猪卵母细胞体外成熟培养时间及去核方法的研究
猪卵母细胞体外成熟培养时间及去核方法的研究*
朱秀萍1，蒋伟娟2，艾晓杰1，徐动1，朱淑文1
1上海交通大学农业与生物学院，上海 (200240)
2上海市兽医卫生监督所，上海 (200335)
E-mail：xpzhu@https://www.wendangku.net/doc/6614351314.html,
摘要：本研究对不同体外成熟培养时间的猪卵母细胞进行盲吸法去核及利用脱羧秋水仙碱(DC)和放线菌酮(CHX)的化学诱导法去核效率进行了比较研究。结果显示，用盲吸法去核，体外成熟培养（IVM）39-41h组卵母细胞去核率与IVM 36-38h组差异显著（P<0.05），与42-44h 组差异不明显（P>0.05），但三组显著高于IVM45-48h组（P<0.05）。化学诱导法去核结果表明，IVM 42-44h组去核率最高，但与IVM 39-41h组差异不显著（P>0.05），其他各组间均差异显著（P<0.05）。在相同的体外成熟培养时间内，盲吸法的去核率比化学诱导法的去核率要高。本实验证明：猪卵母细胞IVM在39-44h内去核率较高，且盲吸法去核效率高于化学诱导去核。
关键词：猪卵母细胞，盲吸法去核，化学诱导去核，去核率
中图分类号：Q 968.1
1 前言
近年来，体细胞核移植在多种哺乳动物获得成功，相继产生克隆羊、牛、小鼠、山羊、猪、猫、兔、骡子和大鼠，为生命科学、医学制药等诸多领域提供了一个崭新的研究手段。卵母细胞核物质的去除是克隆技术成败的关键环节之一，卵母细胞的体外成熟是决定克隆胚胎能否最终发育成正常个体的关键。去核效率的高低与卵母细胞所处的成熟时期及采用的去核方法有密切关系。因此掌握卵母细胞体外成熟时间，快速而准确的去核，对提高去核成功率有重要意义。
目前动物克隆中普遍使用是机械去核法（盲吸法），该方法对细胞的机械损伤较大、耗时、技术要求高。如何既能完全去掉卵母细胞的核，又不致对细胞造成更大的损伤是研究者们一直在探索的问题。“化学诱导去核法”去核首次建立于小鼠卵母细胞，用脱羰秋水仙碱（DC）处理激活的卵母细胞，使染色体和极体牢固结合，然后用诱导第二极体排出的放线菌酮(CHX)处理卵母细胞，成功得到克隆小鼠[1~3]。Yin等把该法也应用于猪卵母细胞的去核[4]。在我国，杜卫华等首次利用化学诱导去核法用于小鼠卵母细胞的去核研究[5]，但对体外成熟培养的猪卵母细胞化学诱导去核研究目前国内尚未见报道。
本研究使用盲吸法和化学诱导去核对不同成熟培养时间的猪卵母细胞进行去核，旨在确定最佳的去核时间；建立猪卵母细胞化学诱导去核方法；同时，通过两种方法的去核效率的比较，为克隆技术研究中卵母细胞去核这一关键环节提供理论依据。
2 材料和方法
2.1 猪卵母细胞的采集
实验所用卵巢均来自于上海市闵行区纪王镇屠宰场屠宰的初情期前小母猪。将获取宰场屠废弃的猪卵巢，置于37℃灭菌生理盐水中，2h内送回实验室。以生理盐水清将卵巢洗两次
*本课题得到上海市科委国际交流项目（015407005）的资助。
后，用剪刀在卵巢门部剪一个V字型口，轻轻挤出其中的血液，然后用带12号针头的5mL 注射器抽取卵巢表面直径为2~6mm卵泡中的卵母细胞-卵丘复合体。静置15min后，在体视显微镜下选择有3层以上致密卵丘细胞及均匀细胞质的卵母细胞为供试卵。
2.2 卵母细胞的体外成熟培养
将卵母细胞在NCSU-37培养液中洗3次，然后移入成熟培养液（NCSU-37）中，每个培养小滴内放15~20枚卵母细胞。在5%CO2、38.5℃及饱和湿度条件下体外成熟培养[6]，前21~22h体外培养液中添加1000 IU/mL PMSG（宁波生物制品有限公司生产，批号：040520）和1000 IU/mL hCG（宁波生物制品有限公司生产，批号：20030118)、100mmol/L二丁酰环腺苷酸（dbcAMP，Sigma产品，批号：D-0627）；后24h不添加激素和dbcAMP。
2.3 卵母细胞去核
卵母细胞的成熟培养分成36~38h、39~41h、42~44h和45~48h四个时间组；将不同时间成熟培养的卵母细胞放入PBS液中轻轻吹打，去除卵丘细胞。
盲吸法去核：将去除卵丘的卵母细胞在含5μg/mL CB浓度的NCSU-37培养液中孵育30min，再用盲吸法去核。
化学去核：将去除卵丘的卵母细胞移入含DC（4μg/mL）的培养液中培养1h，然后在含有DC（4μg/mL）、CHX（50μg/mL）的培养液中培养12h。
Hoeschest33342染色：将去核后的卵母细胞放入含5×10-3g/mL Hoechst33342的培养液中染色15min，在荧光显微镜下检查去核效率；以胞质中无荧光物且细胞完好者为去核完全的卵母细胞。
2.4 不同激活剂预激活的化学性去核
将体外成熟培养36h的猪卵母细胞，分别用7％乙醇、10mg/L CB、0.1mmol/L的CaCl2预激活5min，并设不添加激活剂的卵母细胞为对照组，将卵母细胞在含4μg/mL DC的培养液中培养1h后，移入含DC（4μg/mL）+CHX（50μg/mL）+培养液中培养12h，观察不同激活剂处理的去核率。
2.5 数据处理
数据采用ANOV A分析，Ｆ检验。
3 结果
3.1体外成熟时间对盲吸法去核效率的影响
不同时间成熟培养的卵母细胞用盲吸法去核，荧光检测去核效率见表1。结果表明：IVM 39~41h 组去核率最高，与 IVM 36~38h组差异显著（P<0.05），与42~44h两组差异不明显，但三组显著高于IVM 45~48h组（P<0.05）。在操作过程中吸入过多胞质，或导致卵母细胞质膜破裂、胞质外流，造成卵母细胞损伤（见图1），均计为操作失败。
表1 不同成熟培养时间猪卵母细胞盲吸法去核效率（n=5）
Table 1 The efficiency of different maturation times of porcine oocytes by physical enucleation
组别卵母细胞（枚）去核卵母细胞（%）
(60.82%)a
36~38h卵母细胞去核138 84
(67.89%)b
39~41h卵母细胞去核169 115
(63.53%)b
42~44h卵母细胞去核101 64
(49.07%)c
45~48h卵母细胞去核108 53 注：同一列数据上角标注字母不同者差异显著（P<0.05），下同。
3.2体外成熟时间对化学诱导去核法去核效率的影响
体外不同时间成熟培养的卵母细胞经DC和DC+CHXM处理后，去核率不同（见表2）。IVM 36~38h、39~41h、42~44h和45~48h的去核率分别为44.09%、55.58%、58.12%和36.12%。IVM 42~44h 去核率最高，但与IVM 39~41h的去核率差异不显著（P>0.05），与其他各组之间差异显著（P<0.05）。荧光显微镜观察去核卵母细胞（见图2）。
表2 不同成熟培养时间猪卵母细胞化学诱导法去核效率（n=5）
Table 2 The efficiency of different maturation times of porcine oocytes by chemical-induced enucleation 组别卵母细胞数（枚）去核数（%）36~38h卵母细胞去核144 63(44.09%)b
39~41h卵母细胞去核185 102(55.58%)a
42~44h卵母细胞去核184 107(58.12%)a
45~48h卵母细胞去核174 63(36.12%)c
图1 盲吸法操作后损伤的卵母细胞图2 化学去核完全的卵母细胞Fig 1 The injure oocytes by physical enucleation Fig 2 The enucleation oocytes by chemical-induced
图3 荧光下正常卵母细胞
Fig 3 The normal porcine oocytes
3.3 不同去核法去核效率比较
盲吸法和化学诱导法的去核效率见图4。在相同的时间组内，盲吸法的去核率比化学诱导法的去核率高。IVM 42~44h，两种方法的去核率差异不显著。IVM 36~38h、39~41h和45~48h 两种方法的去核率差异显著（P<0.05）。说明猪卵母细胞体外培养42~44h，用盲吸法去核和化学诱导法去核都可得到较高的去核率。
图4 卵母细胞盲吸法和化学诱导法去核的去核率
Fig 4 The enucleating rate of physical and chemical-induced enucleation in porcine oocytes
4 讨论
去核率的高低与卵母细胞所处的成熟时期以及所采用的去核方法有密切的关系，因此有必要确定准确的去核时间及采用合适的去核方法来获得较高的去核效率。目前常规去核方法仍是以PB1位置为去核参照的盲吸法。化学诱导去核法是一种思路转换的产物，以药物处理来获得去核的受体胞质。
采用以PBl为标志的盲吸法，随着成熟时间的延长，卵龄增加使第一极体与中期染色体的位置发生偏转[7]。刘东等研究表明，成熟培养36h的卵母细胞的中期染色体在第一极体下方；而成熟培养44h时，部分卵母细胞的中期染色体已远离第一极体[8]。本实验结果表明，39~41h 的去核率最高，与42~44h的去核率差异不显著。可见IVM 39~44h之内去核都是较合适的，卵母细胞刚刚排出第一极体，细胞核与极体非常近，此时去核率较高。显微去核需要高水平的视觉和手动控制，存在着技术要求高、耗费时间长、对细胞损伤大的缺点。卵母细胞处于39~41h
时进行去核，可保证卵母细胞的操作时间，降低卵母细胞的损伤。施巧婷等报道成熟的卵母细胞细胞核已远离第一极体，逐渐内移，去核率较低[9]。本研究发现培养45~48h的卵母细胞去核率显著低于另三组，这细胞核远离第一极体，卵母细胞体外培养时间的延长使细胞老化有关。
化学诱导去核法可使卵母细胞去核过程简化，对细胞的物理损伤小、胞质丢失少，实验的重复性好。本研究通过用两种试剂DC和CHX对猪卵母细胞诱导去核，为提高去核效率，以不同的成熟培养时间来分析化学诱导去核法的去核率。研究表明在IVM 36~38h、39~41h、42~44h和45~48h时，去核率分别为44.09%、55.58%、58.12%和36.12%。可见卵母细胞在IVM 42~44h时，去核率最高，但与39~41h组见无显著差异（P>0.05），其余各组间差异显著（P<0.05）。这与杜卫华等对小鼠卵母细胞不同成熟时间化学性去核的研究一致[5]：卵母细胞完全成熟之前，不同的培养时间，去核率逐渐升高，但随着卵母细胞成熟培养时间的延长，去核率逐渐降低，直到降为零。
盲吸法去核需在卵母细胞排出第一极体后来判定核的位置，再进行去核。化学诱导去核法是利用化学药物抑制剂达到去核目的，去核是发生在MI期卵母细胞时期，而观察去核率时卵母细胞已排出第一极体，到达MII期。所以本研究观察到用盲吸法去核，卵母细胞在培养39~41h时去核率最高，而运用化学性去核法，卵母细胞在培养42~44h时观察到的去核率最高。在相同时间组下，两种方法的去核率差异显著（P<0.05），且盲吸法去核的去核率要高于化学诱导去核。原因可能与猪卵母细胞对DC的耐受程度有关，卵母细胞对DC敏感，会使核染色质高度浓缩成小团，影响去核率。另外，DC处理时间的长短对去核率的影响尚有不同看法，Baguisi和Ibabnez等的结果表明，DC处理45~75min获得相对较高的去核率[1,3]，而Gasparrini等认为，DC分别处理15、30和45min后，各自的去核率无明显差异[2]。而Yin等将猪体细胞克隆胚胎在含DC培养液中处理1ｈ，不仅有利于供体核的重塑，而且还可防止出现染色质扩散现象，通过该方法得到了8头克隆仔猪[4]。对卵母细胞化学诱导去核前预激活剂的选择；激活完成至开始DC处理的时间间隔是影响去核率的另一重要因素。这些结果在其他实验研究中未见报道，还需进一步深入研究。卵母细胞进行化学去核处理时各个时期细胞周期进程的变化和机制还需进一步研究，使其中的所有核物质在培养过程中随第一极体的排放而排出，以达到去核目的，同时其对克隆胚胎全程发育的影响也应全面系统的研究。
参考文献
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Study on Enucleation Method and in vitro Maturation Times
of Porcine Oocytes
Zhu Xiuping1，Jiang Weijuan2，Ai Xiaojie1，Xu Dong1，Zhu Shuwen1
1 School of Agriculture and Biology，Shanghai Jiao Tong University，Shanghai (200240)
2 Shanghai Animal Hygienic Supervision Institute，Shanghai (200335)
Abstract
This experiment was conducted to study enucleated rate of porcine oocytes cultivated with different in vitro maturation times, which was treated with physical enucleation and chemical-induced enucleation involved in Demecolcine and CHX. The results show that when maturation time were 39~41hours, the enucleated rate with physical enucleation method was significantly different from that in IVM 36~38h (P<0.05), while no significant difference from that in IVM42~44h (P>0.05), and that in all three groups was higher than that in IVM45~48h (P<0.05). Whereas when in vitro maturation time were 42~44h, the enucleated rate with chemical-induced enucleation was the highest, which was insignificantly different from that in IVM 39~41h (P>0.05) and there was significant difference between the other groups(P<0.05). With the same in vitro maturation time, the rate by physical enucleation was higher than that resulted in chemical-induced method. The study indicated that the higher enucleation rate of porcine oocytes can be achieved with IVM 39~44h and the efficiency of physical enucleation can better than that of chemical-induced method.
Keywords：porcine oocytes，physical enucleation method，chemical-induced enucleation，enucleated rate
甲氧滴滴涕对小鼠卵母细胞体外成熟的影响
甲氧滴滴涕对小鼠卵母细胞体外成熟的影响【摘要】目的：观察甲氧滴滴涕(MXC)对小鼠卵母细胞体外成熟的影响. 方法：实验组小鼠未成熟卵用7.25, 14.5，29 mg/L MXC 不同浓度培养液培养；对照组小鼠未成熟卵直接用合成人输卵管培养液培养，两组培养时间均为24 h. 观察各组生发卵泡破裂(GVBD)和第一极体(PB1) 的形成, 出现PB1的卵母细胞视为核成熟. 结果：培养24 h时，卵母细胞GVBD发生率7.25 mg/L MXC组为80.4%，14.5 mg/L MXC组为78.8%，29 mg/L MXC组为78.4%，与对照组的86%相比较并没有明显改变. 培养过程中不同浓度MXC试验组GVBD发生较同期对照组相比较也没有明显延迟. 但在培养液培养24 h时PB1的排出率7.25 mg/L MXC组为52.8%，14.5 mg/L MXC组为44.4%，29 mg/L MXC组为22%，明显低于对照组的71.2%，差异具有统计学意义(P<0.05). 结论： MXC对体外培养的小鼠卵母细胞GVBD发生没有影响，但能抑制其卵母细胞的核成熟. 【关键词】甲氧氯；卵母细胞；体外研究; 细胞培养技术 【Abstract】AIM: To investigate the effect of Methoxychlor (MXC) on in vitro maturation of mouse oocytes. METHODS： The oocytes in experimental groups were cultured in hunan tubal fluid(HTF) medium supplemented with 7.25，14.5，29 mg/L MXC and the oocytes in the unexposed control group were
哺乳动物雷帕霉素靶蛋白mTOR在小鼠卵母细胞成熟过程中的表达及作用
哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)在小鼠卵母细胞成熟过程中的表达及作用 杨彩荣 魏延昌张 岩郑可佳 李 宁严云勤* (东北农业大学动物细胞与发育生物学教研室，哈尔滨150030) 摘要哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin ，mTOR)是一种Ser/Thr 激酶，属于PIKK 超家族，对调节细 胞周期、蛋白质合成等具有重要作用，是细胞生长、增殖、分化、凋亡的中心调控器，但在哺乳动物卵母细胞中的研究还未见报道．以小鼠卵母细胞为研究对象，采用免疫荧光为主要研究方法，对mTOR 在小鼠卵母细胞中的表达进行研究，并通过mTOR 的特异性抑制剂雷帕霉素(rapamycin ，RAPA )对卵母细胞进行处理，对mTOR 在卵母细胞成熟过程中的作用进行研究．结果显示：小鼠卵母细胞成熟过程中，生发泡(germinal vesicle ，GV )期mTOR 主要集中在核膜处表达，生发泡破裂(germinal vesicle breakdown ，GVBD )后mTOR 伴随染色体分布，第二次减数分裂中期(second metaphase ，M Ⅱ期)mTOR 伴随纺锤体分布；雷帕霉素处理后，小鼠卵母细胞的成熟受到抑制，且这种抑制作用具有浓度依赖性，同时其mTOR 的表达部位和形态也发生变化．研究表明，在小鼠卵母细胞成熟过程中，mTOR 在各个时期的表达及分布具有阶段特异性，并对小鼠卵母细胞GVBD 的发生和第一极体的排放都具有重要作用． 关键词雷帕霉素靶蛋白(mTOR)，小鼠卵母细胞，雷帕霉素，免疫荧光学科分类号 Q2 DOI:10.3724/SP.J.1206.2009.00446 生物化学与生物物理进展 Progress in Biochemistry and Biophysics 2009,36(10):1334~1339 https://www.wendangku.net/doc/6614351314.html, 研究报告 Research Papers *通讯联系人. Tel:0451-********,E-mail:yanyunqin@https://www.wendangku.net/doc/6614351314.html, 收稿日期：2009-07-23，接受日期：2009-09-04 雷帕霉素靶蛋白(mTOR)结构与功能上高度保守，是一种存在于哺乳动物细胞中的Ser/Thr 激酶，属于磷脂酰肌醇激酶相关激酶(phosphatidylinositol kinase-related kinase ，PIKK)家族成员．mTOR 信号通路可以汇聚和整合来自于营养、生长因子、能量和环境胁迫对细胞的刺激信号[1～3]，通过其下游的靶蛋白核糖体蛋白S6激酶1(ribosomal protein S6kinase 1，S6K1)和蛋白质翻译起始因子eIF4E 结合蛋白1(eIF4E binding protein 1,4EBP1)调控蛋白质的翻译，加快细胞G1期/S 期的转换，促进细胞生长和增殖，抑制细胞凋亡[4～6]．mTOR 信号通路紊乱与肿瘤的形成及细胞的恶性转化密切相关[7]． 雷帕霉素(rapamycin ，RAPA ，RPM)是一种大环内酯类抗生素和免疫抑制剂，它进入体内后与胞浆受体FKBP12结合形成复合物，此复合物能够结合在mTOR 蛋白羧基端的FRB 结构域内，形成三元复合物，使得mTOR 的激酶催化域失去接近并磷酸化下游靶蛋白的能力，从而抑制mTOR 的生物学功能[8～10]． mTOR 在卵母细胞成熟和早期胚胎发育中的研究较少，且大多集中在海星、海胆等动物中[11,12]， 而在哺乳动物卵母细胞中的研究还未见报道．以往的研究表明，mTOR 与一些蛋白质的合成有关[12]，而特定蛋白质的合成对卵母细胞成熟具有重要的作用，因此我们推测，mTOR 可能在哺乳动物卵母细胞成熟过程中有重要作用．所以本研究以小鼠卵母细胞为研究对象，观察了mTOR 在卵母细胞成熟各个阶段的表达及分布情况，同时通过雷帕霉素的处理观察mTOR 对卵母细胞成熟的重要作用，为进一步探索mTOR 在小鼠卵母细胞成熟过程中的分子机制提供实验依据． 1材料与方法 1．1 实验材料 本实验选用昆明白品系6～8周龄性成熟雌鼠，购自哈尔滨肿瘤医院实验动物中心． 1．2 主要试剂 α-MEM 购自Gibco 公司；雷帕霉素购自江苏碧云天生物技术研究所；孕马血清(pregnant mare
胚胎干细胞的体外诱导分化模型
胚胎干细胞的体外诱导分化模型马宗源 李祺福(厦门大学生命科学学院福建厦门361005) 胚胎干细胞是具有全能性及无限制的自我更新与分化能力的一类特殊的细胞群体,它能通过祖细胞为中介,分化为各种类型的体细胞,可重演体内干细胞的分化过程。自80年代从小鼠囊胚的内细胞团分离到胚胎干细胞并建系到现在已建立了神经细胞、肌肉细胞、上皮细胞、造血细胞等体外分化体系。将胚胎干细胞体外分化成为可利用的分化模型,无论从组织结构、细胞及分子水平都体现了体内分化过程的体外重演,再加上胚胎干细胞系具有体系简单,影响因子少,可控制,便于研究等特点,因此可用于研究早期胚胎发育和细胞分化调控;可成为器官移植和修复器官的细胞来源;还可用于新型药物筛选。 1 胚胎干细胞的生物学特性 胚胎干细胞具有与早期胚胎相似的结构特征,具有较高的核质比和整倍体核型。体外培养的细胞紧密堆积,呈克隆状生长,具有发育分化的多潜能性和无限制的自我更新能力,碱性磷酸酶染色呈阳性,具有高的端粒酶活性,早期胚胎细胞均表达胚胎阶段特异性抗原SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、T RA-1-81、T R A-1-60等;表达种系转录因子OCT-4,并且可将O CT-4基因作为细胞多能性的一个标志;白介素6型细胞因子家族参与维持调节胚胎干细胞未分化状态。 胚胎干细胞建系的过程中要解决的问题在于体外不断增殖的过程中保持未分化的状态,但是细胞如何维持其未分化状态的机理并不清楚。研究发现主要是通过膜上的特异受体蛋白gp130来发挥作用,细胞因子受体蛋白g p130可激活JA N U S、酪氨酸激酶,JA K-ST A T、M EK/M A P K等信号途径,而JAK/ST A T3和M EK/ ERK信号途径则处于相对平衡的状态。另外,一些未知的膜结合分子也参与胚胎干细胞的增殖与分化。分离纯化及鉴定调节细胞的自我更新及分化的未知分子已成为研究的热点。 2 胚胎干细胞为基础的分化模型 胚胎干细胞要维持其未分化的状态,需要在胚胎饲养层中加入分化抑制因子。一旦改变了维持胚胎干细胞未分化状态的条件,胚胎干细胞首先形成胚胎小体,胚胎小体有外中内三胚层,继续分化可形成多种类型的细胞。在体外分化培养时,可自发形成有节律性跳动的心肌细胞,同时还形成骨骼肌、神经细胞、上皮细胞等。由于体外胚胎细胞可重演体内胚胎细胞的发育过程,并且基因的表达时相与体内的胚胎发育过程是相似的,在这一过程中加入外源的诱导分化因子并与相关的调控基因结合,可使胚胎干细胞分化为各种类型的细胞。现在已初步建立了神经细胞、肌肉细胞、上皮细胞和造血细胞等体外分化模型。 2.1 神经细胞 体外培养胚胎干细胞可模拟从未定型细胞向功能性神经元转化的过程,并且其基因的表达时相与体内的胚胎发育过程相似。在分化的早期表达N FL、N F M基因,后期则表达N eur ocan基因。维甲酸及神经生长因子可诱导胚胎干细胞定向分化为神经细胞,是常用的诱导分化物,它能上调神经元特异基因的表达,同时下调中胚层基因的表达。将神经元特异的SOX2基因转进胚胎干细胞,再经维甲酸诱导,可表达90%以上的具有神经元标志的神经细胞。可能是外源基因和维甲酸同时拮抗分化抑制因子的作用,阻碍细胞向其他的方向分化,迫使其向神经元的方向分化。维甲酸能诱导胚胎干细胞分化为C-氨基丁酸能和多巴胺能神经元,而维甲酸分别结合无血清培养基和含胎牛血清的培养基培养胚胎干细胞后发现,采用无血清培养时,几乎检测不到分化的多巴胺能神经元的存在;但在有血清培养时,却能检测到大量的多巴胺神经元。这暗示血清中的某些未知的因子和维甲酸共同起到定向诱导分化 化为特定组织细胞,将这些细胞回输体内,从而达到长期治疗的目的。干细胞的医学应用还包括体外克隆人体器官,然而这比体内移植干细胞要复杂的多。相信随着研究的不断深入,来自人体干细胞的器官应用于临床治疗已为期不远。干细胞研究与应用不仅在疾病治疗方面有着极其诱人的前景,而且将对克隆动物,转基因动物生产,发育生物学,新药物的开发与药效、毒性评估等领域产生极其重要的影响。 参考文献 1 Th omson J A,Itsk ovitz-Eldor J os eph,Shapiro S S,et al. Em bryonic s tem cell lin es d erived from human b las tocysts.S cience,1998,282:1145—1147. 2 Sh amb lott M J,Axelman J,W ang S,et al.Derivation of Plurip otent stem cells from cultured human primordial germ cell.Proc Natl Acad S ci U SA,1998,95:13726—13731. 3 Jack son K A,M i T,Goodell M A.Hematopoietic potential of s tem cells isolated from murie s keletal mus cle.Proc Natl Acad Sci USA,1999,96:14482— 14486. 4 裴雪涛.干细胞研究现状与展望.高技术通讯,2001, (6):93—95. (BH)
猪卵母细胞体外成熟培养时间及去核方法的研究
猪卵母细胞体外成熟培养时间及去核方法的研究* 朱秀萍1，蒋伟娟2，艾晓杰1，徐动1，朱淑文1 1上海交通大学农业与生物学院，上海 (200240) 2上海市兽医卫生监督所，上海 (200335) E-mail：xpzhu@https://www.wendangku.net/doc/6614351314.html, 摘要：本研究对不同体外成熟培养时间的猪卵母细胞进行盲吸法去核及利用脱羧秋水仙碱(DC)和放线菌酮(CHX)的化学诱导法去核效率进行了比较研究。结果显示，用盲吸法去核，体外成熟培养（IVM）39-41h组卵母细胞去核率与IVM 36-38h组差异显著（P<0.05），与42-44h 组差异不明显（P>0.05），但三组显著高于IVM45-48h组（P<0.05）。化学诱导法去核结果表明，IVM 42-44h组去核率最高，但与IVM 39-41h组差异不显著（P>0.05），其他各组间均差异显著（P<0.05）。在相同的体外成熟培养时间内，盲吸法的去核率比化学诱导法的去核率要高。本实验证明：猪卵母细胞IVM在39-44h内去核率较高，且盲吸法去核效率高于化学诱导去核。 关键词：猪卵母细胞，盲吸法去核，化学诱导去核，去核率 中图分类号：Q 968.1 1 前言 近年来，体细胞核移植在多种哺乳动物获得成功，相继产生克隆羊、牛、小鼠、山羊、猪、猫、兔、骡子和大鼠，为生命科学、医学制药等诸多领域提供了一个崭新的研究手段。卵母细胞核物质的去除是克隆技术成败的关键环节之一，卵母细胞的体外成熟是决定克隆胚胎能否最终发育成正常个体的关键。去核效率的高低与卵母细胞所处的成熟时期及采用的去核方法有密切关系。因此掌握卵母细胞体外成熟时间，快速而准确的去核，对提高去核成功率有重要意义。 目前动物克隆中普遍使用是机械去核法（盲吸法），该方法对细胞的机械损伤较大、耗时、技术要求高。如何既能完全去掉卵母细胞的核，又不致对细胞造成更大的损伤是研究者们一直在探索的问题。“化学诱导去核法”去核首次建立于小鼠卵母细胞，用脱羰秋水仙碱（DC）处理激活的卵母细胞，使染色体和极体牢固结合，然后用诱导第二极体排出的放线菌酮(CHX)处理卵母细胞，成功得到克隆小鼠[1~3]。Yin等把该法也应用于猪卵母细胞的去核[4]。在我国，杜卫华等首次利用化学诱导去核法用于小鼠卵母细胞的去核研究[5]，但对体外成熟培养的猪卵母细胞化学诱导去核研究目前国内尚未见报道。 本研究使用盲吸法和化学诱导去核对不同成熟培养时间的猪卵母细胞进行去核，旨在确定最佳的去核时间；建立猪卵母细胞化学诱导去核方法；同时，通过两种方法的去核效率的比较，为克隆技术研究中卵母细胞去核这一关键环节提供理论依据。 2 材料和方法 2.1 猪卵母细胞的采集 实验所用卵巢均来自于上海市闵行区纪王镇屠宰场屠宰的初情期前小母猪。将获取宰场屠废弃的猪卵巢，置于37℃灭菌生理盐水中，2h内送回实验室。以生理盐水清将卵巢洗两次 *本课题得到上海市科委国际交流项目（015407005）的资助。
生猪养殖技术
规模化猪场健康养殖技术 规模化种猪场生物安全体系就是通过各种手段以排除疫病威胁，保护猪群健康，保证猪场正常生产发展，发挥最大生产优势的方法集合体系总称。总体包括: 猪场环境控制，猪群的健康管理，饲料营养，饲养管理，卫生防疫、药物保健、免疫监测等兽医管理几个方面。 1.猪场的环境控制 1.1场址的整体规划。场址决定着猪场未来的生产难度系数和未来经济效益，是猪场生存和发展的关键。猪场位置的确定，在养猪生产中建立生物安全防范体系上至关重要，场址的选择要充分利用生态养猪，符合动物的防病规则，避免交叉感染，远离养殖场、屠宰加工厂、居民区、工厂，交通便利，水电饲料供应便利，地势要背风向阳，地势要高、干燥、通风良好、水质良好，易使猪只保持干燥和良好卫生环境，最好建在山边或鱼塘、果林、耕地边，利于排污和污水净化。 1.2.猪场建设布局要合理。生活区、生产区与办公区严格分开，必须有围墙、最好是围墙外有防疫沟，设浴室、更衣室、消毒间，由上风向到下风向。饲料贮存库、保育舍应建在猪场的上风向，病猪隔离舍、粪便堆积池设在猪场的下风头。场内道路要划分净道和脏道，饲料车、工作人员走净道,粪车走脏道。场外运输车辆不能进入生产区,生产区内的运输,另由专用车辆解决。各段安排依次为保育-产房- 配种、妊娠-育成-育肥-出猪台。兽医室、隔离舍、病死猪无害化处理间、剖检室应放在猪场的下风处。主干路需要硬化，场内道路布局合理，进料和出粪道严格分开，防止交叉感染，同时做好场区绿化工作。设有种猪运动场，便于公猪、母猪的运动。化粪池必须建在下风向，化粪池要及时处理、除臭，防止蚊蝇孳生。 1.3.温度。温度在养猪生产中也是关键一环。猪舍要求冬暖夏凉，有利于种猪发情、配种、仔猪的存活和增重。温度太高导致公猪因热应激会降低精液的活力，从而增加配种难度，出现返情多，产仔少，影响繁殖成绩。仔猪对温度变化更为敏感(仔猪不同周龄适宜温度见 表１)，适宜的温度可以减少死亡，加快增重，降低料肉比。低温使 仔猪抗病力降低、死亡率升高，料肉比升高。因此对仔猪进行防寒保暖为生产中的重中之重。(不同阶段种猪适宜温度见表２) 1.4.猪场绿化。要重视猪场周围和场区内环境的绿化，这对改善 小气候有重要的作用。植树造林可使冬季有效降低风速，使夏季的气
胚胎干细胞体外诱导分化综述
胚胎干细胞体外诱导分化综述 摘要：由于胚胎干细胞具有自我更新、高度增值和多向分化的潜能，因此，自20世纪90年代开始，对胚胎干细胞的研究成为生物学领域和医药工程领域研究的一个焦点。本文从胚胎干细胞的分离、体外诱导胚胎干细胞的原理和定向分化的机制、胚胎干细胞体外诱导的方法、定向分化的细胞、应用前景和研究存在的问题对胚胎干细胞进行综述。 关键词：胚胎干细胞；体外培养；诱导分化；应用 干细胞是一种具有多分化潜能和自我更新功能的早期未分化细胞。在特定条件下，它可以 分化成不同的功能细胞，形成多种组织和器官，它包括胚胎干细胞和成体干细胞。前者指早期胚胎的多能干细胞，后者是存在于胎儿和成体不同的组织内的多潜能干细胞这些细胞具有自我复制能力，并产生不同种类的具有特定表型和功能的成熟细胞的能力，能够维持机体功能的稳定，发挥生理性的细胞更新和修复组织损伤作用[4,9,10]。 胚胎干细胞（embryonic stem cell,ESC)是从着床前胚胎内内细胞团(inner cell mass,ICM)或原始生殖细胞经体外分化抑制培养分离的一种全能性细胞[1]。它能在体外长期不断自我更新,并保持多向分化潜能,可以分化为内、中、外三个胚层的几乎所有类型细胞。自1981年Evans和Kauffman[2,8]用不同的方法首次成功分离得到小鼠胚胎干细胞以来,小鼠胚胎干细胞成为近20年来人们用来研究发育分化、基因表达调控、基因治疗等最理想的模型，并且有大量研究表明小鼠胚胎干细胞可以在体外被诱导分化为绝大多数类型的成体细胞.1998年Thomson等首次成功分离并建立人胚胎干细胞系。自此，人胚胎干细胞不但提供了一个研究人类自身发育分化的良好机会,而且如果人胚胎干细胞能像小鼠胚胎干细胞一样可以在体外诱导形成各种成体细胞,那么利用这些诱导分化形成的成熟细胞将有可能进行细胞和组织替代治疗, 包括糖尿病、帕金森病、早老性痴呆、心血管疾病和肿瘤等多种目前临床上难以治愈的疾病。 1 胚胎干细胞的分离 自Thomson成功分离并建立人胚胎干细胞系后，多年以来，人们研究出很多胚胎干细胞的 分离方法，在这里主要介绍三种： 1.1 分离自胚胎内细胞团 内细胞团又称胚细胞（embryoblast）,是一团于哺乳动物初期胚胎中的一个细胞团块。从早期胚胎内细胞团（inner cell mass,ICM）分离是获得胚胎干细胞的主要途径。由于不同动物的胚胎发育存在差异，因此应注意取材时间。可通过免疫外科手术法、机械剥离法、组织培 养法等方法除去胚胎滋养层细胞获得囊胚内细胞团（ICM）细胞进行体外分化抑制培养。 1.2分离自原始生殖细胞
生长育肥猪的六种饲养管理方法
生长育肥猪的六种饲养管理方法 (1)一贯育肥法 将肉猪整个饲养期分成两个阶段，即前期20～60千克，后期60～100千克;或分成三个阶段，即前期20～35千克，中期35～60千克，后期60～100千克。各期采用不同营养水平和饲喂技术，但整个饲养期始终采用较高的营养水平，而在后期采用限量饲喂或降低日粮能量浓度方法，可达到增重速度快，饲养期短，肉猪等级高，出栏率高和经济效益好的目的。 (2)肉猪原窝饲养 猪是群居动物，来源不同的猪并群时，往往出现剧烈的咬斗，相互攻击，强行争食，分群躺卧，各据一方，这一行为严重影响了猪群生产性能的发挥，个体间增重差异可达13%。而原窝猪在哺乳期就已经形成的群居秩序，肉猪期仍保持不变，这对肉猪生产极为有利。但在同窝猪整齐度稍差的情况下，难免出现些弱猪或体重轻的猪，可把来源、体重、体质、性格和吃食等方面相近似的猪合群饲养，同一群猪个体间体重差异不能过大，在小猪(前期)阶段群体内体重差异不宜超过2～3千克，分群后要保持群体的相对稳定。 (3)饲料调制和饲喂 科学地调制饲料和饲喂，对提高肉猪的增重速度和饲料利用率，降低生产成本有着重要意义.①饲料调制：饲料调制原则是增强适口性，提高饲料转化效率。②饲喂方法：自由采食与限量饲喂两种饲喂方法，前者日增重高，背膘较厚;后者饲料转化效率高，背膘较薄。为了追求高的日增重用自由采食方法最好，为了获得瘦肉率较高的胴体采用限量饲喂方法最优。如果肉猪为三元杂交猪或杂 优猪，采用自由采食法，日粮稍加调整则也可以获得高的日增重和优等级胴体。肉猪前期采用自由采食，后期限制能量饲料饲喂量，则全期日增重高，胴体脂肪也不会沉积太多。限量饲喂方法的饲喂次数，应按饲料形态，日粮中营养物质的浓度，以及肉猪的年龄和体重而定。在小猪阶段，日喂次数可适当增加，以后逐渐减少。一般前期日喂4次，中期3次，后期以2次为宜。
小鼠胚胎干细胞培养实验步骤
细胞的原代培养 点击次数：540 作者：佚名发表于：2009-03-06 16:26转载请注明来自丁香园 一、原代细胞培养原理 原代细胞培养是将机体内的某组织取出，分散成单细胞，在人工条件下培养使其生存并不断生长、繁殖的方法。借助这种方法可以观察细胞的分裂繁殖、细胞的接触抑制以及细胞的衰老、死亡等生命现象。 ? 幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养 ? 掌握无菌操作技术 ? 了解小鼠解剖操作技术 ? 了解原代细胞培养的一般方法与步骤 ?了解培养细胞的消化分散 ? 了解倒置显微镜的使用 二、实验材料 ? 实验动物：孕鼠或新生小鼠 ? 液体：细胞生长液（内含20%小牛血清） 0.25%胰蛋白酶 平衡盐溶液 70%乙醇 ?器材：灭菌镊子、剪刀若干把 灭菌培养皿、细胞培养瓶、小瓶、烧杯若干个 吸管若干支 酒精灯 原代细胞培养方法 三、胰酶消化法 （1）胰酶消化法操作步骤——取材 a. 用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。
b. 把整个孕鼠浸入盛有75%乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。 c. 用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用无菌镊子将皮肤扯向后腿。 d. 用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，取出含有胚胎的子宫，置于无菌的培养皿上。 e. 剔除胚胎周围的包膜（若胚胎较大，应剪去头、爪），将胚胎放于无菌的含有平衡盐溶液的培养皿中。 f. 漂洗胚胎，去掉平衡盐溶液。继续用平衡盐溶液漂洗胚胎直至清洗液清亮为止。 （2）胰酶消化法操作步骤——切割 a. 将部分胚胎转移至一个无菌小瓶中，用平衡盐溶液漂洗。 b. 然后用眼科手术剪刀小心地绞碎胚胎，直到成1mm3左右的小块，再用平衡盐溶液清洗，洗到组织块发白为止。 c. 静置，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清。 （3）胰酶消化法操作步骤——消化、接种培养 a. 视组织块量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20-40分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。 b. 加入3-5ml细胞生长液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。 c. 静置5-10分钟，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。 d. 1000rpm，离心10分钟，弃上清液。 e. 加入平衡盐溶液5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。 f. 加入细胞生长液l-2ml（视细胞量），血球计数板计数。 e. 将细胞调整到5×105/ml左右，转移至25ml细胞培养瓶中，37℃下培养。 （4）胰酶消化法操作步骤——消化、接种培养
猪养殖业存栏出栏计算方法
一般来说母猪8月龄开始可进入种群并配种，其平均怀孕时间为114天，断乳4周或5周，即28~35天仔猪断奶，母猪返回配种舍，仔猪进入网上培育。母猪断奶后5~7天又发情配种，进入下一个繁殖周期。本文为猪场动力网原创内容，如有转载请注明出处。如图3-1所示： 一、确定繁殖节律和生产工艺参数 集约化猪场都是采用的分阶段饲养和全进全出的连续流水式生产工艺，为了有效地组织生产首先要确定繁殖节律，即在一定时间内对一群母猪进行人工授精或组织自然交配，使其受胎后及时组建起一定规模的生产群，以便保证分娩后组建起规模的哺乳母猪群，并获得规定数量的仔猪。人们把组建哺乳母猪群的时间间隔（天数）叫做繁殖节律。时间经验表明，年出栏1万～3万头规模的猪场多实行7日制，规模较小的猪场采用14、28或56天制。7日制繁殖节律有很多优点：第一，可减少空怀和后备母猪的头数，因为猪的发情周期为21天，恰好是7的倍数。第二，可将繁殖的技术工作和劳动任务安排在1周5天内完成，避开周六和周日，因为大多数母猪断奶后第4～6天发情，因此配种工作可在３天内完成。第三，有利于按周、按月、按年制定工作计划，建立有秩序的工作和休假制度，减少工作的混乱和盲目性。为了准确计算猪场的猪数和存栏数，据此计算各猪舍所需栏位数、饲料需要量、产品出栏数量等各项生产数据，必须首先实事求是地确定生产工艺参数。由于不同的猪场其生产水平不尽相同，所以工艺参数也不相同。现以５００头基础母猪的猪场为例说明，见表３－１。 项目参数 项目参数 妊娠期(日) 114 哺乳期(日) 28
保育期(日) 42 母猪窝产仔数(头) 11 断奶至受胎(日) 7~14 窝产活仔数(头) 10 公母猪年更新率 33% 母猪情期受胎率 85% 配后圈观察(日) 21 栏位消毒时间(日) 7 母猪进产房(日) 7 公母进产房 1:25 成活率(%): 哺乳仔猪 92 断奶仔猪 96 生长育肥猪 98
1动物胚胎工程实验教程小鼠卵的体外成熟与体外受精材料与方法
《动物胚胎工程实验教程》 王子玉自编 南京农业大学动科院 2005年8月
实验一小鼠卵母细胞的体外成熟实验 一、实验目的 熟悉雌鼠的生殖器官的结构特点；掌握小鼠的超数排卵方案；掌握从卵巢上扎取未成熟卵母细胞的方法、卵母细胞的分类方法、体外成熟培养方法及核成熟情况和卵丘扩展程度的观察。 二、实验器材和材料 1. 器材及药品 体视显微镜，手术器械（眼科剪，眼科镊），1mL注射器，胶头滴管，口吸管，CO2培养箱，水浴锅，移液器，枪头，塑料培养皿，记号笔。 操作液（M2），成熟培养液（M－199），激素（PMSG和HCG），石蜡油。 2．实验动物： 3-4周龄昆明系雌性小白鼠，自由采食饮水。 三、实验内容 1.小鼠的超数排卵 注射剂量皮下或腹腔注射PMSG 10 IU/只小鼠。 注射方法 皮下注射：用手指捏住小鼠的头及尾部固定（图1-1），以酒精棉球消毒其背部，提起皮肤，将注射针头平插刺入皮下，将针头微向上挑起不露出针尖时，再注入药物。随着药物的推入，在皮下可看到鼓起一个小泡，即证实药物确已注入皮下部位。皮下注射时防止药液从针孔处逸出。 腹腔注射：针头刚进入腹腔后向上挑，防止损伤小鼠腹腔内器官。注射针头宜选用小号细针头。注射药物后的小鼠自由饮水、采饲，自然光照。 2.卵巢的采集方法 在注射PMSG后46h利用颈椎脱臼法处死小鼠（将供体鼠置于饲养笼上，鼠爪自然抓紧笼上铁支架，此时一只手拉紧鼠尾，另一只手食指与拇指压紧鼠颈部，或用镊子压紧颈部即可致死，此为引颈法。用75%酒精喷湿鼠全身以消毒并防止毛发飞扬）。将小鼠头部固定，用力牵拉鼠尾，可感到颈椎部位脱臼的振动；也可用食指和拇指直接掐断颈椎致死。然后用图钉将小鼠呈仰卧姿势固定于小木板上或鼠解剖台上。
小鼠卵母细胞的孤雌激活
卵母细胞的孤雌激活 将体外成熟卵母细胞（COCs要提前脱卵丘）分别用M2液及含10mM SrCl2的无钙无糖CZB液洗3遍，然后将卵母细胞置于含10mM SrCl2的无钙无糖CZB液中培养2.5小时，之后转入不含SrCl2的无糖CZB液中继续培养3.5小时，即在激活处理6小时后观察原核统计激活率。为了维持孤雌激活胚胎的二倍性，激活液和6小时检查原核前短期培养的培养液中均添加5μg/ml的CB。 激活的判定：2原核或2-细胞各具一原核的卵母细胞判断为激活；卵质膜破裂者判断为死亡；胞质分裂一次或多次但不出现原核者判断为碎裂（fragmentation）。本实验将碎裂卵均归为未激活卵。对照组为未经激活处理，但与激活组培养相同时间的卵母细胞。每次实验，只有当对照组卵母细胞无一激活时，实验组数据才有效。 实验原理：利用氯化锶抑制第二极体的排出 实验用品：培养12小时并老化12小时，即24小时后的卵【要提前脱卵丘】，透明质酸酶，M2操作液，10摩尔每毫升的氯化锶，含钙CZB, 孤雌激活实验步骤 1,，第一天上午杀鼠取卵，培养卵。假设只有一个培养孔的卵，一个孔里最好有20至30个卵，留置第二天孤雌激活。 2,，第二天上午，算好时间，用紫外线照射两个培养孔，15分钟后加液，一个孔里放激活液，【激活液的组成是CB加氯化锶加无钙CZB】，
配置激活液的方法问师兄。另一个孔里放培养液【含钙的CZB】。3，注意激活液不能预热太长时间，CB热时间长会影响效果，【君佐师兄的加法是无钙CZB450微升加上氯化锶50微升平衡20分钟，然后加上氯化锶做滴平衡20分钟就可以放卵了】，在配置激活液时最后应该用枪打一打，好充分混匀。至于放培养液的孔可以以后考虑，激活需要6个小时。把握好时间，脱卵丘后就马上激活。同时预热上需要的药品，包括M2，含钙的CZB，再照上两个中平皿。 4，开始做时先用透明质酸酶处理培养的卵1至3分钟，脱卵丘。再用M2洗3至4遍，再用激活液洗3至4遍，再移入含有激活液的培养孔中。移入培养箱中激活6个小时。 5，假设上午9点做完，下午3点就可以观察。激活的判断方法是2原核或2细胞各具一原核的卵母细胞判断为激活。卵质膜破裂者判断为死亡。胞质分裂一次或多次，但不出现原核者判断为碎裂，本实验将碎裂卵均归为未激活卵。 6，将激活成功的卵母细胞用含钙的CZB培养液洗5至6遍，再转移如含钙CZB的培养孔中培养，理论上48小时后就可以看到4细胞期，此时再转入含糖含钙CZB胚胎培养液中培养，即可以到达囊胚期。
肉猪养殖技术
肉猪养殖技术 本人饲养30几头母猪，养猪十几年了，下面是我养殖过程中总结的几个小办法，现在拿出来，跟大家分享，希望能对有此困扰的猪友有所帮助。 一、关于咬尾 大家都知道，猪即使断了尾，咬尾的情况也时有发生。我的办法:沥青适量备用、柴油适量备用、碾碎的天鹰椒粉适量备用。 用一个容器把沥青放在里面，在火上烤化，加上柴油和天鹰椒粉混匀，在沥青还没有凝固前把混合物蘸到被咬猪的尾巴上，这样柴油的异味在加上天鹰椒的辣味可使咬尾的猪望尾兴叹。 二、关于母猪并栏 1 此法适用于急等圈用的猪友 先用细铁丝和8号铅丝编一个猪嘴形状的笼头备用，把要并圈的两头母猪赶到一个圈里，待分出强弱后(这是关键)，把事先备好的笼头戴在强者的嘴上固定好，这样它就咬不到另一头猪了，而且它会不断的摇头、在地上摩擦也无暇再去咬架。 2 此法适用于不急等圈用的猪友 把一个大圈中间用铁栅栏隔开(这是关键)，把要并圈的两头母猪分别赶到中间有铁栅栏的两个小圈里，这样让它们在里边熟悉4-5天后，在并到一起，他们就会像老相识一样即不咬架，也不斗嘴。我就有这样一个“团结友爱圈”。 三、肥猪出栏后猪圈地面巧清理 肥猪出栏后，空圈舍地面的那层厚厚的粪垢最让人头疼(每日用水冲圈和育肥舍全漏缝地面的猪友可能无此困扰)，有时一间圈舍就累得你呲牙咧嘴，汗流浃背。我的做法是:肥猪出栏前的1-2天，往猪舍的地面上泼水，然后在放些皮球、空饮料瓶之类玩儿的东西，利用猪猪的探究欲，让它们争夺玩具，再加上踩踏、拱
翻和水的浸润(如果粪垢太厚可多泼几次水)，地面上的粪垢很快就会被弄起来，然后再用平掀铲走就可以了。这样做省时省力，各位不妨试试。 1 造成仔猪咬尾症的原因很多，主要包括营养、环境、管理和疾病等几个方面，如，当饲粮营养失衡时，会刺激猪只发生咬尾症;当舍内有害气体、温度和光照超标，或通风不良、饲养密度过大时会引起咬尾现象;当猪只患贫血和体内外寄生虫时，也会发生咬尾现象。针对各种不同的原因可采用相应措施预防咬尾症，上文中作者利用异味减轻猪咬尾，这是个很不错的方法，但是提醒猪友同时要注意消除咬尾的原因，比如营养不良或缺乏引起的咬尾，不仅要减轻咬尾症状，还要调整日粮满足其营养需求，否则即使不咬尾了，猪的生长也受限。另外“在沥青还没有凝固前把混合物蘸到被咬猪的尾巴上”这样会不会烫伤猪尾巴，希望想用此方法的朋友可以跟作者深沟通一下。 2 关于母猪并栏，上文的第一个方法确实能解决问题，这里有一个小小的疑问:强者攻击弱者是本性，那个龙头不可能总带着，去掉以后，它还会攻击其它弱者母猪吗,第二个方法:熟悉了彼此的气味，确实能减少攻击，但是有些强者还是攻击弱者，所以建议把强者和弱者分开，当然如果没有那么多栏，就只好想别的办法。
卵细胞成熟过程
━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 卵子发生 原始卵泡 初级生长卵泡 次级生长卵泡 成熟中的卵泡 成熟卵泡（滤泡）和成熟卵 卵母细胞和卵泡细胞的关系 卵的结构 细胞核 染色体 核仁 细胞质 色素 皮层颗粒 环层板 卵黄 卵的类型 卵膜 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 动物成熟的雌性生殖细胞，亦称卵子。一般呈球形或椭球形，较大，多不能活动。它除具有一般细胞所共有的细胞核、细胞质、细胞器和质膜外，还有一些专供受精后发育所需的营养物质。以哺乳类为例，性成熟后，在神经和激素调控下自卵巢中排出的成熟卵，其外有透明带和放射冠包围，在透明带和质膜之间为充满液体的卵周隙（图1）。 卵（动物） 卵子发生
在性成熟之前卵巢皮层中有相当数量的卵原细胞。卵原细胞是在胚胎时期原始生殖细胞迁移到生殖嵴内分裂繁殖而产生的。卵原细胞之间存在着细胞间桥，所以发育的同步化程度较高。但同步化只限于这一时期，卵原细胞转变为初级卵母细胞时，细胞间桥消失，彼此分开，这点与精子发生不同。哺乳类在胎儿出生前或出生后不久，卵原细胞全部发育为初级卵母细胞。在个体性成熟之前初级卵母细胞不生长。性成熟后卵巢皮层中的、被卵泡细胞包围着的初级卵母细胞在激素刺激下生长，细胞核进行DNA复制,然后进入成熟分裂的前期变化。生长到一定的体积后，初级卵母细胞进行第一次成熟分裂，产生一个次级卵母细胞和第一极体；次级卵母细胞再进行第二次成熟分裂，产生卵子和第二极体。这些变化都是在卵泡中进行的(图2)。卵子和卵泡的发育大致可以划分为： 卵（动物） 原始卵泡尚未开始发育的卵泡，位于卵巢的皮层，由一个卵原细胞和外围一层扁平的卵泡细胞组成，数量很多，但在各类动物中差别很大。 初级生长卵泡卵泡细胞由扁平变为立方形，从一层增殖为几层，卵母细胞也开始增大，细胞核发生一系列成熟分裂前期的变化，产生大量核液，形似球状；在卵母细胞周围开始出现透明带。在透明带中有从卵母细胞和卵泡细胞的表面伸出的微绒毛，它们相互接触，构成卵泡细胞给卵母细胞输送物质的通道。 次级生长卵泡卵泡不断增大，外围的卵泡细胞有几层到十几层，在卵泡细胞之间出现充满透明液体的不规则腔隙，其中的液体即卵泡液。这时卵母细胞也长到最大的体积，并为一层较厚的透明带所包裹。 成熟中的卵泡卵原细胞过渡到卵母细胞，已长到最大体积，并准备成熟分裂；它周围的腔隙逐渐合并越来越大，卵泡仍可继续生长。 成熟卵泡（滤泡）和成熟卵此时体积到达最大限度。初级卵母细胞渐位于卵泡一侧，向腔内突出，仍为卵泡细胞包围，此即卵丘。人的卵泡直径可达1厘米,并从卵巢表面突出。卵泡中的卵母细胞已完成第一次成熟分裂并停止于第2次成熟分裂的中期，等待排卵（图3）。
胚胎干细胞体外培养.
胚胎干细胞体外培养 (一)胚胎干细胞的来源 目前胚胎干细胞的主要来源有：①囊胚的ICM及受精卵发育至桑葚胚之前的早期胚胎细胞；②从胚胎生殖嵴及肠系膜中分离原始生殖细胞PGCs后培养建系的胚胎生殖细胞(embryonic germ cells，EG细胞)，也具有ESCs的特性，可以分化为各种类型的成熟细胞；③体细胞核转移(somatic cell nuclear transplantation，SCNT)至去核卵母细胞后培育出来的全能细胞。其中囊胚的ICM最为常用。 (二)胚胎干细胞的分离 1.分离获取ESCs的时间：以既保证ESCs的全能性又要有足够的细胞数量为原则来确定ESCs分离获取的最佳时间。以ICM为ESCs来源时：小鼠取3～5天囊胚；猪取9～10天囊胚；羊取7～8天囊胚；牛取6～7天桑葚胚或早期囊胚；人取7～10天囊胚。以PGCs取ES细胞时：小鼠取1 2.5天胎儿生殖嵴；大鼠可取10.5天尿囊、中胚层组织块、12.5天背肠系膜或1 3.5～1 4.5天生殖嵴；牛取29～35天胎儿生殖嵴；人取35～63天的生殖嵴。 2.分离获取ESCs的方法：从PGCs分离ESCs的方法常为机械剪切与消化相结合法，即把采取的胚胎组织充分剪碎，采用EDTA、EDTA/胰酶消化。 从囊胚分离ICM的方法主要有三种： (1)免疫外科学方法：体外培养的小鼠胚泡去除透明带后，经兔抗JCR小鼠脾脏细胞抗血清(抗H-26)作用30分钟，移至1∶6稀释的新鲜豚鼠血清中作用30分钟，Hank’s液冲洗，此时胚泡的滋养外胚层呈空泡状，用眼科手术刀挑去死了的滋养层细胞，留存ICM 细胞用于培养。这种方法利用囊胚腔对抗体的不通透性，通过抗体、补体结合对细胞的毒性杀伤作用，去除滋养层细胞，保留ICM细胞进行培养。 (2)组织培养法：在小鼠受精2.5天后切除卵巢，给予外源激素，使胚胎继续发育，但延缓着床，4～6天后，由子宫冲取胚泡进行培养。结果滋养层细胞生长并推开饲养层细胞，在培养皿底壁上铺展；而ICM细胞增殖，垂直向上生长，形成卵圆柱状结构，在显微镜下用细玻璃针挑出这种柱状结构，消化传代。Evans和Kaufman采用这种方法第一个建立了小鼠ESCs系。 (3)显微外科学方法：小鼠受精后3～4天，由子宫冲取胚泡，利用显微操作系统直接从胚泡中吸出ICM细胞进行培养。 由于免疫外科学方法需要特殊的试剂去除透明带和滋养层，易对内细胞群造成损伤，而显微外科学方法需要专门的仪器设备，且对人员的技术水平要求较高，均难以推广应用。组织培养法将胚泡接种在饲养层上，模拟体内胚泡的着床，更接近自然发育过程，内细胞群增殖旺盛，较易获得胚胎干细胞样集落。 (三)胚胎干细胞的培养和建系 ESCs的分离培养和建系是其得以应用的前提。ESCs建系的原理是：将分离获取的ICM 或PGCs与饲养层共同培养，使之增殖而又保持其未分化状态，这样代代相传从而使ESCs
肉猪的饲养技术修订稿
肉猪的饲养技术 Coca-cola standardization office【ZZ5AB-ZZSYT-ZZ2C-ZZ682T-ZZT18】
肉猪的饲养技术 肉猪的喂养是养猪生产中最后的一个环节。喂养肉猪占用的资金多、耗料多。因此对整个养猪生产关系重大，又与经济效益所系。养肉猪的目的是最少的饲料和劳动力，在尽可能短的时间内、获得成本最低、数量最多，质量最好的猪肉，获得最佳的经济效益，以满足人们的肉猪和外贸的需要。影响肉猪生长发育的因素较多，单靠某一种技术是难以达到下述目的的，只有采用综合的技术措施，才能在短时间内获得成本最低，数量最多，质量最好的猪肉。才能提高肉猪的出栏水平。第一节肉猪的生长发育规律和影响生长的因素 一、肉猪的生长发育规律猪在生长发育过程中，各阶段的增重及组织的生长是不同的，也是有规律的。 1、体重的增长规律：在正常的饲料条件、饲养管理条件下，猪体的每月绝对增重，是随着年龄的增长而增长，而每月的相对增重（当月增重÷月初增重×100），是随着年龄的增长而下降，到了成年则稳定在一定的水平。就是说，小猪的生长速度比大猪快，一般猪在100公斤前，猪的日增重由少到多，而在100公斤以后，猪的日增重由多到少，至成年时停止生长。也就是说，猪的绝对增长呈
现慢枣快枣慢的增长的趋势，而相对生长率则以幼年时最高，然后逐渐下降。 2、猪体内组织增长规律：猪体骨骼、肌肉内、脂肪、皮肤的生长强度也是不平衡的。一般骨骼是最先发育，也是最先停止的。骨骼是先向纵行方向长（即向长度长），后向横行方向长。肌肉继骨骼的生长之后而生长。脂肪在幼年沉积很少，而后期加强，直至成年。脂肪先长网油，再长板油。从出生到6月龄（体重100公斤）猪体脂肪随年龄增长而提高。水分则随年龄的增长而减少；矿物质从小到大一直保持比较稳定的水平；蛋白质，在20～100公斤这个主要生长阶段沉积，实际变化不大，每日沉积蛋白质80～120克。小肠生长强度随年龄增长而下降，大肠则随着年龄的增长而提高，胃则随年龄的增长而提高，总的来说，育肥期20～60公斤为骨骼发育的高峰期，60～90公斤肌肉发育高峰期，100公斤以后为脂肪发育的高峰期。所以，一般杂交商品猪应于90～110公斤进行屠宰为适宜。 二、影响高产肥育的因素 1、猪种：不同品种在育肥过程中，在饲料、饲养管理、饲养时间、方法、措施等条件都相同，它的增重是不同的，如东山猪要比陆川猪日增重快10～15%，不同杂交猪，其增重速度也不同，例如
生猪饲养流程
生猪饲养流程 一．场区母猪生产技术操作规程 1.1.0、工作职责、任务与目标 1.1.1、全面负责产区内母、仔猪的饲养管理工作，按计划完成母猪分娩产仔任务。 1.1.2、哺乳期成活率95%以上。 1.1.3、仔猪24日龄断奶平均体重达8公斤以上。 1.1.4，协助本部门其他员工完成临产母猪转入和断奶母猪的转出、仔猪的转出。 1.1.5、加强防疫意识，严格遵守防疫制度，配合兽医做好日常消毒和疫苗注射工作。 1.1.6、细致做好各类原始数据的记录、统计及上报工作，并认真完成上级领导安排的临时性工作任务。 1.2.0、工作日程 6:30-8:30 巡查、喂饲、清理卫生 8:30-10:30 治疗、剪牙、断尾、补铁等 10:30-11:30 清理卫生、饲喂青饲料、其它工作 14:30-15:00 喂饲 15:00-16:00 清理卫生 16:00-17:00 治疗、其它工作
17:00-17:30 报表 19:30-20:00 母猪、仔猪喂饲 二、产仔舍的技术操作规程 2.1.0、分娩前的准备： ①维修好产房及保温箱。 ②检查水嘴的功能是否正常，加热灯是否能正常工作。 ③产房补饲槽的清洗、消毒（聚维酮碘1：200）和空置 干燥。 ④对将进入产房的母猪用消毒药洗刷消毒干净（聚维酮碘1：200）。 ⑤产仔前一天再对栏舍和母猪进行一次彻底消毒（聚维酮碘1：200）。 2.2.0、料表投料。 诱导分娩。产前1-2天，母猪肌注氯前列稀醇2毫升做诱导分娩。 2.3.0、接产流程 2.3.1、接产物质准备 用具。夏天：宝宝爽、盆、剪牙钳、线、桶、饲料袋子等常用工具；冬天：麻袋、桶子、宝宝爽、剪牙钳、饲料袋子、红外线灯泡。 常用的药物的准备：止血敏、吉灵、塞福康、聚维酮碘等。
生猪养殖技术指导实施方案
生猪养殖技术指导实施方案 为加快推进基层农技推广体系改革与建设，加强我区畜牧业科技推广工作，提升农民养殖水平，全面推进科技进村入户，保障畜产品的有效供给，促进农民持续增收提供有效服务和技术支撑。结合我区发展生猪产业项目，特制定本实施方案。 一、工作目标 1、按照基层农技推广体系改革与建设补助项目实施要求，每个技术指导员负责培育 10 户生猪科技示范户，辐射带动 10 户养殖户产业发展与产业增收。 2、示范推广生猪主导品种：长白猪、约克猪、杜洛克猪；主推技术：生猪标准化规模养殖、猪人工授精、重大动物疫病综合防治，以及地方优良品种和先进实用技术。 3、全面开展生猪科技入户工作，使主导品种和主推技术入户率和到位率达到 95％以上，群众满意度达 100％，生猪存栏率及出栏率分别提高 20％。 二、实施内容 1、宣传贯彻党和国家有关“三农”发展的各项法律法规和方针政策，推介主导品种和主推技术，开展的猪新品种、新技术引进、试验、示范工作。 2、组织开展科技示范户、农民养猪技术培训、技术指导和技术咨询工作，推广普及科学养猪技术: （ 1）、推广猪优良主导品种，利用猪人工授精技术进行杂交改良，公猪良种化、母猪本地化、仔猪杂交化；（ 2）、推广饲喂猪全价配合饲料，降低生产成本，缩短育肥期，提高养殖效益；（ 3）、
推广猪疫病综合防治技术，按照免疫程序与技术操作规程，做好猪 瘟、猪蓝耳病、、口蹄疫、猪肺疫防治，消毒灭源及定期驱虫等工作，减少猪疫病死亡；（ 4）、推广适度规模养殖和规范化、标准化饲养技术，“全出全进”，加强猪的饲养管理，改善猪的饲养环境，抓好基地养猪示范村、户建设。通过采取“种、料、防、管、训”综合配套技术措施，做好产前、产中、产后全程服务，不断提高农户生猪产品质量和养殖技术水平。 3、搞好畜牧生产调查，分户制定示范户技术指导方案，搞好示范户所在村组的农民科技培训和指导工作，定期向上级业务部门汇报工作进展情况，及时报送和发布农事信息，完成有关调查统计。 4、建立技术指导档案，做好《技术指导员手册》记录，指导示范户填写《科技示范户手册》。 5、推进畜牧技术服务信息化，充分利用广播、电视、网络、手机、书刊等现代服务手段的作用，加强信息勾通，并通过现场培训、指导或电话咨询及时答复责任区农户提出的各类养殖技术问题，大力推行便民服务制度，提高服务质量，履行技术指导员职责，通过畜牧科技培育养殖示范户，发挥养殖示范的示范带动作 用，从而促进我区养猪业持续健康发展。 精品文档