放射免疫分析

放射免疫分析

摘要：放射免疫技术（radio immunoassay ,RIA）类型主要包括经典的放射免疫分析(radioimmunoassay, RIA)和免疫放射分析或免疫放射度量分析( immunoradiometric assay，IRMA)。由于受接触放射性物质，损害操作人员的身体，测定完成后放射性材料的处置等问题的存在,再加上80年代初出现的非同位素标记技术得到了极大的发展和广泛应用，放射免疫技术的应用有下降的趋势。

0引言：放射性核素依衰变方式分α、β、γ三种，用于放射性标记的有β和γ两类;分别用液体闪烁计数器及γ计数器测定。目前常用的是γ型放射性核素，如125I、131I、51Cr和60Co，以125I最常用；β型放射性核素有3H、14C和32P，以3H最常用。

关键词：结构，原理，临床应用

1检测的基本结构原理、结构及其探测原理

核射线探测仪器由射线探测器和后续电子学单元两大部分组成。核射线探测器是个能量转化器，其检测原理是当射线作用于闪烁体，闪烁体吸收了射线的能量而引起闪烁体中的原子或分子激发，当受激的原子或分子退激时，则发出光子进入光电倍增管光阴极，转换为光电子，光电子在光电倍增管电场作用下到达阳极，形成电脉冲。转换模式是放射能→光能→电能→脉冲。

液体闪烁测量是在闪烁杯内进行的，放射性样品主要被溶剂和闪烁剂分子包围，射线能量先被溶剂分子吸收，受激溶剂分子退激时释放出能量激发闪烁剂，当激发态回到基态时释放出光子到达光阴极，光阴极产生光电子，在光电倍增管的电场作用下，在阳极获得大量电子，形成脉冲信号，输入后读分析电路形成数据信号，最后由计算机数据处理，求出待测抗原含量。

放射性活度测定方法放射免疫分析中经抗原抗体反应和B、F分离后通过检测放射性量来反映待测物的含量。放射性量的检测需特殊的仪器，放射免疫分析仪实际上就是进行放射性量测定的仪器。测量仪器有两类，即晶体闪烁计数仪（主要用于检测γ射线，如125I、131I、57Cr等）和液体闪烁计数仪（主要用于检测β射线，如3H、32P、14C等）。无论是晶体闪烁计数仪还是液体闪烁计数仪都是将射线（放射能）与闪烁体的作用转换成光脉冲（光能），然后用光电倍增管将光脉冲转换成电脉冲（电能），电脉冲在单位时间内出现的次数（即仪器记

录的cmp值）反映了发出射线的频率，而电脉冲的电压幅度则反映了射线能量的高低。

计数单位是探测器输出的电脉冲数，单位为cpm（计数/分），也可用cps（计数/秒）表示。如果知道这个测量系统的效率，还可算出放射源的强度，即dpm （衰变/分）或dps（衰变/秒）。

2 晶体闪烁计数器组成和工作原理

晶体闪烁计数器又称γ放射计数器，主要用于检测如125I、131I、57Cr和60Co 等产生的γ射线。

2.1 仪器组成及工作原理

（1）闪烁体闪烁体是将核辐射能激发分子转化成可探测闪光的荧光物质。常用的有有机闪烁体、无机闪烁体和特殊闪烁体等。

（2）光电倍增管光电倍增管的作用是有选择性地把闪烁体发出的极弱闪光的一部分转换成电信号。光电倍增管的基本结构主要包括光电转换、电子倍增和电子收集装置三个部件。

在医学检验中，用于体外样品放射性测量的井型NaI、Tl、）闪烁探测装置中的晶体及光电倍增管等是装在一只有盖的铅室中的。由于探测效率和探头相对于样品的几何位置关系十分密切，测量中要特别注意。还要避免样品对探头的污染，一旦造成污染，要及时进行有效的去污处理，以免使仪器本底增高，影响装置性能指标。

（3）多道脉冲分析器多道分析器（MCA）是进行能谱分析的重要仪器，现代的MCA与通用微型计算机有许多共同特性，是现代核探测分析及放射影像装置的重要组成部分。

①脉冲高度分析器的基本原理比例放大器、甄别器和反符合电路三部分组成了典型脉冲高度分析器的主体。

由光电倍增管产生的输出脉冲与γ射线等在NaI、Tl等闪烁体内失去的能量成正比。将此脉冲信号输入放大器进行放大，由于输入脉冲高度与输出脉冲高度是按比例设计的，该放大器称比例放大器。经比例放大的脉冲信号再被送入甄别器。由上限和下限两个甄别器组成，分别让脉冲高度高于下限甄别器预定电压U的信号及高于上限甄别器预定电压U+△U的信号送入反符合电路。反符合电路有选通特性，输入脉冲只有一路进入时，便输出一个脉冲，否则电路无脉冲输出。于是整个电路只选取了脉冲高度在U和U+△U的信号进行计数。如果设定△U值，逐渐变换U并读出计数值，便可获得γ射线在晶体内所失出的能量分布状态，即能谱。其中U称阈电压，△U称窗电压或窗宽。

②多道分析器（MCA）多道分析器的基本组成部分是模-数变换器（ADC）和存储

器。每个存储单元都是一个独立的计数器。进入分析器的所有脉冲按多路定标方式以幅度大小安排在各个存储单元中计数，直到全部存储器都被寻址为止。这种工作方式的净效应就是提供和分析器道数相等数量的一些独立的计数器进行脉冲高度分析计数，各计数器再把每一顺序时间间隔内的总计数记录下来，完成多路定标的脉冲高度多道分析。

③γ能谱分析γ射线可以通过光电吸收、康普顿散射、电子对产生三种机制与物质发生作用。NaI、Tl等闪烁体可以将作用时损失的能量在能谱仪中记录下来。能谱的横坐标为脉冲高度，纵坐标为一定时间内所测到的各个脉冲高度（在一定宽度范围内）的频数。能谱中高峰部位是由光电吸收而形成的光电峰，又称全能峰，是放射性核素的标识峰。能谱中占份额较大的是康普顿坪。高能γ射线还会形成电子对产生的逃逸峰。峰的面积和γ射线的强度成正比，γ能谱分析就是根据能谱中各标识峰面积的相对比例来测定样品中放射性的组成，因此根据峰的位置和面积可对放射性核素进行定性和定量分析。

2.2 γ-辐射计数器

（1）工作原理γ辐射计数器主要用于125I、131I等以及能量在400KeV以下γ或X放射线的探测。

γ-辐射计数器以NaI，并掺入少量的铊（Tl）晶体为探测元件。使用铊激活的晶体对γ辐射的吸收高，荧光产额高，时间分辨能力强。当样品位于晶体井内时，晶体吸收125I释放的γ射线能量后，使闪烁晶体处于受激状态，受激的原子或分子在退激过程中将以闪光形式释放能量。晶体发出这一短暂的闪光称为光脉冲。光脉冲照射到光电倍增管的光阴极，打击出光电子，再经打拿极逐级放大，最后在光电倍增管的阳极获得电脉冲。

（2）系统组成整机可分作采样部分和数据处理部分。采样部分由探头、换样装置、高低压电源、放大器及单道组成。数据处理部分由接口、计算机、输入输出装置等组成。

（3）使用中应注意的问题

①γ仪的机器效率一般用125I标准源（其放射性活度（用dpm为单位表示）由仪器制造厂提供）。放到测量井记下cpm值后算出的效率（效率=cpm/dpm）乘上1.25倍就得125I的效率,其效率一般应大于70％。若不到70％，首先微调高压到计数最大值，如仍达不到，则应对仪器作检查；②要防止探头部分的NaI晶体碰坏，晶体受潮后会发黄使效率下降。

3液体闪烁计数器基本结构和应用

液体闪烁计数器是医学研究中常用的一种放射性测定仪器，多用于蛋白质(如细胞因子、激素等)对细胞增殖分化的影响或分泌表达蛋白质能力的研究。由

于它是将样品混入闪烁体溶液内的，不存在样品中的射线自吸收，并可进行4π立体角的测量，成为3H、14C等低能β射线及α射线的最适宜的辐射探测装置。

3.1液体闪烁计数器的基本结构

液体闪烁计数器的结构和性能不断发展，目前多采用双管快符合对称系统多独立道分析，与微机联用，实现了高度的自动化。

（1）基本电子线路液体闪烁计数器的电路图主要由双管快符合、相加电路、线性门电路及多道脉冲幅度分析器等组成。

（2）自动换样器自动换样器的使用不仅节省时间，还可使样品有足够的暗适应和温度平衡时间。样品传送机构类型较多，一般使用继电器控制的传送带、升降机、轮盘等。为了做到可靠的光密封，测量位置通道口设有快门、迷宫和转轮等。有的自动换样控制器还具备一定的识别功能，适应多用户需要。

（3）微机操作系统多数仪器都可用微机进行工作条件选定、各种参数的校正、读取数据等操作。由于多采用键盘操作，并伴有显示屏指令提示，操作容易掌握。

3.2液体闪烁计数器的使用

（1）样品-闪烁液反应体系建立样品和闪烁液按一定比例装入测量瓶，向光电倍增管提供光信号。

（2）猝灭样品、氧气、水及色素物质等加入闪烁体中，会使闪烁体的荧光效率降低，出射荧光光谱改变，从而使整个测量装置的测量效率降低的过程称为猝灭。为减小猝灭，可在闪烁液中通氮气或氩气驱氧；将样品pH值调至7左右，避免酸的猝灭作用；对卟啉、血红蛋白等着色样品进行脱色处理等。

（3）计数效率测定液体闪烁计数器通常用于放射性的相对测量，即通过样品的计数率与标准样品的计数率的比较来测定样品。由于标准样品与待测样品的猝灭情况不同，就需要对猝灭进行必要的校正来求出每个具体样品相对于标准样品的实际计数效率。常用的校正法有内源法，外源法和道比法等。目前广泛使用的是外部标准源校正法。

4 放射免疫分析仪的应用

放射免疫分析由于敏感度高、特异性强、精密度高、可测定小分子和大分子物质，所以在医学检验中应用极为广泛。常用于测定各种激素（如甲状腺激素、性激素、胰岛素等）、微量蛋白质、肿瘤标志物（如AFP、CEA、CA-125、CA-199等）和药物（如苯巴比妥、氯丙嗪、庆大霉素等）等。各种检测项目均有试剂盒供应，所以被广泛采用。近年来其他标记免疫分析技术如酶免疫分析、发光免疫分析等在技术上有飞跃的进展，放射免疫分析有被取代的趋势。但在生物医学基础研究中，新发现的生物活性物质日益增多，对它们的研究也是基础医学科研中的热门课题。研究这些新的活性物质和某些疾病发生及发展的关系，需要高灵敏

度、高特异性的检测方法，其中放射免疫分析技术仍为首选。

免疫分析方法20070321

免疫学反应原理 单扩散 琼脂糖凝胶平板→打孔→点加样本→孵育(过夜) →观察沉淀线 可以定性，也可以定量应用：检测抗原抗体。如免疫球蛋白测定 双扩散 琼脂糖凝胶平板→打孔(两两对应)→点加样本及对应抗原或抗体→孵育(过夜) →观察沉淀线 一般用于定性，也可观察抗原抗体有无交叉反应。如抗原抗体的鉴定 免疫沉淀 在试管中加入抗原及抗体，混匀后孵育，观察沉淀的出现 环状沉淀：毛细管内进行。如链球菌的血清学分型 对流电泳 操作类似于双扩散。但在两侧施加电场，以加快免疫反应的速度。 适用于抗原抗体检测。如乙肝表面抗原的检测 火箭电泳 类似于单扩散，但外加了电场，孔内所加抗原向一特定方向迁移，且迁移沉淀线的长度与抗原的浓度成正比，故可以定量。如甲胎蛋白的检测。 血球凝集试验 将抗体或抗原结合在动物红血球（羊、牛、兔等）上（致敏），当致敏的红血球与相应抗原或抗体相遇时，发生肉眼可见的凝集。也可制备反向血凝或血凝抑制试验。 血球在致敏前需要进行处理（鞣化），使之不易破坏，也更容易致敏。 如乙肝表面抗原的检测：成本低廉，检测灵敏度也高。 乳胶凝集 原理同血球凝集试验，但致敏的是乳胶颗粒，且试剂更易保存。如细菌抗原的快速检测试剂。 补体结合试验 在抗原抗体反应的体系中加入新鲜制备的补体（豚鼠）以及指示系统（红细胞），当有相应的抗原抗体存在并发生反应时，激活补体，红细胞溶解。若加入与人体的被测抗体相竞争的抗体时，被测抗体消耗掉大量抗原，而无能与指示系统中的抗体反应的抗原剩余，补体不被激活，红血球不被溶解：补体结合抑制试验。 如抗链O检测 金标记试验 以胶体金致敏抗原，当遇相应抗体时，与之结合并吸附在支持介质上，浓集后形成可见的红色。一般用于快速试验，卡片式的反应体系方便易用。但敏感性和特异性不足。 也有用胶体硒的。如表面抗原、抗HIV等 免疫斑点试验 原理与金标记法类似，但标记的是酶，在抗原抗体结合后，标记在上面的酶可催化随后加入的显色系统，以出现黑色斑点为阳性。 免疫印迹 先将微生物抗原电泳分离，再通过免疫转印技术将琼脂上的抗原转染到硝酸纤维膜上并固定（可裁成小条供多个检测用）。测定时加入人血清，血中抗体与膜上的抗原结合，再加入标记的抗体或生物素系统，最后是显色。与相应特异抗原结合的位置上的显色即代表了有对应该相应抗原的抗体。特异性较高。 如：抗HIV检测 免疫比浊 原理是在一定的反应体系中，抗原抗体的反应速度与其浓度相关。测定体系中抗原抗体反应所引起的浊度变化速率即可间接测定体系中抗原或抗体的浓度。一般用于全自动的免疫分析仪。如免疫球蛋白的检测。放射免疫 一般为竞争法：以放射性元素标记抗原，与待测抗原共同竞争与同时加入的抗体的结合，待测抗原越多，与抗体结合的标记抗原越少，存留的放射性就越低。 抗原的标记：琥珀酸酐法、O-（羧甲基）羟胺法 放射性元素的选择：碘125、碘131、氢3等。检测放射性：γ计数仪 酶免试验

碘标记血管紧张素Ⅰ放射免疫分析药盒说明书

【药品 名称】 碘标记血管紧张素I放射免疫分析药盒 【概述】肾素-血管紧张素系统在机体的血压、水、电解质平衡的调节上起着重要作用。因此血浆肾素活性(PRA)和血管紧张素Ⅱ(AⅡ)浓度的测定已经成为原发性和继发性高血压的诊断及研究的重要指标。血浆肾素活性(PRA)的测定是以血管紧张素I(AI)产生的速率来表示的，血管紧张素I(AI)是由肾素作用于血管紧张素原而生成的10肽，它被血管紧张素转换酶降解成血管紧张素Ⅱ。血管紧张素I正常生理浓度下无生物活性。PRA、AⅡ二者测定均采用酶抑制剂来阻断转换酶和血管紧张素酶的活性，以达到准确测定PRA和AⅡ的目的。该项指标的测定，可作为判断肾素活性和对多种高血压及肾脏疾病诊断、分型的依据。 【测定原理】本试剂盒采用匀相竞争放射免疫分析方法，测定人血浆中AI的含量。先将校准品(或样品)、标记物和抗体按操作程序依次加入试管中，使标记抗原和抗原与限量抗体发生竞争性结合，待反映平衡后，加入分离剂，离心沉淀，使游离抗原与抗原抗体复合物分离，测量沉淀中放射性强度。随AI含量增加，放射性强度减少。 【试剂组成和配制方法】1.校准品 7瓶(冻干品) 每瓶用 ml缓冲液溶解，浓度分别为:0，0.19，0.38，0.75，1.5，3.0，6.0ng/ml 2.125I —AI 1-2瓶(红色冻干品) 每瓶用5.5ml缓冲液溶解，3.5μCi/μg 3.抗体 1瓶(蓝色冻干品) 使用前用 ml缓冲液溶解(如不填写100T 10ml溶解) 4.缓冲液 1瓶(液体) 5.分离试剂 1瓶(悬浮液) 使用前充分摇匀。 6.8-羟基喹啉 1瓶(液体) 7.二巯基丙醇 1瓶(液体) 8.EDTA-Na21瓶(液体) 9.保温液 1瓶(液体) 10.质控血清 2瓶(冻干品) 使用前用0.5ml缓冲液溶解 【样本要求】1.酶抑制剂的配制:按取血5ml计每支采血管加入50ulEDTA-NA2(如果晶粒析出，可温热溶解)50ul8-羟基喹啉和25ul二巯基丙醇，混匀，备用或2-8℃储存可用一周。 2.标本采集:按常规取静脉血5ml，迅速注入放在冰水浴冷却的酶抑制抗凝试管中，摇匀，立即放回冰水浴中冷却，待离心时取出。1000rpm离心5分钟(最好4℃离心机)，分离取出血浆，此操作应该在15分钟内完成，血浆备检或-25℃保存，可用2个月。 3.标本处理:测定前将冰冻的血浆标本在流动的冰水浴中快速融化，快速取双份标本，每份分别加入10ul保温液。作对照管的一份标本放在冰水浴中，作为测定管的一份标本放在37℃水浴中温育1小时，取样后放入冰水浴中。 【适用 仪器】 GC-2010γ放射免疫计数器、DMF-96型多管放射免疫计数器、γ放射免疫单管分析仪等。 【操作方法】将圆底聚苯乙烯试管编号(按复管操作)，按下表程序操作: AI加样测定程序表单位:μl 试剂NSB管S0-S6校准管对照管样品管生理盐水100 100 100 100 缓冲液200 ――― 校准品―100 ―― 待测血浆标本――100 100 125I―AI 100 100 100 100 AI抗血清―100 100 100 混匀，4℃放置15小时以上，任取3管测量，作为总放射性T(cpm)。 分离试剂1000 1000 1000 1000

放射免疫分析技术

放射免疫分析技术 摘要RIA 是一种微量分析法, 就是利用放射性核素标记抗原或抗体, 然后与被测的抗体或抗原结合, 形成抗原抗体复合物的原理来进行分析的。它兼有放射性同位素的灵敏性和抗原、抗体反应的特异性两大特点。该法还具有准确性高和精密度好, 便于标准化以及操作简便、经济等优点。由于RIA具有灵敏度高，特异性强，测量简单，成本低等优点，RIA在应用方面具有一定的生命力。但是，又因为它最致命的弱点就是使用放射性核素，此外标记物有效使用时间短，难以实现操作和测量的自动化等，它的进一步发展受到一些局限。现在免疫分析技术都在朝着非同位素标记免疫分析的方向发展，自动化仪器已经投入到临床常规项目的检测中，使得传统的RIA使用市场逐渐缩小。不过第五代RIA技术的出现，使得现在的RIA 技术较其他方法在方法学有了更多的优势，尤其是纳米磁性固相的应用，为RIA自动化的研制提供了很大帮助。此外，在生命科学的实验领域，非放射标记免疫技术始终不能代替RIA。关键字RIA IRIA 基本原理第五代RIA技术 1959 年，美国科学家Berson 和Yalow 将放射性同位素测量的高灵敏度与抗原抗体的高特异性巧妙地结合起来，创立了放射免疫分析( radioimmuoassay，RIA) 技术。RIA 经过半个多世纪的发展，可以分析成百上千种物质，包括激素、维生素、肿瘤相关抗原、抗体、药物、病毒等。使那些曾认为无法检测的微量而又具有重要生物活性的物质得以精确定量，为医学、生命科学的发展做出划时代的贡献。因此，1977 年Yalow荣获诺贝尔生理学或医学奖。随后，各国学者发展了酶免疫分析( EIA) 、荧光( FIA) 、时间分辨荧光( TRFIA) 和化学发光( CLIA) 等非同位素标记免疫分析技术。 1. RIA基本原理 放射免疫分析法的本质是一种分子相同的被侧物质和同位素标记物质, 同另一种浓度有限的特异性结合试剂进行的竞争性结合。当同位素标记化合物和特异性结合试剂的量保持一定时, 加入的被侧物或标准物的量与标记物的量之和多于特异性结合试剂有效结合的数目时, 被测物或标准物与标记物一特异性结合试剂复合物之间就呈现一种函数关系。即被测物的量越多, 则标记物的被稀释程度也就越大, 使标记物一特异性结合试剂复合物的量逐渐减少, 放射性强度侧定就越低。根据这种原理来对生物体内的微量物质进行定量测定。 以标记化合物为P* . , 非标记化合物为P , 特异性结合试剂为Q, 其反应式构成了放射

碘标记血管紧张素Ⅱ放射免疫分析药盒说明书

碘[125I]血管紧张素Ⅱ放射免疫分析药盒 【药品 名称】 碘[125I]血管紧张素II放射免疫分析药盒 【概述】血管紧张素Ⅱ(AⅡ)是由血管紧张素转换酶降解血管紧张素I而生成的8肽，并在酶作用下转变成血管紧张素Ⅱ。血管紧张素Ⅱ具有增强血管收缩能力和提升血压的功能，是肾素-血管紧张素系统的重要物质。在机体的血压、水和电解质平衡调节上起重要作用。血浆中血管紧张素Ⅱ含量的测定，为多种高血压和肾脏疾病的分型与诊断提供依据。 【测定原理】本试剂盒采用匀相竞争放射免疫分析方法，直接测定人血浆中AⅡ的含量。先将校准品(或样品)、标记物和抗体按操作程序依次加入试管中，使标记抗原和抗原与限量抗体发生竞争性结合，待反应平衡后，加入分离剂，离心沉淀，使游离抗原与抗原抗体复合物分离，测量沉淀中放射性强度。随AⅡ含量增加，放射性强度减少。 【试剂组成和配制方法】1.校准品 7瓶(冻干品) 每瓶用 ml缓冲液溶解，浓度分别为:0，25，50，100，200，400，800pg/ml 2.125I—AII 1-2瓶(红色冻干品)每瓶用5.5ml缓冲液溶解，3.5μCi/μg 3.抗体 1瓶(蓝色冻干品)使用前用 ml缓冲液溶解(如不填写100T 10ml溶解) 4.缓冲液 1瓶(液体) 5.分离试剂 1瓶(悬浮液) 使用前充分摇匀。 6.8-羟基喹啉 1瓶(液体)(与AI药盒合用) 7.二巯基丙醇 1瓶(液体)(与AI药盒合用) 8.EDTA-Na2 1瓶(液体)(与AI药盒合用) 9.质控血清 2瓶冻干品每瓶用前用0.5ml蒸馏水溶解 【样本要求】1.酶抑制剂的配制:按取血5ml计每支采血管加入50ulEDTA-NA2(如果晶粒析出，可温热溶解)50ul 8-羟基喹啉和25ul二巯基丙醇，混匀，备用或2-8℃储存可用一周。 2.标本采集:按常规取静脉血5ml，迅速注入放在冰水浴冷却的酶抑制抗凝试管中，摇匀，立即放回冰水浴中冷却，待离心时取出。1000rpm离心5分钟(最好4℃离心机)，分离取出血浆，此操作应该在15分钟内完成，血浆备检或-25℃保存，可用2个月。 【适用 仪器】 GC-2010γ放射免疫计数器、DMF-96型多管放射免疫计数器、γ放射免疫单管分析仪等。 【操作方法】将圆底聚苯乙烯试管编号(按复管操作)，按下表程序操作: AⅡ加样测定程序表单位:μl 试剂NSB管S0-S6校准管样品管 生理盐水200 200 200 缓冲液300 ―― 校准品―200 ― 待测标本――200 125I―AⅡ100 100 100 AⅡ抗血清―100 100 混匀，4℃放置15小时以上，任取3管测量，作为总放射性T(cpm)。 分离试剂1000 1000 1000 充分混匀，4℃放置15分钟

免疫分析法

免疫分析法 1,熟悉免疫分析法的基础知识 ,了解放射免疫分析法,酶免疫分析法,化学发光免疫分析法,荧光免疫分析法 第一:概述 基本原理 基本条件 方法分类 免疫分析法(Immunoassay,IA):是指以特异性抗原-抗体反应为基础的分析方法. 1959年,由美国Yallow和Berson等人将放射性同位素示踪技术的高灵敏性和免疫反应的高特异性结合起来,首先测定了糖尿病人血浆中的胰岛素含量,从而创立了放射免疫分析方法(Radioimmunoassay,RIA). 酶免疫分析法,化学发光免疫分析法,荧光免疫分析法,时间分辩免疫分析方法等. 一,基本原理 (一)竞争抑制原理 实质都是抗原一抗体竞争结合反应 Ag*:标记抗原 Ag:未标记抗原 Ab:特异抗体 Ag*-Ab:标记抗原-抗体结合物, Ag-Ab代表未标记抗原一抗体结物 K:平衡常数(K=K1/K2). 抗原-抗体反应须满足以下条件: Ag*与Ag(待测物)必须是相同的生物活性物质; 所加入Ag*和Ab的量应是固定的; Ag*与Ag的量之和应大于Ab的结合位点; Ag*,Ag及Ab须处在同一反应体系中. 这种竞争抑制的数量关系成为免疫分析的定量基础 (二)竞争抑制曲线(剂量反应曲线) 用待测物的标准品配置一系列已知浓度的标准溶液,再加入一定量的标记抗原和抗体,待抗原抗体反应达到平衡后,测定系列标准溶液的Ag*-Ab的结合率. B代表结合的标记抗原; F代表游离的标记抗原; T代表总的标记抗原. B/F-[Ag] B/(B+F)×100%-[Ag] (三)抗原一抗体反应的特点 1.特异性 一种抗原分子只能与由它刺激产生的抗体发生特异性结合反应. 抗原的特异性主要取决于抗原决定簇(Cluster)的数量,性质及立体构型. 抗体的特异性则取决于抗原结合段(fragment of antigen binding,IgFab)与相应抗原决定簇的结合能力. 交叉反应(cross reaction):结构相近似的其它药物或化合物与抗体的结合. 2.可逆性

放射免疫分析仪技术参数

放射免疫分析仪技术参数 *1、对125I的探测效率≥78% *2、本底计数≤60CPM 3、探头不一致性≤2% *4、8小时稳定性：探测效率的附加误差不大于3% *5、计数精密度：γ计数器的计数精密度与幅射统计涨落的理论期望值无显著性差异。用X2双测检验法重复测量21次，应符合（10.851≤X2≤31.410）6、探头数量：5个 *7、一次装样容量：380个样品，测量过程中可随时添加 8、仪器工作方式：全自动测量、机械手抓取样品 *9、具有多核素选择测量功能，可选择125I、57Co、59Fe、75Se、ICo-I等多种放射性核素标记物测量。 10、自动排队测量，采用条码阅读自动识别技术，一次最多可设置10个检 测项目。 11、具有断电续测功能、浓度反查功能、标准曲线调用功能等。 12、具有复管测量功能，复管数最高可设置4个，提高检测准确度。 13、仪器智能化程度高，可自动进行坪、谱曲线的测量、故障自诊断提示等， 操作维护简单。 14、六种检测模式选择：放射免疫（RIA）、免疫放射（IRMA）、肝炎、TG.TM、 胰岛素系列、纯计数测量。 15、七种数据处理方式：线性内插方程、样条函数、三次多项式方程、Log-logit 方程、3/2次方程、四参数、五参数。 16、五种结合率方式：B/T、B/B0、B/Bm、F/B、B/F。 17、可编辑打印多种报告单样式，不同项目的检测结果可综合打印在一张报 告单上。 18、质控分析功能：提供批间质控、批内质控、精密度图、质控图等。 19、数据可网上传输，实现资源共享。 20、同步皮带传送样品，进样、退样不打滑。

21、利用多组光电传感器，控制机械手抓样、放样可靠方便。 22、采用条码阅读技术，实现了多项目测量的自动排队。 23、多核素的选择测量，计算机自动识别，无需旋钮调节。 24、5个探头的测量误差小于2%。 25、电路采用高度集成的模块化设计，维护方便，维修简单。注：本参数无指向性、排它性，仅为满足医院需要。

8放射免疫技术

放射免疫技术 （一）单项选择题（A型题） 1、放射免疫分析的创建者和创建时间 A．Cooms于1941年创建B．Berson和Y allow于1959年创建 C．Nakene和Pierce于1966年陈创 D．Miles和Hales于1968年创建 建 E．Emgrall和Perlmann于1971年创建 2、放射性核素的选择原则不包括 A．高比活度B．适宜半衰期 C．对抗原戒抗体活性没有影响D．容易标记 E．标记物易于保存 3、最理想且临床最常用的放射性核素为 A．125I B．51Cr C．60Co D．3H E．131I 4、释放β射线的核素为 A．125I B．51Cr C．60Co D．3H E．131I 5、3H标记放射免疫技术比125I标记放射免疫技术优越的是 A．标记方法简便B．放射性测量量方法简便，效率高 C．易获得高比放射性标记物D．标记物保存期较长 E．放射性废戏物处理较易 6、下列关于抗体质量指标K值的描述，正确是的 A．抗体K值越小，放射免疫分析的灵敏度．精确度和准确度越佳 B．抗体K值越大，放射免疫分析的灵敏度．精确度越佳，量准确度越差 C．抗体K值越大，放射免疫分析的准确度越佳，但灵敏和精确度越差 D．K值达到106～109mol/L，才适用于放射免疫技术 E．放射性标记物．待测抗原和标准品对同一抗体应具有完全相同的K值，否则测定结果将失真7、直接标记地制备放射性标记结合物时，常用的氧化剂为 A．氯胺T B．乳过氧化物酶C．N-溴代琥珀酰亚胺 D．H2O2E．SHPP 8、关于直接法制备放射性标记结合物，下列说不正确的是 B．能标记所有蛋白质或多肽 A．通过小分子载体使125I与蛋白结 合

(完整版)荧光和化学发光免疫分析方法

荧光和化学发光免疫分析方法 免疫分析是利用抗原抗体反应进行的检测方法，即利用抗原与抗体的特异性反应，应用制备好的抗原或抗体作为试剂，以检测标本中的相应抗体或抗原。由于免疫的特异性结合，免疫分析方法具有很好的选择性，荧光免疫分析和化学发光免疫分析是其中典型的两种。本文将对这两种免疫分析方法进行详细的介绍。 一、免疫 免疫是指机体免疫系统识别自身与异己物质，并通过免疫应答排除抗原性异物，以维持机体生理平衡的功能。免疫是人体的一种生理功能，人体依靠这种功能识别“自己”和“非己”成分，从而破坏和排斥进入人体的抗原物质，或人体本身所产生的损伤细胞和肿瘤细胞等，以维持人体的健康。 特异性免疫系统，是一个专一性的免疫机制，针对一种抗原所生成的免疫淋巴细胞（浆细胞）分泌的抗体，只能对同一种抗原发挥免疫功能。而对变异或其他抗原毫无作用。 1、抗原 1.1抗原的定义 抗原：是一类能刺激机体免疫系统使之产生特异性免疫应答(免疫原性) ，并能与相应抗体在体内或体外发生特异性结合的物质(免疫反应性)。 抗原一般为大分子物质，其分子量在10kD以上。 1.2抗原的分类 完全抗原：同时具有免疫原性和免疫反应性的抗原，如细菌、病毒、异种动物血清等。

半抗原：仅具有与相应抗原或致敏淋巴细胞结合的免疫反应性，而无免疫原性的物质。如大多数的多糖、类脂及一些简单的化学物质，它们本身不具免疫原性，但当与蛋白质大分子结合后形成复合物，便获得了免疫原性， 1.3抗原的性质 决定簇是指抗原分子表面的基团，它直接决定免疫学反映的特异性。 抗原通过抗原决定簇与相应淋巴细胞表面抗原受体结合，从而激活淋巴细胞，引起免疫应答，抗原也藉此与相应抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合。 因此，抗原决定簇是被免疫细胞识别的靶结构，也是免疫反应具有特异性的物质基础。 2、抗体 2.1抗体的定义 抗体：是机体受抗原刺激后，由淋巴细胞合成的一类能与相应抗原发生特异性结合的球蛋白。 2.2抗体的结构 抗体是机体受抗原刺激后，由淋巴细胞特别是浆细胞合成的一类能与相应抗原发生特异性结合的球蛋白，因其具有免疫活性故又称作免疫球蛋白。 人免疫球蛋白有五类，分别为IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。 3、抗原抗体的结合 体外抗原抗体反应又称血清学反应

放射免疫分析法

放射免疫分析（radioimmunoassay，RIA）是以放射性核素为标记物的标记免疫分析法。于1960年由美国学者Yalow和Berson创立，并首先用于糖尿病患者血浆胰岛素含量的测定。这是医学和生物学领域中方法学的一项重大突破，开辟了医学检测史上的一个新纪元。它使得那些原先认为是无法测定的极微量而又具有重要生物学意义的物质得以精确定量，从而为进一步揭开生命奥秘打开了一条新的道路，使人们有可能在分子水平上重新认识某些生命现象的生化生理基础。此后30年，内分泌学科的飞速进展充分证明了这一超微量分析技术的巨大推动力。1977年，这项技术的发明者荣获诺贝尔生物医学奖。随后这一崭新的技术迅速渗透到医学科学的其他领域，如病毒学、药理学、血液学、免疫学、法医学、肿瘤学等，以及与医学生物学相关的学科，如农业科学、生态学及环境科学等。放射免疫分析的物质，由激素扩大到几乎一切生物活性物质。我国放射免疫分析研究起步于1962年，并迅速发展与普及，对我国生物医学的进展起了很大的促进作用。 放射免疫分析由于敏感度高、特异性强、精密度高、并可测定小分子量和大分子量物质，所以在检验医学中应用极为广泛，常用于测定各种激素（如甲状腺激素、性激素、胰岛素等）、微量蛋白质、肿瘤标志物（如AFP、CEA、CA—125、CA—199等）和药物（如苯巴比妥、氯丙嗪、庆大霉素等）等。各种检测项目均有试剂盒供应，而且仪器设备并不昂贵，所以在国内被广泛采用。但由于核素的放射性对人体有一定的危害性，必须加以防护，核素实验室的建设须经防疫部门的监督，操作人员须经过特殊训练。另外，由于核素有半衰期，试剂盒的货存期较短，因而放射免疫分析在应用中有诸多不便之处。特别是近年来其他标记免疫分析技术如酶免疫分析、发光免疫分析等在技术上有飞跃的进展，高级仪器的自动化程度已可与生化自动分析仪相媲美，因此从长远前景看，放射免疫分析有被取代的趋势。但在目前，从所需的设备和检测的费用上，放射免疫分析还有一定的优越性，还将在一定时期内被医学检验实验室所采用。 一、放射免疫分析的基本试剂 （一）标准品 标准品是放射免疫分析法定量的依据，由于以标准品的量用来表示被涮物质的量，故标准品与被测物质应当化学结构一致并具有相同免疫活性。标准品作为定量的基准。应要求高度纯化。标准品除含量应具有准确性外，还应具备稳定性，即在合理的贮存条件下保持原来的特性。 按实验要求，将标准品用缓冲液配成含不同剂量的标准溶液，用于制作标准曲线。 （二）标记物 标记抗原应具备：①比放射性高，以保证方法的灵敏度；②免疫活性好；③所用的核素的半衰期尽可能长，标记一次可较长时间使用，这对来之不易的抗原尤其重要；④标记简便、易防护。 要准确测量B与F的放射性，必须有足够的放射性强度。所选用的标记抗原的量，在使用125I时达5000～15000cpm。 （三）抗体 应选择特异性高、亲和力强及滴度好的抗体，用于放射免疫测定。 根据稀释曲线，选择适当的稀释度，一般以结合率为50%作为抗血清的稀释度。 （四）B与F分离剂 以2%加膜活性炭溶液为例，2%加膜活性炭溶液的配制： 活性炭2g（杭州木材厂生产，森工牌732型） 右旋糖酐T200.2g

免疫分析技术研究进展

免疫分析技术研究进展 摘要：目的：综述免疫分析技术的最新研究进展。方法：通过查阅国内外有关免疫分析技术的研究论文，对放射免疫分析(RIA)、酶免疫分析(EIA)、荧光免疫分析(FIA)、化学发光免疫分析(CLIA)等免疫分析技术进行了综述，同时指出了发展前景和尚待解决的问题。结果：多种免疫分析方法相互结合，可大大提高分析方法的灵敏度，增大检测范围；CLIA和TRFIA是非放射免疫分析的两大主流，其中，CLIA更具有竞争力。结论：目前还没有一种免疫分析技术是完美无缺的，各种技术还需要不断发展和完善，以开发出更新、更理想的免疫分析技术。 关键词：药物分析学；免疫分析；放射免疫分析；酶免疫分析；荧光免疫分析；化学发光免疫分析 免疫分析法(immunoassay ，IA)是基于抗原和抗体特征性反应的一种技术。由于免疫分析试剂在免疫反应中所体现出的独特的选择性和极低的检测限，使这种分析手段在临床、生物制药和环境化学等领域得到广泛应用。各种标记技术(放射性标记、荧光标记、化学发光、酶标记等)的发展，使免疫分析的选择性更加突出。免疫分析法起始于本世纪50年代，首先应用于体液大分子物质的分析，1960年，美国学者Yalow和Berson等将放射性同位素示踪技术和免疫反应结合起来测定糖尿病人血浆中的胰岛素浓度，开创了放射免疫分析方法的先河。1968年，Oliver将地高辛同牛血清白蛋白结合，使之成为人工抗原，免疫动物后成功获得了抗地高辛抗体，从而开辟了用免疫分析法测定小分子药物的新领域。在RIA的基础上，随着新的标记物质的发现及新的标记方法的使用，以及电子计算机、自动控制技术的广泛应用，派生出许多新的检测技术[1]，使免疫分析法逐渐发展成为一门新型的独立学科。 1 免疫分析方法分类 (1)根据标记物的不同，可以免疫分析主要分为放射免疫分析(radioimmunoassay，RIA)、酶免疫分析(enzyme immuoassay，EIA)、化学发光免疫分析(chemiluminescent immunoassay，CLIA)、荧光免疫分析法(fluorescence immunoassay，FIA)等。 (2)按反应机制的不同，可以分为竞争法和非竞争法。非竞争法是将待测抗原与足够的标记抗体充分反应形成抗原-标记抗体复合物，产生的信号强度与抗原的量成正比。竞争法是将过量的待测抗原与定量标记抗原竞争结合形成定量的特异性抗体，待测抗原的量越大，与抗体结合的标记抗原量越少，产生的信号强度越小，由此定量待测抗原的量。 (3)还可以按测定过程中的某些步骤的差异分为均相免疫分析和非均相免疫分析两大类。均相酶免疫测定法的特点是抗原-抗体反应达到平衡，对结合与游

免疫分析技术基本原理

免疫分析技术基本原理

免疫分析技术基本原理 利用抗原、抗体之间的特异性结合来测定、分析特定物质的方法 ?抗原：可诱导动物免疫系统产生免疫应答的物质。按 其引起免疫应答的能力分半抗原、抗原、超抗原。 ?抗体：由动物免疫系统产生，可特异性结合某种物质 的免疫球蛋白。分IgG、IgM、IgE、IgA、IgD 五个亚型。不同亚型针对同一抗原表位的结合位点的结构相同。不同亚型出现的先后顺序不同，在血清中的含量不同，在机体中出现的地点不同。 抗原抗体反应的特性 1可逆性 抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡，其反应式为： Ag+Ab→Ag·Ab 抗体的亲和力（affinity），可以用平衡常数K表示：K=[Ag·Ab]／[Ag][Ab] ,Ag·Ab的解离程度与K值有关。高亲和力抗体的抗原结合点与抗原的决定簇在空间构型上非常适合，两者结合牢固，不易解离。解离后的抗原或抗体均能保持原有的结构和活性 2特异性 抗原抗体的结合发生在抗原的决定簇与抗体的结合位点之间。化学结构和空间构型互补关系，具有高度的特异性。

测定某一特定的物质，而不需先分离待检物。 3最适比例 4敏感性 化学比色法的敏感度为mg/ml水平。 酶反应测定法的敏感度约为5-10μg/ml。 免疫测定中凝胶扩散法和浊度法的敏感度与酶反应法相仿。 标记的免疫敏感度可提高数千倍，达ng/ml水平。例如，HBsAg，其敏感度可达0.1ng/ml。 固相免疫测定的原理 基础:抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析。

化学发光免疫分析方法的研究及应用

本文由：华夏学术传媒网提供https://www.wendangku.net/doc/6510974686.html, 摘要：本文根据各化学发光免疫分析方法所使用标记物质的不同，将化学发光免疫分析方法分为化学发光免疫分析、化学发光酶免疫分析和电化学发光免疫分析法，并对各方法经典标记物质及分析方法原理进行了分析。同时，介绍了化学发光免疫分析方法在医学检验、食品安全及环境科学方面的应用进展情况。 关键词：化学发光免疫分析；分类；研究进展 化学发光是在常温下由化学反应产生的光的发射。其发光机理是：反应体系中的某些物质分子，如反应物、中间体或者荧光物质吸收了反应释放的能量而由基态跃迁到激发态，当中间体由激发态回到基态时会释放等能级的光子，对光子进行测定而实现定量分析［1］。 化学发光免疫分析方法是将化学发光与免疫反应相结合的产物，因化学发光具有荧光的特异性，但与荧光产生需要激发光不同，化学发光由化学反应产生光强度，并不需要激发光，从而避免了荧光分析中激发光杂散光的影响。化学发光免疫分析包含了免疫化学反应和化学发光反应两个部分。免疫分析系统是将化学发光物质或酶标记在抗原或抗体上，经过抗原与抗体特异性反应形成抗原－抗体免疫复合物。化学发光分析系统是在免疫反应结束后，加入氧化剂或酶的发光底物，化学发光物质经氧化剂的氧化后，形成一个处于激发态的中间体，会发射光子释放能量以回到稳定的基态，发光强度可以利用发光信号测量仪器进行检测。待测物质浓度因为与发光强度成一定的关系而实现检测目的［2］。 一、化学发光免疫分析方法的类别化学发光免疫分析法根据标记物的不同可分为3 大类，即化学发光免疫分析、化学发光酶免疫分析和电化学发光免疫分析法。（一）化学发光免疫分析化学发光免疫分析是用化学发光剂直接标记抗体或抗原的一类免疫测定方法。目前常见的标记物主要为鲁米诺类和吖啶酯类化学发光剂。 1. 鲁米诺类标记的化学发光免疫分析。鲁米诺类物质的发光为氧化反应发光。在碱性溶液中，鲁米诺可被许多氧化剂氧化发光，其中H2O2最为常用。因发光反应速度较慢，需添加某些酶类或无机催化剂。酶类主要是辣根过氧化物酶（HRP），无机类包括O3、卤素及Fe3+、Cu2+、Co2+和它们的配合物。鲁米诺在碱性溶液下可在催化剂作用下，被H2O2等氧化剂氧化成3－氨基邻苯二酸的激发态中间体，当其回到基态时发出光子。鲁米诺的发光光子产率约为0.01，最大发射波长为425 nm。 2. 吖啶酯类标记的化学发光免疫分析 吖啶酯用于化学发光免疫分析方法（ChemiluminescentImmunoassay，CLIA）由于热稳定性不是很好，Klee 等研究合成了更稳定的吖啶酯衍生物。在含有H2O2的碱性条件下，吖啶酯类化合物能生成一个有张力的不稳定的二氧乙烷，此二氧乙烷分解为CO2和电子激发态的N－甲基吖啶酮，当其回到基态时发出一最大波长为430 nm 的光子。吖啶酯类化合物量子产率很高，可达0.05。吖啶酯作为标记物用于免疫分析，发光体系简单、快速，不需要加入催化剂，且标记效率高，本底低。吖啶酯或吖啶磺酰胺类化合物应用于CLIA，通常采用HNO3+H2O2和NaOH 作为发光启动试剂，有些在发光启动试剂中加入Triton X－100，CTAC，Tween－20等表面活性剂以增强发光。（二）化学发光酶免疫分析化学发光酶免疫分析（Chemiluminescent Enzyme Immunoassay,CLEIA）是以酶标记生物活性物质进行免疫反应，免疫反应复合物上的酶再作用于发光底物，在信号试剂作用下发光，用发光信号测定仪进行发光测定。目前常用的标记酶为辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（ALP），它们有各自的发光底物。HRP 最常用发光底物是鲁米诺及其衍生物。在CLEIA 中，使用过氧化物酶标记抗体，进行免疫反应后，利用鲁米诺作为发光底物，在过氧化物酶和起动发光试剂（NaOH和H2O2）作用下鲁米诺发光，酶免疫反应物中酶的浓度决定了化学发光的强

放射免疫分析

放射免疫分析 摘要：放射免疫技术（radio immunoassay ,RIA）类型主要包括经典的放射免疫分析(radioimmunoassay, RIA)和免疫放射分析或免疫放射度量分析( immunoradiometric assay，IRMA)。由于受接触放射性物质，损害操作人员的身体，测定完成后放射性材料的处置等问题的存在,再加上80年代初出现的非同位素标记技术得到了极大的发展和广泛应用，放射免疫技术的应用有下降的趋势。 0引言：放射性核素依衰变方式分α、β、γ三种，用于放射性标记的有β和γ两类;分别用液体闪烁计数器及γ计数器测定。目前常用的是γ型放射性核素，如125I、131I、51Cr和60Co，以125I最常用；β型放射性核素有3H、14C和32P，以3H最常用。 关键词：结构，原理，临床应用 1检测的基本结构原理、结构及其探测原理 核射线探测仪器由射线探测器和后续电子学单元两大部分组成。核射线探测器是个能量转化器，其检测原理是当射线作用于闪烁体，闪烁体吸收了射线的能量而引起闪烁体中的原子或分子激发，当受激的原子或分子退激时，则发出光子进入光电倍增管光阴极，转换为光电子，光电子在光电倍增管电场作用下到达阳极，形成电脉冲。转换模式是放射能→光能→电能→脉冲。 液体闪烁测量是在闪烁杯内进行的，放射性样品主要被溶剂和闪烁剂分子包围，射线能量先被溶剂分子吸收，受激溶剂分子退激时释放出能量激发闪烁剂，当激发态回到基态时释放出光子到达光阴极，光阴极产生光电子，在光电倍增管的电场作用下，在阳极获得大量电子，形成脉冲信号，输入后读分析电路形成数据信号，最后由计算机数据处理，求出待测抗原含量。 放射性活度测定方法放射免疫分析中经抗原抗体反应和B、F分离后通过检测放射性量来反映待测物的含量。放射性量的检测需特殊的仪器，放射免疫分析仪实际上就是进行放射性量测定的仪器。测量仪器有两类，即晶体闪烁计数仪（主要用于检测γ射线，如125I、131I、57Cr等）和液体闪烁计数仪（主要用于检测β射线，如3H、32P、14C等）。无论是晶体闪烁计数仪还是液体闪烁计数仪都是将射线（放射能）与闪烁体的作用转换成光脉冲（光能），然后用光电倍增管将光脉冲转换成电脉冲（电能），电脉冲在单位时间内出现的次数（即仪器记

化学发光免疫分析方法

化学发光是在常温下由化学反应产生的光的发射。其发光机理是：反应体系中的某些物质分子，如反应物、中间体或者荧光物质吸收了反应释放的能量而由基态跃迁到激发态，当中间体由激发态回到基态时会释放等能级的光子，对光子进行测定而实现定量分析。 化学发光免疫分析方法是将化学发光与免疫反应相结合的产物，因化学发光具有荧光的特异性，但与荧光产生需要激发光不同，化学发光由化学反应产生光强度，并不需要激发光，从而避免了荧光分析中激发光杂散光的影响。化学发光免疫分析包含了免疫化学反应和化学发光反应两个部分。免疫分析系统是将化学发光物质或酶标记在抗原或抗体上，经过抗原与抗体特异性反应形成抗原－抗体免疫复合物。化学发光分析系统是在免疫反应结束后，加入氧化剂或酶的发光底物，化学发光物质经氧化剂的氧化后，形成一个处于激发态的中间体，会发射光子释放能量以回到稳定的基态，发光强度可以利用发光信号测量仪器进行检测。待测物质浓度因为与发光强度成一定的关系而实现检测目的。 一、化学发光免疫分析方法的类别 化学发光免疫分析法根据标记物的不同可分为 3 大类，即化学发光免疫分析、化学发光酶免疫分析和电化学发光免疫分析法。 （一）化学发光免疫分析化学发光免疫分析是用化学发光剂直接标记抗体或抗原的一类免疫测定方法。目前常见的标记物主要为鲁米诺类和吖啶酯类化学发光剂。 1. 鲁米诺类标记的化学发光免疫分析。 鲁米诺类物质的发光为氧化反应发光。在碱性溶液中，鲁米诺可被许多氧化剂氧化发光，其中H2O2最为常用。因发光反应速度较慢，需添加某些酶类或无机催化剂。酶类主要是辣根过氧化物酶（HRP），无机类包括O3、卤素及Fe3+、Cu2+、Co2+和它们的配合物。鲁米诺在碱性溶液下可在催化剂作用下，被H2O2等氧化剂氧化成3－氨基邻苯二酸的激发态中间体，当其回到基态时发出光子。鲁米诺的发光光子产率约为0.01，最大发射波长为425 nm。 2. 吖啶酯类标记的化学发光免疫分析 吖啶酯用于化学发光免疫分析方法（ChemiluminescentImmunoassay，CLIA）由于热稳定性不是很好，Klee 等研究合成了更稳定的吖啶酯衍生物。在含有H2O2的碱性条件下，吖啶酯类化合物能生成一个有张力的不稳定的二氧乙烷，此二氧乙烷分解为CO2和电子激发态的N－甲基吖啶酮，当其回到基态时发出一最大波长为430 nm 的光子。吖啶酯类化合物量子产率很高，可达0.05。吖啶酯作为标记物用于免疫分析，发光体系简单、快速，不需要加入催化剂，且标记效率高，本底低。吖啶酯或吖啶磺酰胺类化合物应用于CLIA，通常采用HNO3+H2O2和NaOH 作为发光启动试剂，有些在发光启动试剂中加入Triton X－100，CTAC，Tween－20等表面活性剂以增强发光。 （二）化学发光酶免疫分析 化学发光酶免疫分析（Chemiluminescent Enzyme Immunoassay,CLEIA）是以酶标记生物活性物质进行免疫反应，免疫反应复合物上的酶再作用于发光底物，在信号试剂作用下发光，用发光信号测定仪进行发光测定。目前常用的标记酶为辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（ALP），它们有各自的发光底物。HRP 最常用发光底物是鲁米诺及其衍生物。在CLEIA 中，使用过氧化物酶标记抗体，进行免疫反应后，利用鲁米诺作为发光底物，在过氧化物酶和起动发光试剂（NaOH和H2O2）作用下鲁米诺发光，酶免疫反应物中酶的浓度决定了化学发光的强度。此传统的化学发光体系（HRP－H2O2－lumi-nol）为几秒内瞬时闪光，存在发光强度低、不易测量等缺点。后来，在发光系统中加入增强发光剂，以增强发光信号，并在较长时间内保持稳定，便于重复测量，从而提高分析灵敏度和准确性。碱性磷酸酶（ALP）已广泛用于酶联免疫分析和核酸杂交分析。 碱性磷酸酶和1，2－二氧环己烷构成的发光体系是目前最重要、最灵敏的化学发光体系。这类体系中具有代表性的是Bronstein 等提出的ALP－AMPPD 发光体系。AMPPD 为1，

化学发光免疫分析法-自己整理

化学发光免疫分析法（CLIA） A、管式磁性微粒子化学发光免疫分析法： （竞争法：用标记抗原与待检抗原竞争性结合固相抗体，待检抗原与检测信号成反比） 一、原理：本实验采用竞争法，酶标抗原与标准品抗原竞争抗体，标准品抗原浓度越大，结合到抗体上的酶标抗原越少，RLU越小，B/B0值越小。例：A为一种抗原小分子，有免疫反应性。实验中采用竞争法对尿液中的A进行分析，使待测A、辣根过氧化物酶标记的A(A-HRP)在均相体系中与异硫氰酸荧光素（FITC）标记的兔抗A抗体（FITC-A抗体）发生竞争性免疫反应，再加入用羊抗FITC抗体包被的磁微粒，反应生成物结合在磁微粒上，在磁场经分离、洗涤后加发光底物，用冷光分析仪检测发光强度（RLU），测定尿液中A的含量。 二、仪器：

1、Flash’n glow LB955 30 管全自动进样冷光分析仪(Berthold 公司); 2、高速离心机(Beckman 公司), 转速13000 r/min 3、磁性分离器(北京科美生物技术有限公司定制, 磁场强度2800 高斯) 4、XW80 旋涡混合器(上海精科实业有限公司) 5、试管12 × 60 mm(浙江拱东医用塑料厂) 6、磁性微粒子(磁性分离剂, Adaltis 公司) 三、试剂 1、A标准品 2、A单克隆抗体 3、A-BSA结合物 4、抗FITC抗体包被的磁性微粒子（5mg/mL） 5、FITC标记的A单克隆抗体 6、HRP标记的A 7、PBST 洗涤液(0.05mol/L PBS, 含0.05% Tween-20) 8、分析缓冲液(0.05 mol/L 的PBS 缓冲溶液, pH 7.4, 含2.0%BSA、0.5 %的水解明胶、0.1%的Proclin-300) 9、发光底物液(鲁米诺、过氧化氢和对碘苯酚溶液) 实验用水为二次蒸馏水 四、试剂处理 1、用分析缓冲液为稀释液, 梯度稀释标准品； 2、取A-BSA-HRP溶液, 以分析缓冲液为稀释液, 梯度稀释, 配制1:1000、1:2000、1:5000 的A-BSA-HRP 溶液,4 ℃保存. FITC-A单克隆抗体溶液的配制:

第8章 放射免疫技术

安徽理工大学医学院

分配备注标记免疫技术是利用多种标记技术与免疫技术相结合而建立的分析技术体 系。抗原与抗体结的高度特异性是免疫技术用于样品检测的主要特点。标 记免疫技术即是用多种可微量或超微量探扭的示踪物(如荧光素、放射性核 素、酶、化学或生物发光剂等)标记抗原或抗体成标记物，与相应未书记抗 体或抗原进行反应，并对免疫反应结果进行测定的一种分析技术。它不测 定免疫复合物本身，需测定标记物信号即可确定待检物质的含量。因此， 标记免疫技术的核心即是高度特异性和高度灵敏性的有机结合，具有测定 重复性好，准确性高，操作简便，易于商品化和自动化，适用范围广等优 点 标记免疫技术总体分为两类：定位测定组织或细胞中的免疫组化技术， 和检测液体标本中抗巾或抗原含量的免疫测定(immunoassay)。一般按示踪 物及标记技术种类分为：放射免疫技术、荧光免疫技术、酶免疫技术、化 学发光免疫技术和金免疫技术等；也可按测定反应体系的物理状态分为均 孝免疫测定和非均相免疫测定；还可按是否使用放射性核素作标记物，分 为放射性和非放射性免疫测蜀类。标记免疫技术的发展与标记技术，单克 隆抗体技术和分子生物学技术的发展紧密联系。目前，几切具抗原性和半 抗原性的物质，甚至基因扩增产物均可被测定，标记免疫技术已形成包含 多种标术和多种反应模式的综合性检测体系。 放射免疫技术是利用放射性核素可探测的灵敏性，精确性与抗原抗体 反应的特异性相结合而创建的一类免疫测定技术。最早期的放射免疫技术 是基于竞争性结合反应原理的放射免疫分析（RIA)，稍后又发展了非竞争 结合的免疫放射分析(IRMA)。 第一节、放射免疫技术的特点 一、基本类型及原理 按其方法学原理，主要有两种基本类型： 1．放射免疫分析(RIA) 是该类技术最经典的模式。它是以放射核素标记抗原与反应系统中未 标记的抗原竞争特异性抗体的基本原理来测定待检样品中抗原量的一种分 析法。 2．免疫放射分析(IRMA) 是用放射性核素标记的过量抗体非竞争结合抗原，经固相分离，测定 待测样品中抗原量的一种方案。

2017年主管检验技师考试临床免疫学和免疫检验讲义第七章放射免疫分析

第七章放射免疫分析 第一节放射免疫技术 一、优点 灵敏度高、特异性强、重复性好、样品及试剂用量少、操作简便且易于标准化等优点。 用于各种微量蛋白质、激素、小分子药物和肿瘤标志物的定量分析。 二、基本类型及原理 （一）放射免疫分析（RIA）是以放射性核素标记的抗原与反应系统中未标记抗原竞争结合特异性抗体为基本原理来测定待检样品中抗原量的一种分析法。 （二）免疫放射分析（IRMA）是用放射性核素标记的过量抗体与待测抗原直接结合，采用固相免疫吸附载体分离结合与游离标记抗体的非竞争放射免疫分析法。 三、常用的放射性核素 125I、131I、3H、14C等，使用最广泛的是125I。 四、放射性标记物制备及鉴定 （一）原理：以放射性碘原子通过取代反应置换被标记物分子中酪氨酸或酪胺残基以及组胺残基上的氢原子。因此，凡蛋白质、肽类等化合物在结构中含有上述基团者，均可用125Ⅰ直接标记，而对那些不含上述基团的甾体激素或药物分子，则必须在分子结构上连接相应基团才能用于放射性碘标记。 （二）标记及类型 1.直接标记法：肽类、蛋白质和酶的碘化标记，其特点是标记方法操作简便，易得到比放射性较高的标记物。常用方法为：①氯胺T(ch-T)法；②乳过氧化物酶标记法。 2.间接标记法：也称联接标记法，是最常用的间接碘标记方法。该法主要用于甾体类化合物、环核苷酸、前列腺素等缺乏碘标记基团的小分子化合物的标记。 （三）标记物的纯化：125Ⅰ标记物反应后，标记物需进行分离纯化以去除游离125Ⅰ和其他杂质。纯化标记物的方法有利用分子筛机制的凝胶过滤法、利用游离125Ⅰ与标记物分子极性差异进行吸附解离的离子交换层析法、按分子所带电荷和直径不同在电场作用下分子迁移速率不同进行分离纯化的聚丙烯酰胺凝胶电泳法（PAGE）以及高效液相色谱法。 （四）标记物的鉴定 1.放射化学纯度：是指单位标记物中结合于被标记物上的放射性占总放射性的百分率，一般要求大于95%。该项参数还是观察在贮存期内标记物脱碘程度的重要指标。 2.免疫活性 3.比放射性 五、方法学评价 为增强结果的可比性，需对RIA方法学进行评价。除常规的灵敏度、精密度、准确性、特异性和稳定性等指标外，还应注意以下指标： （一）可靠性：又称健全性，是评价被测物与标准品的免疫活性是否相同的指标。借助标准曲线与样品稀释曲线的平行性分析来判断方法的可靠性。平行性好者可靠。 （二）剂量-反应曲线：标记免疫实验是通过已知浓度的标准品和相应的反应参数绘制成剂量-反应曲线，待测物定量是通过计算其反应参数在剂量-反应曲线上对应的标准品浓度值而确定。 （三）高剂量钩状效应：高剂量钩状效应(HOOK效应)是指当标本中被测物浓度超过线性范围上限时，所得结果反而降低或呈阴性的现象。