膜片钳技术资料汇编
丁香园膜片钳技术讨论区
资料汇编
整理人：xiaoxuanzi
发起人：tianx775
2006年6月
目录
第一节膜片钳技术介绍 (1)
应用 (1)
基本概念 (2)
第二节仪器操作和维护 (3)
仪器的使用 (3)
噪声 (4)
玻璃微电极的制备 (5)
第三节 实验操作 (7)
1.细胞的分离、培养 (7)
(1)心肌细胞 (7)
(2)平滑肌细胞 (17)
(3)其他细胞 (19)
2.电极的拉制与电镀 (23)
3.电极内外液与渗透压 (25)
4.串联、封接、电极电阻 (28)
5.补偿 (37)
6.刺激方案 (40)
7.动作电位记录 (42)
8.电流记录 (42)
(1)钙电流 (42)
(2)钾电流 (45)
(3)钠电流 (47)
(4)其他电流 (48)
9.穿孔 (50)
10.单通道记录 (51)
11.脑片 (54)
12.数据分析与处理 (55)
第四节 相关电子文献及书籍 (61)
第一节 膜片钳技术介绍
一、应用
1.全细胞记录技术的应用
[Cactuswzw]（1）离子通道宏观性质的分析，例如，离子通道的性质和分类(电压门控通道、膜受体激活通道、配体门控通道、胞内第二信使激活通道等)
（2）离子通道微观性质分析，例如单一离子通道活动的测定的测定，离子通道的构造，分布和机能的分析等。
（3）膜电容的测量及其对细胞分泌活动的研究。
（4）胞内钙离子浓度和钙通道电流的同时定量检测。
（5）组织切片的全细胞记录。
(6)植物细胞的电生理研究。
二、基本概念
1.刚刚接触patch，有些概念都很模糊
holding potential与command potential？
Axon200B的放大器控制面板上有ext. command，又是什么东东？
都分别什么时候给予？
在我理解，pipette capacity compesation就是快电容补偿，而Cm补
偿为慢电容补偿，那为何Axon200B的面板上在pipette capacitance compensation下面列了FAST和SLOW的magnitude以及时间常数的调节
扭？
[baxiansheng]Holding potential 是钳制电压，这是实验中从头至尾
通过电极用于钳制细胞的一个电压，和膜电位的关系取决于采用的实验
模式。而command voltage是在holding potential基础上施加的刺激
方案，比如全细胞实验中可以设置Holding potential在-80mV，然后
去极化至+10mV 400ms，那么这个去极化至+10mV的方波就是command
voltage，当然command voltage的设置可以根据实验设置得更复杂。
Axon200B放大器控制面板的ext. command是用于接外接刺激器的，通
过外接刺激器来施加command voltage，当然现在完全由计算机代替了。
pipette capacity是电极电容，因为时间常数小，所以称快电容，而
Cm是膜电容，因为时间常数大，所以称为慢电容。Axon200B的面板上
在pipette capacitance compensation下面列了FAST和SLOW的
magnitude以及时间常数的调节扭，那是对电极电容的补偿方式。实际
上电极电容中也有一些时间常数较大的成分，单纯补偿FAST效果并不
完美，需要再稍稍调节一下SLOW。
2.我的课题是关于心血管系统中离子通道方面的研究。离子通道一般有备
用关闭状态（close），激活状态（active）和失活状态（inavtive）。但
最近我看文献有去激活状态,英文为deactivation,我想跟失活肯定不是
一个概念，但又找不到确切的含义，有谁能帮我解释一下这几种通道状
态个代表什么含义？
[coolworm]C<----->O<------->I
这里，C: 关闭
O：开放
I：失活
激活(activation：从C到O的过程。
失活(inavtivation)：从O到I的过程。
去激活(deactivation)：I 回到C的过程。
3.请问，有没有人知道，电压钳和电流钳的区别，电流钳的英文是不是
current-clamp?多谢！
[xuji007] 电压钳应该就是钳制住电压来测电流，电流钳就是钳制住电流来测电压。
电流钳就是current-clamp。
4.请教整流的定义，以及内向整流、外向整流的区别，我只知整流是一种
电学特性，并且成为诸如钾通道分类的标准，但对上述确切含义还很模糊，请高手赐教！
[xuji007]我不是高手，只是谈谈自己的理解。
如果膜只是一个单纯的电阻的话，那么通过它的电流就应该和电压是线性的关系。但由于通道的存在，这种线性关系就会被改变。比如Ik1,它的电流随电压增大的趋势会随着电压的增大而逐渐减弱，也就是内向整流了。
还请高手之指正。
[dingyinyuan]所谓整流一般是相对离子通道电流的电压依赖性的线性关系而言，内向整流指离子通道电流随电压的升高而降低，I-V曲线位于相对偏向下。如心肌细胞IK1 。外向整流指离子通道电流随电压的升高而更高超过电压依赖性的线性关系电流值，I-V曲线位于相对偏向上。
[心潮澎湃]依据欧姆定律：R=U/I，若U增大，但是I不是按比例增大，即为整流。若U增大，I增大的幅度减小，I-V曲线向下弯曲，则为内向整流，如IK1的部分外向电流，反之，如U增大，I增大的幅度增加，I-V曲线向上弯曲，则为外向整流，如ITO电流，整流与除极和复极有一定联系。
[baxiansheng]rectifying “整流”，是借用物理电子学的一个概念，大家都知道“整流二极管”，在一个方向电阻非常小，反向电阻非常大。
在通道电流中，是指这种通道的电流在一个方向上的电导（电阻的倒数）大，而反方向的电导小。比如内向整流钾电流，是指电流内流时电导较小，外流时电导较大，在I-V曲线上不呈直线，而是零电流以上的部分斜率下降，呈抛物线状，亦及电导G＝I/V变小（在通道电生理中，一般外向电流为正）。在钾通道中，很多电流具有整流特性，比如乙酰胆碱敏感钾电流，ATP敏感电流等等。
delayed rectifying k+ channel 延迟整流钾通道，是特指的一种钾电流通道，在豚鼠上有表达，而在大鼠上几乎没有。它具有整流的特性。
而且这个通道只具有激活们而没有失活门，当去极化激活后，电流不会象钠电流、钙电流、瞬时外向钾电流等随时间延长又自动失活，这大概就是它delayed的含义。这个电流含有快成分和慢成分两种。
不知这样解释是否明白。
第二节 仪器操作和维护
一、仪器的使用
1．各位高手，本实验室刚买的一套设备， 膜片钳放大器是Axopatch 200B，采集卡是 digitizer 1200 ，软件是Axon公司的Pclamp 8.0，请问各位有没有使用相似设备的，能把你们放大器和采集卡interface的线路连接告诉我吗？
还有，我们的微操纵器是***的液压的，那个架子是怎么安装到显微镜上面去的？
[chianhuu]其实那么多接口，用到的并不多。信号线是使用BNC线将放大器的scaled output连接信号器的 ANALOG IN 任意接口，这是采集信号。将 放大器的 COMMAND INPUT（任意,分别对应于面板上两个旋钮，根据需要连接）连接信号器的 ANALOG OUT 1或2 。HEADSTAGE 接电极HEAD。最好能将放大器上的SIGNAL GROUND 和整台机器的公共接地端连接，抗干扰。放大器连接电脑的接口用DIGITAL BOARD 。其他的就不用了。
2．我看了几个单位的PATCH ,他们都没有要外加的刺激器和示波器.仅有PATCH CLAMP(AXONPATCH200和A/D(1322A)转换卡.我们想PATCH CLAMP 里有方波刺激,电脑显示屏能代替示波器.于是我们也参照他们的线路联接.结果就是不能正常地测电阻.
谁能告诉我们AXONPATCH200B和A/D1322转换器正确的连接线路吗?
1, 由PATCH CLAMP 和A/D组成的如何连接
2. 由PATCH CLAMP 和A/D以及示波器组成的连线.
[yangk2002](1)，要不要刺激器，取决于实验设计。如果只需要通过电极细胞内刺激，当然不需要刺激器。而如果需要在细胞外产生刺激（例如刺激突触前递质分泌），则非用不可；
(2)示波器显示变化比电脑快，有的实验室还用。这是各人习惯问题，有
人说用示波器“太土”，是一种不了解情况的说法；
(3)接线方法有二：彻底搞清法（费时，但对今后有好处）：仔细对照软件
使用指南，上面有详细说明；囫囵吞枣法（省事，立即可用）：照猫画虎，看别人的连接方法，然后拷贝别人的程序，保证可以运行。
是为抛砖引玉。
3．膜片钳采集软件Clampex的Acquisition Mode中Fixed-Length Events Mode和Variable-Length Events Mode是如何采样的？他们有何区别？
主要用于那种实验？
[刘振伟]Fixed-Length Events Mode用于诱发突触活动、动作电位等时间长度固定的信号采集。在设定阈值的情况下，对阈上事件进行采样，对每个阈上事件的记录时间长度是固定的，但总的采集时间被记录下来。记录也可受控于外部触发命令。
Variable-Length Events Mode用于通道关闭时间较长（静止期较长）的单通道记录。在设定阈值的情况下，只对阈上事件进行采样，而对没有阈上事件发生的“静止期”则不采样，从而减小了所记录数据文件的容量。
4．请问,各位,我们用的200Ｂ的放大器，为什么总是超载呢？是软件设置的问题，还是硬件的问题（急）谢谢
[upboom]我用的也是200B，以前我也碰到过overload的情况，提供几个方面的原因供你参考：
(1)保证电极拉制质量，没有断头、过粗现象。
(2)holder和参比电极的银丝要镀得均匀，时间过久则需要重新镀银。
(3)接地良好。
(4)细胞外液、电极内液配制合理，渗透压、PH保证在正常范围内，并用
滤膜过滤去除杂质细菌。
(5)入水后适当调节液接电位（我的offset值就调在4～5之间），如果是
这方面原因，那么肯定会恢复正常的。
二、噪声
1.我们用的是ＣＥＺ-2400型膜片钳放大器(NIHON KOHDENO,Japen)放大,
是血细胞做的，接地还可以，以前他们一直是这么做的，可是我放大
以后才发现干扰电流幅度在2~6pA左右，基本把我作出的电流淹没了。
[sbboy1973]你要首先确定你的G欧封接是否成功？依我个人经验电极
电阻一般在7－10较合适，等你G欧封接成功后噪声会大大降低；
2，滤波要打在1KHz，不要太高；
3，放大一般在20－50倍即可，但还要根据你测定的通道电流大小决定；
4，要大大降低噪声，还是要很好的接地、很好的屏蔽（最要注意的是
显微镜）、最好在晚上做，其中屏蔽尤其要注意那些电线、插头，可以
用排除法慢慢试，要有耐心。
[changqingent]如果你能够按照楼上的方法妥善解决噪音问题（但我
个人认为这个可能性不大，因为你们实验室已经完好的运转了很长时
间），你尝试将放大器增益增大。如果还不行，那只有换实验室（放大
器）或者课题（全细胞模式）
[changqingent]我个人认为膜片钳实验封接过程中，防震台非常重要，
电极抖动主要与台子有关，而与橡皮管关系不大。橡皮管的长度与粗细
和封接的难易有较大关系，应该是越近holder时，管径越细，且管子
不应该太长。如果太长，给的负压就更易分散（相当于表面积大，单位
负压就很小）。我们实验室用的是一种硅胶管，从老师德国带回来的，
不过我见过其它实验室用一般的硅胶管做DRG细胞，也挺好的。Good
luck!
2.屏蔽网、微操、防震台以及屏蔽笼内其他设备通过地线集线器连于放
大器的SIGNAL GND,另外埋设了一根专用地线，是否要将SIGNAL GND
与专用地线相连？SIGNAL GND和仪器的电源地实际是相通的，如果将
SIGNAL GND与专用地线相连，是否会导致多点接地，引起环路干扰？
正确的接地方法应该怎样接？
[baxiansheng]Axon的200B的SIGNAL GND和仪器的电源地是不相通的。
也有些牌子的放大器两者之间提供了一个连接片，连与不连供自己选
择。看来，在减低干扰上，专家们也对SIGNAL GND和仪器的电源地是
否应该相导通，没有统一意见。
请教过一些电学专家，说地线只对50Hz之类的较低频干扰效果较好，
而对于高频干扰没什么效果。你可以先比较一下SIGNAL GND与专用地
线连与不连时，干扰的情况怎么样。如果连上差别不大，甚至干扰更大
（我们实验室就是这样，可能引入了环路干扰），就不必连了。
因为很多建筑的电源地是比较马虎的，你还可以不用电源地（电源三相
插头的地线不连上），而只用专用地线试一试，看看效果是不是更好。
三、玻璃微电极的制备
1．请教大家一个问题，也许是很傻的问题，但我不懂，希望知者不辞劳苦给予解答。
膜片钳用的电极分两步拉制。请问拉出来的两个电极是一样的吗？我们
拉出来的都不一样。如果应该是这样的话，那上面和下面的两个电极哪
一个口径粗，哪个口径细？两个都能用吗？还有，如果一拉设置在
13.50，那二拉的参数越小应该拉出来的口径越大，对吧？但是如果想
同时调节一拉和二拉的参数，怎么样才能得到理想口径的电极呢？我们
拉出来的电极的口径偏大，请问能不能提供一个好的参数？
拜托了！先谢了！
[zhangyu]电极得拉制要根据你实验得目的去定，拉制参数越高口径越
小，阻抗就越大，这在电脑上有显示得。一般电极尖端充液后得阻抗
在1-5M欧左右即可。可以根据实验得结果，封接好不好调整参数。
2．我想问一下有经验的各位老师,电极拉制时想让电极尖端后面的肚子胖些,应该怎样调整参数,两步拉制仪,当尖端大小合适时是不是应该把
拉力增大才会让它胖起来呢 ?
[baxiansheng]把第一步拉的长度调短一些，拉力增大一些。如果口径
大了，再把第二步温度调高些。
3．我想使用的是南京六合生产的外径是1.5或1.8mm的玻璃毛坯管来拉制膜片钳电极, 但是我试了很久都没有找到合适的拉制程序.
有哪位高手使用的是SUTTER公司的P-97拉制仪,或者NARISHIGE公司
的PC-10拉制仪,可以告知一下拉制程序怎么设置吗?谢谢!
[dairiver]我使用的是南京六合生产的外径 1.5mm的玻璃毛坯
管,NARISHIGE公司的PC-10拉制仪,设置为两步拉制,第一步93度,第二
步67度,电极电阻一般为3-7兆.你可以试试.
4．我使用SUTTER公司的P-97拉制仪,南京六合生产的外径是1.6mm的玻璃毛坯管来拉制玻璃微电极,拉制程序如下：
1）heat=RAMP+20 pull=15 velocity=75 time=150
2）heat=RAMP+20 pull=15 velocity=75 time=150
3）heat=RAMP pull=20 velocity=80 time=100
但是玻璃微电极的电阻只有0.2M欧。
我想拉制1~2M欧的玻璃微电极进行细胞外记录，请教各位高手如何设
置P-97拉制仪的拉制程序？非常感谢！
[chianhuu]你好 ，你所使用的程序是用来拉微电极(Microelectrode)
的，不是来拉膜片钳电极的。拉膜片钳电极的时候，要把Pull=0，而
后调节velocity，一般80左右，loop是1次。一般1次就可以了。
但是sutter的说明书上说要3次的最好，照说明书调就可以了。
我用heat=RAMP+15 pull=0 velocity=80 time=200
一般都在3-5之间。
5．有谁用过多管拉制仪，麻烦介绍几种。
[barrywl]多管电极拉制仪介绍
多管电极拉制仪（PV-4型，日本Narishige）为半自动电极拉制仪。需要设定的参数有：
HEATER：加热强度（10-15A）λ
MORTOR：锁套旋转速度（使电极扭曲）λ
三管给药电极制作:
选用外径1.5mm，内径0.88mm，长度120mm的带芯玻璃电极毛胚，用胶布将3根捆绑在一起，上端固定于锁套，下端挂重物，调节旋纽（上下，前后，左右）使电极位于加热圈中心点，开电源，调节加热强度和锁套旋转速度，当电极变软后，稍加固定砝码，使电极扭成麻花状，直至断开，迅速下调加热丝，关闭电源。显微镜下观察，各管开口均匀平齐者用于实验。每根玻璃管尖端开口8~12 μm。其中一管用于固定，其余管折出45度角，用于装药液。
6．用NARISHIGE的抛光仪，那么一般离电阻丝多远呢，多长时间，电流大小？
[samnj]玻璃电极抛光在显微抛光仪或其它类似设备上进行时以400-800倍的放大率观查电极尖端。热源通常是铂丝或铂-铱丝，为了防止金属蒸发到玻璃电极上，热丝通常在与玻璃电极靠近的点涂敷玻璃。由于玻璃电极尖端的开口刚好在观察的分辨率水平上，因此你可能看不到电极尖端形状的改变，而仅仅会看到电极尖端略为回缩变暗。如果想知道电极尖端是否被熔化而堵塞了，或者想知道尖端的直径，可以用一只小注射器产生空气压力，通过微电极往甲醇中吹气，观察气泡的状况。经过抛光处理后，玻璃微电极表面变得更加宽阔和光滑。 而在涂敷硅酮树脂时，黏附于电极尖端附近的Sylgard的溶剂也会被抛光加热去除，从而保证封接的顺利进行。抛光时需注意：在靠近加热线圈的位置以较低的温度抛光电极，其电极尖端内径的玻璃面一般会是平行而且较为尖锐。而在离加热线圈较远的位置以较高的温度抛光电极，其电极尖端趋向于变圆且变得较钝。
单通道和全细胞记录中应用的电极有所区别，反应在电极的抛光过程中也有所不同，具体如下：
单通道记录时：膜片钳电极应接近加热丝，使接近尖端的玻璃层变厚变尖。电极入水电阻较高，容易得到较高阻抗的封接。
全细胞记录时：膜片钳电极的玻璃壁应比单通道记录中所用的为细，且尖端较钝为好。尖端较细的电极形成封接后不容易吸破。
第三节 实验操作
一、 细胞的分离、培养
（一）心肌细胞
1．请问哪位是做豚鼠心肌细胞急性分离的，我想问一下是用什么酶，消化多少分钟得到的心肌细胞状态比较好
[wwggrr]我们做大鼠心肌细胞急性分离。30ml台氏液（0.06钙）加20mg一型胶原酶，3mg蛋白酶，20mg牛血清白蛋白。至于消化时间要根据老鼠大小，和灌流速度来定，没有固定的时间。我们的做法是，在心脏膨大变软后，从心室内吸少量液体在显微镜下找单个心肌细胞，见单个细胞后再延长半分钟到一分钟。
[xuji007]同意楼上的说法，消化时间要自己摸一下。酶的量也不一定，我记得原来做的时候，20ml液体用了5mg一型胶原酶,3mg蛋白酶。我个人觉得酶还是要用Sigma的。
[冷月寒星]需要根据你实验室的酶的纯度活性，重新定量，个个实验室是不同的。 我们用的2型胶原酶 8mg，不过是粗酶。
消化时间也受很多因素影响，没毒浓度、温度、豚鼠状态、个人习惯都影响很大，需要即时观察，到豚鼠心肌消化变大变软变色、酶成浑浊，方可剪下。2．我最近在用离体灌流的方法急性分离大鼠心肌细胞，但是分离到的细胞非常少，而且都是死细胞。我先是用有钙台氏液灌流5min，再用无钙台氏液灌流5min，然后用消化液灌流（含胶原酶II0.6mg/ml),灌流到流出液变浑浊为止,然后在该消化液中剪碎吹打后离心1分钟(1000转),我消化时间从5min到20min都尝试了,但所得细胞非常少,而且全是团状死的或正在死亡的.请问哪位高人可以给予指点迷津,在下不甚感激,另外以什么标准来衡量心肌消化好了.(我用的是三蒸水,灌流液温度37度)
[冷月寒星]你说分离的细胞非常少，对此，我不是很理解。如果按以下分析，应该细胞数很多，并且死细胞占大多数。
根据你的实验方法来看，又几点不太合适，建议进行一些调整。
1.“有钙台氏液灌流5min” 时间过长，通常加入有钙液后，只要心肌复跳，
即可停止，改用无钙台式液冲洗。
2. “无钙台氏液灌流5min” 无钙台式液应冲洗至心肌停跳 ，时间长短要
看具体情况而定。有钙液一定要冲洗干净，否则，加酶后很难分下活细胞。
3.“消化液灌流（含胶原酶II0.6mg/ml)” 0.6的浓度过高，建议在0.2附
近调整，以找到实验室适合的浓度。
4.在我们实验室是不进行离心的，细胞状态不错。但必须将酶液冲洗干净！
5.剪取心肌的时间，大部分来自于经验，由于，细胞消化时间并不一致，应
该分时间，分不剪取。
总之，各个实验室的条件不同（包括仪器和室温），具体方法只能自己摸索，祝你实验顺利、成功。
[rainwave]试一下以下措施:
1.不要用有钙台氏液灌流5min。直接用无钙也灌注，时间要足够长，使得细
胞内的钙离子完全排出。
2.取出的心脏可以放在冷的正常1.8钙台氏液中。
3.酶液的时间以心脏的颜色和硬度来确定的。也可以不断观察流出液体中是
否有心肌细胞，来确定时间。
4.酶灌完后，一定要用台氏液好好冲洗，至少50ml液体。“该消化液中剪
碎吹打后离心”，坚决不能这样。
5.刚分下来的细胞成活率约为90%以上。
祝你实验成功！
3．请问各位急性分离大鼠心肌细胞的朋友:
我现在遇到的问题是用消化酶灌流4min(0.5mg/ml)心脏后心脏局部就变白,8min左右整个心脏就变白,不知道是什么原因,敬请各位赐教,谢谢
[rainwave]可能原因：
1.冠脉中有微血栓形成，导致灌流不均匀而致。处死动物之前，先腹腔注射
肝素1000u/kg.
2.大鼠的状态也是非常重要的。
4．我正在做大鼠心肌细胞膜片钳，感觉每次细胞分的都不错，可是在复钙时，细胞就多数收缩死亡，这主要是什么原因，还有在记录电流时，是否必须要灌流，不灌流行吗，另外，细胞似乎很难贴壁，我也试过多聚赖氨酸，效果不是很好，可能是使用不当的原因吗？（是不是，先涂上多聚赖氨酸，等到晾干后再滴细胞悬液
[jixincai]我觉得如果你不用新的培养皿，那你一定要彻底清洗培养皿（首先要泡酸），然后涂上多聚赖氨酸，在室温放置自然晾干，或是用干烤箱烤干（55-65度）然后在滴上细胞悬液，那样细胞贴壁较牢固。
祝好运！
5．你们好！我也是刚开始做心肌细胞不久，分离了有几次细胞，因为没有请landenff什么装置，所以是在体灌流清洗的，之后再取下剪碎酶解的。用的是0.05的胶原酶，消化半个小时后收集细胞的，不过没有收集酶解液的细胞，而是从新置换外液吹打组织块得来的细胞，刚拿到细胞时也有很多贴壁的细胞，但是杆状的不多，我想问一下多余的那么多的块状，椭球装的细胞是什么细胞，而且我们用杆状细胞进行封接时好象感觉没有细胞膜一样内容物很致密，电极根本抽不动，是什么原因呢？还有细胞好象放置一会就都漂起来了，我想问一下，我拿到的是不是也都是死细胞呢？还有，封接时没有用灌流系统有多大影响呢，是不是不加灌流细胞就会死，根本不能用呢 ？
[为非典郁闷中]你好，你用的是那种动物，对于成年动物来讲，由于其胶原、纤维组织较多，必须灌流，才可以充分消化。你消化后得到的椭球状的细胞是可能是挛缩后的心肌细胞，如果你没有将血液清洗干净，有可能是红细胞。
你分离出的细胞，在显微镜下如果看到清晰横纹，那是好的细胞。如果横纹不清，那一定是状态不好的细胞。无法做实验。在进行封接之前，一定要用灌流液，灌流5分钟左右，在整个实验过程中也要持续灌流，否则死亡的细胞释放出多种酶，及钙，死细胞的碎片也会影响封接，细胞也会缺乏养分，导致细胞状态不好。你电极吸不动，可能是你的电极尖端有垃圾（冲灌电极或进入灌流液导致的）。其实Langendorff装置很简单，用不了很多的钱，需要一个蠕动泵，一个超级恒温水浴和双层的玻璃管道。如果想的好的细胞，必须要有一个合适的装置。
[baxiansheng]1.不知你分离的心肌细胞是大鼠的还是豚鼠的，大鼠我们的
酶浓度高些，6mg/50ml；豚鼠小些，4mg/50ml。但我感觉胶原酶P不同批号活性有一些不同。但实际上实验中酶浓度稍稍偏差一些不太要紧，我称酶的时候常并不精确去称量，大致就行，因为最后酶解停止的程度也是靠自己的感觉。我感觉豚鼠心肌细胞好分些，消化时间短些，刚分下来的好细胞数量多些。
至于给负压的时候细胞就挛缩，一是可能你选择的细胞本身就不太静止，有时候不仔细看看不出来，盯着看一会就会发现它偶尔会动一下，这种细胞尽管胞膜边缘清晰，横纹清晰，也不能用。反而是那些看起来并不是非常清晰，而静止的细胞可用。二是你下电极压得细胞太重了，所以一给负压就动起来。
三是负压给得太大也会这样。至于下电极压细胞多深，给负压多大，我在丁香园中谈过。
如果你的细胞分得稍稍有些不够，细胞表面有纤维组织，可能会使你下电极压细胞后电阻没有什么反应，导致你压得过深。或者bath液灌流不太干净，电极尖端入液时碰上脏东西，也会导致电极压细胞后没有反应。
2. 我们做实验时对室温没有特别要求，因为没有这个条件去控制。至于天
气稍冷些，文献上说对延迟整流钾电流会有影响，引出电流变小。但对封接的影响我还没碰到过，也没有见过这方面资料。所以气温因素可能不是主要的。
3. 至于插入主动脉的管不能太粗，直径我还真没测过, 只知道原来的管头
和主动脉管径差不多，甚至还粗一些，挂心脏的时候，要把主动脉撑开，勉强挂上去；现在的管头明显比主动脉管径细，很轻松挂上去，还留有许多空隙。
6．我也是刚开始做心肌细胞钙电流测定不久，但是分离细胞一直都不好，昨天还拿到了些可以的细胞，但是一会就皱缩死亡了，今天和昨天的程序大致上一样，就是酶的浓度由0.05降到0.04，但是时间由8分钟延长到了15分钟，结果细胞全都死亡了，还不如昨天的细胞，请问这是不是由于酶解时间长了的原因。你一般都是酶解多少时间呢？我们用的是胶原酶2，是灌流消化的。
我还想知道你们是怎么样逐步复钙的，还有细胞最后是保存在钙多大浓度的溶液里的。我们是保存在KB液里，但是没有逐步复钙。希望能解答的同仁们给予帮助。
我们用的电极内液的ATP也是冻存前保存的，一个月左右再次更换，不过我觉得有时候能用很长时间。不知道其他的师兄是怎样的呢 ？
[shel]1) 你在分离细胞的酶液中加入了多少钙，因为钙的量可以影响到细胞的酶解效果和细胞的存活。
2)酶量是一是一个重要的因素，但是你的改动太大了,你的酶量减少了0.01，
但时间却延长了近一倍。你可以改变酶量，但不要变时间，或者酶量不要变改变时间，可以根据你开始分离出细胞的形态来判断是酶解过头，或酶解不足，如果细胞的量很多，而且碎片多，细胞横纹不清，表明酶解过头，如果细胞量不大，且圆球形的细胞较多，细胞悬液较清，表明酶解不够。我们做的是豚鼠，同样用胶原酶II ，用量大约14-15mg/40ml，酶解时间大约3分钟左右。
3）如果细胞保存在KB液中，细胞在复钙时钙的耐受性很差，会死亡很多细胞。我们复钙的protocol 如下
1。取下心脏剪去心房，在含有20umol/Lca2+和1%牛血清白蛋白的20ml MOPS
液中剪碎，吹打，温孵10分钟。2. 20ml mops 液+70ul 72mmol/L Ca 3. 20ml mops 液+14ul 720mmol/L Ca 4 .20ml mops 液+28ul 720mmol/Lca2+ 5. 20ml mops 液+40ul 720mmol/Lca2+ 。最 ca2+的终浓度约在1mmol/L
[baxiansheng]我们刚开始分心肌细胞的时候，也是总分离不出什么好细胞，请教过很多这方面的专家，提过很多建议，什么水要特别，需要测电导啦等等，其实根本没那么多的要求。根据我们的经验，水只要去离子水就行。一般溶液按文献中的配方基本没什么大问题。注意的就是pH值的调定，因为现在很多pH计用过一段时间后会不太准，但实际上对pH要求也不是太严格，我常常用pH计调定后，再用精密pH试纸测侧，大致偏差不太大就行。我们用的酶是胶原酶P（宝灵曼公司，现在被Roche公司收购），这是一种混合酶，不但有胶原酶的活性，还有一些蛋白酶的活性，因为心肌之间的成分很多，单一酶对有些成分的消化不太好。但也有只用胶原酶就能分出好细胞的，不必先换酶，再摸摸条件。
分细胞的时候，操作也很重要。取心脏挂上Langendorff装置要快。心脏周围成分的修饰可以等挂上Langendorff装置灌流时边灌边修饰。刚开始操作不熟练时，可以开胸后，先用4℃的冰台式液淋在心脏上，减少其活动性，降低其氧耗；剪下心脏后，放在4℃的冰台式液，稍加修饰，就快速挂上Langendorff装置。挂上装置后，我们就直接先用无钙台式液灌流冲洗干净心腔内积血，这时从心脏滴下的液体滴速要至少达到40滴/min以上，否则可能心脏内有微血栓形成，灌流不充分，这是不能分解出好细胞的重要原因。
所以也有人在取心脏前，先心腔内给些肝素以防血栓的形成。无钙台式液的灌流一般5min就行，足够冲洗干净了，滴下的液体已经很清澈了。无钙液充灌也是使心肌细胞间连接松散的必须过程，但无钙液灌流太久，会使分离出的细胞不耐钙（参见文献Barbara B，et al. Life Sciences，1983；33：1-18）。然后换酶液灌流，酶液中钙的浓度50μM就行，不能太高，否则分出的细胞也不好。整个灌流过程中，灌流速度很重要（可以从液体滴速判断），所以灌流压力要保持，如果灌流过程变得太慢，说明灌流不充分，肯定分不出好细胞。至于酶解多长时间，没有一定，完全凭经验，即使同样的条件，由于灌流的情况不同，也会不一样，所以我不看时间。当心脏变得透明，快呈拉丝状了，就可以了，剪下心肌，稍稍吹打，就松散开了。没经验的时候，可以先剪一些右心房或右心室的组织，这样不影响灌流，看看能不能吹打开。
至于灌流过程要通氧，保持恒温这些条件就不用说了，也是很重要的。根据我的经验，保持灌流速度是非常重要的，刚开始时我们分不出好细胞，主要就是灌流不稳定，在用酶液灌流一段时间后，滴速会非常慢。后来发现是Langendorff装置的挂心脏的头太粗，如果经主动脉插入过深，就会压迫主动脉根部的冠脉开口，导致灌流不好。你也可以多注意这些方面。
我们的细胞也是保存在KB液中，至于逐步复钙，就是配置不同钙浓度的细胞外液，从低到高逐步置换KB液，以免复钙后大多数心肌细胞又挛缩死掉。
但这样仍是会有40％左右心肌细胞会挛缩死掉。
至于电极内液，我用过冻存过3个月的，仍旧有效。
7．能否详细指教一下大鼠心肌细胞急性分离的准备过程?包括消化、灌流方面的细节。盼回复，谢谢！
[shel]1)预热Langendorff灌流装置，使其温度达到37oC左右（在Langendorff灌流装置的灌流液流出口处温度测量）
２）大鼠麻醉后取心,置于4 oC无钙MOPS液清洗，并剪去多余的组织。
３）迅速将心脏置于Langendorff灌流装置上，经主动脉逆向灌流,首先用无钙MOPS液灌流5分钟，以清除心室及冠脉系统的血液。
４）然后改用含48umol/Lca2+和18 mg左右的胶原酶（TypeII，I）、1%牛血清白蛋白的MOPS液灌流8-9分钟左右，灌流酶液时大约3分多钟拉丝，灌流完毕心室松软肿大，达到充分消化。灌流速度在9ml/min.
５）取下心脏剪去心房，在含有100umol/Lca2+和1%牛血清白蛋白的MOPS 液中剪碎，吹打，温孵10分钟。
６）复钙，将细胞悬液过滤，逐步将钙浓度提高至1mmol/L，室温保存待 用。
灌流液均用100% 的O2饱和。灌流系统的温度保持37oC。灌流液的pH最好调到7.2。
8．我想问一下你是怎么保持灌流速度的，依据我的体会，消化分离心肌细胞时先是流出液减慢（可能消化下来的碎片堵住部分血管），随着进一步消化，流出速度会加快（可能血管壁破裂，心肌细胞已连接疏松），你有采取人为干预的因素来控制灌流速度吗。
另外请问各位大侠：
我想做心肌细胞贴附式，假设静息电位是-70mv，如果我想把细胞钳制在0mv 引出L钙电流，那我是要给予-70mv的刺激才能把细胞膜电位控制在0mv吗，如过我需把细胞控制在-40mv，那我又需给予多大的刺激呢，请指教。
[baxiansheng]Langendorf装置是靠重力势能维持灌流压的，所以保持液柱高度是重要的，滴下的酶液要反复循环利用。装置的玻璃管尽量细一些，50ml 的液体应该要保持70cm高左右的水柱。消化分离心肌细胞时都会先变慢一些，但最慢的时候也不应该少于20~30滴,否则分离效果是不好的。至于另外的干预因素倒没有采取，主要是靠操作的熟练和迅速吧。
单通道贴附式还没有作过，也希望听听高手的指教
9．baxiansheng 你好, 谢谢你的热心帮助。可我还是有个比较简单的问题不明白，在逐步复钙时，不同浓度钙的溶液时陆续加入细胞悬液的呢还是更换呢，如果是陆续加入，那最后的体积一定很大啊，是怎样浓缩细胞的呢，是离心还是静置然后弃上清呢？如果是置换不同的溶液，那更换溶液时是不是也要离心或者静置呢 ？好像没有见过离心收集细胞的，那要是静置有的文献上说要等半个小时左右细胞才完全下沉的。因为没有见过究竟是怎么样提取心肌细胞的，所以又很多的问题不明白，希望能得到大家的帮助。
[baxiansheng]逐步复钙，我们是更换不同浓度钙的溶液，细胞悬液放在试管中静置，细胞下沉后，抽掉上清夜，加入低钙溶液，15min后又抽掉，再换高些浓度的钙溶液，如此而已，不要想得太复杂。
10．我们用的是0.04％的胶原酶。这样看来我们的浓度是有些高了，而且我看到有的酶解时间就只有3－4分钟，从开胸到开始灌流的时间大约是6－7分钟吧，因为插管不熟练，费了点时间，最好是多少呢？而且有的师兄说的心肌呈拉丝状是怎样的呢？是不是心脏表面的纹络？这个是酶解较好的标志么？希望有人能指点一下！谢谢
[afnie]0.04%的浓度是有点低, 我个人认为酶解3-4 分钟是不够的,可能与酶的种类不同有关吧,从开胸到灌流的时间越短越好,一般在3-4 分钟, 应该是先挂上心脏, 再修剪, 而对于心肌呈拉丝状指的是流出的液体的形状,而不是心脏的形状, 这一般被认为是酶解好的标志, 我也做的不是太好，希
望对你有帮助
11．请教各位师兄!!!
做急性分离的心肌细胞时，在显微镜下看到电极接触到了细胞，
可是电阻没见升高，给负压也没见升高（或升高很少，1～2M）。
选择贴壁状态较好（移动载物台，细胞不随液体晃动）、在10×镜下有明显条纹状的杆状细胞。
或者是，电极稍微接触细胞，细胞就缩掉了，有点象絮状物。
我们可以想到的就是可能细胞本身状态不好，但是有没有可能是其他因素？
另：我们在10×下可以看到明显条纹，也能看到一圈黑色的细胞膜，但是在40×下看不清细胞膜。如果排除显微镜的原因，还可能是什么原因？
[ lyq77311]我的细胞也遇到过这样的问题!
如果你的细胞是要经过酶消化的话,可能是消化过了!你可以考虑改进消化,减少酶量或减短时间.
基本不是仪器的问题!
12．请问做膜片钳的细胞状态（活性）怎么测定，最常用的有那些方法？ 简便而又公认的又有哪些？ 谢谢！ 最后，是不是做膜片钳都要测定细胞状态（活性）的
[sunnyhuying]细胞活性一般都是在显微镜下观察的。一般来说活性好的细胞在镜下看胞壁光滑，比较透明，折光性好，细胞内没有粗大的颗粒，电极尖接触细胞时可以感觉到细胞弹性好。存活时间长，封接容易，细胞不易崩解。
做膜片钳不需要专门测定细胞活性，至少我们实验室没有专门测
13．谁急性分离心肌细胞用的sigma公司胶原酶2型啊，我分出来的细胞边缘总是不整齐，且很多缺一块，细胞数量也不是很多我得酶浓度是
11.4mg/60ml消化时间大约6分钟，大家给我点指导啊，消化完没有中止直
接将心脏取下在孵化液中剪碎的的，小弟情大家给点建议啊，先多谢了！
[springcoming]急性分离出的心肌细胞边缘是不整齐的，但是好的细胞是棱角分明的，横纹也很清楚，细胞数量不多可能是酶的浓度有些小或者是酶解时间短造成的，消化结束后最好再用溶液冲洗一下心脏再剪下孵育，这样能减小酶对细胞的继续作用，溶液也会干净些。
[yoyolee]细胞数量少与酶浓度和消化时间都有关系。可以适当加大酶浓度，延长消化时间。我的经验酶浓度9mg/30ml消化时间在10min左右。实验室不同，操作者不同，动物种属及个体不同，具体的浓度和时间都不同。最好固定一个条件，然后变换其他条件，摸索最佳条件吧。建议以本实验室以往的操作为参考
[rainwave]正常台氏液的钙离子浓度为1.8mM。分出地心肌细胞经过复钙后几乎有一半死亡。一般会让细胞在1.8的液体中至少待30分钟以上，也有人称之为耐钙细胞。如果死亡的较多，可以减少酶解时间，提高细胞的存活数。
还有就是你的细胞氏保存在什么液体中的？一般可以放在高钾kb液中，这样细胞就可以存活较长时间。
希望有所帮助！
14．我的试验原来做得挺顺利，最近一段时间不知道怎么回事，总是分不 出好细胞，心肌消化后看上去颜色发白，吹打后显微镜下看到的都是
碎片，没有完整的细胞。我试验步骤和方法都和以前一样，也没换过
药，可能是什么原因呢
[9801463]可能原因： 1.PH是否正确
2.最近气温升高，你的装置的温度需要调节一下（需要
降低一点），否则容易消化过了
[lulu7511] 本人认为，温度不是问题，因为做灌流的装置都要恒温控制的。
不过如果心肌看上去发白，那是消化过了的表现。是不是你最近用的酶的批号与原来的不同。个人认为sigma的酶是不好的。很多实验室都开始使用日本的酶，其消化效果与众不同的。还有吹打的力度及频率是要适度的，否则会影响渗透压，促进细胞的死亡。
15．SOS! 不知各位做膜片钳的前辈中，有谁都做过急性分离的平滑肌细胞，我做的是肺动脉。在此，想请教各位前辈几个问题：在消化血管的过程中，如何判断消化的程度，是单凭肉眼观测血管块的状态还是在显微镜下观测组织消化的程度。判断组织消化是否恰到好处有什么标准吗？如果消化过度是不是也不能 吹打出细胞，我现在不知道我分不出细胞究竟是消化过了还是消化不足，请前辈指教。
[liusysc]我正在做。如果你做的是大动脉，确实很难分，中小动脉相对来说还好消化，得到的细胞也多，凭肉眼完全可以判断消化程度，但是这一定是在有经验的基础上，不过只要你看一眼别人做过的，你就会得到感性的认识，对自己的实验帮助很大。消化过度，也可吹打出细胞，只是都是状态不好或死细胞，在显微镜下也可以看见平滑肌细胞。
16．请教各位大侠，我们最近一段时间分离大鼠心肌细胞总是得不到很好的细胞，看起来还可以但是做起来很难，有时候封接还可以但是破膜以后就不行了，电阻狂降，几乎就没有什么好的结果。而且有时候即使一切都还不错，记录的电流就不太像钙电流，看形状倒是有些像钠电流，但是在记录L钙电流的条件下应该不会记录到很明显的钠电流啊，很怪，出现率很高，我们也不清楚到底事什么，请大家帮我们分析分析，还有就是细胞状态一直不好，可是一切条件我们都和以前一样的啊，猜测会不会事天气的原因，进来我们这里非常热，还有什么可能的原因想不出了，请大家帮帮忙，多谢多谢！
[mengyou999]我认为你纪录到的是钙电流,心肌细胞钠电流时间很短,10几毫秒,幅度大于5nA.夏天做实验确实很不容易,继续努力吧.
[cynthia152]我做过人心房肌细胞的Ik1，常常会记录到钠电流，是因为封接电阻不够，我想你肯定是因为细胞状态不好，封接电压没有达到2G欧姆以上，才出现这种情况，建议下次同时加4-AP阻断钠电流，4-AP不稳定，需要现配。17．分大鼠心肌细胞的朋友们：有个问题请教一下大家，你们在充氧的时候用的是纯氧、还是95％O2和5％CO2的混合气？有什么理由吗？先谢谢了[poneyy]这取决于你的ＰＨ缓冲剂是什么．如果用ＮaＨＣＯ３做缓冲就需要通95％O2和5％CO2的混合气，如果只通纯氧，ＰＨ会上升，ＮaＨＣＯ３变为ＣＯ３根和溶液中的钙形成沉淀。如果用ＨＥＰＥＳ，则仅需要通纯氧，通95％O2和5％CO2的混合气，则CO2变为Ｈ２ＣＯ３，ＰＨ会下降。
并且纯氧相对便宜。
这是我的一点看法，请大家指正。
18．我也正准备做豚鼠的心室肌细胞分离。请教各位前辈，豚鼠的心肌细胞分离和大鼠是不是差不多？所用的灌流液、KB液和消化液的配方是不是也和大鼠的差不多？若有配方可发给我嘛？谢谢！
[mengyou999]我们实验室用豚鼠，我试过同样的配方分离大鼠心肌细胞，分下来的细胞不理想．我们的配方是：
（1）无钙台氏液(mmol-1)：NaCl 130，KCl 5.4，KH2PO4 1.2，MgSO4 0.5，HEPES 6.0，Glucose 10.0，PH=7.4 with NaOH
（2）有钙台氏液(mmol-1)：NaCl 137，KCl 5.4，CaCl2 1.8，MgCl2 0.5，HEPES
6.0，Glucose 5.0，PH=
7.4 with NaOH
（3）酶溶液：无钙台氏液+0.4mg/ml collagenase+0.1mg/ml protease
（4）贮存液(mmol-1)：KOH 70，L-glutamine acid50，KCl 40，Taurine 20，KH2PO4 20，MgCl2 3，Glucose 10，HEPES 10，EGTA 0.5，PH=7.4 with KOH 19．请教做大鼠心肌细胞的前辈们 ，我做了一段时间的分离心肌细胞，分离的效果不怎么好，经复钙后，大部分死亡，要不然就是细胞活性不好，封接不上。
我的具体步骤如下：
1.在冷的无钙台式液中剪去多余组织
2.无钙液灌流5分钟
3.无钙液加5mg蛋白酶E 5mg一型胶原酶 50mg BSA共50ml 灌流20至30分
钟不等
4.KB液灌流5分钟
5.保存在30mlKB液中复钙备用
我们实验室一个老师说，他们都不复钙，直接将分离的细胞静止几个小时后就观察，请问这样可以吗？是不是酶量太少而灌流时间过长影响了细胞的活性？具体如何复钙效果比较好？另外酶液中加低钙具体是多大的？（这样分离的细胞是不是就耐钙些）谢谢先
[mengyou999]我分离过豚鼠细胞,我的经验是:
1.不要急于复钙,细胞分下来后就在KB液中保存,PATCH时复钙就行.即使分下
来的细胞很好,复钙后1h也会死50%以上,时间越长,活的细胞越少.
2.胶原酶量可能有点少,一般文献酶液灌流时间都在8-15分钟左右(豚鼠).不
过出产酶的公司不同,酶的活性也不一样,这个需要你自己摸索,我觉得***的酶比什么SIGMA的要好很多,活性高,分下来的细胞干净.
3.酶液中不必加钙.因为一般蛋白酶中都含有一定的钙,有文献说0.1mg/dl蛋
白酶中的钙的浓度正好发挥胶原酶的活性.我试过,不管加多低的钙,分下来的细胞都不好!
20．请教各位：分离大鼠心肌细胞过程中，灌流液在充氧前后的PH值会有很大的波动，不知是否在充氧一段时间后还要校正PH值，这种波动该怎样解决呢。急盼恢复。
[reaction]你如果是急性分离大鼠心肌细胞，灌流液用的应该是台氏液吧。而且台氏液书上也有几种配方，不同的配方，也就是含有不同种类的缓冲对，氧饱和需要通入的气体也不一样，有纯氧或者混氧，具体书上很清楚，只要缓冲对和通入的气体匹配，一般在灌流前调节PH值达7.3左右，然后氧饱和不会对PH值造成多大影响。
我们一直就是这样分的，没有问题。
21．大家好，有和我一样做大鼠心肌细胞的朋友们，我想请教几个问题。
1.我的kb液怎么会配下来很偏酸（3.几）
配方是这样的：L-Glutamic acid 70 KCL 25 Taurine 20 KHPO4 10 Mgcl 3 EGTA
0.5 Glucose 10 HEPES 10
2.我用25MG 的一型胶原酶，1.5MG的蛋白酶，分下的细胞还是很漂亮，但就
是封接不上，我的细胞没有复钙，这样可以吗？能帮我分析原因吗，谢谢。
[baxiansheng]1.你的配方是从何得来？从配方看就是偏酸的一个溶液，因为L-Glutamic acid挺多。实际上配方应该是用谷氨酸钾，但谷氨酸钾在碱性环境下不易溶解，易析出沉淀，所以在配制上常用L-Glutamic acid，溶解完全后，逐渐加入KOH调pH值。 我的KB solution (in mM): KOH 85, L-glutamic acid 50, KCl 30, Taurine 20, MgCl2 1.0, KH2PO4 30, HEPES 10, EGTA 0.5, Glucose 10 (pH adjusted to 7.4 with KOH)，供参考。
2.封接不上和没有复钙有关。我们知道，Ca2+的二价阳离子在很多情况下起两
个负电物体连接的媒介作用。以前我们也试过不复钙，因为这样对细胞的损害小，镜下细胞很漂亮，但封接很困难。复钙以后，虽然细胞死亡一些，但封接就容易了。以前在中文文献上也看过有不复钙的，但国外文献很少见到，大家都知道中国人的科研真真假假，…… 哈哈。
22．请问您能告诉我您是怎么复钙的吗？文献中都没有详细的说明。我现在也存在同样的问题，不是细胞封不上，就是封上了但一破膜就掉到几十M。
真不知该怎么办才好，明年就毕业了，可现在还没膜出来，大家帮帮忙吧。
[baxiansheng]复钙很简单。不知你们的细胞槽能不能灌流，如果能的话，把细胞悬液滴在里面，静置几分钟，待细胞贴壁后，然后用含钙的细胞外液（一般就是台式液）灌流几分钟就行，既能冲掉细胞悬液中的杂质，便于下电极不堵，又复了钙。如果是简单的用培养皿作细胞槽，不好灌流，那就在试管装细胞悬液时，静置，细胞下沉于管底时，把上清夜用吸管吸掉，再加入含钙的细胞外液就行。
也有人喜欢用逐步复钙法，就是配置几个不同钙浓度的细胞外液，逐次从低到高用上述办法复钙，这样对细胞损伤小些。我是一般一次就复钙到位，因为省事，虽然对细胞损伤大些，但好细胞已足够用，就偷懒不愿费事。你可以根据自己的情况把握。因为细胞外液中钙浓度很低，所以液体中其它成分不用变，一般是不会影响渗透压和pH值的。
[reaction]其实关于复钙的问题，我是这样认为的：两种方法都可以，也就是一步复钙法和分步复钙法。我们一直都使用的是一步复钙，这样细胞的耐钙性没 有分步复钙法的好，因为分步的方法毕竟可以使细胞具有一定的耐受性。
但是可以这样想一想，虽然一步复钙大多数细胞都在收缩，显示出不耐钙，但一个浴槽里有几个甚至一个耐钙的细胞就可以了，这个耐钙的细胞必定不错，因为他经历了严重的打击都没有受损。一个槽子里有太多的耐钙细胞，真正对我们试验也没有什么意义，因为一个槽子里也只是选择成功一个细胞而已。 23．我也正准备做豚鼠的心室肌细胞分离。请教各位前辈，豚鼠的心肌细胞分离和大鼠是不是差不多？所用的灌流液、KB液和消化液的配方是不是也和大鼠的差不多？若有配方可发给我嘛？谢谢！
[lulu7511]我们实验室用豚鼠，我试过同样的配方分离大鼠心肌细胞，分下来的细胞不理想．我们的配方是：
（1）无钙台氏液(mmol-1)：NaCl 130，KCl 5.4，KH2PO4 1.2，MgSO4 0.5，HEPES 6.0，Glucose 10.0，PH=7.4 with NaOH
（2）有钙台氏液(mmol-1)：NaCl 137，KCl 5.4，CaCl2 1.8，MgCl2 0.5，HEPES
6.0，Glucose 5.0，PH=
7.4 with NaOH
（3）酶溶液：无钙台氏液+0.4mg/ml collagenase+0.1mg/ml protease
（4）贮存液(mmol-1)：KOH 70，L-glutamine acid50，KCl 40，Taurine 20，KH2PO4 20，MgCl2 3，Glucose 10，HEPES 10，EGTA 0.5，PH=7.4 with KOH
1. 我们使用的无钙液和有钙液就只是区别在钙的有无，其他成分都不变，ph
一般调在7.3。
2. 我们蛋白酶用量一般是0.06mg/ml，胶原酶差不多就是你们用的量。
3. 储存液，也就是KB液，这个配方差不多了，因为各文献中配方都差不多，
只是高钾低氯就可以了，不过ph我们是调到7.2的。
4. 你的细胞分的不理想，是怎样的不理想？如果是消化的过头，那么我觉得
八成是蛋白酶用量的问题。这还是要你们自己摸适合自己实验的条件的。
希望对你有帮助！
24．fanping前辈,我还没到复钙细胞都死了。分离大鼠心室肌细胞时用蛋白酶E吗？原来只用胶原酶时还有些细胞，但是不多，高倍镜下每视野1－2个，现在加了蛋白酶E0.03mg/ml，胶原酶的量降了一半0.25mg/ml，仅消化3－4分钟，就有很多细胞，但是过一会就都死掉。我得KB液：KB solution (in mM): KOH 70, L-glutamic acid 50, KCl 40, Taurine 20, MgSO4 3.0
[fanping]分离大鼠心室肌细胞时用蛋白酶E吗？
并非需要两种酶同时使用，如果你使用一种酶就可以消化到很好的细胞，那么另一种可以不用。文献上报道两种酶同时使用是方法的问题，并非要模仿，可根据自己的实验条件和情况而定。
仅消化3－4分钟，就有很多细胞，但是过一会就都死掉。
1.考虑酶过量，可下次实验减少酶量；
2.考虑酶消化时间过长；
3.实验温度，
以及KB液pH值。
建议：可以边实验边观察细胞状态，这样有利于你提早摸好实验条件，但尽管这样，我发现心肌细胞的分离实验可重复性不好。继续努力吧，一起！ 25．有问题请教大家:
1, 新鲜分离的成年大鼠心肌细胞电极一接触上去细胞就死了，除了细胞状态不好还有其他什么原因？
2，可以做膜片钳的心肌细胞镜下看有什么特征？
3，若用新生乳鼠心肌细胞做膜片钳，是用带有小玻片的培养皿养细胞吗？培养瓶可不可以？
4，刚从培养皿拿出来的带有新生乳鼠心肌细胞小玻片放到膜片钳裕槽之前要经过什么处理吗？
谢谢各位前辈！
[xiaoxuanzi]1、最最主要的原因是你的细胞状态不好，除非你的电极内液渗透压有问题
2、细胞呈杆状、横纹清晰、无自主收缩
3、不一定非要用带有小玻片的培养皿养细胞，也可以直接培养的6孔板那
种孔径大小的培养皿里
4、一般不用经过什么特殊处理，培养的新生乳鼠心肌细胞离开孵箱时间不
能太长，否则状态不行，最好液体温度能维持在37度
[mouse9801]电极接触细胞后细胞死亡可能是因为消化过度引起的，另外与上电极时的操作精细度有关，一般应缓慢将电极移至细胞表面，不可动作过大。
2、理想的心肌细胞特征有：边缘整齐、表面无颗粒、横纹清晰、无收缩。
3、做培养的细胞时一般用盖玻片，这样方便取出细胞，培养瓶瓶口太小，
盖玻片放进取出困难，一般用培养皿。
4、一般取出盖玻片后无需特别处理，若表面有杂物可先用PBS轻轻洗涤几
次。
26．SPRINGCOMING及各位高手，请看我的心肌细胞，豚鼠的，横纹清晰，表面清洁，贴壁良好，形状如图，一个很奇怪的现象，刚分下来的细胞反而不好封接，早上12点分，要到下午7,8点才好封。但是破膜总是不行，老掉。
现在不知道是细胞外液内液渗透压什么的问题，还是细胞本身的问题，或者还有什么其他的问题，请教各位高手指点，快毕不了业，昏倒！
[springcoming]我觉得你这个细胞已经不太好了，你可以看到细胞边缘已经有点圆滑了，棱角也有点钝了。我也遇到过你这样的情况，虽然这时细胞贴壁很好，但封接合破膜时可以感觉膜好像绵绵的，粘性大，而不是弹性，通常放置时间久了就会这样，但刚分下需要放置1-2个小时才会好用。而且刚分下时一定要细胞很好，至少成活率在95以上，好的时候几乎就没有死掉的，这样两个小时候在做时也会有很多死掉，但留下的基本上就是比较好的细胞了。如果港份下时就很多死亡的，多半活着的也不会好，这时就要分析分离过程了。总之，急性分离细胞受影响的因素太多了，经验要多摸索积累了。还有渗透压我门用的是在310-310，你可以参考一下。
（二）平滑肌细胞
1.有做平滑肌细胞高手吗？我急性分离的细胞活性不好，封接和破膜怎样超作
呀？多谢了
[沙漠绿洲]不知道你是做哪种平滑肌细胞的?我是做胃的平滑肌细胞的.细胞的质量是实验的关键,如果细胞的质量不好,你的实验技术再高,结果也不会好的,"巧妇妇难为无米之炊",活性不好可能存在以下几个方面的问题:
1.仔细检查一下配置溶液的水是否干净,我一直用的是去离子水;
2.重新标定一下酸度计,溶液的PH值对细胞的活性的影响是很大的,
3.调整一下消化酶的剂量,消化酶需要根据气候温度等情况不同随时加减
4.消化的时间也是根据具体情况适当的缩短或延长.
5.有时候动物的状态也会影响平滑肌细胞的活性质量的,假如动物挨饿,受冻,
受热等使动物处于应急状态,细胞的质量也会下降的.
以上是我在实验中的一些感受,或许对你能有些帮助.希望你的困难早日解决,咱们也相互探讨.
[clamp]我是作脑动脉血管平滑肌细胞钙电流的，做了很长时间但效果不是很好，上面战友也有作平滑肌细胞的，真有同命相连的感觉。我们可以互相交流，共同解决问题。
对于血管平滑肌细胞的急性分离，我的体会是
1. 分离液体最好是新配的，超过一周就不要再用了
2. pH应为7.4为宜，宁偏碱不要偏酸
3. 酶量与消化时间、消化温度（一般37℃）要自己多摸摸，不同细胞的条件
不同
4. 木瓜蛋白酶的效果比胶原酶好（具体原因我也说不清）
尽管都注意了，但运气还是很重要。
国外的消化方法大都两步或三步法，郑永芳教授实验室用两步法消化，但我用他们的方法效果不是特别好，可能各个实验室也有差别。
[沙漠绿洲]你好!实事求是的讲,做平滑肌的确是有点难的,但是我觉得,最难的是细胞质量的问题,只要细胞好,就成功了一多半了,
你说的是封接难,我有点疑义,电极内压是不能给太高的,你想:如果压力太高的话,细胞内液往电极内流的速度不就更快了吗,RUNDOWN不就会更快了吗?你也不能把细胞压的太狠了,那样对细胞也是一个刺激,并且那样更不容易封接了,最好是电极尖端贴到细胞膜后稍微压一点,具体也没有办法说,只能靠自己体会
关于 你说的破膜难,我估计你使用的是国产机器吧,我这里那台国产的机器破膜也是不好,有时候需要用嘴吸,有一次还吸了我一嘴的酚红,恶心了好几天,但是AXON和HEKA公司的两台只要封接好之后,一"zap"却很容易就破了.
做穿孔模式,我也实过,个人觉得更难!
我的一些个人体会,或许有用,供大家相互参考,大家相互交流
[clamp]以我的经验而言，做血管平滑肌细胞主要有4点：
1. 分离：活性好的血管平滑肌细胞的分离比较困难，上面的帖子大体上说了
一些。
2. 封接：由于平滑肌细胞比较小（一般只有20pF左右），封接时，首先应该
用灌流液多冲洗几遍，以去除BSA的影响（李慈珍，1994）；其二，电极尖端压细胞时不能太狠，以免刺破细胞，以在高倍镜下看到细胞表面有一小凹陷为宜（这要多练习）；其三，细胞浴液（灌流液）为高渗液体比较容易封接（康华光，2003）。
3. 破膜：分离得到的平滑肌细胞膜都比较脆，所以，1）电极内负压大时，
可能还没达到GW封接时细胞已破膜，所以宁可升得慢些；2）zap功能对血管平滑肌而言，太大了细胞容易掉，小了不起作用，具体的参数我认为是没有确定值的，使用时要多次摸索，结合负压吸引，个人的手法，熟练程度和运气都很重要。
4. 电流记录：血管平滑肌细胞钙电流非常小，如脑动脉只有30pA左右，
rundown现象又普遍存在，所以我最绝望的就是废了大半天劲却记录不到电流，这一点我还没解决。
2.baxiansheng师兄，是用这篇文献中分离大脑后动脉平滑肌的方法来分rat
的主动脉平滑肌细胞？细胞状态如何呐？钳细胞没有问题？使用的酶量具体如何调整呐，不知baxiansheng师兄是否方便说
[baxiansheng]是的。我们摸索的几种成分的量是：albumin 2.5 mg/ml，DTT
1.5 mg/ml，papin 1.5mg/ml，collagenase
2.5 mg/ml，hyaluronidase 2.5
mg/ml. 分的细胞状态很好，镜下成梭形或香蕉状。后来我们分成熟后，把酶量降下来，调至和文献一样，也能酶解出好细胞。所以酶量不是关键，酶量少一些可以适当延长一些时间，重要的是判断酶解每一步到什么程度该停止，把握这个火候。一般第一步剪成的血管块酶解成接近粘稠的脓鼻涕状（这个形容太恶心，但不知怎么描述恰当些）。然后迅速转移至第二个含酶的小瓶进行第二步酶解。
由于平滑肌个头小，封接比心肌困难，破膜时也比较容易掉。但要有信心。
3.请问您再分离时需要持续通氧气吗？
血管段剪的很小吗？您一般分离多长时间呢？所用液体是当天用当天配制
工程施工技术资料汇编
A册施工技术资料汇总及竣工图 A—0 A册目录 A—1工程概况 A—2单位工程竣工核验有关资料 A—2.1施工单位工程质量竣工报告（合格证明书）A—2.2勘察单位工程质量检查报告（合格证明书）A—2.3设计单位工程质量检查报告（合格证明书）A—2.4监理单位工程质量评估报告（合格证明书）A—2.5监理单位工程质量评估报告（详细报告） A—2.6建设工程竣工验质量检和功能试验纪录表 A—2.7建设工程竣工验收报告 A—2.8建设工程竣工验收备案表 A—3基础分部工程核验有关资料 A—3.1分项、分部工程质量验收证明书（基础分部工程）A—3.2基础分部工程质量监理评估报告 A—4主体分部工程核验有关资料 A—4.1分项、分部工程质量验收证明书（主体分部工程）A—4.2主体分部工程质量监理评估报告 A—5结构吊装、桩基分项工程核验有关资料 A—5.1分项、分部工程质量验收证明书（结构吊装工程）A—5.2结构吊装工程质量监理评估报告 A—5.3分项、分部工程质量验收证明书（桩基分项工程）
A—5.4桩基分项工程质量监理评估报告 A—5.5桩基分项工程竣工图 A—6 建筑工程开工、竣工通知 A—7工程地质勘察报告 A—8图纸会审纪录 A—8.1施工图设计文件审查合格证明书 A—8.2图纸会审纪录 A—9技术核定单及设计修改变更通知书 A—9.1技术核定单 A—9.2设计修改变更通知书 A—10建（构）筑物测量放线及复核 A—10.1工程测量定位放线纪录 A—10.2建（构）筑物工程测量复核表 A—11建（构）筑物变形测量资料 A—11.1建（构）筑物沉降观测记录 A—11.2建（构）筑物沉降量分布曲线示意图，压力与沉降发展曲线图A—11.3垂直测量成果表 A—12地基验槽纪录 A—13 隐蔽工程验收纪录 A—13.0隐蔽工程验收纪录汇总表 A—13.1基坑挖土隐蔽工程验收纪录 A—13.2砂垫层隐蔽工程验收纪录
膜片钳原理
膜片钳技术原理 可兴奋膜的电学模型 细胞膜由脂类双分子层和和蛋白质构成。脂质层的电导很低，由于双分子层的结构特点，形成了细胞的膜电容，通道蛋白的开闭状况主要决定了膜电导的数值。在细胞膜的电学模型中，膜电容和膜电导构成了一个并联回路。在细胞膜的电兴奋过程中，脂质层膜电容的反应是被动的，其电流电压曲线是线性的；而由通道蛋白介导的膜电导构成了膜反应的主动成分，它的电流电压关系是非线性的。 当改变跨膜电位时，膜电容和膜电导分别引发被动和主动电流：Im=Ii＋CdV/dt，其中Im是流过膜的总电流，Ii是通道电流，CdV/dt是由膜电容介导的电容电流。为了考察通道电流就必须消除电容电流的影响，此时可以令dV/dt＝0，即将膜电位钳制在一固定数值，使其不随时间变化，这就是电压钳技术的实质所在。 电压钳技术 离子通道的近代观念源于Hodgkin、Huxley、Katz等人在20世纪30—50年代的开创性研究。在1902年，Bernstein创造性地将Nernst的理论应用到生物膜上，提出了“膜学说”。他认为在静息状态下，细胞膜只对钾离子具有通透性；而当细胞兴奋的瞬间，膜的破裂使其丧失了选择通透性，所有的离子都可以自由通过。Cole等人在1939年进行的高频交变电流测量实验表明，当动作电位被触发时，虽然细胞的膜电导大为增加，但膜电容却只略有下降，这个事实表明膜学说所宣称的膜破裂的观点是不可靠的。1949年Cole在玻璃微电极技术的基础上发明了电压钳位（voltage clamp technique）技术，基本原理如下： 电压钳技术的核心在于将膜电位固定在指令电压的水平，这样才能研究在给定膜电位下膜电流随时间的变化关系。在上图中，膜电位Vm由高输入阻抗的电压跟随器所测量。钳制放大器在比较了膜电位和指令电位E之后，通过电阻Ra将电流注入膜内以控制膜电位。钳制放大器的输出：Vo=A（E－Vm），因为这个输出由电阻Ra和膜所分压，所以输出电流：I=（Vo－Vm）/Ra。由这两个关系可推出：Vm=EA/(1+A)-RaI/（1+A）。因此若钳制放大器的增益A极大，膜电位Vm和指令电位E之间的差别就可以忽略，即实现了电压钳制。 Hodgkin、Huxley和Katz应用电压钳技术研究枪乌贼巨轴突，结合同位素示踪和胞内灌流等技术发现：动作电位的初期，细胞膜主要对钠离子的通透性发生改变，胞外的钠离子迅速内流，并产生所谓的“超射”现象（overshoot）；随后对钠的通透性的急剧减少并且对钾离子的通透性增加。兴奋期的膜电位存在“超射”现象也是膜学说所不能解释的。 根据这些实验，Hodgkin、Huxley和Katz在其1949—1952年的一系列论文中提出了“离子学说”或“钠学说”。认为当膜的去极化超过一个临界值时，就会触发动作电位的产生。在此期间，钠电导迅速上升，钠离子大量内流，使得膜电位接近钠的平衡电位；随后钠电导迅速失活，钾电导逐渐增加，引起膜电位的复极化。 Hodgkin和Huxley通过对电压钳位实验数据的分析，给出了所谓的Hodgkin—Huxley方程。他们将膜电位钳制在不同的水平，观察钾电导或钠电导随时间的变化，然后用一个常微分方程去逼近所得到的实验曲线，而这些微分方程中的参数则假定跟离子通道上的“粒子”相关。根据H—H方程，能够推导出动作电位的阈值、形状、幅度等性质。并且在去除电压钳制的条件下，可以得到一个以电压和时间为变量的偏微分方程，由它可以给出和真实状况相符合的神经冲动的传导。 膜噪声和噪声分析 Katz等人在1970年代初期研究了蛙神经肌肉接头处肌纤维膜电位的波动。他们根据对这种膜电位“噪声”的分析，提出了量子释放的概念，认为神经递质是以囊泡的形式从突触前膜释放到突触间隙中。并且Katz等人借助这种新的“噪声分析”方法（fluctuation analysis），能从突触后膜电位的“噪声”中推测出单位事件的幅度和时程。Anderson、Stevens、Colquhoun和Sigworth等人进一步发展了“噪声分析”。 “噪声分析”的实质在于二项分布期望和方差之间的关系。假定通道只有开和关两个状态，并且各个通道的开关是独立的。若N是通道的总数，p是通道的开放概率，i是单通道电流，I是膜电流的期望值。则有：I=Npi，var(I)=Np(1-p)i2,即：var(I)=iI-I2/N。用var(I)对I作图，这显然是一个开口朝下的抛物线。微分这个二次方程得到曲线的斜率：dvar(I)/dI=i-2I/N,当I=0时的斜率就是单通道电流，根据钳制电位和反转电位之间的差就可以算出单通道电导；在抛物线的顶点即当：dvar(I)/dI=0时，I=Ni/2，由此可算出
膜片钳记录和分析技术在生命科学中的应用
膜片钳记录和分析技术在生命科学中的应用 细胞是动物和人体的基本组成单元，细胞与细胞内的通信,是依靠其膜上的离子通道进行的，离子和离子通道是细胞兴奋的基础，亦即产生生物电信号的基础，生物电信号通常用电学或电子学方法进行测量。由此形成了一门细胞学科—电生理学（electrophysiology），即是用电生理的方法来记录和分析细胞产生电的大小和规律的科学。 早期的研究多使用双电极电压钳技术作细胞内电活动的记录。现代膜片钳技术是在电压钳技术的基础上发展起来的。 1976年德国马普生物物理研究所Neher和Sakmann创建了膜片钳技术（patch clamp recording technique）。这是一种以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜单一的（或多个的离子通道分子活动的技术）。以后由于吉欧姆阻抗封接(gigaohm seal, 109Ω)方法的确立和几种方法的创建。这种技术点燃了细胞和分子水平的生理学研究的革命之火，它和基因克隆技术（gene cloning）并驾齐驱，给生命科学研究带来了巨大的前进动力。这一伟大的贡献，使Neher和Sakmann获得1991年度的诺贝尔生理学与医学奖。 一、膜片钳技术发展历史 1976年德国马普生物物理化学研究所Neher和Sakmann首次在青蛙肌细胞上用双电极钳制膜电位的同时，记录到ACh激活的单通道离子电流，从而产生了膜片钳技术。 1980年Sigworth等在记录电极内施加5-50 cmH2O的负压吸引，得到10-100GΩ的高阻封接（Giga-seal），大大降低了记录时的噪声实现了单根电极既钳制膜片电位又记录单通道电流的突破。 1981年Hamill和Neher等对该技术进行了改进，引进了膜片游离技术和全细胞记录技术，从而使该技术更趋完善，具有1pA的电流灵敏度、1μm的空间分辨率和10μs的时间分辨率。 1983年10月，《Single-Channel Recording》一书问世，奠定了膜片钳技术的里程碑。Sakmann 和Neher也因其杰出的工作和突出贡献，荣获1991年诺贝尔医学和生理学奖。 二：膜片钳技术原理 膜片钳技术是用玻璃微电极吸管把只含1-3个离子通道、面积为几个平方微米的细胞膜通过负压吸引封接起来（见下图），由于电极尖端与细胞膜的高阻封接，在电极尖端笼罩下的那片膜事实上与膜的其他部分从电学上隔离，因此，此片膜内开放所产生的电流流进玻璃吸管。在此基础上相对稳定膜电位，同时，对该膜片（单通道）和（全细胞）上的离子通道电流进行监测和记录，即用一个极为敏感的电流监视器（膜片钳放大器）测量此电流强度，代表离子通道电流；并通过分析通道电流了解细胞的性质和生理功能及各因素干预后的影响。
膜片钳技术的发展和应用
膜片钳的发展和应用 1．背景 细胞是生物的基本组成单元，细胞外围有一层薄膜，彼此分离又互相联系，细胞间与细胞内的通信、信号传递依靠其膜上的离子通道来进行，离子和离子通道是细胞兴奋性的基础，亦是产生生物电的基础。生物电信号通常是用电学或电子学的方法进行测量。早期多采用双电极电压钳技术作胞内记录，近年来逐渐被膜片钳所取代，这项技术为从细胞和分子水平了解生物膜离子单通道“开启”和“关闭”的门控动力学及各种不同离子通道的通透性和选择性等膜信息提供了最直接的手段。 膜片钳记录(patch clamp recording)是利用玻璃微电极吸引封接面积仅为几个um2的细胞膜片，在10-12A水平，记录单个或几个通道的离子电流，已达到当今电子测量的极限。此技术广泛用于细胞膜离子通道电流的测量和细胞分泌、药理学、病理生理学、神经科学、脑科学、植物细胞的生殖生理等领域的研究。从而点燃了细胞和分子水平的生理学研究的生命之火，并取得了丰硕的成果。 2．膜片钳技术简介 2.1 基本原理和记录方法 电压钳(V oltage-clamp)是由英国学者Huxley和Katz最先应用的[1]。其实质是通过负反馈微电流放大器在兴奋性细胞膜上外加电流，保持细胞跨膜电位不变，并迅速控制其数值，以观察在不同膜电位条件下膜电流的情况。膜电流的改变反映了膜电阻和膜电容的变化，因此电压钳可用来研究整个细胞膜或一大块细胞膜上所有离子通道的活动，但该技术由于在细胞内插人两根电扳，对细胞损伤很大，在小细胞中难以实现，又因细胞形态复杂，很难保持细胞膜各处生物特性的一致，而逐渐被膜片钳所取代。 膜片钳技术(patch-clamp)是在电压钳基础上发展起来一种新技术，与电压钳的主要区别有二：一是钳制膜电位的方法不同；二是电位固定的细胞膜面积不同，即所研究的离子通道数目不同。与电压钳一样，膜片钳也是利用负反馈电子线路，将微电板尖端所吸附的一个至几个平方微米的细胞膜电位固定在一定水平，观察流过通道的离子电流。其实现膜电位固定的关键是在玻璃微电极尖端边缘与细胞膜之间形成高阻封接，使电极尖开口处与相接的细胞膜小区域(膜片)形成无论是从机械上还是电学上都极为紧密地封接，从而可反映细胞上单一(或多数)离子通道的分子活动[2]。1976年，德国科学家Neher和Sakmann首先用此技术对蛙胸皮肌细胞膜上的己酰胆碱受体通道进行了研究，记录出了量值在皮安级(10-12 A)的微弱电流[3,4]。1981年，经Hamill等[5]后人的进一步完善，其电流测量灵敏度已达1pA，时间和空间分辨率达10 us和1 um。 随着膜片钳技术的出现，目前有几种不同的记录方式： (1)细胞吸附式(cell-attached patch)将两次拉制后，经热抛光的微管电极置于清洁的细胞膜表面, 形成高阻封接，在细胞膜表面隔离出一小片膜，即通过微管电极对膜片进行电压钳制，从而测量膜电流。 (2)内面向外模式(inside-out patch)高阻封接形成后，将微管电极轻轻提起，使其与细胞分离，电极端形成密封小泡，在空气中短暂暴露几秒钟后，小泡破裂再回到溶液中，使小泡的外半部分破裂即得。
膜片钳使用规则
膜片钳使用规则 一、工作原理： 1.膜片钳是一种可以直接观察单一的离子通道蛋白质分子对相应离子通透难易程度等特性的一种实验技术。其基本原理是用一个尖端光洁，直径约为0.5~3um 的玻璃微电极同神经或肌细胞的膜接触而不刺入，然后在微电极另一端开口处施加适当的负压，将与电极尖端接触的那一小片膜轻度吸入电极尖端的纤细开口，这样在这一小片膜周边与微电极开口处的玻璃边沿之间，会形成紧密的封接，其电阻可达数个或数十个千兆欧，这实际上把吸附在微电极尖端开口处的那一片膜同其余部分的膜在化学上完全隔离出来，由微电极记录到的电流变化只同该膜片中通道分子的功能状态有关。如果在这一小片膜中只包含了一个或少数几个通道蛋白分子，那么通过微电极测量出的电流，就是某种带电离子经由开放的单一通道蛋白质分子进行跨膜移动的结果。 二、操作步骤： 1.打开总电源。 2.依次打开电脑、显微镜、监视器、微操、放大器。 3.打开PULSE软件，在E盘建立自己的文件夹。 4.灌注玻璃电极并排空气体。 5.装上玻璃电极，浸入液面并调至视野范围。 6.点击set-up，将增益调为0.5，点Auto，记录电极电阻。
7.封接细胞，若上G，提起或吸破细胞。 8.依次点击on-cell，whole-cell补偿。 9.选定In-out或whole-cell模式进行实验。 10.用毕请关闭仪器，并切断总电源。 三、注意事项： 1.每天做实验前请用清水拖地，以防尘埃、静电伤害机器。 2.拉制仪使用前需预热15-30min。 3.银丝电极及地线发白时，请先用砂纸轻微打磨，再浸入新鲜的次 氯酸钠溶液镀氯化银，如果银丝电极30min未变黑，则考虑更换 次氯酸钠。 4.先开放大器，后开软件；先关软件，后关放大器。 5.非必须用到汞灯时请不要打开汞灯电源，打开后至少需1个小时 才可关闭。 6.在放大器打开时绝对不能用手、金属物品或其它导电的物品接触 电极丝（包括地线），在取放细胞片时请关闭放大器。 7.向玻璃微电极灌注内液时切勿灌太多（1cm左右为适），以防液 体进入银丝底部增加噪声。 8.安装玻璃微电极时，电极应与银丝平行，防止刮蹭银丝电极。 9.玻璃微电极需先用甲醇浸泡，再用酒精灯微烧两端，使其平滑。 10.换液时应时刻观察浴槽，防止液面过低或液体溢出污染镜头，最 适液面为微高于出液口。
以色列技术创新成果资料汇编
以色列技术创新成果资料汇编 新材料行业 特拉维夫大学 希伯来大学
目录 一、特拉维夫大学 (1) 1.3-2015-907 | 抗污薄膜，抗污材料 (1) 2.11-2012-336 | 薄膜透明导电纳米线的显示面板 (2) 3.11-2007-122 | 钴钨磷无电沉积工艺和材料 (3) 4.11-2007-121 | 薄铜钼层为ULSI中应用化学沉积 (4) 5.3-2011-144 | 牙科应用多肽纳米结构抗菌复合树脂充填 (6) 6.11-2013-522 | 蓝宝石高温超导线材 (8) 7.3-2013-469 | 固体气体产生灭火系统高能有机化工原料 (9) 8.11-2012-333 | 从水母制成的生物塑料和水凝胶 (10) 9.2-2007-14 | 自组装肽水凝胶 (12) 10.6-2015-911 | 金属合金纳米泡沫作为在天然气合成油的甲烷干法重整的催化剂 (14) 11.3-2011-149 | 用肽纳米管加强环境传感器和生物传感器的耐久度、敏感度和选择度 (14) 12.11-2013-448 | 铋纳米线 (15) 13.3-2009-27 | “智能”肽纳米纺织品 (17) 14.3-2011-145 | 纳米增强粘合剂、塑料、油漆和涂料 (18) 15.3-2009-26 | 采用纳米压印光刻产品认证（NIL） (19) 16.3-2013-469 | 用于固态产气灭火系统的活性有机材料 (21) 17.3-2012-389 | 铼纳米结构和电沉积 (23) 18.6-2013-468 | 基于多孔硅的光学水中杂质探测 (25) 19.7-2013-442 | 微机电系统（MEMS）传感器和执行器 (27) 20.6-2012-372 | 用于石油挖掘的多孔介质表征 (29) 二、希伯来大学 (31) 1.8-2012-2708 | 将蜘蛛丝蛋白转化为纤维 (31) 2.6-2006-40 | 加强粘性的生物相容黏合剂 (31) 3.9-2010-2490 | 提高导电涂料和光电纳米涂料的生产效率 (32) 4.14-2008-2154 | 层级表面形态的纳米棒 (33) 5.16-2009-2287 | 纳米级鸟笼结构催化剂 (34) 6.9-2013-2904 | 可调节/可固定的混合纳米晶/纳米碳管印刷传感器 (35) 7.9-2013-2893 | 应用于3D印刷传导结构的油墨和加工过程 (36) 8.9-2012-2870 | 效率高，成本低的钙钛矿太阳能电池 (37) 9.9-2012-2868 | 使用弱性石墨金属硫化物复合材料于锂离子电池的制造过程 (38) 10.9-2006-1065 | 设计和制造光化学传感器的新型途径 (39) 11.15-2012-2780 | 通过分子层沉积形成自清洁光滑的表面 (39) 12.14-2013-2965 | 使用闪烁材料进行3D打印 (41) 13.15-2014-3073 | 新型海洋防污手段 (42) 14.9-2010-2423 | 接触型和遥感型新型聚合物凝胶 (43) 15.16-2006-103 | 纳米金的电气连接 (44) 16.6-2006-762 | 与活细胞通讯的电子装置（脑黄金） (44) 17.16-2011-2602 | 重掺半导体的纳米晶体量子点 (45) 18.9-2011-2588 | 融合自我组装材料进入微电子织造过程 (46) 19.9-2011-2608 | 纳米结构和纳米表面的新型掺杂方法 (47) 20.9-2008-2090 | 高敏感度的爆炸物传感器 (48)
膜片钳记录和分析技术
膜片钳记录和分析技术 2010-12-15 16:41 来源：美国分子仪器点击次数：2186 关键词：膜片钳细胞信号 分享到： ?收藏夹 ?腾讯微博 ?新浪微博 ?开心网 细胞是动物和人体的基本组成单元，细胞与细胞内的通信,是依靠其膜上的离子通道进行的，离子和离子通道是细胞兴奋的基础，亦即产生生物电信号的基础，生物电信号通常用电学或电子学方法进行测量。由此形成了一门细胞学科-电生理学（electrophysiology），即是用电生理的方法来记录和分析细胞产生电的大小和规律的科学。 早期的研究多使用双电极电压钳技术作细胞内电活动的记录。现代膜片钳技术是在电压钳技术的基础上发展起来的。 1976年德国马普生物物理研究所Neher和Sakmann创建了膜片钳技术（patch clamp recording technique）。这是一种以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜单一的（或多个的离子通道分子活动的技术）。以后由于吉欧姆阻抗封接(gigaohm seal, 109W)方法的确立和几种方法的创建。这种技术点燃了细胞和分子水平的生理学研究的革命之火，它和基因克隆技术（gene cloning）并架齐驱，给生命科学研究带来了巨大的前进动力。 这一伟大的贡献，使Neher和Sakmann获得1991年度的诺贝尔生理学与医学奖。 一、膜片钳技术发展历史 1976年德国马普生物物理化学研究所Neher和Sakmann首次在青蛙肌细胞上用双电极钳制膜电位
的同时，记录到ACh激活的单通道离子电流，从而产生了膜片钳技术。 1980年Sigworth等在记录电极内施加5-50 cmH2O的负压吸引，得到10-100GW10-100G?的高阻封接（Giga-seal），大大降低了记录时的噪声实现了单根电极既钳制膜片电位又记录单通道电流的突破。 1981年Hamill和Neher等对该技术进行了改进，引进了膜片游离技术和全细胞记录技术，从而使该技术更趋完善，具有1pA的电流灵敏度、1μm的空间分辨率和10μs的时间分辨率。 1983年10月，《Single-Channel Recording》一书问世，奠定了膜片钳技术的里程碑。Sakmann 和Neher也因其杰出的工作和突出贡献，荣获1991年诺贝尔医学和生理学奖。 二、膜片钳技术原理 膜片钳技术是用玻璃微电极吸管把只含1-3个离子通道、面积为几个平方微米的细胞膜通过负压吸引封接起来（见下图），由于电极尖端与细胞膜的高阻封接，在电极尖端笼罩下的那片膜事实上与膜的其他部分从电学上隔离，因此，此片膜内开放所产生的电流流进玻璃吸管，用一个极为敏感的电流监视器（膜片钳放大器）测量此电流强度，就代表单一离子通道电流。 膜片钳技术的建立，对生物学科学特别是神经科学是一资有重大意义的变革。这是一种以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜单一的（或多个的离子通道分子活动的技术。些技术的出现自然将细胞水平和分子水平的生理学研究联系在一起，同时又将神经科学的不同分野必然地融汇在一起，改变了既往各个分野互不联系、互不渗透，阻碍人们全面认识能力的弊端。
膜片钳技术在药学研究中的应用
膜片钳技术在药学研究中的应用 前言 德国物理学家Neher和Sakmann[1.2]建立的膜片钳技术（patch clamp technique）是一种以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞上单一的（或多数的）离子通道活动的技术，已被广泛应用。作为先进的细胞电生理技术，它一直被奉为研究离子通道的“金标准”。应用膜片钳技术可以证实细胞膜上离子通道的存在，并能对其电生理特性、分子结构、药物作用机制等进行深入的研究。基因组学、蛋白质组学研究表明，以离子通道为靶标的药物研究在未来具有很大的发展空间。 关键词膜片钳技术；药学研究；应用 Abstract [ ]The patch-clamp technique , a dominant technique in cellular electrophysiology , is always being regarded as the gold standard for ion channel research.. Application of the patch-clamp technique can demonstrate the existences of ion channels and provide valuable information for ion channels, including their electrophysiological properties , molecular structures and the mechanism of drug action .Genomics and proteomics research has showed that the development of drugs for ion channel target would be very promising in future. Key words Patch-clamp technique ; Study on Medicinal chemistry ; Application 80年代初发展起来的膜片钳技术（patch clamp technique）为了解生物膜离子单通道的门控动力学特征及通透性、选择性膜信息提供了最直接的手段，该技术的兴起与应用，使人们不仅对生物体的电现象和其它生物现象有更进一步的了解，而且基因组学、蛋白质组学研究表明，以离子通道为靶标的药物研究在未来具有很大的发展空间。为了突破由于筛选技术所造成的对离子通道为靶标的药物开发的瓶颈，近年来，对膜片钳技术进行了改进以适合药物高通量筛选的要求，由此产生了一些技术。 一、膜片钳技术原理及特点
特种设备安全技术资料汇编
特种设备安全技术资料汇编 特种设备安全生产目标管理责任书 关于明确特种设备安全管理机构及任命特种设备安全管理人员（专/兼职）的通知特种设备安全生产责任制度 特种设备维护、保养管理制度 特种设备文件和记录管理制度 特种设备应急措施及救援制度 特种设备定期自查及隐患整改制度 特种设备定期检验申报制度 特种设备作业人员安全教育、培训制度 特种设备安全生产会议制度 特种设备事故处理制度 特种设备安全会议记录 特种设备安全自行检查记录 特种设备作业人员培训记录 特种设备停用、报废（拆除）报告 特种设备定期检验申报单 特种设备延期检验申请表 特种设备台帐 锅炉安全运行记录
前言 为贯彻《特种设备安全监察条例》，针对使用单位存在特种设备安全管理规章制度和相关记录不完善的薄弱环节，提高特种设备使用单位安全管理水平，我们引用了特种设备安全管理先进单位的管理资料，组织有关人员编印了《特种设备安全管理规章制度及相关表卡汇编》，旨在帮助特种设备使用单位更好地履行主体责任，建立各项安全规章制度，完善有关特种设备使用过程表单和记录，健全特种设备安全技术档案。 本《汇编》有关内容，虽引用了特种设备安全管理先进单位的管理资料，但考虑到特种设备使用单位管理情况的复杂性，有些内容不一定适合使用单位，各单位在参照《汇编》有关内容时，应结合本单位实际，制定出适合的，可操作的各项安全管理规章制度及相关表卡。《汇编》仅供参考、借鉴，内容若有错误，以国家现行法规、规章、技术规范和有关规范文件为准。 编者 XXXX年X月
特种设备安全生产目标管理责任书 为了进一步加强本公司的安全生产工作，落实安全生产责任，有效的控制各类伤亡事故，依据《特种设备安全监察条例》、现向本公司有关部门、生产车间下达以下安全目标管理责任书： 一、安全生产控制指标. 年，各部门、生产车间不得发生伤亡人员事故。 二、安全生产管理目标. (一)公司成立安全生产工作领导小组，由担任组长，配备专职、兼职安全管理人员。 (二)对特种设备至少每月进行一次自行检查，并作出记录，对发现的问题及时采取措施整改。 (三)建立特种设备安全技术档案。新安装的特种设备必须办理使用登记手续。 (四)提前一个月向特种设备检验机构提交书面特种设备定期检验申请，不使用未经定期检验或者检验不合格的特种设备。 (五)建立健全特种设备生产使用管理的各项规章制度，并做好各项记录。 (六)制定特种设备事故应急措施和救援预案。 (七)加强特种设备的作业人员及相关管理人员的安全知识教育和培训，必须持质量技术监督局统一格式的特种作业人员证书，方可从事相应的作业或者管理工作。 (八)按照国家和自治区有关规定，及时、准确上报各类事故，不得延报、漏报、隐瞒不报。 三、各部门、生产车间必须认真按照责任书要求严格管理，保证特种设备安全运行。抓好安全生产工作。 责任部门（车间）：公司：（公章） 负责人：总经理： 年月日年月日
膜片钳技术原理与基本操作
膜片钳技术原理与基本操作 1976 年Neher 和Sakmann 建立了膜片钳技术（Patch clamp technique），这是一种以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜上单一的或多数的离子通道分子活动的技术。1981 年Hamill, Neher 等人又对膜片钳实验方法和电子线路进行了改进，形成了当今广泛应用的膜片钳实验技术。该技术可应用于许多细胞系的研究，也是目前唯一可记录一个蛋白分子电活动的方法，膜片钳技术和克隆技术并驾齐驱给生命科学研究带来了巨大的前进动力，这一伟大的贡献，使Neher 和Sakmann 获得1991 年诺贝尔医学与生理学奖。 一、膜片钳技术的基本原理 用一个尖端直径在1.5~3.0μm 的玻璃微电极接触细胞膜表面，通过负压吸引使电极尖端与细胞膜之间形成千兆欧姆以上的阻抗封接，此时电极尖端下的细胞膜小区域（膜片，patch）与其周围在电学上分隔，在此基础上固定（钳制，Clamp）电位，对此膜片上的离子通道的离子电流进行监测及记录。 基本的仪器设备有膜片钳放大器、计算机、倒置显微镜、示波器、双步电极拉制器、三轴液压显微操纵器、屏蔽防震实验台、恒温标本灌流槽、玻璃微电极研磨器。膜片钳放大器是离子单通道测定和全细胞记录的关键设备，具有高灵敏度、高增益、低噪音及高输入阻抗。膜片钳放大器是通过单根电极对细胞或膜片进行钳制的同时记录离子流经通道所产生的电流。膜片钳放大器的核心部分是以运算放大器和反馈电阻构成的电流-电压（I-V）转换器，运算放大器作为电压控制器自动控制，使钳制电位稳定在一定的水平上。 二、操作步骤 1.膜片钳微电极制作 (1) 玻璃毛细管的选择：有二种玻璃类型，一是软质的苏打玻璃，另一是硬质的硼硅酸盐玻璃。软质玻璃在拉制和抛光成弹头形尖端时锥度陡直，可降低电极的串联电阻，对膜片钳的全细胞记录模式很有利；硬质玻璃的噪声低，在单通道记录时多选用。玻璃毛细管的直径应符合电极支架的规格，一般外部直径在 1.1~1.2mm。内径1mm。 (2) 电极的拉制：分二步拉制。第一部是使玻璃管中间拉长成一窄细状，第二次拉制窄细部位断成二根，其尖端直径一般在1~5μm，充入电极内液后电极电阻在1~5MΩ为宜。调节第一步和第二步拉制时加热线圈的电流强度，即可得到所需要的电极尖端直径。电极必须保持干净，应现用现拉制。 (3) 涂硅酮树酯：记录单通道电流时，为了克服热噪声、封接阻抗噪声及电极浸入溶液产生的浮游电容性噪声，需要在电极尖颈部（距离微电极尖端50mm）的表面薄薄地涂一层硅酮树酯（sylgard），它具有疏水性、与玻璃交融密切、非导
网络基础知识及移动通信技术材料汇编
网络基础知识及移动通信技术材料汇编 胥正川编印 上海 2009年1月18日
目录 https://www.wendangku.net/doc/626971414.html,munications of the ACM, Special Issue: Emerging technologies for homeland security, Vol. 47, Issue 3, 2004 Saydjari, O.S. Cyber defense: art to science, pp. 52 - 57 Bajcsy, R. etc, Cyber defense technology networking and evaluation, pp. 58 - 61 II.Choi, Y.B., etc (2006) ‘Corporate wireless LAN security: threats and an effective security assessment framework for wireless information assurance’, Int. J. Mobile Communications, Vol. 4, No. 3, pp.266–290. III.Kumar, S. (2004) ‘Mobile communications: global trends in the 21st century’, Int. J. Mobile Communication, Vol. 2, No. 1, pp.67–86. IV.Varshney, U., Malloy, A., Ahluwalia, P. and Jain, R. (2004) ‘Wireless in the enterprise: requirements, sol utions and research directions’, Int. J. Mobile Communications, Vol. 2, No. 4, pp. 354–367. V.Lim, B. and Zheng, H. (2004) ‘A day in the life of Jini: a peek at service-oriented architecture for internet appliances’,Int. J. Mobile Communication, Vol. 2, No. 2, pp.199–216. VI.Pietro, R.D. and Mancini, L.V. (2003) Security and privacy issues of handheld and wearable wireless devices, Communications of the ACM, Vol 46, No. 9. VII.Wei, J., Liu, L.C. and Koong, K.S. (2006) ‘An onion ring
膜片钳技术SOP
膜片钳技术SOP 关键词：膜片钳 目的： 研究膜片上几个甚至一个离子通道的电流，对单个离子通道在各种电位状态及每种电位状态下对产生电流的离子作出定性、定量的分析，来反映细胞膜上离子通道活动，为研究离子通道结构与功能关系提供关于生物电特性的新资料。基本原理： 膜片钳制技术（patch clamp technique)是对一块单独的细胞膜片（或整个细胞）的电位进行钳制的一项电生理技术。 通过对膜电位的钳制可以观察通过离子通道的电流，膜片钳放大器正是通过维持电压的恒定而测出这种电流。运用膜片钳技术记到的最小电流可达到pA级(10-12 A)。膜片钳的本质属于电压钳范畴，其基本工作原理是：采用经典的负反馈放大技术作电压固定，但改用细胞外微吸管作电极，将微电极管尖端与细胞膜表面接触，经负压抽吸，形成具极高阻抗的紧密封接，其电阻值高达10-100千欧（即GΩ=109Ω）。只有在这种封接存在时，通过膜电极引导记录的电流才是通过该膜的离子通道电流。 膜片钳技术原理示意图 Rs是膜片阻抗相串联的局部串联电阻（输入阻抗），Rseal是封接阻抗。Rs通常为1～5MΩ，如果Rseal高达10GΩ（1010Ω）以上时，IP/I=Rseal/(Rs+ Rseal)-1。此Ip可为在I－V转换器（点线）内的高阻抗负反馈电阻(Rf)的电压降而被检测出。
药品和试剂： 根据不同的实验设计选择不同的药品和试剂。 主要仪器设备与材料： ①屏蔽防震实验台(TMC 63-544) ②数字式超级恒渐浴槽（HSS-1 CHENDU INSTRUMENT China） ③微管电极拉制器（PP-83 NARISHIGE Japan） ④微管电极抛光仪（ME-83 NAEISHIFE Japan） ⑤电子刺激器（SEN-2030, NIHON KOHDEN, Japan） ⑥膜片钳放大器（AXOPATCH 200B Axon Instruments U.S.A） ⑦倒置相差显微镜（AXIOVERT 135 ZEISS Germany） ⑧计算机（PⅢ 800） ⑨A/D、D/A转换器（DIGIDATA-1200 Axon Instruments U.S.A） ⑩pClamp软件（10.0）Axon Instruments U.S.A ) 实验对象： 兔、大鼠、猪、和人的组织细胞（直径小于30μm的细胞），都可用于膜片钳实验。动物由泸州医学院（许可证号：SYXK（川）2008-063）提供；人体组织来源于临床手术丢弃物。本SOP以猪冠状动脉平滑肌细胞为例，选取体重约120～150 Kg的猪，雌雄不拘，猪心脏购自泸州市屠宰场。 实验环境： 常温（22o C）下进行, 湿度（70-80%） 操作步骤： 1.液体配制 主要根据研究通道的不同，所用细胞的不同，配制相应的液体，可参考相应的文献进行调整。包括：电极液；细胞外液等。基本原则是保持2个平衡，渗透压平衡和酸碱平衡。另外，所有液体在使用前必须过滤，以保持液体洁净。（详见细胞的分离与培养SOP：L Y-XJD-SYJS-014/015） 2.标本制备 膜片钳实验一般是在单个细胞上进行。实验用单细胞主要来自培养细胞或急性酶分离的细胞，也可来自脑片细胞中的原位细胞。常用的酶是胶原酶和蛋白酶，
线材技术资料汇编实例
一.模管员作业规范 1.模治具开发申请 新开模具由业务开出联络书(提供样品),转交工程,再由工程申请开模,因生产需求,需增开模具由生技写出报告申请开模. 2. 订单作业,跟催 申请单经张总核准后.由模具申请单位联络供应商,提供样品,并从供应商处追回报价单,连同申请单一并交与采购,采购依报价单与供应商联络谈好价格后下订单.订单完成后,交一份订单与申请单位,由申请单位依订购单跟崔模具到位. 3模具的试模确认: 模具到位后,由生技课收取模具.并安排试模填写”模具验收单,”模具”NG”即着送还模具厂修理,’’OK’’则建立履历表,入档管制 二.模具验收作业程序规范. 1.生技课模具管理员将新开或维修后的模具从仓库领出,作初步目视检查以确定 是否有重点缺陷. 2.检查模具结构设计是否合理或符合我司特殊指定要求. 3.检查模具之线档.定位.定位梢,顶针,炮筒等部件是否符合成型作业要求. 4.检查泠冷却系统装置是否符合要求. 5.检查排气系统是否合理. 6.检查射料口开得是否合理.水口料头是否良好,上模是否带插头,合模是否紧密, 模具是否容易安装及拆卸. 7目视检查成型后产品是否有毛边.断胶.气泡,压伤线材及零件等外观不良现象. 8.对照图纸或客户原样.用游标卡尺检查各部分尺寸是否有公差范围内. 9.成型出来的产品与相配外壳组装是否良好.
10.用风磨笔将模具编号打在模板上并记录于<<模具管制一览表>>上. 11.模具验收OK后,及时将验收结果记录于<<模具验收履历表>>上. 三.模具外发/借管制规范. 1.外发/借原因明确:模治具外借时,模管员须写明外发/借原因,是为何而发/借出. 如:因托外加工等,否则不予以发/借出.若无写明原因而发/借出,则视模管员因为不按程序办理记警告以上处罚. 2.外发/借单据.各模治具外发/借时,必须具备相关单据.<<模治具外发/借管 表>><<模治具进出管制表>>.<<模治具(维修)外借管制表>>还有放行条,以上各单据模管员在填表写时必须按表单要求逐项填写准确.<<模治具外发/借管制表>>经本公司单位主管,仓库,工程确认签名,并呈经理或总经理签名后而予以放行,并要求厂商确认签收.模管员必须严格按照以上办理各单据,,缺一不可. 3.如期不回.模治具必须及时跟催回来,各发/借出模具.须按单据归还时间按时归 还,若未及时归还,须注明原因,若未按时跟催回来又未合理处理原因则视为模管员跟催不及时给予处罚. 4.认真确认:模具归还时,模管员须认真确认,若确认无误,则在相关单据上签名. 若确认有问题,须注明责任归属.,以待处理,若有问题而管理员没有查出,而造成损失由模管员负责承担责任. 四.模治具管理规范 1.保养入库.外发/借模治具经确认无误后须及时保养入库,并填写好<<模治具进 出管理表>>. 2.问题处理:对归还有问题之模治具.经明确责任归属后,及时按模治具维修管理 程序处理.
施工技术资料目录汇总
施工技术资料目录汇总 施工技术资料目录汇总作者：佚名时间：2008-3-4 浏览量：A 册施工技术资料汇总及竣工图A—0 A 册目录 A—1 工程概况 A—2 单位工程竣工核验有关资料 A—施工单位工程质量竣工报告（合格证明书） A—勘察单位工程质量检查报告（合格证明书） A—设计单位工程质量检查报告（合格证明书） A—监理单位工程质量评估报告（合格证明书） A—监理单位工程质量评估报告（详细报告） A—建设工程竣工验质量检和功能试验纪录表 A—建设工程竣工验收报告 A—建设工程竣工验收备案表 A—3 基础分部工程核验有关资料 A —分项、分部工程质量验收证明书（基础分部工程）A—基础分部工程质量监理评估报告 A—4 主体分部工程核验有关资料 A—分项、分部工程质量验收证明书（主体分部工程） A—主体分部工程质量监理评估报告 A—5 结构吊装、桩基分项工程核验有关资料
A —分项、分部工程质量验收证明书（结构吊装工程） A—结构吊装工程质量监理评估报告 A —分项、分部工程质量验收证明书（桩基分项工程） A—桩基分项工程质量监理评估报告 A—桩基分项工程竣工图 A—6 建筑工程开工、竣工通知 A—7 工程地质勘察报告 A—8 图纸会审纪录 A —施工图设计文件审查合格证明书 A—图纸会审纪录 A—9 技术核定单及设计修改变更通知书 A —技术核定单 A —设计修改变更通知书 A—10 建（构）筑物测量放线及复核 A —工程测量定位放线纪录 A—建（构）筑物工程测量复核表 A—11 建（构）筑物变形测量资料 A—建（构）筑物沉降观测记录 A—建（构）筑物沉降量分布曲线示意图，压力与沉降发展曲线图 A—垂直测量成果表
膜片钳的发展与应用
膜片钳技术的发展与应用 崔梦梦 （生命科学学院 1241410026） 摘要：膜片钳技术是在电压钳技术的基础上发展起来的，该技术的核心是能够记录 单一离子通道的电流。膜片钳可以测量到0.06pA的电流，它具有1um的空间分辨 率和10us的时间分辨率。作为先进的细胞电生理技术，膜片钳一直被奉为研究离 子通道的“金标准”。应用膜片钳技术可以证实细胞膜上离子通道的存在并能对其 电生理特性、分子结构、药物作用机稍等进行深入的研究。此外，将膜片钳技术与 其他一些先进的技术结合，使其在药理学、病理学、神经科学、脑科学、细胞生物 学和分子生物学等生物科学方面,，得到了越来越广泛的应用。 关键词：膜片钳；离子通道；发展与应用 在细胞膜上存在有许多的离子通道，这些离子通道是细胞兴奋性的基础，对细胞内以及细胞之间的信息传递起着非常重要的作用。为探究离子通道的功能和结构，许多电生理技术被发明创造。英国学者Huxley和Katz最早应用电压钳来研究细胞膜上离子通道的电流变化，但由于该技术钳制的细胞膜面积很大，包含着大量随机开放和关闭着的离子通道，因而不能测定单一离子通道电流。所以在1976年德国神经生物学家Erwin Neher和Bert Sakmann 建立起一种新的技术，即膜片钳技术，并且逐渐取代了电压钳技术。 随着膜片钳技术的不断完善，自1981年以来, 该技术已经在不同动物的肝、脾、胃肠、心肌、骨骼肌、神经系统、内分泌等各类细胞上应用并取得了研究成果。膜片钳技术点燃了细胞和分子水平的生理学研究的革命之火，给生命科学研究带来了巨大的前进动力。 一、膜片钳技术的基本原理 膜片钳技术是利用玻璃微电极尖端经抛光后贴附于神经元膜上，与玻璃微电极尖端相接的膜仅含1—3个离子通道，然后通过负压吸引将这片膜与周围的膜实行高阻封接，因此在电极尖端覆盖下的那片膜，在电学上已于膜的其他部分相互分隔。电极尖端下的膜通道开放所产生的电流流进玻璃微电极吸管，通过一极其敏感的膜片钳放大器，就可测量得到单一离子通道电流。电极尖端的直径一般可达0.5um，它与膜的高阻封接可达到10亿欧，因而极大提高了膜片钳技术的可靠性和灵敏度。 二、膜片钳技术的改进与新进展 （一）穿孔膜片钳技术 1988年Horn等对传统全细胞记录进行了改进，建立了穿孔膜片钳技术。即利用某些抗生素具有在生物膜上形成通透性孔道的性质，将这类抗生素充灌在电极液中，在高阻封接形成之后自发形成全细胞记录模式。该技术中，抗生素形成孔道的有效半径为0.4—0.8 nm，可以选择性地通透Na+ 、K+ 、Li+ 、Cs+ 、Cl- 等一价离子，使细胞内环境相对稳定，电