第二章 分子克隆工具酶

2 分子克隆工具酶（4学时）

概述

限制性内切核酸酶

甲基化酶（Methylase）

DNA聚合酶（DNA polymerase Ⅰ）

其他分子克隆工具酶

工具酶的定义

o在生物技术中常用的各种工具酶系指能用于DNA和RNA分子的切割、连接、聚合、反转录等有关的各种酶系统称为工具酶。

o基因工程的操作，是在分子水平上的操作，是依赖一些酶(如限制性核酸内切酶，连接酶，DNA聚合酶等)作为工具对基因进行人工切割，拼接和扩增等操作。所以把这些酶称之为“工具酶”。

o工具酶是对野生菌株（或真核生物如酵母）进行改造、优化、而产生的生物工程产品。

o自然界的许多微生物体内存在着一些具有特异功能的酶类。这些酶类参与微生物的核酸代

谢，在核酸复制和修复等反应中具有重要作

用，有的酶还作为微生物区别自己和非己的DNA 进而降解非己DNA的防御工具。

o本章主要介绍用于基因工程的各种工具酶。

常用的工具酶

2.1 限制性内切酶(restriction enzyme)

o限制与修饰（Restriction and modification）o限制酶识别的序列

o限制酶产生的末端

o DNA末端长度对限制酶切割的影响

o位点偏爱（Site preference）

o酶切反应条件

o星星活性（star activity）

o单链DNA 的切割

o酶切位点的引入

o影响酶活性的因素

o酶切位点在基因组中分布的不均一性

E.coli k 感染频率下降许多

E .coli B 【E .coli B 限制λ（k ）】

1. 限制与修饰现象

①50年代后Luria 和Human(1952), Bertani 和Weigle (1953) 发现细菌的“限制”现象：

2.1.1 限制与修饰（Restriction and modification ）

E.coli B 修饰

λ(k)*λ(k)

感染

E.coli(B)

细菌如何对λ噬菌体进行限制和修饰?

E.coli B对这些λ(K)进行了修饰。

表2-1 λ噬菌体不同感染株对E.coli 不同菌株的感染率1

11E.coli C 10-4110-4E.coli B

10-410-41E.coli K

λC λB λK λ噬菌体感染率

E.coli 菌株

细菌的限制—修饰系统

①1962年W.Arber(瑞士)发现，寄主对噬菌体的

修饰是在λPhage的DNA上。

②1965年，Arber发现修饰与λ的降解有关，提

出：细胞中存在位点特异性限制酶和特异性甲基化酶，即细胞中有限制—修饰系统(R-M

Restriction-modification system)。

甲基化是常见的修饰作用，可使腺嘌呤A 成为

N 6甲基-腺膘呤，胞嘧啶C 成为5‘甲基胞

嘧啶。

R-M系统是细菌安内御外的积极措施。

2.限制性内切酶的发现

?1968年，Meselson从E.coli K株中分离出了第一个限制酶Eco K，同年Linn和Aeber从E.coli B株中分离到限制酶Eco B。

?1970年，Smith和Wilcox从流感嗜血杆菌中分离到一种限制性酶Hin dⅡ，这是第一个分离到的Ⅱ类限制性内切核酸酶。

?HindⅡ限制性内切酶位点和切割位点如下：

5 '…GTPy↓PuAC…3 '

3 '…CAPu↑PyTG…5 '

由宿主控制的限制与修饰作用

限制性内切酶的命名

o限制性酶采用三字母的命名原则，即属名+ 种名+ 株名的1个首字母，再加上序号，将限制性内切核酸酶的命名要点列于表。

表限制性内切核酸酶的命名要点

Escherichia Coli Ry13

E c o RⅠ

属名种类株系编号

3.限制与修饰系统的种类

o根据酶的亚单位组成、识别序列的种类和是否需要辅助因子，限制与修饰系统至少可分为四类。

o在已纯化分类的3000多种限制性内切酶中，已发现了超过250种的特异识别序列。

表2-2 各种限制与修饰系统的比较Yes

Yes No 限制作用是

否需用ATP 同时竞争互斥分开的反应限制反应与

甲基化反应

在识别位点下游24-26bp 无特异性，至少在识别位点外1000bp 在识别位点中或靠近识别位点切割位点

5-7bp 非对称非对称4-6bp, 大多数为回文对称结构识别位点

二亚基双功能酶三亚基双功能酶(R ，M ，S 亚基) 内切酶与甲基化酶分子不在一起酶分子

ⅢⅠⅡ

Ⅱ型（typeⅡ）限制与修饰系统

o限制酶：一般是同源二聚体（homodimer），由两个彼此按相反方向结合在一起的相同亚单位组成，每个亚单位

作用在DNA 链的两个互补位点上。

o修饰酶：单体，修饰作用一般由两个甲基转移酶来完成，分别作用于其中一条链，但甲基化的碱基在两条链

上是不同的。

o它们识别回文对称序列（palindrome sequence），在回文序列内部或附近切割DNA，产生带3'-羟基和5'-磷酸基团的DNA 产物，需Mg2+，相应的修饰酶只需SAM 。

识别序列主要为4-6bp ，或更长且呈二重对称的特殊序列，但有少数酶识别更长的序列或简并序列，切割位置

因酶而异。

三四章分子克隆载体---答案_完_

第三章分子克隆载体（Molecular cloning vectors） 一、名词解析 1.质粒：质粒是染色体外的遗传因子，能进行自我复制（但依赖于宿主编码的 酶和蛋白质）；大多数为超螺旋的双链共价闭合环状DNA分子（covalently closed circle , cccDNA），少数为线性；大小一般为1～200Kb，有的更大。2.质粒拷贝数：质粒拷贝数(plasmid copy numbers)是指细胞中单一质粒的份数 同染色体数之比值,常用质粒数/每染色体来表示。不同的质粒在宿主细胞中的拷贝数不同。 3.质粒的不相容性：两个质粒在同一宿主中不能共存的现象称质粒的不相容 性，它是指在第二个质粒导入后，在不涉及DNA 限制系统时出现的现象。 不相容的质粒一般都利用同一复制系统，从而导致不能共存于同一宿主中。 4.质粒的转移性：质粒具转移性。它是指在自然条件下，很多质粒可以通过称 为细菌接合的作用转移到新宿主内。它需要移动基因 mob ，转移基因 tra ，顺式因子 bom 及其内部的转移缺口位点 nic。 5.穿梭质粒：既能在真核细胞中繁殖又能在原核细胞中繁殖的载体。这类载体 必须既有细菌的复制原点或质粒的复制原点，又含有真核生物的复制原点，还具备酶切位点和合适的筛选指标。它用来转化细菌，又可以用于转化真核细胞。 6.α-互补：α-互补是指 lacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完 整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶（β -galactosidase ，由 1024 个氨基酸组成）阴性的突变体之间实现互补。α-互补是基于在两个不同的缺陷β-半乳糖苷酶之间可实现功能互补而建立的 7.温和噬菌体：既能进入溶菌生命周期又能进入溶源生命周期的噬菌体。 8.溶源性细菌：具有一套完整的噬菌体基因组的细菌叫溶源性细菌。 9.整合：如果噬菌体的DNA是被包容在寄主细菌染色体DNA中，便叫做已整合 的噬菌体DNA。这中细菌提DNA组入细菌染色体DNA的过程，叫做噬菌体DNA 的整合或插入。 10.溶源化：用温和的噬菌体感染细菌培养物使之形成溶源性细菌的过程叫做溶 源化。

分子克隆技术试卷

分子克隆技术 一、填空题 1.PCR反应中加入矿物油的作用是___________________________。 2.分子克隆实验中外源DNA和载体片段连接之前，要对载体进行去磷酸化处理，我 们在本次试验中去磷酸化使用的碱性磷酸酶是___________________________。它 的目的是___________________________。 3.用α互补筛选转化子是，带有外源片段的菌落显___________________________色。 4.Southern杂交中进行与杂交的目的是___________________________。 5.凝胶糖凝胶电泳时加入loading buffer作用是___________________________和 ___________________________。 6.影响琼脂糖凝胶电泳的因素主要有___________________________、 ___________________________、___________________________、 ___________________________、___________________________。 二、简答题 1.简述PCR反应体系中都有哪些成分及各成分的作用。 2.为得到质量较好的水稻RNA，抽提前应做如何准备？RNA抽提过程中、RNA的 保存及以后对RNA的操作过程中应特别注意什么？ 3.简述为防止放射性同位素外照射及内照射对人体造成伤害，在操作放射性同位素 时，我们可以采取哪些措施进行防护？ 4.简述影响电转化感受态细胞转化效率的因素有哪些？ 5.质粒抽提时用到的SolutionI，SolutionII，SolutionIII及异丙醇分别起什么作用？操 作时应注意什么？ 三、分析问答题 1.描述并图示pUC19载体DNA及其在HindIII位点克隆了外源DNA片段的质粒DNA 和水稻总DNA及它们的HindIII和BamH1酶切产物在琼脂糖凝胶电泳时的带型。 2.利用质粒载体克隆外源DNA片段主要包括哪些步骤？涉及到哪些工具酶？要获得 理想的结果，各步骤操作中应主要注意哪些事项？ 3.在Southern杂交实验中，同一根杂交管内的膜曝光的····（原卷此处不清晰）冲 洗后，有些组X光片信号很强，有些组信号很弱，有的样品点样孔附近有较强的 信号，但是有的地方信号较弱，请分析造成这种结果的可能原因。 4.下面是本次课生物技术班某组β-active基因RT-PCR（反转录前没有对总RNA进 行去除DNA 的处理）试验的琼脂糖凝胶电泳图，凝胶上共点了6个样，PCR使用 的模板从左至右分别是：该组提取的水稻总DNA，该组提取的水稻总RNA，该组 的4个反转录产物。（原卷本题图不清晰） 请问： 提取的RNA的质量如何？ RT-PCR是否成功？为什么会出现这样的结果？ 有哪些地方需要改进？

常用分子克隆实验方法

常用分子克隆实验方法I 一、植物总DNA的小量提取 方法1：提取吸附法。无须巯基乙醇、氯仿等有毒物质，产物无须Rnase处理。 (1)充分研磨。称取约0.2克植物组织，加入液氮充分研磨3-5min，稍后加约1ml溶液 A，继续研磨至略粘稠的组织匀浆，用大口1ml吸头将所有溶液移至1.5ml离心管 中，55℃水浴30min； (2) 高速离心去杂质。10,000rpm离心5min，取约600ul上清至新1.5ml离心管； (3) 核酸吸附。往上清液中加入1倍的异丙醇，轻轻混匀，再加入总体积1/4已混匀的 溶液B，静置3min; (4) 低速离心沉淀。5000rpm离心1min，轻轻倒掉上清，并用吸水纸轻吸离心管口， 再用移液枪吸走大部分残余液体； (5) 75%乙醇清洗。加入1ml75%乙醇，5000rpm离心30s，轻轻倒掉上清，用吸水纸稍 吸离心管口。重复该步骤一次，再5000rpm离心30s，然后用移液枪吸走管底的残 液，晾干5min； (6) 核酸洗脱。加入约55ul TE（PH8.0）至管底，轻轻重悬硅土，静置3min，10,000rpm 离心1min，用小枪头轻轻吸取出50ul管底溶液，冷藏。 方法2：CTAB法，此为在经典方法基础上，经过摸索改进，提高了得率，减少了污染。 (1)充分研磨。称取约0.2克植物组织，加入液氮充分研磨3-5min，稍后加约1ml CTAB 提取液，继续研磨至略粘稠的组织匀浆，用大口1ml吸头移至1.5ml离心管，65℃ 水浴30-60min。 (2) 氯仿抽提。10,000rpm离心3min，取约600ul上清。加入1倍的氯仿，轻轻混匀， 10,000rpm离心3min，取上清再抽提1遍。 (3) 核酸沉淀。加入预冷的1倍异丙醇或2倍乙醇，轻混匀，6000rpm离心3min，弃 上清。 (4) 清洗沉淀。轻加入1ml 75%乙醇，再吸掉上清，重复一次，倒置于吸水纸或横放于 离心管架上晾干5min。 (5) 溶解DNA。加50ul含Rnase A（约10ug/ml）的TE，常温下放置30min。取约3-5ul 电泳检测后，低温冷藏。

分子克隆技术步骤

分子克隆技术步骤 在分子水平上提供一种纯化和扩增特定DNA 片段的方法。常含有目的基因，用体外重组方法将它们插入克隆载体，形成重组克隆载体，通过转化与转导的方式，引入适合的寄主体内得到复制与扩增，然后再从筛选的寄主细胞内分离提纯所需的克隆载体，可以得到插入DNA 的许多拷贝，从而获得目的基因的扩增。 克隆在生物学中其名词含义系指一个细胞或个体以无性繁殖的方式产生一群细胞或一群个体，在不发生突变的情况下，具有完全相同的遗传性状，常称无性繁殖( 细胞)系；其动词(clone,cloned,cloning) 含义指在生物体 外用重组技术将特定基因插入载体分子中，即分子克隆技术。 将DNA 片段( 或基因)与载体DNA 分子共价连接，然后引入寄主细胞，再筛选获得重组的克隆，按克隆的目的可分为DNA 和cDNA 克隆两类。 cDNA 克隆是以mRNA 为原材料，经体外反转录合成互补的DNA(cDNA) ，再与载体DNA 分子连接引入寄主细胞。每一cDNA 反映一种mRNA 的结构，cDNA 克隆的分布也反映了mRNA 的分布。特点是：①有些生物，如RNA 病毒没有DNA ，只能用cDNA 克隆； ②cDNA 克隆易筛选，因为cDNA 库中不包含非结构基因的克隆，而且每一cDNA 克隆只含一个mRNA 的信息； ③cDNA 能在细菌中表达。cDNA 仅代表某一发育阶段表达出来的遗传信息，只有基因文库才包含一个生物的完整遗传信息。 1. 方法： (1) DNA 片段的制备：常用以下方法获得DNA 片段：①用限制性核酸内切酶将高分子量DNA 切成一定大小的DNA 片段； ②用物理方法( 如超声波) 取得DNA 随机片段；③在已知蛋白质的氨基酸顺序情况下，用人工方法合成对应的基因片段；④从mRNA 反转录产生cDNA 。 (2) 载体DNA 的选择： ①质粒：质粒是细菌染色体外遗传因子，DNA 呈环状，大小为1-200 千碱基对(kb) 。在细胞中以游离超螺旋状存在，很容易制备。质粒DNA 可通过转化引入寄主菌。在细胞中有两种状态，一是“紧密型”；二是“松驰型”。此外还应具有分子量小，易转化，有一至多个选择标记的特点。质粒型载体一般只能携带10kb 以下的DNA 片段，适用于构建原核生物基因文库，cDNA 库和次级克隆。 ②噬菌体DNA ：常用的λ噬菌体的DNA 是双链，长约49kb，约含50 个基因，其中50% 的基因对噬菌体的生长和裂解寄主菌是必需的，分布在噬菌体DNA 两端。中间是非必需区，进行改造后组建一系列具有不同特点的载体分子。λ载体系统最适用于构建真核生物基因文库和cDNA 库。 M13 噬菌体是一种独特的载体系统，它只能侵袭具有 F 基因的大肠杆菌，但不裂解寄主菌。M13DNA(RF) 在 寄主菌内是双链环状分子，象质粒一样自主制复，制备方法同质粒。寄主菌可分泌含单链DNA 的M13 噬菌体，又能方便地制备单链DNA ，用于DNA 顺序分析、定点突变和核酸杂交。 ③拷斯(Cos) 质粒：是一类带有噬菌体DNA 粘性末端顺序的质粒DNA 分子。是噬菌体－质粒混合物。此类载体分子容量大，可携带45kb 的外源DNA 片段。也能象一般质粒一样携带小片段DNA ，直接转化寄主菌。这类载体常被用来构建高等生物基因文库。 (3) DNA 片段与载体连接：DNA 分子与载体分子连接是克隆过程中的重要环节之一，方法有：①粘性末端连接，DNA 片段两端的互补碱基顺序称之为粘性末端，用同一种限制性内切酶消化DNA 可产生相同的粘性末端。在连接酶的作用下可恢复原样，有些限制性内切酶虽然识别不同顺序，却能产生相同末端。②平头末端连接，用物理方法制备的DNA 往往是平头末端，有些酶也可产生平头末端。平头DNA 片段可在某些DNA 连接酶作用下连接起来，但连接效率不如粘性末端高；③同聚寡核苷酸末端连接。④人工接头分子连接，在平头DNA 片段末端加上一段人工合成的、具有某一限制性内切酶识别位点的寡核苷酸片段，经限制性内切酶作用后就会产生粘性末端。 连接反应需注意载体DNA 与DNA 片段的比率。以λ或Cos 质粒为载体时，形成线性多连体DNA 分子，载体与DNA 片段的比率高些为佳。以质粒为载体时，形成环状分子，比率常为1∶1。 (4) 引入寄主细胞：常用两种方法：①转化或转染，方法是将重组质粒DNA 或噬菌体DNA(M13) 与氯化钙处 理过的宿主细胞混合置于冰上，待DNA 被吸收后铺在平板培养基上，再根据实验设计使用选择性培养基筛选重组子，通常重

分子克隆及细胞培养基本实验方法

分子克隆及细胞培养基本实验方法 1.载体构建实用操作技术 1.1菌种的保存—20%甘油菌 2体积菌液与1体积70%的甘油混合后，储存于-20℃或-70℃备用。（甘油菌中甘油的浓度为20-30%均可） 1.2甘油菌复苏、培养 方法一、挑取甘油菌一环，接种在含100ug/ml Amp的LB固体培养基上（活化菌种），37℃培养过夜（约16小时）；挑取一个菌落转接在含100ug/ml Amp 的LB液体培养基中，37℃振荡过夜（约12~16小时）。 方法二、直接吸取10~20ul甘油菌，接种在含100ug/ml Amp的LB液体培养基中，37℃振荡过夜（约12~16小时）。 1.3小规模制备质粒DNA（QIA miniprep kit ） 适于从1~5ml 菌液中制备20ug高拷贝质粒 ⑴收集菌液，离心1000rpm，１分，弃上清 ⑵以250ul P1重悬细菌（P1中已加RNase） ⑶加入250ul P2，颠倒4~6次轻混，约2~3分（轻混以免剪切基因组DNA，并免 长时间消化） ⑷加入350ul N3，迅速颠倒4~6次轻混；离心10分，13 000rpm ⑸上清入QIAprep柱，离心30~60秒，滤液弃之 ⑹加入0.5ml PB洗，离心30~60秒 ⑺加入0.75ml PE洗，离心30~60秒，弃滤液，再离心1分 ⑻换新管，加入50ul EB，静置1分（EB 37℃预热），离心1分。 1.4酶切反应 ⑴体系构成（反应体系尽可能小！） pGEM3ZF-huCTLA4-Ig（ul）pAdTrack-CMV（ul）

①dd.H2O 17 17 ②10×NEbuff 2 3 3 ③10×BSA 3 3 ④底物DNA 5 5 ⑤内切酶HindⅢ 1 1 XbaⅠ 1 1 Total : 30 ul 30ul ⑵37℃水浴1~2小时，必要时延长酶切时间至12小时 ⑶酶切2小时后，取5-10ul 电泳观察酶解是否完全 ⑷65℃灭活内切酶 ⑸-20℃保存备用 1.5回收目的片段（QIAquick Gel extraction Protocol） ⑴胶，尽可能去除多余的胶，称重； ⑵加入适量buff QG（300ul QG /100mg胶）；>2%的胶，应加大QG用量（600ul QG /100mg）； ⑶水浴50℃，10min，每2-3min混匀一次，使胶完全溶解！必要时延长水浴时间， 胶完全溶解后混合物颜色应为黄色，与buff QG 相似； ⑷当DNA片段在<500bp或>4kb时，应加入异戊醇100ul/100mg胶，以提高产物 量。此步不离心。DNA片段在500bp~4kb时，加入异戊醇并不能提高产量； ⑸结合：将混合物转入QIAquick柱，离心13000rpm，1min；（柱容量800ul/次）； ⑹洗：0.75ml buff PE，离心13000rpm，1min；（DNA用于盐敏感操作时，如平 端连接、直接测序，加入PE后静置2-5min）；弃离心液，再离心13000rpm， 1min，以去除剩余的乙醇； ⑺将QIAquick柱置于一清洁的1.5ml Ep管，加入30~50ul buff EB或H2O （滴 于QIAquick 膜上！），静置1min，离心15000rpm，1min； ⑻-20℃保存备用。 1.6连接反应

分子克隆工具酶部分答案

分子克隆工具酶答案（选择和判断） 题1 关于宿主控制的限制修饰现象的本质，下列描述中只有( )不太恰当。 B. 这一系统中的核酸酶都是Ⅱ类限制性内切核酸酶 题目2 Ⅱ型限制性内切核酸酶：( ) D. 限制性识别非甲基化的核苷酸序列 题目3 Ⅲ型限制性内切核酸酶：( ) E. 不同亚基的识别位点甲基化和限制活性相互排斥：MS亚基促使甲基化，R亚基促使限制 题目4 限制性片段长度多态性(RFLP)是：( ) E. 物种中的两个个体限制性图谱间的差别 题目5 下面有关限制酶的叙述哪些是不正确的?( ) E. 限制酶是外切酶而不是内切酶 题目6 因研究λ噬菌体的限制与修饰现象的本质而获得诺贝尔奖的科学家是：( ) C. WArber 题目7 第一个被分离的Ⅱ类酶是：( ) A. HindⅡ 题目8 双链DNA中一段自我互补的序列被称为回文序列，这种序列不具有下列特征：( ) B. 可增强基因的表达 题目9 在下列进行DNA部分酶切的条件中，控制那一项最好?( ) B. 酶量酶量 题目10 在下列试剂中，那一种可以螯合Ca2＋离子?( ) A. EGTA 题目11

在下列工具酶中，那一种可以被EGTA抑制活性?( ) C. Bal 31核酸酶 题目12 限制性内切核酸酶可以特异性地识别：( ) B. 双链DNA的特定碱基序列 题目13 限制性内切核酸酶的星号活性是指：( ) B. 在非常规条件下，识别和切割序列发生变化的活性。 题目14 下面哪一种不是产生星号活性的主要原因?( ) C. 酶切反应时酶浓度过低 题目15 关于回文序列，下列各项中，( )是不正确的 B. 是高度重复序列 题目16 关于宿主控制的限制修饰现象的本质，下列描述中只有( )不太恰当 D. 这一系统中的核酸酶都是Ⅱ类限制性内切核酸酶 题目17 T4DNA连接酶是从T4噬菌体感染的E．coli中分离的，这种连接酶( ) B. 既能催化平末端连接又能催化黏性末端连接 题目18 DNA连接酶在体内的主要作用是在DNA复制、修复中封闭缺口，( ) A. 将双链DNA分子中的5，磷酸基团同3，-OH末端重新形成磷酸二酯键 题目19 在长模板链的指导下引物延伸合成长的DNA互补链时应选用( ) A. T7DNA聚合酶 题目20 末端转移酶是合成酶类，( ) D. 在C0 2＋的存在下，可以在3’突出末端延长DNA链 题目21 在基因工程中，可用碱性磷酸酶( ) B. 防止DNA的自身环化 题目22

分子克隆技术实验讲义2016.3(最终版)

分子克隆技术实验讲义 黑龙江大学生命科学学院 2016年3月 甜菜M14品系BvM14-glyI基因的克隆与鉴定 一、实验目的 1、熟悉和了解目的基因克隆与鉴定的过程和方法。 2、学习和掌握质粒、T载体的特点。 3、学习和掌握TA克隆的连接体系及操作要点。 4、学习和掌握XcmⅠ酶切制备T载体的过程及方法。 5、学习和掌握CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞的原理和方法。 6、学习并掌握热激法转化技术的原理和操作步骤。 7、学习并掌握重组子鉴定和筛选的原理及蓝白筛选的原理和方法。 8、学习并掌握碱法小量制备质粒DNA的原理及操作步骤。

二、相关知识 （一）T载体的制备 pMD18-T Vector是一种高效克隆PCR产物（T-A Cloning）的商业化专用载体，由pΜC 18载体改建而成。在pΜC 18多克隆位点处的XbaⅠ和SalⅠ识别位点之间插入了Eco RⅤ识别位点，用Eco RⅤ进行酶切反应后，再左两侧的3′端添加“T”而成，可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率。 相关知识点：（1）质粒的提取；（2）酶切；（3）PCR等。 （二）DNA的重组与连接（PCR产物的克隆） 把DNA片段从某一类型的载体无性繁殖到另一类型载体中，例如从某种质粒克隆到另一种质粒，这个过程称为亚克隆。所谓重组，就是把外源目的基因“装进”载体的过程，即DNA的重新组合。为了将目的基因重组于载体分子中，需要将载体DNA和目的基因分别进行适当处理，一般采用内切酶法将载体DNA分子切割成可与外源基因连接的线性分子，使其与相同酶切过的载体分子相互连接，彼此成为配伍末端（compatible end），以产生末端连接。现在一些生物公司也开发了针对不同插入DNA片段的专用载体，如专门用于克隆PCR产物的载体，大大方便了实验操作。 相关知识点：（1）克隆与亚克隆；（2）DNA重组；（3）内切酶；（4）粘性末端与平末端；（5）连接酶；（6）连接酶的分类及功能等。 （三）大肠杆菌感受态细胞的制备 外源基因与载体在体外连接成重组体DNA分子后，需将其导入受体细胞进行扩增和筛选，得到大量、单一的重组体分子，这就是外源基因的无性繁殖，或称为克隆。受体细胞也叫宿主细胞，大肠杆菌宿主菌是目前基因工程最常用的受体细胞。感受态细胞（competent cell）是经过一定方法处理后，具有接受外源DNA能力的大肠杆菌，只有发展了感受态的细胞才能稳定地摄取外来的DNA分子。 相关知识点：（1）克隆；（2）宿主细胞的定义及分类；（3）感受态细胞定义及其功能；（4）转化定义及方法（DMSO、MnCl2、TB aq、PEG）等。 （四）重组DNA的转化及重组子的鉴定 将外源DNA分子导入某一宿主细胞的过程称为转化。把重组DNA分子导入到细菌中产生克隆有两个目的，一是大量产生重组DNA分子，在完成连接反应后，重组DNA分子往往只有纳克级的量，不易操作和进行下一步的分析，若把重组DNA分子导入到细菌细胞中，细菌细胞可分裂多次产生克隆，克隆中每一个细胞都含有很多个拷贝的重组DNA分子，这样重组DNA分子的量就多了；二是对重组DNA 分子进行纯化，在构建重组DNA分子的过程中很难保证体系中不污染其他的DNA分子，连接过程完成以后体系中有多种分子存在，除了需要的重组DNA分子以外，还含有没有连接上的载体分子、没有连接上的DNA片段、自身环化的DNA分子和连接上污染DNA片段的重组DNA分子，未连接上的载体和DNA片段对实验影响不大，因为它们即使导入细菌细胞，因为不能复制，很快就要被细菌细胞中的酶降

分子克隆基本流程及技术原理

分子克隆主要技术： （1）限制性内切酶酶切与连接 基因克隆也叫DNA分子克隆，即在体外重组DNA分子，而实现该技术的关键是一种被称作限制性核酸内切酶的工具酶。每一种限制性核酸内切酶可以识别DNA分子上特定的碱基序列，切断DNA分子。依据碱基互补的原理，在DNA连接酶的作用下可以把切开的DNA片段连接起来，因此可以把目的片段连接到合适的载体上形成重组子。 （2）转化与转染 作为表达载体，必须具有复制起始序列、多克隆位点及选择标记，可以在宿主细胞中进行自我复制或整合到宿主基因组中进行复制。作为宿主的工程菌或细胞在某些化学条件或物理刺激下会改变其细胞膜的通透性，从而易于将细胞表面附着的外源基因吸收到胞内，这一过程即转化（工程菌）或转染（细胞）。 利用选择标记可以很容易鉴别成功导入目的基因的工程菌或细胞，比如抗生素抗性筛选—凡是成功导入重组载体的工程菌或细胞均获得某种抗生素抗性，而未导入的工程菌或细胞则不能在含该抗生素的培养基中生长。 （3）聚合酶链式反应 聚合酶链式反应，即PCR。PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃（具体退火温度根据引物的Tm值确定）左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

分子克隆技术第二章

第二章基因工程的工具酶 第一节限制性核酸内切酶 一、限制性核酸内切酶的发现 Restriction endonucleases ● Restriction-modification systems occur in many bacterial species, and constitute a defense mechanism against the introduction of foreign DNA into the cell. ● They consist of two components; the first is a restriction endonuclease, which recognizes a short, symmetrical DNA sequence, and cuts (hydrolyzes) the DNA backbone in each strand at a specific site within that sequence. Foreign DNA will hence be degraded to relatively short fragments. 2017/2/21 有关的几个概念 限制 (restriction) 修饰 (modification) 宿主控制性限制(host —controlled restriction) 限制性核酸内切酶的生物学功能 ● The second component of the system is a methylase, which adds a methyl group to a C or A base within the same recognition sequences in the cellular DNA. This modification renders the host DNA resistant to degradation by the endonuclease. Restriction endonucleases ● Restriction endonucleases are bacterial enzymes which cut (hydrolyze) DNA into defined and reproducible fragments. In bacteria, they form part of the restriction-modification defense mechanism against foreign DNA.They are the basic tools of gene cloning. 二、限制性核酸内切酶的分类 核酸酶 核糖核酸酶（RNase ） 脱氧核糖核酸酶（DNase ） 核酸外切酶（exonuclease ） 核酸内切酶（endonuclease ）

基因工程复习总结材料

思考题 第二章分子克隆工具酶 1简述基因工程研究用的工具酶的类型和作用特点。 2.说明限制性内切核酸酶命名原则（举例）。

3.限制内切核酸酶的星活性是指什么？ 在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星星活性。星星活性是限制性内切酶的一般性质，任何一种限制酶在极端非标准条件下都能切割非典型位点。 引起星星活性的因素:甘油浓度高（>5%），酶过量（>100U/ml），离子强度低（<25 mmol/L），pH 值过高（>8.0），或是加了有机溶剂如DMSO（二甲基亚砜）、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺，或是用其它2价阳离子如Mn2+、Cu2+、Co2+ 或Zn2+代替了Mg2+。 4.T4 DNA ligase 和E.coli ligase 有什么异同？

5.连接酶的反应温度如何选择，为什么？ 连接酶最适的反应温度应是37℃，但在这一温度下粘性末端的氢键结合不稳定，因此连接反应常采用的最佳温度一般在4-16℃间，通常多选用12-16℃30分钟到16小时。 6.什么是Klenow酶？有什么作用？ Klenow DNA聚合酶是从全酶中除去5′―3′外切活性的肽段后的大片段肽段，而聚合活性和3′―5′外切活性不受影响。也称为Klenow片段（Klenowfrgment），或E.coli DNA聚合酶Ⅰ大片段（E.coli DNA polymeraseⅠlarge fragment）。 它也可以通过基因工程得到，分子量为76 kDa。由于没有5′―3′外切活性，使用范围进一步扩大。 ①补平3′凹端，如果使用带标记的dNTP，则可对DNA进行末端标记。 ②抹平DNA3′凸端在3′―5′外切活性 ③通过置换反应对DNA进行末端标记 ④在cDNA克隆中合成第二链 ⑤随机引物标记 ⑥在体外诱变中，用于从单链模板合成双链DNA ···7.如何利用工具酶来研究某一个基因内含子的存在？ ···8.哪些工具酶可以用于探针标记？ T4 DNA聚合酶的替代合成法标记DNA探针。 反转录酶还可利用单链DNA或RNA作模板合成分子探针。 第三章分子克隆载体 1.基因工程载体应具备哪些特点？ 能在宿主细胞中独立复制； 有一定的选择标记，易于识别和筛选； 有合适的限制酶位点，可插入一段较大的外源DNA，而不影响其本身的复制; 最好有较高的拷贝数，便于载体制备。 2.作为一个最基本的载体，它必须具备哪些功能元件？ 能独立复制的单链或双链DNA; 选择标记基因；

分子克隆技术实验指导

分子克隆技术 DNA重组技术是在分子水平对基因进行体外操作，因而也称为分子克隆（Molecular Cloning）或基因克隆，是在体外对DNA分子按照既定的目的进行人工重组，并导入到合适的受体细胞中，使其在细胞中扩增和繁殖，以获得DNA 分子大量复制，并使受体细胞获得新的遗传特征的过程。 其基本原理是：将编码某一多肽或蛋白质的基因（外源基因）经过特定限制性酶切割以及与目标载体连接，组装到细菌质粒（质粒是细菌染色体外的双链环状DNA分子）中，再将这种质粒（重组质粒）转入大肠杆菌体内，这样重组质粒就随大肠杆菌的增殖而复制，从而表达出外源基因编码的相应多肽或蛋白质，并且来源于一个菌株的质粒是一个分子克隆，而随质粒复制出的外源基因也就是一个分子克隆。 分子克隆技术的成就对于工业、农牧业和医学产生深远影响，并将为解决世界面临的能源、食品和环保三大危机开拓一条新的出路。 实验前准备 实验开始前，需准备好所需的试剂，如PCR扩增及酶切，连接所需酶类试剂及相应的buffer，均为TaKaRa产品分装，Buffer、dNTP、引物试剂等需要从-20℃取出至室温融化、涡旋震荡混匀离心后使用，酶类试剂从-20℃取出瞬时离心（小于4000 rpm）放置冰浴中备用。 还有各项实验所需的药品（如琼脂糖），以及配置好培养基，抽提质粒用的溶液一、二、三等试剂。 本次实验所涉及的常规仪器及耗材有：Thermo Scientific Arktik PCR仪，水平电泳槽，超净工作台，恒温水浴锅，紫外照胶仪，赛默飞公司提供的F1，F2和F3一系列量程的单道移液器等仪器，1.5ml离心管，玻璃试管，赛默飞公司提供的QSP盒装吸头及15ml离心管等。 接下来进入实验部分，本实验操作流程为：首先在GenBank中查询目的基因序列，然后根据得到的序列进行酶切位点分析及引物的设计，通过RT-PCR获取目的基因，酶切以及与载体连接，转化进入宿主菌中，针对得到的菌落进行菌落PCR快速筛选，得到初步的阳性克隆，最后通过质粒提取及鉴定，得到的阳

第二章 分子克隆工具酶题目

第二章分子克隆工具酶 一、选择题 1.有关基因工程的叙述正确的是（） A.限制性内切酶只在获得目的基因时才用 B.重组质粒的形成在细胞内完成 C.质粒都可作运载体 D.蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料 2.限制性内切酶EcoRⅠ在野生型的λ噬菌体DNA中有5个切点，Hind Ⅲ有7个切点。调 整这些酶切位点的数量，主要通过（）。 A.体内突变 B.完全酶切后连接 C.部分酶切 D.先用甲基化酶修饰后再酶切 二、填空题 1.如果用限制性内切核酸酶切割双链DNA产生5?突出的黏性末端，则可以用__________进行3?末端标记。如果用限制性内切核酸酶切割DNA产生的是3?突出的黏性末端，可以用__________________ 进行3?末端标记。 2.可用T4 DNA聚合酶进行平末端的DNA标记，因为这种酶具有____________和_______的活性。 三、判断题 1. pBR327是在pBR322的基础上去掉了1089bp的片段，留下了ampR和tetR的完整片段。pBR327比pBR322有更高的拷贝，每个细胞中含有30-45个拷贝。同时pBR327具有接合能力，能直接转入其他细胞（） 四、名词解释 1. DNA聚合酶 2. 限制性内切酶 3. 甲基化酶 4. T4-DNA连接酶 5. 核酸酶 6. Klenow酶 7. T4 DNA聚合酶 8. Taq DNA聚合酶 9. 逆转录酶10. 同裂酶 11. 核酶 五、简答题 1.限制性内切酶分为哪几大类，各有什么特点？ 2. DNA修饰酶主要有哪些，各有什么作用？ 3.简述Klenow聚合酶的用途。 4.比较E.coli DNA 连接酶和Taq DNA 连接酶的作用特点。

分子克隆技术第三章

2017/2/21 第三章载体 第一节基因克隆技术概述 一、基因克隆技术 基因克隆技术包括把来自不同生物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接，构建成新的重组的DNA，然后送入受体生物中去表达，从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。 二、目的基因的取得 1、直接 2、反转录酶 3、化学合成 4、基因文库 5、PCR ?首先利物理方法（如剪切力、超声波等）或酶化学方法（如限制性 内切核酸酶）将生物细胞染色体DNA切割成为基因水平的许多片段，继而将这些片段与适当的载体结合。将重组DNA转入受体菌扩增，获得无性繁殖的基因文库，再结合筛选方法，从众多的转化子菌株中选出含有某一基因的菌株，从中将重组的DNA分离、回收。这种方法也就是应用基因工程技术术分离目的基因，其特点是绕过直接分离基因的难关，在基因组DNA文库中筛选出目的基因。可以说这是利用“溜散弹射击”原理去“命中”某个基因。由于目的基因在整个基因组太小，在像当程度上还得靠“碰运气”，所以人们称这个方法为“鸟 枪法”或“散弹枪”实验法。 三、重组体的构建 1、载体 要把一个有用的基因通过基因工程手段送进生物细胞中，需要运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具叫载体（Vector）。 （1）质粒（plasmid) （2）噬菌体λ的衍生物 （3）科斯质粒（cosmid） （4）单链DNA噬菌体 M13（5）病毒?面包酵母吲哚甘油磷酸脱氢酶基因的制取，先 用Eco RI把面包酵母DNA切成许多片段，使这些片段与λ载体连成重组DNA，可把这些重组DNA导入“吲哚甘油磷酸脱氢酶型组氨酸缺陷型”大肠杆菌，在基本培养基中培养。只有引入了该基因的细菌才能生长。进一步分离这种菌株，可以得到目的基因。 2、载体的性质 1）它必须具有能够在某些宿主细胞中独立地自我复制和表达的能力。 2）载体DNA的分子量应该较小。 3）载体上最好应具有两个以上的容易检测的遗传标记（如抗药性基因等），以赋予宿主细胞以不同的表型。 4）载体应该具有多个限制性内切酶的单一切点；载体上的单一酶切位点最好是位于检测表型的遗传标记基因之内，这样目的基因是否已连接载体就可以通过这一表型的改变与否而得知，利于筛选重组体。 3、酶系的选用

分子克隆实验指南

做了快一年的分子克隆，犯了很多错误，经历了很多坎坷，也学到了很多东西。分子克隆过程中出现问题最多的大概就是连接了，大家抱怨的也最多，我也陷入在个步骤上很久。经过长时间的摸索我在连接这个问题上有一些体会，在这里跟大家分享一下我的经验，以供和我一样陷入困境及刚开始做克隆的同学参考。 关于连接的提问多集中在连接的体系、DNA的用量、vector和insert的比例、连接酶等。但是我认为，连接不成功，问题并不一定出在连接这步上。 有很多环节影响连接的成败，如酶切的好不好、回收的质量好坏、连接时的浓度或比例、感受态等。以下我详细说明。 1，PCR引物的设计。通俗的不说，需要指出的是设计引物时一定要考虑切点的甲基化问题。做普通的克隆会涉及到甲基化形式有两种：dam甲基化和dcm甲基化。常用的大肠杆菌都有这两种甲基化酶。dam甲基化酶识别GATC位点并甲基化；dcm甲基化酶识别CCWGG 位点（W是A或T）并甲基化。如果有这两种位点那么多数情况内切酶是切不开了。容易受甲基化影响的内切酶有：Dpn1（GA/TC）天生就甲基化；Cla1（A TC/GAT）如果前面加个G或后面加个C那么恭喜你，dam甲基化；Xba1（T/CTAGA）如果前面加个GA或后面加个TC也是dam甲基化，等等有好多。这些容易甲基化的切点设计引物时一定要注意，避免引入甲基化位点。如果真是避免不了或者后来才发现问题，那么把甲基化的质粒转化到甲基化酶缺陷型大肠杆菌中再提质粒就没有甲基化，可以切了。甲基化缺陷型菌有：DM1（Invitrogen）、INV110（invitrogen）、JM110等。 2，PCR产物。两种方式：一种纯化后直接酶切连接；一种连T载体再往下切连接。我个人强烈建议第二种，连T载体。因为PCR产物直接酶切我觉得有两个缺点：①由于两头把手太短，虽说有保护碱基，但我觉得还是不如从质粒上往下切好切，而且容易切坏、切碎；②无法从电泳上看出来切没切开，因为也就切下了几个十几个bp，带形没啥变化。连T载体的优点：①进载体后，大提一次的质粒夸张点说够用一辈子的，不用总PCR往出调了，再说PCR那东西还不太稳定，一把多一把少的。②酶切会很清晰，切下来了就是有带，没切动就是没有，没连上也能知道不是没切开而是别的步骤有问题。连T载体也有些麻烦的地方，如需要的切点有时跟T载体上自带的切点冲突，这就要小心鉴别；而且连T载体最好测序看一下PCR的产物对不对、切点对不对。总体来讲连T载体是很有优势的。 3，提质粒。有时手工小提或粗提的质粒酶切效果不好，这可能是提取的不够纯或者内切酶品质不好。所以若酶切效果不佳建议用柱子精提或大提。 4，酶切。用于连接的酶切很关键。需注意如下几点： ①如果是双酶切A和B，预实验中必须做A和B各自的单酶切和A+B的双酶切,好确认这几种酶都好用，质粒上的切点都好用。如果切不开就要考虑是不是酶的问题，buffer的问题，质粒上有没有这些切点，序列是否甲基化等。 ②酶切尽量用大体系，如50ul、100ul等。大体系能稀释内切酶包装中的甘油，对反应有利。相反，连接尽量用小体系，以增加DNA末端的碰撞机会。 ③如果要回收、连接，酶切用的DNA量我的经验是不用太大。大了会切碎，形成一些不规则的末端，不利于连接。 ④酶切后的电泳，即切胶的那次电泳中，如果切成的条带很清晰，不拖泥带水，没有弥散，没有拖尾，那做回收、连接效果最好。相反，若有弥散、拖尾、不清楚、一团亮等情况就是切的不好，做后续实验成功率会降低。若真是效果很差建议改进体系重新切。 5，回收。回收可以用柱式试剂盒或手工法。柱式回收试剂盒：此类试剂盒适合各种长度DNA，对黏性末端基本没有破坏，回收效率也不错。手工醇沉法步骤如下，把切得的胶弄碎，用Tris-HCl浸泡一段时间，吸出所有的液体，用酚抽提一遍，氯仿抽提一遍，加盐和醇醇沉，

分子克隆实验报告

分子克隆 实验报告 实验名称：分子克隆、分子杂交、基因表达检测实验类型：综合性 指导教师：李一博 班级： A 姓名：孙阳阳 学号：2014304110100 实验时间：2015/8/19—2015/8/25

实验一分子克隆 DNA重组技术包括载体及外源DNA片段的酶切消化、目的片段的获得及纯化、目的片段与克隆载体的体外连接、重组子的筛选和鉴定等内容。DNA片段的克隆技术是分子操作的核心部分 实验原理及方法 DNA提取：（CTAB法） CTAB是一种非离子去污剂，植物材料在CTAB的处理下，结合65?C水浴使细胞裂解、蛋白质变性、DNA被释放出来。CTAB与核酸形成复合物，此复合物在高盐（>0.7mM）浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（0.1-0.5mM NaCl）下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。经离心弃上清后，CTAB-核酸复合物再用70－75%酒精浸泡可洗脱掉CTAB。再经过氯仿/异戊醇(24:1) 抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化DNA，最后经异丙醇或乙醇等DNA沉淀剂将DNA沉淀分离出来。感受态细胞的制备及质粒的转化 质粒提取：在pH 12.0 ~ 12.6碱性环境中，细菌大分子量染色体DNA变性分开，而共价闭环的质粒DNA虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。将pH调至中性并有高盐存在及低温的条件下，大部分染色体DNA、大分子量的RNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍然为可溶状态。通过离心，可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，然后用酚、氯仿抽提进一步纯化质粒DNA CaCl2法：利用冰冷的CaCl2处理对数生长期的细胞，可以诱导其产生短暂的“感受态”，易于摄取外源DNA。106 ～ 107转化子/μg DNA。 酶切酶连：限制性内切酶可识别特定位点并切割DNA产生粘性末端或平末端的外源片段，经纯化处理后的DNA用于连接反应；选择克隆载体pUC19多克隆位点上相应的限制性内切酶切割，并用碱性磷酸酶处理防止载体自连；在连接酶的作用下将外源片段连接到载体上，实现外源片段的克隆。 实验材料和试剂 携带pUC19质粒载体的大肠杆菌菌液； 携带含有水稻DNA片段的M812载体的大肠杆菌菌液； 氨苄青霉素、卡那霉素； RNaseA； 碱裂解法试剂 Solution I:Tris.HCl （pH 7.5） 50 mM

分子克隆技术

分子克隆技术
生
物 ww 秀 -专 w. bb 心 io 做 o. 生 co 物 m ！

克隆载体
l
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是用来在生物学寄主和试管间“传送”克隆的序 列的DNA分子 (如从细菌到试管再到植物细 胞)。 其共性有四点： 1. 启动自发复制的能力. 2. 含有遗传标记 (通常是显性的) 供选择。 3. 唯一的限切位点以利于克隆插入的DNA 4. 非必需DNA序列 尽可能少以克隆更大片 段。
生
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生
pBR322
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生
pBR322
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pBR322是4362bp的环状 双链DNA载体，有2个抗 药性基因（四环素和氨 苄青霉素），一个复制 起始点和多个用于克隆 的限制酶切点。当缺失 抗药性基因的大肠杆菌 被pBR322成功地转化 时，它便从该质粒获得 了抗生素抗性。两个抗 生素基因中均含供插入 外源DNA用的不同的单一 酶切位点。一般只选一 个抗生素基因作为插入 外源DNA之用。外源DNA 插入后该抗生素抗性失 活。另一抗生素抗性基 因则作为转化细菌后筛 选阳性克隆之用。
生
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四个重要位点
l (1)
负责质粒复制的rep复制子 (来自 pMB1; (2) 编码Rop 蛋白的rop基因，促进 不稳定的 RNA I – RNA II 复合体转变为 稳定的复合体并起着减少质粒拷贝数的 作用 (来自 pMB1); (3) 编码 beta-内酰胺 酶的bla基因，赋予对氨苄青霉素的抗性 (来自 Tn3转座子); (4) 编码四环素抗性蛋 白的tet基因 (来自 pSC101).
生
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