的物理结合，分析结合的及筛选细胞内与融合蛋白相结合的。

11 ．染色质免疫沉淀法是目前可以研究与相互作用的主要方法。

12 ．目前克隆致病相关基因主要有和两大策略。

13 ．根据受体细胞的类型不同，基因治疗分为的基因治疗和的基因治疗两大类。

14 ．目前使用的基因载体有和两大类。

15 ．在人类基因治疗实施中，导入基因的方式有和两大类。

四、名词解释

1 ． probe

2 ． blotting technologe

3 ． gene libary

4 ．核转移技术

5 ． gene chip

6 ． gene therapy

7 ． gene diagnosis

8 ．基因疫苗

9 ． gene inactivation

10 ． gene replacement

11 ． gene augmentation

12 ． PCR

13 ． ex vivo

五、问答题

1 ．简述印迹技术的分类及应用。

2 ．简述 PCR 反应体系的基本成分、 PCR 的基本反应步骤和主要用途。

3 ．简述 PCR 技术的基本原理。

4 ．简述逆转录 PCR 、原位 PCR 和实时 PCR 技术的基本原理和主要区别。

5 ．简述 DNA 链末端合成终止法（ Sanger 法）测序的基本原理。

6 ．简述基因转移和基因剔除技术在医学发展中的作用。

7 ．简述酵母双杂交技术的基本原理及应用。

8 ．试述染色质免疫沉淀法基本原理及用途。

9 ．简述基因诊断的概念及特点。

10 ．何为基因治疗，目前基因治疗有哪些基本策略？

11 ．试述基因治疗的基本程序。

12 ．欲生产一种药用多肽，科学家已经将此多肽的基因与某真核表达质粒重组在一起。请你设计一个实验，利用 PCR 方法鉴定此重组表达质粒是否含有这一多肽的基因。

13 ．请设计一个实验，利用酵母双杂交系统检测从某一癌组织中提取、纯化的一种未知蛋白质 X 与两种已知蛋白质 a 、 b 之间是否有相互作用。

14 ．请为某一单基因遗传病（低表达或不表达）的患者设计一个基因治疗方案。

参考答案

一、选择题

（一）A型题

1 ． B

2 ． C

3 ． D

4 ． E

5 ． B

6 ． D

7 ． B

8 ． A

9 ． D 10 ． A 11 ． D 12 ． C 13 ． B 14 ． E 15 ． D 16 ． C 17 ． C 18 ． A 19 ． D 20 ． A （二）B型题

1 ． D

2 ． B

3 ． C

4 ． E

5 ． B

6 ． C

7 ． A

8 ． D

9 ． E 10 ． C 11 ． A 12 ． D 13 ． B 14 ． C 15 ． E 16 ． C 17 ． A 18 ． D

（三）X型题

1 ． ABCD

2 ． ABCDE

3 ． ABCDE

4 ． ACE

5 ． ABD

6 ． ABCDE

7 ． ABC

8 ． ABDE

9 ． BCD 10 ． BD 11 ． ACD 12 ． BCDE 13 ． AB 14 ． ABCD 15 ． ACD

二、是非题

1 ． B

2 ． B

3 ． A

4 ． A

5 ． A

6 ． B

7 ． B

8 ． B

9 ． A 10 ． B 11 ． A

12 ． B

13 ． A 14 ． B 15 ． B 16 ． A 17 ． B 18 ． A

三、填空题

1 ．变性复性

2 ．变性单链毛细作用 NC

3 ．电泳转移杂交放射自显影或化学显色

4 ． DNA 重组质粒噬菌体

5 ． mRNA 差特异性强假阳性率低

6 ．特异性蛋白质的存在特异性蛋白质的半定量分析蛋白质分子

7 ．变性退火延伸

8 ．基因差异表达情况双色荧光探针杂交

9 ．转基因转基因动物

10 ．两种蛋白质分子具体结构部位未知分子

11 ．体内 DNA 蛋白质

12 ．功能克隆定位克隆

13 ．体细胞生殖细胞

14 ．病毒载体非病毒载体

15 ．直接体内疗法间接体内疗法

四、名词解释

1 ．探针，是指带有特殊可检测标记（放射性核素或其它化合物标记）的核酸片段，它具有特定的序列，能够与待测的核酸片断互补结合，因此可用于检测核酸样品中特定的基因。

2 ．印迹技术，是指将在凝胶中分离的生物大分子转移或直接放在固定化介质上并加以检测分析的技术。它包括 DNA 印迹技术、 RNA 印迹技术和蛋白质印迹技术等。

3 ．基因文库，是指一个包含了某一生物体全部 DNA 序列的克隆群体。基因文库可以分为基因组 DNA 文库和 cDNA 文库。

4 ．核转移技术，即所谓动物整体克隆技术，是指将动物体细胞核全部导入另一个体去除了胞核的激活的卵细胞内，使之发育成个体。这样的个体所携带的遗传性状仅来自一个父亲或母亲个体，因而为无性繁殖。从遗传角度上讲，是一个个体的完全拷贝，故称之为克隆。

5 ．基因芯片，又称 DNA 微阵列，包括 DNA 芯片 (DNA chip) 和 cDNA 芯片 (cDNA chip) ，是指将许多特定的 DNA 片段或 cDNA 片段作为探针，有规律地紧密排列固定于支持物上，然后与待测的荧光标记样品进行杂交，杂交后用荧光检测系统等对芯片进行扫描，通过计算机系统对每一位点的荧光信号做出检测、比较和分析，从而迅速得出定性和定量的结果。

6 ．基因诊断，是指利用现代分子生物学和分子遗传学的技术和方法，直接检测基因结构及其表达水平是否正常，从而对疾病作出诊断的方法。

7 ．基因治疗，从广义上讲，是指将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，以达到治疗疾病目的的方法。

8 ．基因疫苗，主要是指 DNA 疫苗，是第三代疫苗。其将编码外源性抗原的基因插入到真核表达质粒中，直接导入人体内，抗原基因在一定时间内持续表达，不断刺激机体免疫系统，达到治病或防病目的。

9 ．基因失活，是指将特定的序列导入细胞后，在转录或翻译水平阻断某些基因的异常表达，已达到治疗疾病的目的。

10 ．基因置换，是指用正常的基因通过体内基因同源重组，原位替换致病基因，使细胞内的 DNA 完全恢复正常状态。

11 ．基因增补，是指将目的基因导入病变细胞或其它细胞，不去除异常基因，而通过目的基因的非定点整合，使其表达产物弥补缺陷基因的功能或使原有的功能增强。

12 ．聚合酶链反应，指以 DNA 分子为模板，以一对与模板序列相互补的寡核苷酸片段为引物，在 DNA 聚合酶的作用下，完成新的 DNA 的合成，重复这一过程使目的 DNA 片段得到扩增。这一技术可以将微量目的 DNA 片段扩增一百万倍以上。

13 ．间接体内疗法，是指在体外将外源基因导入靶细胞内，再将这种基因修饰过的细胞回输病人体内，使带有外源基因的细胞在体内表达相应产物，已达到治疗的目的。

五、问答题

1 ．简述印迹技术的分类及应用。

答：印记技术是指将在凝胶中分离的生物大分子转移或直接放在固定化介质上并加以检测分析的技术。它主要包括 DNA 印迹技术 (Southern blot) 、 RNA 印迹技术(Northern blot) 和蛋白质印迹技术 (Western blot) 等。

DNA 印迹技术主要用于基因组 DNA 的定性和定量分析，例如对基因组中特异基因的定位及检测等，此外亦可用于分析重组质粒和噬菌体。

RNA 印迹技术主要用于检测某一组织或细胞中已知的特异 mRNA 的表达水平，也可以比较不同组织和细胞中的同一基因的表达情况。

蛋白质印迹技术，也叫免疫印迹，用于检测样品中特异性蛋白质的存在、细胞中特异蛋白质的半定量分析以及蛋白质分子的相互作用研究等。

2. 简述 PCR 反应体系的基本成分、 PCR 的基本反应步骤和主要用途。

答：组成 PCR 反应体系的基本成分包括模板 DNA 、特异性引物、耐热性 DNA 聚合酶、dNTP 以及含有 Mg 2+ 的缓冲液。

PCR 的基本反应步骤包括：

(1) 变性：将反应体系加热至95 ℃ ，使模板 DNA 完全变性为单链，同时因物自身以及引物之间存在的局部双链也得以消除。

(2) 退火：将温度下降至适宜温度使引物与模板结合。

(3) 延伸：将温度升至72 ℃ ， DNA 聚合酶以 dNTP 为底物催化 DNA 的合成反应。PCR 主要用途： (1) 目的基因的克隆； (2) 基因的体外突变； (3)DNA 和 RNA 的微量分析； (4)DNA 序列测定； (5) 基因突变分析。

3 ．简述 PCR 技术的基本原理及应用。

答。这种变性 - 复性 - 延伸的过程就是一个 PCR 循环， PCR 就是在合适条件下的这种循环的不断重复。主要用于目的基因的克隆、基因的体外突变、 DNA 和 RNA 的的微量分析、 DNA 序列测定和基因突变分析等。

4. 简述逆转录 PCR 、原位 PCR 和实时 PCR 技术的基本原理和主要区别。

答：逆转录 PCR 是将 RNA 的逆转录和 PCR 反应联合应用的一种技术。即首先以 RNA 为模板，在逆转录酶的作用下合成 cDNA ，再以后者为模板通过 PCR 反应来扩增目的基因。

原位 PCR 是在固定液固定、石蜡包埋的组织切片或细胞涂片上的单个细胞内进行的PCR 反应，然后用特异性探针进行原位杂交，即可检出待测 DNA 或 RNA 是否在该组织或细胞中存在。

实时 PCR 的基本原理是引入了荧光标记分子，并使荧光信号强度与 PCR 产物量成正比，对每一反应时刻的荧光信号进行实时分析，计算出 PCR 产物量。根据动态变化数据，可以精确计算出样品中最初的含量差异。

逆转录 PCR 与传统 PCR 相比，将 RNA 的逆转录和 PCR 反应联合起来，可以对已知序列的 RNA 进行定性及半定量分析。常规 PCR 或 RT-PCR 技术的产物不能在组织细胞中定位原位，因而不能与特定的组织细胞特征表型相联系，原位 PCR 技术可以将目的基因的扩增与定位相结合。实时 PCR 技术与传统 PCR 反应相比，在常规正向和反向引物之间，增加了一特殊引物作为探针。该技术可以通过动态监测反应过程中的产物量，消除了产物堆积对定量分析的干扰。

5. 简述 DNA 链末端合成终止法（ Sanger 法）的基本原理。

答： DNA 链末端合成终止法基本原理是：将 2 ' ， 3 ' - 双脱氧核苷酸 (ddNTP) 代替部分 dNTP 作为底物掺入到新合成的 DNA 链中，由于 ddNTP 缺乏 3 ' -OH ，一旦

ddNTP 掺入到 DNA 链中，就不能与下一核苷酸形成磷酸二酯键，因此合成反应终止。测定时，首先将模板分为四组，每一组分别加入引物和 DNA 聚合酶及由 32 P 或 35 S 标记的 dNTP ，启动 DNA 合成，一定时间后，每一组加入四种 ddNTP 中的一种，就可以获得在不同部位终止的、长短不同的 DNA 链，经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离这些片段，通过反射自显影就可以读出 DNA 的序列。

6. 简述基因转移和基因剔除技术在医学发展中的作用。

答：基因转移和基因剔除技术在医学中最重要的用途是建立疾病动物模型。以往的遗传疾病动物模型主要是自然发生或用化学药物、放射诱导等方式获得。基因转移和基因剔除技术为直接建立动物模型提供了有效的手段。这些模型可用于探讨疾病的发生机制，更重要的是可作为新的治疗方法和新的药物的筛选系统。

建立动物模型： (1) 单基因决定疾病模型：应用基因剔除模拟基因失活，如动脉硬化症疾病模型。 (2) 多基因决定疾病模型

7 ．简述酵母双杂交技术的基本原理及应用。

答：酵母双杂交系统目前已成为分析细胞内未知蛋白相互作用的主要手段之一。该技术是基于酵母转录激活因子 GAL4 分子的 DNA 结合区 (BD) 和促进转录的活性区 (AD) 被分开后将丧失对下游基因的激活作用，但 BD 和 AD 分别融合了具有配对相互作用的两种蛋白质分子后，就可以依靠所融合的蛋白质分子之间的相互作用而恢复对下游基因的表达激活作用。

酵母双杂交系统可以用于 (1) 证明两种已知基因序列的蛋白质可以相互作用的生物信息学推测； (2) 分析已知存在相互作用的两种蛋白质分子的的相互作用功能结构域或关键的氨基酸残基； (3) 将拟研究的蛋白质的编码基因与 BD 基因融合成为“ 诱饵” 表达质粒，可以筛选 AD 基因融合的“ 猎物” 基因表达文库，筛选未知的相互作用蛋白质。

8 ．试述染色质免疫沉淀法基本原理及用途。

答：染色质免疫沉淀技术是目前可以研究体内 DNA 与蛋白质相互作用的主要方法。

该法可以研究蛋白质与 DNA 在染色质状态下的相互作用，阐明真核生物基因表达机制。它的基本原理是在活细胞状态下用化学交联试剂固定蛋白质 -DNA 复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，再利用PCR 技术特异性的富集目的蛋白结合的 DNA 片段，从而获得蛋白质与 DNA 相互作用的信息。

9 ．简述基因诊断的概念及特点。

答：基因诊断是指利用现代分子生物学和分子遗传学的技术和方法，直接检测基因结构及其表达水平是否正常，从而对疾病作出诊断的方法。

基因诊断与其他诊断方法相比，基因诊断的方法特点是：

（ 1 ）针对性强，以基因作为检查材料和探察目标，属于“ 病因诊断” 。

（ 2 ）特异性强，用分子杂交技术选用特定基因序列作为探针，故有很高的特异性。（ 3 ）灵敏度高，所用技术具有放大效应，故诊断灵敏度高

（ 4 ）适用性强，诊断范围广。

10 ．何为基因治疗，目前基因治疗有哪些基本策略？

答：从广义上讲，是指将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，以达到治疗疾病目的的方法，均谓之基因治疗。

(1) 缺陷基因精确的原位修复包括对致病基因的突变碱基进行矫正的基因矫正和用正常基因通过重组原位替换致病基因的基因置换。这两种方法是对缺陷基因精确的原位修复，不涉及基因组的任何改变，是最为理想的治疗方法，但技术上目前尚未突破。

(2) 基因增补是指将目的基因导入病变细胞或其它细胞，不去除异常基因，而通过目的基因的非定点整合，使其表达产物弥补缺陷基因的功能或使原有的功能增强。目前基因治疗多采用此法。

(3) 基因失活是指将特定的序列导入细胞后，在转录或翻译水平阻断某些基因的异常表达，已达到治疗疾病的目的。

(4) 基因疫苗主要是指 DNA 疫苗，是第三代疫苗。其将编码外源性抗原的基因插入到真核表达质粒中，直接导入人体内，抗原基因在一定时间内持续表达，不断刺激机体免疫系统，达到治病或防病目的。

11 ．试述基因治疗的基本程序。

答：基本程序如下：

(1) 治疗性基因选择选择对疾病有治疗作用的特定目的基因。

(2) 基因载体的选择有病毒载体和非病毒载体，常用的是病毒载体。

(3) 靶细胞的选择基因治疗根据受体细胞种类的不同分为体细胞和生殖细胞的基因治疗，目前进行的基因治疗均是体细胞基因治疗和间接体内疗法。

(4) 基因转移基因导入人体的方式：间接体内疗法，即在体外将外源基因导入靶细胞内，再将这种基因修饰过的细胞回输病人体内，使带有外源基因的细胞在体内表达相应产物，达到治疗的目的；直接体内疗法，将外源基因直接导入体内有关的器官组织，使其进入相应细胞进行表达。

12 ．欲生产一种药用多肽，科学家已经将此多肽的基因与某真核表达质粒重组在一起。请你设计一个实验，利用 PCR 方法鉴定此重组表达质粒是否含有这一多肽的基因。答：实验步骤如下：

(1) 利用国际基因文库等信息资源，获得这一多肽的基因序列

(2) 根据多肽的基因序列，设计 PCR 引物

(3) 提取转化菌中的重组表达质粒和空载质粒

(4)PCR 扩增

(5)PCR 扩增产物的鉴定

13 ．请设计一个实验，利用酵母双杂交系统检测从某一癌组织中提取、纯化的一种未知蛋白质 X 与两种已知蛋白质 a 、 b 之间是否有相互作用。

答：实验方案如下：

(1) 测定 X 的氨基酸序列； a 与 b 氨基酸序列已知

(2) 根据氨基酸序列，推测 X 、 a 、 b 的 cDNA 序列

(3) 构建诱饵基因与猎物基因表达质粒各两种

(4) 分三组共转染酵母细胞

(5) 检测下游报告基因表达产物，若下游报告基因表达则两蛋白质之间有相互作用；否则无相互作用

表达质粒及共转染分组如下：

X 的 cDNA 与 BD 基因融合为诱饵表达质粒；

a 的 cDNA 与 AD 基因融合为猎物表达质粒；

X 的 cDNA 与 BD 基因融合为诱饵表达质粒；

b 的 cDNA 与 AD 基因融合为猎物表达质粒。

14 ．请为某一单基因遗传病（低表达或不表达）的患者设计一个基因治疗方案。

答： (1) 基因治疗方法：基因增补是指将目的基因导入病变细胞或其它细胞，不去除异常基因，而通过目的基因的非定点整合，使其表达产物弥补缺陷基因的功能或使原有的功能增强。目前基因治疗多采用此法。

( 2) 基因导入方式：间接体内疗法，即在体外将外源基因导入体细胞内，再将这种基因修饰过的细胞回输病人体内，使带有外源基因的细胞在体内表达相应产物，以达到基因治疗的目的。

(3) 基因治疗步骤：治疗性基因的选择→ 基因载体的选择→ 重组体的构建→ 靶细胞的选择→ 基因转移→ 外源基因表达的筛选→ 回输体内→ 检测疗效

a ．治疗性基因的选择：选择该单基因遗传病的野生型基因作为治疗性基因。

b ．基因载体的选择：选用重组腺病毒相关病毒作为载体

c ．靶细胞的选择：选择该患者的淋巴细胞作为靶细胞

分子生物学实验指导(精)

分子生物学实验指导生物技术教学室编宁夏大学生命科学学院 2008年8月

实验一分子生物学实验技术多媒体演示 [目的要求] 通过多媒体试验录像进一步掌握分子生物学基本操作技术。 [教学方式] 多媒体光盘演示。 [实验内容] 基本的分子生物学实验操作技术包括核酸凝胶电泳技术；质粒提取；转化；重组体的筛选；PCR技术等。

实验二琼脂糖凝胶电泳检测DNA [目的要求] 通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术 [实验原理] 琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的常用方法。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应，DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。不同浓度琼脂糖凝胶可以分离从200bp至50 kb的DNA片段。在琼脂糖溶液中加入低浓度的溴化乙锭（Ethidum bromide ,EB），在紫外光下可以检出 10ng的DNA条带，在电场中，pH8.0条件下，凝胶中带负电荷的DNA向阳极迁移。琼脂糖凝胶有如下特点： (1) DNA的分子大小在凝胶基质中其迁移速率与碱基对数目的常用对数值成反比，分子越大迁移得越慢。 (2) 琼脂糖浓度一个特定大小的线形DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率(u)的对数与凝胶浓度(t)成线性关系。 (3) 电压低电压时，线状DNA片段迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长，随着电压的增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大，所加电压不得超过5v/cm。 (4) 电泳温度DNA在琼脂糖凝胶电泳中的电泳行为受电泳时的温度影响不明显，不同大小的DNA片段其相对迁移速率在4℃与30℃之间不发生明显改变，但浓度低于0.5%的凝胶或低熔点凝胶较为脆弱，最好在4℃条件下电泳。 (5) 嵌入染料荧光染料溴化乙锭用于检测琼脂糖凝胶中的DNA，染料嵌入到堆积的碱基对间并拉长线状和带缺口的环状DNA,使其刚性更强,还会使线状迁移率降低15%。 (6) 离子强度电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA电泳迁移率。在没有离子存在时（如误用蒸馏水配制凝胶，电导率最小，DNA几乎不移动，在高离子强度的缓冲液中（如误加10×电泳缓冲液），则电导很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化。

(完整版)分子生物学试题及答案(整理版)

分子生物学试题及答案一、名词解释 1．cDNA与cccDNA：cDNA是由mRNA通过反转录酶合成的双链DNA；cccDNA是游离于染色体之外的质粒双链闭合环形DNA。 2．标准折叠单位：蛋白质二级结构单元α－螺旋与β－折叠通过各种连接多肽可以组成特殊几何排列的结构块，此种确定的折叠类型通常称为超二级结构。几乎所有的三级结构都可以用这些折叠类型，乃至他们的组合型来予以描述，因此又将其称为标准折叠单位。 3．CAP：环腺苷酸（cAMP）受体蛋白CRP（cAMP receptor protein ），cAMP与CRP结合后所形成的复合物称激活蛋白CAP（cAMP activated protein ） 4．回文序列：DNA片段上的一段所具有的反向互补序列，常是限制性酶切位点。 5．micRNA：互补干扰RNA或称反义RNA，与mRNA序列互补，可抑制mRNA的翻译。 6．核酶：具有催化活性的RNA，在RNA的剪接加工过程中起到自我催化的作用。 7．模体：蛋白质分子空间结构中存在着某些立体形状和拓扑结构颇为类似的局部区域 8．信号肽：在蛋白质合成过程中N端有15~36个氨基酸残基的肽段，引导蛋白质的跨膜。 9．弱化子：在操纵区与结构基因之间的一段可以终止转录作用的核苷酸序列。 10．魔斑：当细菌生长过程中，遇到氨基酸全面缺乏时，细菌将会产生一个应急反应，停止全部基因的表达。产生这一应急反应的信号是鸟苷四磷酸(ppGpp)和鸟苷五磷酸（pppGpp）。PpGpp与pppGpp的作用不只是一个或几个操纵子，而是影响一大批，所以称他们是超级调控子或称为魔斑。 11．上游启动子元件：是指对启动子的活性起到一种调节作用的DNA序列，-10区的TATA、-35区的TGACA 及增强子，弱化子等。 12．DNA探针：是带有标记的一段已知序列DNA，用以检测未知序列、筛选目的基因等方面广泛应用。13．SD序列：是核糖体与mRNA结合序列，对翻译起到调控作用。 14．单克隆抗体：只针对单一抗原决定簇起作用的抗体。 15．考斯质粒：是经过人工构建的一种外源DNA载体，保留噬菌体两端的COS区，与质粒连接构成。16．蓝-白斑筛选：含LacZ基因（编码β半乳糖苷酶）该酶能分解生色底物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)产生蓝色，从而使菌株变蓝。当外源DNA插入后，LacZ基因不能表达，菌株呈白色，以此来筛选重组细菌。称之为蓝-白斑筛选。 17．顺式作用元件：在DNA中一段特殊的碱基序列，对基因的表达起到调控作用的基因元件。18．Klenow酶：DNA聚合酶I大片段，只是从DNA聚合酶I全酶中去除了5’→3’外切酶活性 19．锚定PCR：用于扩增已知一端序列的目的DNA。在未知序列一端加上一段多聚dG的尾巴，然后分别用多聚dC和已知的序列作为引物进行PCR扩增。 20．融合蛋白：真核蛋白的基因与外源基因连接，同时表达翻译出的原基因蛋白与外源蛋白结合在一起所组成的蛋白质。二、填空 1． DNA的物理图谱是DNA分子的（限制性内切酶酶解）片段的排列顺序。 2． RNA酶的剪切分为（自体催化）、（异体催化）两种类型。 3．原核生物中有三种起始因子分别是（IF-1）、（IF-2）和（IF-3）。 4．蛋白质的跨膜需要（信号肽）的引导，蛋白伴侣的作用是（辅助肽链折叠成天然构象的蛋白质）。5．启动子中的元件通常可以分为两种：（核心启动子元件）和（上游启动子元件）。 6．分子生物学的研究内容主要包含（结构分子生物学）、（基因表达与调控）、（DNA重组技术）三部分。7．证明DNA是遗传物质的两个关键性实验是（肺炎球菌感染小鼠）、（ T2噬菌体感染大肠杆菌）这两个实验中主要的论点证据是：（生物体吸收的外源DNA改变了其遗传潜能）。 8．hnRNA与mRNA之间的差别主要有两点：（hnRNA在转变为mRNA的过程中经过剪接，）、（mRNA的5′末端被加上一个m7pGppp帽子，在mRNA3′末端多了一个多聚腺苷酸(polyA)尾巴）。 9．蛋白质多亚基形式的优点是（亚基对DNA的利用来说是一种经济的方法）、（可以减少蛋白质合成过程中随机的错误对蛋白质活性的影响）、（活性能够非常有效和迅速地被打开和被关闭）。 10．蛋白质折叠机制首先成核理论的主要内容包括（成核）、（结构充实）、（最后重排）。 11．半乳糖对细菌有双重作用；一方面（可以作为碳源供细胞生长）；另一方面（它又是细胞壁的成分）。所以需要一个不依赖于cAMP—CRP的启动子S2进行本底水平的永久型合成；同时需要一个依赖于cAMP—CRP的启动子S1对高水平合成进行调节。有G时转录从（ S2）开始，无G时转录从（ S1）开

《分子生物学》实验指导(2015-2016)

《分子生物学》实验指导实验1 总DNA提取生物总DNA的提取是分子生物学实验的一个重要内容。由于不同的生物材料细胞壁的结构和组成不同，而细胞壁结构的破坏是提取总DNA的关键步骤。同时细胞内的物质也根据生物种类的不同而有差异，因此不同生物采用的提取方法也不同，一般要根据具体的情况来设计实验方法。本实验介绍采用CTAB法提取植物总DNA的技术。 [实验目的] 学习和掌握学习CTAB法提取植物总DNA的基本原理和实验技术。学习和掌握紫外光吸收法鉴定DNA的纯度和浓度。 [实验原理] 植物叶片经液氮研磨，可使细胞壁破裂，加入去污剂（如CTAB），可使核蛋白体解析，然后使蛋白和多糖杂质沉淀，DNA进入水相，再用酚、氯仿抽提纯化。本实验采用CTAB法，其主要作用是破膜。CTAB 是一种非离子去污剂，能溶解膜蛋白与脂肪，也可解聚核蛋白。植物材料在CTAB的处理下，结合65℃水浴使细胞裂解、蛋白质变性、DNA 被释放出来。CTAB与核酸形成复合物，此复合物在高盐（>0.7mM）浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（0.1-0.5mM NaCl）下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。经过氯仿/ 异戊醇(24:1) 抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化DNA，最后经异丙醇或乙醇等沉淀剂将DNA沉淀分离出来。由于核酸、蛋白质、多糖在特定的紫外波长都有特征吸收。核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在260nm。纯的DNA样品A260/280≈1.8，纯的RNA样品A260/280≈2.0，并且1μg/ml DNA 溶液A260=0.020。 [实验器材] 1、高压灭菌锅 2、冰箱 3、恒温水浴锅 4、高速冷冻离心机 5、紫外分光光度计 6、剪刀 7、陶瓷研钵和杵子 8、磨口锥形瓶（50ml） 9、滴管10、细玻棒11、小烧杯（50ml）12、离心管（50ml）13、植物材料 [实验试剂] 1、3×CTAB buffer（pH8.0） 100mM Tris 25mM EDTA 1.5M NaCl 3% CTAB 2% β-巯基乙醇 2、TE缓冲液（pH8.0） 10mmol/L Tris·HCl 1mmol/L EDTA 3、氯仿-异戊醇混合液（24：1，V/V） 4、95％乙醇 5、液氮 [实验步骤] 1、称取2g新鲜的植物叶片，用蒸馏水冲洗叶面，滤纸吸干水分。 2、将叶片剪成1cm长，置预冷的研钵中，倒入液氮，尽快研磨成粉末。 3、待液氮蒸发完后，加入15mL预热（60℃）的CTAB提取缓冲液，转入一磨口锥形瓶中，

关于分子生物学试题及答案

分子生物学试题（一）一.填空题(,每题1分,共20分) 一.填空题(每题选一个最佳答案,每题1分,共20分) 1. DNA的物理图谱是DNA分子的（）片段的排列顺序。 2. 核酶按底物可划分为（）、（）两种类型。 3．原核生物中有三种起始因子分别是（）、（）和（）。 4．蛋白质的跨膜需要（）的引导，蛋白伴侣的作用是（）。5．真核生物启动子中的元件通常可以分为两种：（）和（）。6．分子生物学的研究内容主要包含（）、（）、（）三部分。 7．证明DNA是遗传物质的两个关键性实验是（）、（）。 8．hnRNA与mRNA之间的差别主要有两点：（）、（）。 9．蛋白质多亚基形式的优点是（）、（）、（）。 10.蛋白质折叠机制首先成核理论的主要内容包括（成核）、（结构充实）、（最后重排）。 11.半乳糖对细菌有双重作用；一方面（可以作为碳源供细胞生长）；另一方面（它又是细胞壁的成分）。所以需要一个不依赖于cAMP-CRP的启动子S2进行本底水平的永久型合成；同时需要一个依赖于cAMP-CRP的启动子S1对高水平合成进行调节。有G时转录从（S2 ）开始，无G时转录从（S1 ）开始。 12．DNA重组技术也称为（基因克隆）或（分子克隆）。最终目的是（把一个生物体中的遗传信息DNA转入另一个生物体）。典型的DNA重组实验通常包含以下几个步骤： ①提取供体生物的目的基因（或称外源基因），酶接连接到另一DNA分子上（克隆载体），形一个新的重组DNA分子。 ②将这个重组DNA分子转入受体细胞并在受体细胞中复制保存，这个过程称为转化。 ③对那些吸收了重组DNA的受体细胞进行筛选和鉴定。 ④对含有重组DNA的细胞进行大量培养，检测外援基因是否表达。 13、质粒的复制类型有两种：受到宿主细胞蛋白质合成的严格控制的称为（严紧型质粒），不受宿主细胞蛋白质合成的严格控制称为（松弛型质粒）。 14．PCR的反应体系要具有以下条件： a、被分离的目的基因两条链各一端序列相互补的 DNA引物（约20个碱基左右）。 b、具有热稳定性的酶如：TagDNA聚合酶。 c、dNTP d、作为模板的目的DNA序列 15．PCR的基本反应过程包括：（变性）、（退火）、（延伸）三个阶段。 16、转基因动物的基本过程通常包括： ①将克隆的外源基因导入到一个受精卵或胚胎干细胞的细胞核中； ②接种后的受精卵或胚胎干细胞移植到雌性的子宫；

分子生物学复习题(有详细答案)

绪论思考题：（P9） 1.从广义和狭义上写出分子生物学的定义？广义上讲的分子生物学包括对蛋白质和核酸等生物大分子结构与功能的研究，以及从分子水平上阐明生命的现象和生物学规律。狭义的概念，即将分子生物学的范畴偏重于核酸（基因）的分子生物学，主要研究基因或DNA结构与功能、复制、转录、表达和调节控制等过程。其中也涉及与这些过程相关的蛋白质和酶的结构与功能的研究。 2、现代分子生物学研究的主要内容有哪几个方面？什么是反向生物学？什么是后基因组时代？研究内容： DNA的复制、转录和翻译；基因表达调控的研究；DNA重组技术和结构分子生物学。反向生物学：是指利用重组DNA技术和离体定向诱变的方法研究已知结构的基因相应的功能，在体外使基因突变，再导入体内，检测突变的遗传效应，即以表型来探索基因结构。后基因组时代：研究细胞全部基因的表达图式和全部蛋白质图式，人类基因组研究由结构向功能转移。 3、写出三个分子生物写学展的主要大事件（年代、发明者、简要内容） 1953年Watson和Click发表了?脱氧核糖核苷酸的结构?的著名论文，提出了DNA的双螺旋结构模型。 1972~1973年，重组DNA时代的到来。H.Boyer和P.Berg等发展了重组DNA 技术，并完成了第一个细菌基因的克隆，开创了基因工程新纪元。 1990~2003年美、日、英、法、俄、中六国完成人类基因组计划。解读人类遗传密码。 4、21世纪分子生物学的发展趋势是怎样的？随着基因组计划的完成，人类已经掌握了模式生物的所有遗传密码。又迎来了后基因组时代，人类基因组的研究重点由结构向功能转移。相关学说理论相应诞生，如功能基因组学、蛋白质组学和生物信息学。生命科学又进入了一个全新的时代。第四章思考题：（P130） 1、基因的概念如何？基因的研究分为几个发展阶段？概念：基因是原核、真核生物以及病毒的DNA和RNA分子中具有遗传效应的核苷酸序列，是遗传的基本单位和突变单位以及控制形状的功能单位。发展阶段：○120世纪50年代以前，主要从细胞的染色体水平上进行研究，属于基因的染色体遗传学阶段。 ○220世纪50年代以后，主要从DNA大分子水平上进行研究，属于分

分子生物学实验心得体会

关于分子生物学实验的体会梁慧媛（生技01 级）不知不觉间，一年的时间就这样流逝了，与分子生物实验相伴，对我而言，的确不同寻常。并不仅仅是学习生物学实验技术和方法的宝贵经历，它意味着更多。首先是实验条件、实验过程、实验设计的完备性，从这里可以初步感受到生物学研究的科学性与严肃性，自己可以得到宝贵的机会，亲身体会生物学研究的苦辣酸甜。一直一直喜欢，得到正确实验结果时刻的畅快感，那是无法言明的欣慰感，一次身心彻底地放松，可以将所有一整天来积累的疲劳抛之身后，即使仅仅是小小的成功，也会让我们兴奋不已。在整理资料，将一年来保存的记录一遍一遍的翻看，重温其中的特别滋味，我，轻轻地笑了。我，喜欢这里，喜欢生物学。失误是常有的，经历过吃惊、后悔、无奈，检讨分析，最后重新开始。一波三折的记忆清晰的印在脑海中，这种深深的挫折感，再试一次的勇气，我会一生记取的。一年间，随着对生物学实验知识和技能的进一步学习，我更坚定了自己学习生物学的志向，感谢分子生物学实验的"试炼" 。分子生物学实验心得体会刘东强（生科01 级）分子生物学实验室本科生第一次接触到了真正培养实验能力的实验课，它不同于我们在大二开的植物、动物、微生物等实验课。在这些课上，主要以制备样品并观察样品的形态、结构特征为主，这是由于我们当时正值大二，专业知识还远不够。随着以后理论课学习的深入，我们开始了分子生物学实验的学习，这无疑对于深刻巩固我们理论课上学到的知识是有帮助的，也进一步加深了对原有知识的理解，如启动子的概念、类型、PCR的原理等。另外，在实验课中，我们掌握并学会如何运用分子生物学研究中的一些基本实验技术，如质粒的提取、总RNA 的制备、PCR 技术等。我们的实验动手能力通过亲身接触实验过程并亲自设计一些实验得到了提高，使我们不再象刚开始做分子生物学实验的时候照搬实验指导上的实验步骤，而是通过我们自己的思考，根据现有的实验条件，对原有的步骤作必要的改进。此外，通过这门实验课的学习，我们形成了严谨的态度，如有时得出的实验结果与理论不符，我们渐渐养成了仔细分析实验结果的习惯，查找在实验设计或操作过程中出现的问题，同时对理论知识认识得更清楚。总之，我认为，分子生物学实验课，是称得上实用、精彩、有意思的好实验，对于今后我的研究或工作很有价值刘佳凝（生技01 级）一学期的分子生物学实验对我来说很重要，同时通过一学期的实践让我给分子生物学有了较深入地体会： 1、很感谢由我系生化组老师们编写的这本实验指导。里面的实验原理与操作步骤都清晰易懂，有助于我

(完整版)分子生物学》试题及答案

《分子生物学》考试试题B 课程号：66000360 考试方式：闭卷考试时间：一、名词解释（共10题，每题2分，共20分） 1. SD 序列 2. 重叠基因 3．ρ因子 4．hnRNA 5. 冈崎片段、 6. 复制叉(replication fork) 7. 反密码子(anticodon)： 8. 同功tRNA 9. 模板链(template strand) 10. 抑癌基因二、填空题（共20空，每空1分，共20分） 1.原核基因启动子上游有三个短的保守序列,它们分别为____和__区. 2.复合转座子有三个主要的结构域分别为______、______、________。 3.原核生物的核糖体由_____小亚基和_____大亚基组成，真核生物核糖糖体由_____小亚基和_______大亚基组成。 4.生物界共有___个密码子，其中__ 个为氨基酸编码，起始密码子为__ _______；终止密码子为_______、__________、____________。 5. DNA生物合成的方向是_______，冈奇片段合成方向是_______。 6.在细菌细胞中，独立于染色体之外的遗传因子叫_______。它是一

种_______状双链DNA，在基因工程中，它做为_______。三．判断题（共5题，每题2分，共10分） 1.原核生物DNA的合成是单点起始，真核生物为多点起始。( ) 2.在DNA生物合成中，半保留复制与半不连续复制指相同概念。( ) 3.大肠杆菌核糖体大亚基必须在小亚基存在时才能与mRNA结合。( ) 4.密码子在mRNA上的阅读方向为5’→ 3’。( ) 5.DNA复制时，前导链的合成方向为5’→ 3’，后随链的合成方向也是5’→ 3’。（）四、简答题（共6题，每题5分，共30分） 1.简述三种RNA在蛋白质生物合成中的作用。 2.蛋白质合成后的加工修饰有哪些内容? 3.简述人类基因组计划的主要任务。 4.简述现代分子生物学的四大研究热点。 5.何谓转座子?简述简单转座子发生转座作用的机理。 6.简述大肠杆菌乳糖操纵子与色氨酸操纵子在阻遏调控机制上有那些区别？四、问答题（共2题，共20分） 1.叙述蛋白质生物合成的主要过程。（10分） 2.请叙述真核基因的表达调控主要发生在那些环节？分别是怎样进行的？（10分）

分子生物学常用实验指南

生命科学系 2011-2012学年度分子生物学实验（0801班）

2011-2012学年度分子生物学实验指导实验一大肠杆菌感受态细胞的制备 (3) 实验二质粒DNA的转化 (4) 实验三质粒DNA的提取 (5) 实验四琼脂糖凝胶电泳检测DNA (7) 实验五PCR基因扩增 (9) 实验六DNA重组 (10) 实验七蓝白斑筛选实验 (11) 实验八DNA酶切技术 (13)

实验一大肠杆菌感受态细胞的制备一、实验目的：掌握大肠杆菌感受态细胞的制备技术二、实验原理：感受态——细菌处在容易吸收外源DNA的状态。我们选用经过基因改造的生物工程菌株——大肠杆菌top10菌株为材料，在0℃、CaCl2低渗溶液处理，细胞壁破坏，细胞成为球型原生质体。因而具备了吸收外源DNA的能力。三、仪器：1.超净工作台 2.低温离心机 3.恒温摇床 4.紫外分光光度仪四、材料与试剂： 1.大肠杆菌top10菌株 2. 0.1mol/L CaCl2溶液500mL、 0.2mol/L CaCl2溶液50mL 3..LB液体及固体培养基 4.50%甘油500mL（灭菌）五、实验操作步骤： 1.从大肠杆菌top10菌株平板上挑取一个单菌落，接种于3mL LB液体培养基中， 37℃振荡（200r/min）培养过夜。 2.次日早上取0.4mL菌液转接到40mL LB液体培养基中，37℃震荡培养2～3h.(A600 应在0.4～0.5之间) 3.将菌液置冰浴中10min。（同时将0.1mol/L CaCl2溶液、50%甘油预冷） 4.取菌液1.5mL，4℃离心2min（3500r/min）.弃上清，再加菌液1.5mL，4℃再离心一次，弃上清，倒置以便使培养液流尽。 5.用冰冷的0.1mol/L CaCl2溶液1mL悬浮细胞（轻轻涡旋使悬浮），立即置冰浴保温30min。 6.4℃离心2min（3500r/min），弃上清，加入100μL冰冷的0.2mol/L CaCl2溶液、 100μL50%甘油轻轻手摇悬浮，置冰浴上，接着进行质粒DNA转化，或-70℃保存。

分子生物学实验指导-3

北京化工大学分子生物学实验指导

实验一少量质粒DNA的制备一、实验目的（1）了解质粒的特性及其在分子生物学研究中的作用。（2）掌握质粒DNA分离、纯化的原理。（3）学习碱裂解法分离质粒DNA的方法。二、实验原理质粒（plasmid）是一种双链的共价闭环状的DNA分子，它是染色体外能够稳定遗传得因子。质粒具有复制和控制机构，能够在细胞质中独立自主地进行自身复制，并使子代细胞保持它们恒定的拷贝数。从细胞生存来看，没有质粒存在，基本上不妨碍细胞的存活，因此质粒是寄生性的复制子。根据质粒的这种特性，通常采用DNA体外重组技术和微生物转化等基因工程的技术和方法，使重组到质粒的某种基因（如干扰素基因）带进受体细胞（如具有一定特性的大肠杆菌细胞等）表达它的遗传性质，改变或修饰寄主细胞原有的代谢产物，或产生新的物质（如干扰素）。目前，质粒已广泛地用作基因工程中的DNA分子无性繁殖的运载体，同时它也是研究DNA结构与功能的较好模型。在细菌细胞中，质粒DNA通常为染色体DNA的2%左右，但是细菌质粒DNA的含量与其复制类型有关。质粒在细胞内的复制，一般分为两种类型：严密控制（stringent control）复制型和松弛控制型（relaxed control）复制型。严密控制复制型的质粒只在细胞周期的一定阶段进行复制，染色体不复制时，质粒也不复制。每个细胞内只含1个或几个质粒分子（即有1个或几个拷贝）。松弛控制复制型的质粒在整个细胞周期中随时可以复制，当染色体复制已经停止时，该质粒仍然能够继续复制。该质粒在一个细胞内有许多拷贝，一般在20个以上，例如col E1 质粒（含有产生大肠杆菌素E1 基因）及其衍生质粒，在每个细胞内约有20多个拷贝。所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。目前应用于质体DNA的纯化或抽取的方法众多，例如碱溶裂法（alkaline lysis）、热裂解法（boiling method）、氯化铯（CsCl）纯化法，及市售柱层析套管法等。最常用的碱裂解法具效率高、价廉、简单易学等优点。其原理是利用碱处理质粒DNA及染色体DNA，使两者双股打开呈单股状态，再加酸中和，使单股回复为双股DNA，同时在急速中和反应中，染色体DNA因分子过于庞大以致于碱基匆忙配对，形成杂乱无序的巨大分子，对水的相对溶解度低而易被沉淀下来。相反，质粒DNA因分子小，两单股DNA恢复原碱基配对快而易溶于水中，所以只要经过离心，即可将染色体DNA与质体DNA分离。本实验所使用的pUC19含有β-lactamase基因，会产生peripasmic酶，进行蓝白斑筛选，抗氨苄青霉基因ampicillin (Amp)两种抗性筛选标记。碱裂解法：本实验是以alkaline lysis的方法进行，其原理是将大肠杆菌以NaOH及SDS分解，并使蛋白质及DNA变性，然后以酸中和。小分子质粒DNA在中和后可恢复原状，但大部

分子生物学题(含答案)

1.哪些因素引起DNA的突变？简要叙述生物体存在的修复方式。突变引起的物理因素：辐射、紫外线等，化学因素：聚乙二醇，致癌物质等，生物因素：仙台病毒等。修复方式：错配修复恢复错配切除修复（碱基、核苷酸）切除突变的碱基和核苷酸片段重组修复复制后的修复，重新启动停滞的复制叉 DNA直接修复修复嘧啶二体或甲基化DNA SOS系统DNA的修复，导致变异 2.描述乳糖操纵子的调控机制。（看不懂题目，乱写的）乳糖操纵子的调控属于可诱导调节。在以乳糖为碳源的培养基中，在单个透过酶分子的作用下，少量乳糖分子进入细胞，又在单个β-半乳糖苷酶分子作用下转变成异构乳糖。某个异构乳糖与结合在操纵区上的阻遏物结合后使后者失活离开操纵区，开始了lac mRNA的生物合成。Lac mRNA翻译后生成大量的透过酶和β-半乳糖苷酶，加速了乳糖分子的转变。当乳糖分子都被消耗完毕时，阻遏物仍在不断被合成，有活性的阻遏物浓度超过了异构乳糖浓度，使细胞重新建立起阻遏状态，导致lac mRNA合成被抑制。mRNA半衰期短，不到一个世代生长期，mRNA几乎从细胞消失，透过酶和β-半乳糖苷酶的合成也趋于停止。 3.简述DNA半保留复制的概念。每个子代分子的一条链来自亲代DNA，另一条链则是新合成的，这种复制方式被称为DNA的半保留复制。 4.对生物体转录和复制的特征进行说明比较？（网上找的） DNA复制和RNA转录在原理上是基本一致的，体现在：①这两种合成的直接前体是核苷三磷酸，从它的一个焦磷酸键获得能量促使反应走向合成；②两种合成都需要RNA聚合酶和四种核苷酸；③两种合成都是以DNA为模板；④合成前都必须将双链DNA解旋成单链；⑤合成的方向都是5’→ 3’。 DNA复制和RNA转录的不同点体现在：①复制和转录所用的酶是不同的，复制用的是DNA聚合酶，而转录用的是RNA聚合酶；②所用前体核苷三磷酸种类不同，DNA复制用四种脱氧核糖核苷三磷酸，即dA TP、dGTP、dCTP、dTTP，而RNA转录用四种核糖核苷三磷酸，即A TP、GTP、CrP、UTP做前体底物；③在DNA复制时是A与T配对，而RNA转录是A与U配对；④DNA复制时两条链均做模板，而RNA转录时只以其中一条链为模板；⑤DNA复制是半不连续的，可产生冈崎片段，而RNA转录是连续的；⑥DNA复制时需RNA做引物，而RNA转录无需引物；⑦DNA复制时需连接酶的参与，而RNA 转录时不需要。 5.阐述蛋白质生物合成途径氨基酸的活化→翻译的起始（核糖体结合mRNA且甲硫氨酰-tRNA*结合到核糖体）→肽链的延伸（后续AA-tRNA与核糖体的结合，肽键生成，移位）→肽链终止→蛋白质前体加工→蛋白质的折叠 6.简要叙述真核生物mRNA的转录后加工的方式，这些加工方式各有何意义 RNA的编辑：某些RNA，特别是mRNA前体的一种加工方式，如插入、删除或取代一些核苷酸残基，导致DNA所编码的遗传信息的改变。因为经过编辑的mRNA序列发生了不同于模板DNA的变化。生物学意义：校正作用有些基因突变在突变过程中丢失的遗传信息可能通过RNA的编辑得以回复

分子生物学实验报告

分子生物学实验院系：生命科学与技术学院专业：生物科学（基地）班级：201101班学号：：

分子生物学基础实验分子生物学实验技术已成为生物化学及分子生物学以及相关学科院系教学科研不可缺少的一部分。为提高学生在分子生物学技术方面的动手能力，生物技术综合实验室主要开设常用而基本的分子生物学实验技术。它的容包括质粒DNA的制备；DNA的重组；PCR 基因扩增等等。实验一质粒DNA的小量制备一、实验原理要把一个有用的外源基因通过基因工程手段，送进细胞中去进行繁殖和表达，需要运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具就叫载体（vector）。载体的设计和应用是DNA体外重组的重要条件。作为基因工程的载体必须具备下列条件:(1)是一个复制子，载体有复制点才能使与它结合的外源基因复制繁殖；（2）载体在受体细胞中能大量增殖，只有高复制率才能使外源基因在受体细胞量扩增；（3）载体DNA链上有1到几个限制性切酶的单一识别与切割位点，便于外源基因的插入；（4）载体具有选择性的遗传标记，如有抗四环素基因（Tc r），抗新霉素基因（Ne r）等，以此知道它是否已进入受体细胞，也可根据这个标记将受体细胞从其他细胞中分离筛选出来。细菌质粒具备上述条件，它是基因工程中常用的载体之一。质粒（plasmid）是一种染色体外的稳定遗传因子，大小在1～120kb之间，具有双链闭合环状结构的DNA分子，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。质粒具有自主复制和转录能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。它可独立游离在细胞质，也可以整合到细菌染色体中，它离开宿主的细胞就不能存活，而它控制的许多生物学功能也是对宿主细胞的补偿。质粒在细胞的复制，一般分为两种类型：严密控制型（stringent control）和松弛控制型（relaxed control）。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，染色体不复制时，它也不复制。每个细胞只含有1个或几个质粒分子。后者的质粒在整个细胞周期中随时复制，在细胞里，它有许多拷贝，一般在20个以上。通常大的质粒如F因子等，拷贝数较少，复制受到严格控制。小的质粒，如ColE Ⅰ质粒（含有产生大肠杆菌素E1基因），拷贝数较多，复制不受严格控制。在使用蛋白质合成抑制剂－氯霉素时，染色体DNA复制受阻，而松弛型ColEⅠ质粒继续复制12－16h，由原来20多个拷贝可扩增至1000－3000个拷贝，此时质粒DNA占总DNA的含量由原来的2％增加到40％－50％。本实验分离提纯化的质粒pBR322、pUC19就是由ColE Ⅰ衍生的质粒。所有分离质粒DNA的方法都包括三个基本步骤:培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细

分子生物学试题及答案

生命科学系本科2010-2011 学年第1 学期试题分子生物学（ A ）答案及评分标准一、选择题，选择一个最佳答案（每小题 1 分，共15分） 1、1953 年Watson和Crick 提出（A ） A、多核苷酸DNA链通过氢键连接成一个双螺旋 B、D NA 的复制是半保留的，常常形成亲本——子代双螺旋杂合链 C、三个连续的核苷酸代表一个遗传密码 D、遗传物质通常是DNA而非RNA 2、基因组是（D ） A、一个生物体内所有基因的分子总量 B、一个二倍体细胞中的染色体数 C、遗传单位 D、生物体的一个特定细胞内所有基因的分子总量 3、下面关于DNA 复制的说法正确的是（D ） A、按全保留机制进行 B、按3Z V方向进行 C、需要4种NTP加入 D、需要DNA聚合酶的作用 4、当过量的RNA 与限量的DNA 杂交时（A ） A、所有的DNA均杂交 B、所有的RNA均杂交 C、50%的DNA 杂交 D、50%的RNA 杂交 5、以下有关大肠杆菌转录的叙述，哪一个是正确的？（ B ） A、-35 区和-10区序列间的间隔序列是保守的 B、-35 区和-10区序列距离对转录效率非常重要 C、转录起始位点后的序列对于转录效率不重要 D、-10区序列通常正好位于转录起始位点上游1Obp处 6、真核生物mRNA 转录后加工不包括（A ） A、加CCA—OH B、5,端帽子”结构 C、3,端poly （A）尾巴 D、内含子的剪接 7、翻译后的加工过程不包括（ C ） A、N端fMet或Met的切除 B、二硫键的形成 C、3,末端加poly （A ）尾 D、特定氨基酸的修饰

8、有关肽链合成的终止，错误的是（C ） A、释放因子RF具有GTP酶活性 B、真核细胞中只有一个终止因子 C、只要有RF因子存在，蛋白质的合成就会自动终止 D、细菌细胞内存在3种不同的终止因子：RF1、RF2、RF3 9、酵母双杂交体系被用来研究（C） A、哺乳动物功能基因的表型分析 B、酵母细胞的功能基因 C、蛋白质的相互作用 D、基因的表达调控 10、用于分子生物学和基因工程研究的载体必须具备两个条件（B） A、含有复制原点，抗性选择基因 B、含有复制原点，合适的酶切位点 C、抗性基因，合适的酶切位点 11、原核生物基因表达调控的意义是（D） A、调节生长与分化 B、调节发育与分化 C、调节生长、发育与分化 D、调节代谢，适应环境 E、维持细胞特性和调节生长 12、乳糖、色氨酸等小分子物质在基因表达调控中作用的共同特点是（E） A、与DNA结合影响模板活性 B、与启动子结合 C、与操纵基因结合 D、与RNA聚合酶结合影响其活性 E、与蛋白质结合影响该蛋白质结合DNA 13、Lac阻遏蛋白由（D ）编码 A、Z基因 B、Y基因 C、A基因 D、I基因 14、紫外线照射引起DNA损伤时，细菌DNA修复酶基因表达反应性增强，这种现象称为（A） A、诱导 B、阻遏 C、正反馈 D、负反馈 15、ppGpp在何种情况下被合成？（A） A、细菌缺乏氮源时 B、细菌缺乏碳源时 C、细菌在环境温度太高时 D、细菌在环境温度太低时 E、细菌在环境中氨基酸含量过高时、填空题（每空1分，共10 分）

分子生物学实验室常用仪器及使用方法.

实验指导目录实验一分子生物学实验室常用仪器及使用方法实验二质粒 DNA 的提取-碱裂解法实验三琼脂糖凝胶电泳实验四限制性内切核酸酶的酶切与鉴定实验五大肠杆菌感受态细胞的制备及转化实验六动物组织细胞基因组 DNA 提取实验七 DNA 的定量实验八 PCR 基因扩增实验九琼脂糖凝胶电泳分离与纯化目的 DNA 实验十 DNA 重组实验十一动物组织细胞总 RNA 的提取实验一分子生物学实验室常用仪器及使用事实证明, 在科学飞速发展的今天, 无论从事哪个领域的研究,要想突破,除了有良好的理论基础外,更重要的是依赖于先进的技术和优良的仪器设备以及良好的研究环境。一个标准的分子生物学实验室除了具有一般生物学实验室的常规仪器设备外, 还具有一些特殊用途的仪器, 这些仪器一般较精密, 价格昂贵。下面介绍这些仪器的使用方法和注意事项。一、冷冻离心机

低温分离技术是分子生物学研究中必不可少的手段。基因片段的分离、酶蛋白的沉淀和回收以及其它生物样品的分离制备实验中都离不开低温离心技术 , 因此低温冷冻离心机成为分子生物学研究中必备的重要仪器。在国内, 有多个厂家生产冷冻离心机, 本实验室的高速冷冻离心机为 GL-20G-Ⅱ型(上海安亭 ,落地式。配有角式转头:6×50ml 、 12×10ml 和 12×1.5ml 。极限转速 20000rpm 。 1. 安装与调试离心机应放置在水平坚固的地面上,应至少距离 10cm 以上且具有良好的通风环境中,周围空气应呈中性,且无导电性灰尘、易燃气体和腐蚀性气体,环境温度应在 0~30℃之间,相对湿度小于 80%。试转前应先打开盖门,用手盘动转轴,轻巧灵活,无异常现象方可上所用的转头。转子准确到位后打开电源开关,然后用手按住门开关, 再按运转键,转动后立即停止,并观察转轴的转向,若逆时针旋转即为正确,机器可投入使用。 2. 操作程序 (1插上电源, 待机指示灯亮; 打开电源开关,调速与定时系统的数码管显示的闪烁数字为机器工作转速的出厂设定,温控系统的数码管显示此时离心腔的温度。 (2设定机器的工作参数,如工作温度,运转时间,工作转速等。 (3将预先平衡好的样品放置于转头样品架上,关闭机盖。 (4按控制面板的运转键,离心机开始运转。在预先设定的加速时间内,其运速升至预先设定的值。 (5 在预先设定的运转时间内(不包括减速时间 , 离心机开始减速,其转速在预先设定的减速时间内降至零。 (6按控制面板上的停止键,数码管显示 dedT ,数秒钟后即显示闪烁的转速值,这时机器已准备好下一次工作。

分子生物学试题及答案(20200524090730)

生命科学系本科2010-2011学年第1学期试题分子生物学（A）答案及评分标准一、选择题，选择一个最佳答案（每小题1分，共15分） 1、1953年Watson和Crick提出（ A ） A、多核苷酸DNA链通过氢键连接成一个双螺旋 B、DNA的复制是半保留的，常常形成亲本——子代双螺旋杂合链 C、三个连续的核苷酸代表一个遗传密码 D、遗传物质通常是DNA而非RNA 2、基因组是（ D ） A、一个生物体内所有基因的分子总量 B、一个二倍体细胞中的染色体数 C、遗传单位 D、生物体的一个特定细胞内所有基因的分子总量 3、下面关于DNA复制的说法正确的是（ D ） A、按全保留机制进行 B、按3＇→５＇方向进行 C、需要4种NTP加入 D、需要DNA聚合酶的作用 4、当过量的RNA与限量的DNA杂交时（ A ） A、所有的DNA均杂交 B、所有的RNA均杂交 C、50%的DNA杂交 D、50%的RNA杂交 5、以下有关大肠杆菌转录的叙述，哪一个是正确的？（ B ） A、-35区和-10区序列间的间隔序列是保守的 B、-35区和-10区序列距离对转录效率非常重要 C、转录起始位点后的序列对于转录效率不重要 D、-10区序列通常正好位于转录起始位点上游10bp处 6、真核生物mRNA转录后加工不包括（ A ） A、加CCA—OH B、5＇端“帽子”结构 C、3＇端poly（A）尾巴 D、内含子的剪接 7、翻译后的加工过程不包括（ C ） A、N端fMet或Met的切除 B、二硫键的形成 C、3＇末端加poly（A）尾 D、特定氨基酸的修饰

— 8、有关肽链合成的终止，错误的是（ C ） A、释放因子RF具有GTP酶活性 B、真核细胞中只有一个终止因子 C、只要有RF因子存在，蛋白质的合成就会自动终止 D、细菌细胞内存在3种不同的终止因子：RF1、RF2、RF3 9、酵母双杂交体系被用来研究（ C ） A、哺乳动物功能基因的表型分析 B、酵母细胞的功能基因 C、蛋白质的相互作用 D、基因的表达调控 10、用于分子生物学和基因工程研究的载体必须具备两个条件（ B ） A、含有复制原点，抗性选择基因 B、含有复制原点，合适的酶切位点 C、抗性基因，合适的酶切位点 11、原核生物基因表达调控的意义是（ D ） A、调节生长与分化 B、调节发育与分化 C、调节生长、发育与分化 D、调节代谢，适应环境 E、维持细胞特性和调节生长 12、乳糖、色氨酸等小分子物质在基因表达调控中作用的共同特点是（ E ） A、与DNA结合影响模板活性 B、与启动子结合 C、与操纵基因结合 D、与RNA聚合酶结合影响其活性 E、与蛋白质结合影响该蛋白质结合DNA 13、Lac阻遏蛋白由（ D ）编码 A、Z基因 B、Y基因 C、A基因 D、I基因 14、紫外线照射引起DNA损伤时，细菌DNA修复酶基因表达反应性增强，这种现象称为（ A ） A、诱导 B、阻遏 C、正反馈 D、负反馈 15、ppGpp在何种情况下被合成？（ A ） A、细菌缺乏氮源时 B、细菌缺乏碳源时 C、细菌在环境温度太高时 D、细菌在环境温度太低时 E、细菌在环境中氨基酸含量过高时

分子生物学实验报告

分子生物学实验报告专业：****** 班级：*** 指导老师：** 学生姓名：*** 目录：实验一质粒DNA的小量制备实验二DNA的含量、纯度与分子量的电泳法测定实验三感受态细胞的制备及转化实验四PCR扩增技术与琼脂糖凝胶电泳检测分子生物学基础实验分子生物学实验技术已成为生物化学及分子生物学以及相关学科院系教学科研不可缺少的一部分。为提高学生在分子生物学技术方面的动手能力，生物技术综合实验室主要开设常用而基本的分子生物学实验技术。它的内容包括质粒DNA的制备；DNA的重组；PCR基因扩增等等。实验一质粒DNA的小量制备一、实验原理要把一个有用的外源基因通过基因工程手段，送进细胞中去进行繁殖和表达，需要运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具就叫载体（vector）。载体的设计和应用是DNA体外重组的重要条件。作为基因工程的载体必须具备下列条件:(1)是一个复制子，载体有复制点才能使与它结合的外源基因复制繁殖；（2）载体在受体细胞中能大量增殖，只有高复制率才能使外源基因在受体细胞中大量扩增；（3）载体DNA链上有1到几个限制性内切酶的单一识别与切割位点，便于外源基因的插入；（4）载体具有选择性的遗传标记，

如有抗四环素基因（Tc r），抗新霉素基因（Ne r）等，以此知道它是否已进入受体细胞，也可根据这个标记将受体细胞从其他细胞中分离筛选出来。细菌质粒具备上述条件，它是基因工程中常用的载体之一。质粒（plasmid）是一种染色体外的稳定遗传因子，大小在1～120kb之间，具有双链闭合环状结构的DNA分子，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。质粒具有自主复制和转录能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。它可独立游离在细胞质内，也可以整合到细菌染色体中，它离开宿主的细胞就不能存活，而它控制的许多生物学功能也是对宿主细胞的补偿。质粒在细胞内的复制，一般分为两种类型：严密控制型（stringent control）和松弛控制型（relaxed control）。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，染色体不复制时，它也不复制。每个细胞内只含有1个或几个质粒分子。后者的质粒在整个细胞周期中随时复制，在细胞里，它有许多拷贝，一般在20个以上。通常大的质粒如F因子等，拷贝数较少，复制受到严格控制。小的质粒，如ColE Ⅰ质粒（含有产生大肠杆菌素E1基因），拷贝数较多，复制不受严格控制。在使用蛋白质合成抑制剂－氯霉素时，染色体DNA复制受阻，而松弛型ColEⅠ质粒继续复制12－16h，由原来20多个拷贝可扩增至1000－3000个拷贝，此时质粒DNA占总DNA的含量由原来的2％增加到40％－50％。本实验分离提纯化的质粒pBR322、pUC19就是由ColE Ⅰ衍生的质粒。所有分离质粒DNA的方法都包括三个基本步骤:培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。采用溶菌酶可破坏菌体细胞壁，十二烷基硫酸钠（SDS）可使细胞壁解，经溶菌酶和阴离子去污剂（SDS）处理后，细菌染色体DNA缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀出来，而质粒DNA则留在清液中。用乙醇沉淀、洗涤，可得到质粒DNA。质粒DNA的相对分子量一般在106－107范围内，如质粒pBR322的相对分子质量为2.8×106，质粒pUC19的相对分子质量为1.7×106。在细胞内，共价闭环DNA（covalently closed circular DNA，简称cccDNA）常以超螺旋形式存在。如果两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，这种松弛型的分子叫做开环DNA（open circular DNA，简称ocDNA）。在电泳时，同一质粒如以cccDNA形式存在，它比其开环和线状DNA的泳动速度快，因此在本实验中，自制质粒DNA在电泳凝胶中呈现3条区带。二、实验目的 1．掌握最常用的提取质粒DNA的方法和检测方法。 2．了解制备原理及各种试剂的作用。三、实验材料和试剂材料：大肠杆菌E.coli，含pBR322质粒。试剂：

第五章 分子生物学常用技术 习题

分子生物学实验指导(精)

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