植物的病毒检测技术
植物的病毒检测技术
植物病毒病害是一类重要病害,几乎在各类作物上都有发生,严重影响农作物的产量和质量,用一般的方法难以防治,是生产上的一大难题。种植无病毒种子、苗木是一种非常有效的防治措施。因而如何对种子、苗木等无性繁殖材料以及在发病早期对植株进行快速准确地检测诊断就显得尤为重要。最初植物病毒检测主要依靠生物学性状,但生物学方法费时费力,检测周期长,而且易受环境条件的影响,反应不稳定、重复性差。目前植物病毒检测主要是血清学检测(以病毒外壳蛋白为基础)和核酸检测,前者主要包括ELISA、快速免疫滤纸测定、免疫胶体金技术、免疫毛细管区带电泳、免疫PCR 等;后者主要有PCR、分子信标、实时RT-PCR和核酸杂交等。
1 血清学检测方法
1．1 酶联免疫吸附测定(ELISA)
酶联免疫吸附测定是一种采用固相(主要为聚苯乙烯酶联板) 吸附,将免疫反应和酶的高效催化反应有机结合的方法,其基本原理是以酶催化的颜色反应指示抗原抗体的结合。该方法首先将同源特异抗体吸附在反应器皿底部，加入欲测试的含病毒的样品，病毒与抗体结合，病毒颗粒被固定，再加入标记的特异抗体和酶的底物，酶与底物反应后会出现有颜色的溶液其强度与病毒浓度成正比，用此方法可测定出病毒的浓度。ELISA方法简单,灵敏度高,特异性强,适于大量样品的检测,目前该方法已被广泛用于植物病毒检测。在此基础上加以改进又发展了一些新的检测方法,如A 蛋白酶联吸附(SPA-ELISA)、斑点免疫吸附(DIBA)、直接组织斑免疫测定( IDDTB) 、伏安酶联免疫分析[1]、快速ELISA 等。
1．2 快速免疫滤纸测定法(Rapid immuno-filter paper assay , RIPA) 快速免疫滤纸测定类似乳胶凝集反应,其原理是把待测病毒的抗体吸附在乳胶颗粒上,通过大颗粒乳胶间接反应小颗粒病毒的存在。所不同的是RIPA使用了一种红色乳胶,从而使检测更加简单和直观。RIPA[2]目测检测提纯TMV 的灵敏度分别可达
5ng/ml～50ng/ml 。
1.3 免疫胶体金技术( Immunogold2label as2say)
免疫胶体金技术最早起源于电镜方面的研究,由于金在生物学上是惰性的,且有良好的电荷分布,可以和蛋白质(如抗体、A 蛋白等)紧密结合,因此广泛应用于生物学和微生物学的各个领域。其原理是用柠蒙酸钠将氯金酸金离子还原为胶体金。胶体金颗粒在适当的条件下,以静电、非共价键方式吸附抗体IgG(或A蛋白)分子,从而形成稳定的IgG(或A蛋白) - 胶体金复合物。通过抗原抗体特异性结合,抗体(或A蛋白)胶体金复合物就可以结合在抗原上。金颗粒吸附在病毒粒体周围,从而得到明显的鉴别性和可见度[3] 。
随着技术的发展,1971年Taylor 等报道了免疫金染色技术( Immunogold staining) ,1981年Danscher又创建了免疫金- 银染色技术( Immunogold-silver staining) 。自1983年首次成功使用胶体金标记的抗体检测植物病毒以来,该技术逐渐被应用于植物病毒的检测。20 世纪80年代发展起来的斑点免疫金渗滤试验(Dot immunogold fitration assay) 是一种快速免疫胶体金诊断技术,该技术以硝酸纤维素膜为载体,利用微孔滤膜的渗滤浓缩和毛细管作用,使抗体抗原反应和洗涤在一特殊的渗滤装置中迅速完成,从而大大缩短了检测时间。在此基础上,又建立了更为简
易快速的胶体金免疫层析试验( Gold immuno-chromatography assay) ,该技术以硝酸纤维素膜为载体,利用微孔膜的毛细管作用,使滴加在膜条一端的液体慢慢向另一端渗透移动,在移动的过程中,抗体抗原发生反应,并通过免疫金的颜色显示出来。上述两种快速检测技术的优点是简便、快速、直接,不需要酶促反应底物,除试剂外不需任何特殊仪器设备,特别适于田间快速诊断和口岸检疫。但不能准确定量,灵敏度与酶联相当。魏梅生等[5～6]应用该技术成功地进行烟草环斑病毒的检测。
1．4 免疫毛细管区带电泳( Immuno-capillary zone electrophoresis , I-CZE) 毛细管区带电泳是在装有一种电解液的空毛细管两端加一个外加电压。在外加电压作用下,通过电泳迁移和电渗流的作用,样品中的不同组分由于迁移率的不同而分开。I-CZE将血清学反应专化性和毛细管区带电泳灵敏、快速、可自动检测的特点结合起来,实时检测抗原- 抗体复合体Eun[7 ]等应用I-CZE检测到10fg 建兰花叶病毒和齿兰环班病毒的提纯病毒。I-CZE 灵敏度高,且可快速分析多个样品,因而在无病毒苗木检测、抗病品种选育、植物检疫、种质筛选等方面可发挥巨大作用,有广阔的应用前景。
1．5 免疫PCR
近年来出现的免疫PCR 是一种将抗原抗体反应的高特异性与PCR 的高灵敏度有机结合的检测技术,与酶联检测技术相比,免疫PCR 是先用抗体来捕获抗原,提取核酸后,再用PCR 扩增DNA 片段,从而放大抗原抗体反应,大大提高了检测灵敏度。Sharman[8]建立的复合免疫PCR ,可同时检测香蕉和车前草粗提液中的香蕉苞叶花叶病毒、黄瓜花叶病毒和香蕉束顶病毒。
1.6 沉淀法
在电解质存在时，抗体与同源抗原相互结合形成沉淀，不同病毒类型形成沉淀也不同。如杆状、线状病毒形成絮状沉淀，球形病毒多形成颗粒状沉淀，通过稀释终点法，就是利用稀释终点对于每种病毒来说是比较稳定的这一特点，来测定病毒溶度。
1.7 补体结合测定法
血清中有一种对热不稳定的成分，它能在抗体存在的条件下，溶解红血球或破坏革兰氏阴性菌，这种成分称为补体。它的一个重要特性是一旦抗体与抗原结合，则补体也与之结合，通过补体的酶作用可以溶解红细胞。
2 以病毒核酸为基础的检测方法
2．1 多聚酶链式反应(PCR)
PCR 是Mullis 等在1985 年发明的一种特异性DNA 体外扩增技术。其基本原理是:以待扩增的DNA 样品为模板,两个分别与待扩增DNA 片断正链和负链互补的DNA 片断为引物,在DNA 聚合酶的催化下,快速体外扩增特异DNA 序列。在反应过程中,前一轮扩增得到的DNA 又作为后一轮反应的模板,因此DNA 的量迅速增加,一般经过大约30次循环反应,DNA 的量可扩增100 万倍以上。对于DNA 病毒可以直接进行扩增,而对于大多数的RNA 病毒,则需先将RNA反转录成cDNA 再进行PCR 扩增, 此方法称RT2PCR(Reverse transcription-PCR) 。用PCR 检测植物病毒所需时间短,灵敏度特别高。用RT2PCR 检测苹果褪绿叶斑病毒和苹果茎沟病毒的灵敏度可达5pg[10]。近年来,在此基础上又发展了多种方法用于植物病毒检测。如复合PT2PCR 是在同一
RT-PCR 反应体系中用几对不同的引物同时检测多个目的片段;PCR-ELISA 是用
ELISA代替琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物,灵敏度高。Olmos 等[12]用PCR2ELISA 方法检测李痘病毒的灵敏度比免疫PCR 高100 倍。
2．2 分子信标(Molecular beacon)
分子信标[13 ] 是具有茎环结构的一段单链核酸分子,5′- 端和3′- 端序列互补形成“茎”,与目标序列互补的探针序列为“环”,在5′- 端连接荧光组分,3′- 端连接猝灭组分。反应开始时先将反应液加热到80 ℃,这时分子信标变性,无茎环结构,不管有无目标序列均有荧光。当温度逐渐降到20 ℃时,连续检测其荧光强度。如果反应中产生与分子信标互补的目标序列,当温度降到解链温度时,分子信标和目标序列杂交,荧光部分从猝灭部分移开,从而发出荧光。如果反应中没有目标序列,分子信标的两臂相遇形成茎环结构,不会产生荧光。由于只有与互补序列杂交后分子信标才发出荧光,未杂交的信标不发荧光,因此不需要从反应混合物中除去未杂交的分子信标,可实时定量检测,灵敏度高。
2．3 TaqMan实时定量PCR ( Real-time RT-PCR)
TaqMan实时定量PCR 是将RT-PCR和荧光检测相结合,利用Taq DNA 聚合酶的5′-端核酸酶活性来切割在扩增过程中与目标序列退火的荧光探针。探针5′- 端连接荧光组分,3′- 端连接猝灭组分,当探针完整时,无荧光出现。在PCR 过程中,荧光探针(也称TaqMan探针) 专化性地与两引物扩增产物间的一段序列退火后被Taq DNA 聚合酶切割,荧光组分与猝灭组分分开,产生荧光信号,荧光信号的强度与目标序列浓度或拷贝数成比例。在每一循环中,都会有更多的分子被切割下来,荧光强度呈指数增长。TaqMan实时RT-PCR不仅可避免假阳性的出现、提高检测灵敏度、实时定量检测,并且可在一个反应管内完成,减少了污染,反应自动完成, 易定量。应用该技术, Roberts等[14]成功检测少至500fg 的番茄斑萎病毒,Eun 等[15]同时检测少至5fg 的建兰花叶病毒和齿兰环班病毒。
2．4 核酸杂交技术(Nucleic acid hybridization)
核酸杂交是两段具有一定的同源性、来源不同的核酸分子在去掉变性条件后,互补的区段退火形成异质双链分子的过程。核酸杂交是先将待测核酸固定在膜上,然后用核酸探针与其进行杂交,使杂交体带上标记而被显示出来。一般采用核酸点杂交法来检测植物病毒,直接把病毒核酸点到NC 膜上再使之与探针杂交;也有的直接把病毒样品点到NC膜上。检测的专化性程度取决于探针与病毒核酸序列的互补程度。核酸杂交技术适用于DNA 病毒、RNA 病毒及类病毒的检测,灵敏度高、特异性强,可检测到1pg 的DNA。朱水芳等[16]、李尉民等[17]分别应用核酸杂交成功检测了番茄环斑病毒和南方菜豆花叶病毒。核酸杂交还可和RT-PCR 结合使用,Bertolini 等[18] 采用复合RT-PCR 同时检测侵染橄揽树的6 种RNA 病毒,随后用这6 种病毒的特异
Dig(地高辛) 标记的探针对PCR 产物进行检测。Dig 标记的cRNA 探针检测马铃薯卷叶病毒的灵敏度可达1pg/ml 。
2．5 双链RNA分析(Double-stranded RNA ,dsRNA)
RNA 病毒、类病毒以及卫星RNA 在基因组复制过程中要形成双链的复制型或复制中间体,因此寄主植物体内存在其dsRNA ,且每一种RNA 病毒、类病毒、卫星RNA 形成的dsRNA 都是特异的,有各自的迁移率、分子量、片段数。但正常的植物组织中无大分子的dsRNA ,因而可以利用dsRNA进行RNA 病毒、类病毒和卫星RNA 的诊断与检测。dsRNA分析不需要贵重的仪器设备,在一般实验室即可进行。但不适合大量样品
的检测,而且需要一定的技术和知识才能准确进行诊断。另外,本方法也不适合DNA 病毒的检测,在负链RNA 病毒如Rhabdovirus 侵染的植物组织中也未发现dsRNA。
3 其它检测方法
3．1 石英晶体微天平生物传感器(Quartz crystal microbalance biosensor) 石英晶体微天平生物传感器是由生物敏感元件(分子识别元件) 和传感器组成
的分析仪器。生物敏感元件的活性材料可以是抗体或单链核酸,它们可与相应的病毒或病毒核酸特异识别。传感器把识别反应所引起的物理的、化学的变化转变成可直接测量的光信号或电信号。利用生物传感器可以实现对病毒的在线实时检测,灵敏度高、特异性强。在一定的线性范围内可分析专一物质的含量,但不能进行精确的病毒含量测定,主要用于定性分析。Eun 等[20～21]应用该技术进行两种兰花病毒的检测。3．2 液相色谱-质谱分析和激光解吸-离子化质谱分析法
对于已知外壳蛋白分子量的病毒,可用液相色谱- 质谱分析法( liquid chromatogram-phyPmass spectrometry , LCPMS) 和激光解吸-离子化质谱分析法(matrix-assisted laser des-orption-ionization mass spectrometry ,
MALDI-mass spectrometry) 来检测。该方法可快速、精确、灵敏地提供样品分子量信息。测定一个样品只需1g 病组织,制备方法简便,可自动检测大量样品[22]。
3.3 枯斑和指示植物检测法
利用受病毒侵染能产生枯斑的寄主植物进行检测病毒，用感染植物的叶片与少许金刚砂相混，研磨成粗汁液，然后在指示植物的叶片上蘸取汁液，摩擦供试植物的叶片，经清水清洗后，置于室温条件下的温室内测定，2-3d后叶片上会出现局部坏死灶，即圆形的枯斑，一定范围内，枯斑数与侵染病毒的溶度成正比。
3.4 电镜负染检测法
一些重金属离子能绕核蛋白体四周沉淀下来，形成一个黑暗的背景，在核蛋白体内部不能沉积而形成一个清晰的亮区，其图像如同一张照相的底片，称为负染色。
3.5免疫电镜检测法
是将免疫学原理与电镜负染技术相结合的产物，利用抗原抗体的亲和性和吸附性这一特点，使病毒能较集中地沉集在有效视野内，便于电镜下观察，大大提高了检测几率。
3.6电镜超薄切片法
该技术的发展已经达到病毒的体内定位研究和体内复制及侵染过程的动态研究水平，并能直观病毒生物大分子的亚基单位，已经从细胞水平发展到分子水平。尤其对一些未知病毒，难于提纯的病毒材料，负染技术不能解决的检测材料都可用此方法，通过对组织细胞的直接观察而得到解决，因此在病毒学检测和脱毒快繁的实际生产中均有着特殊的重要性和不可取代的作用。
4 已应用于兰花病毒检测的技术
4. 1 症状观察
症状观察是诊断兰花病毒病的传统方法之一, 但由于兰花品种多, 症状不稳定, 并有隐症现象, 栽培环境对症状表现也有一定影响。因此, 一般认为, 症状对诊断的意义不大,只能作为参考数据。有人曾从75 株外表不显症状的建兰植株中检出7 例ORSV , 从15 株表面健康的卡特兰中检出6 株感染Cym2MV , 2 株同时感染CymMV 和ORSV。
4. 2 生物学鉴定
生物学鉴定是一种十分准确和可靠的方法, 兰花病毒的鉴别寄主有苋色藜、望江南、千日红、曼陀罗以及Xanthi-nc 烟等。值得注意的是: 不同病毒和不同寄主, 需采用一些特殊的接种措施才能成功。如有的病毒(O FV )接种时需高温环境, 有的则需冷冻后研磨, 有的可用刀片切割病叶表皮后直接将汁液进行摩接。另外, 接种后症状表现的时间及持续技术也有很大区别, 如将CymMV 接种到苋色藜上需20～
24 天后才表现症状, 而接种建兰环斑病毒则只需2～ 4 天就可表现症状。
4. 3 电镜检测
像CymMV 和ORSV 等一些病毒的粒子很常见, 它们为丝状体和杆状体, 电镜观察十分方便, 因此, 采用电镜或免疫吸附电镜直接观察病毒粒子是最快速的检测方法之一。
4. 4 血清学方法
目前, 血清学方法是国内外检测兰花病毒的常用方法, 除了琼脂双扩散、微量凝集法、对流免疫及EL ISA 外, 近年还发展了一些新的血清学方法。如采用致敏抗体(A 蛋白) 代替常规抗血清所形成的微量凝聚法, 其灵敏度就有很大的提高[23]。Kaw ano 等研制了一种新的致敏乳胶检测技术, 其是用不同颜色乳胶粒体代替常规乳胶, 根据滤纸上的乳胶和病毒粒体的毛细管作用原理, 不同结合产物颜色差异很大, 以此提高这一方法的灵敏度。不过, Ellio t t 在运用免疫双扩散、ELISA 及斑点免疫法检测大量样品后认为:不能依据一种血清学检测结果来判断样品是否带毒, 必须有两种以上方法相互印证后, 诊断结果才可靠[24]。
4. 5 核酸检测
Ch ia 应用组织印迹杂交技术检测建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒, 其主要步骤包括:横切兰花叶片, 将其表面印迹在硝酸纤维膜上, 然后使膜上核酸与经放射性标记处理的CymMV 和ORSV 的cDNAs杂交, 再采用自动放射显影术检测病毒粒子的存在情况。其灵敏度可达20pg, 较ELISA 方法灵敏2～3 个反应级[25]。
4. 6PCR
分子生物学方法是近10多年来发展起来的一种新方法, 它以PCR技术为基础, 直接对病毒的核酸序列进行检测, 所以灵敏度较前述方法均有很大程度的提高。KiHyun 等研究了使用RT-PCR 检测CymMV 的方法,即以该病毒衣壳病毒基因作为引物模板, 合成一个由20个碱基对组成的引物, 然后对病毒核苷酸进行扩增, 扩增产物的长度为692bp。以反应体系中是否产生这种扩增产物来判断样品中是否存在该病毒。这种方法的灵敏度可达10fg, 所需样品量少, 在快速检测低含量样品时十分有用。
4.7 电化学发光反转录聚合酶链式反应技术
将反转录PCR技术与电化学发光分析方法结合起来,用于检测兰花中齿兰环斑病毒。检测过程中采用生物素标记的探针与PCR产物杂交,可起到筛选特异性产物的作用,从而避免假阳性结果的产生。三联吡啶钌标记探针与PCR产物杂交,既可以起到进一步筛选目的片段的作用,又可与分析液中的三丙胺反应,从而产生光信号,被电化学发光仪所检测到。在引物的5′端分别连接一段特异性核酸序列,既提高了钌探针与特异性产物的杂交几率,又增强了样品检测信号,从而提高了信躁比。实验结果表明:此方法灵敏度高、稳定性好、操作简单,可以从兰花样品中准确地检测到齿兰环
斑病毒,有望发展成为一种高效的病毒检测方法。
4.8 生物芯片
台湾农业试验所宣布研发出能同时检测2种兰花病毒的新技术, 其灵敏度比传统检定法高1 000倍, 还能结合生物芯片将检测成本降低3倍。为让新技术容易普及运用,农试所已结合生物芯片技术做成整合型生物芯片试剂套组, 检测价格会比正常RT - PCR法便宜3倍, 且一般人就可用肉眼判别。
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植物病毒检测技术研究进展汇总
植物病毒检测技术研究进展 刘茂炎 摘要：随着现代技术的发展特别是分子技术的发展，鉴定和检测病毒的方法越来越多，也越来越精确快速。以PCR为基础的基因工程技术已经广泛应用于病毒核酸分子的鉴定，其高灵敏度和高特异性是与PCR扩增反应的特异性引物相关联的；于此同时传统的鉴定检测技术依然有其发展优势。不论怎样的方法技术，都是以病毒的理化性质以及侵染性为基础的。在此基础上，甚至出现了某些边缘技术在病毒鉴定检测方面的应用。本文主要综述的是对植物病毒鉴定检测技术的研究进展。 关键词：植物病毒；检测技术；PCR 病毒在生物学上特征（如病毒的理化性质，包括病毒粒子的形态、大小、对理化因子的耐受性等）以及在寄主上的反应（如寄主范围、症状表现、传播方式等）是对病毒最直观的认识。常规的对植物病毒的鉴定检测方法有：生物学测定方法、血清学技术、电子显微镜技术、分子生物学技术等。生物学测定依据病毒的侵染性，观察寄主植株或其它生物的症状表现；血清学技术以病毒外壳蛋白(CP)为基础；电子显微镜技术依据病毒的形状大小的不同；分子生物学鉴定则以病毒核酸为基础。 1.生物学鉴定 最直接的方法是目测法，直接观察病毒对植物的病害症状。如烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus，TMV），病害症状为叶上出现花叶症状，生长陷于不良状态，叶常呈畸形；玉米鼠耳病的诊断主要依据田间症状表现[1]。目测法因观察的主观性和症状的不确定性的影响而不精准。1929年美国病毒学家霍姆斯（Holmes）用感病的植物叶片粗提液接种指示植物，2~3天后接种叶片出现圆形枯斑，枯斑数与侵染性病毒的浓度成正比，能测出病毒的相对侵染力，对病毒的定性有着重要的意义，这种人工接种鉴定的方法就是枯斑和指示植物检测法。国内报道的水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf fijivirus，RBSDV)可侵染28属57种禾本科植物，该病毒的主要传毒介体是灰飞虱(Laodelphax striatella)，
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关于计算机病毒检测技术分析 【摘要】计算机的出现改变了人们的生活方式和工作方式，同时也改变了全球经济的结构，逐渐的成为人类物质社会最为重要的组成部分，随着互联网的迅速发展，网络安全问题也日益严重起来。计算机病毒给计算机系统的安全带来了严重的危害，并且造成的损失也比较大，一般认为，计算机网络系统的安全运行来自计算机病毒的攻击，那么研究分析计算机病毒检测技术也就有着极大的现实意义。本文探究了计算机病毒，以及计算机病毒的种类，并且着重分析研究了计算机病毒检测技术，以期提高计算机安全。 【关键词】计算机病毒;检测技术;分析 1.引言 对于计算机的安全广大的安全专家以及用户都是比较担忧的，虽然目前计算机反病毒的技术正在不断的更新，但是反病毒技术仍然是被动的，用户需要应付每一个出现的计算机病毒，并且随着互联网技术的逐渐普及，计算机病毒越来越多的泛滥而出。计算机病毒攻击的方式、传播的方式也在随着社会经济的发展逐渐的变化着，它能够隐形的依附在下载的视频或者资料中，或者利用图片传播等，计算机病毒的传播速度较快，并且危害性也相对较大，那么为了保证计算机的安全使用，就必须要提高计算机病毒检测技术，在计算机没被病毒侵害之前进行检测，并进行杀毒。 2.计算机病毒综述 计算机病毒是一种人为制造的，专门用来破坏或者攻击计算机软件系统，并复制本身传染其他应用程序的代码，随着计算机网络技术的逐渐发展和应用，计算机病毒已经成为信息系统安全的主要威胁之一[1]。计算机病毒能够像生物病毒一样进行繁殖，在程序正常运行的时候，能够进行运行自身复制，也就是说计算机病毒具有繁殖性，再有计算机病毒具有传染性，一旦病毒被复制或者是产生变种，那么它的传播速度是很难预防的，传染性是计算机病毒基本的特征。此外计算机病毒还具有潜伏性，这跟定时炸弹是差不多的，在之前设计好病毒爆发的时间，给人以措手不及，还具有隐蔽性、破坏性等特性。计算机病毒大致上被分为宏病毒、木马病毒、黑客工具、脚本病毒等种类，下面我们将对这些病毒进行系统的分析。 第一，宏病毒，这是脚本病毒中的一种，但是由于其特性故将其分为一类，宏病毒的前缀是Macro，第二前缀是Word、Excel等，较为著名的宏病毒有著名的美丽莎。 第二，脚本病毒，脚本病毒的前缀是Script[2]，脚本病毒的共有特性是使用脚本语言编写的，借助网页进行传播的病毒。
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基因芯片及其在植物病原物检测中的应用 摘要:基因芯片是近年来发展起来的一项新兴技术，是把大量DNA探针或基因片段按特定的排列方式固定在硅片、玻璃、塑料或尼龙膜等载体上，形成致密、有序的DNA分子点阵，在基因定位、DNA测序、突变检测、基因筛选、基因诊断和发现新基因等方面起着重要的作用。基因芯片技术已广泛应用于病原物检测，在植物病害预测和防治中起着重要的作用。 关键词:基因芯片; 病原物检测 1996年，美国Affvmetrix生物公司制造出世界上第一块商业化的基因芯片(Gene chips)，由此掀起了基因芯片研究热潮。基因芯片被迅速而广泛地应用于生命科学与医学的各领域，被誉为继大规模集成电路后又一次意义深远的科技革命[1]。随着基因芯片技术的不断发展，其在生命科学和医学中的研究领域中的应用几乎是全方位的，包括基因定位、DNA测序、突变检测、基因筛选、基因诊断和发现新基因等［2］。本文仅叙述基因芯片原理已经基因芯片在植物病原物检测中的作用。 基因芯片的基本原理 基因芯片，又称DNA芯片(DNA chips)，属于生物芯片(bio-chip)中的一种，是综合微电子学、物理学、化学及生物学等高新技术，把大量DNA探针或基因片段按特定的排列方式固定在硅片、玻璃、塑料或尼龙膜等载体上，形成的致密、有序的DNA分子点阵，因固相载体常用硅玻片或硅芯片，故称之为基因芯片［3］。基因芯片技术的基本原理是分子生物学中的核酸分子原位杂交技术:将短链核酸分子固定在固相载体上作为探针，待分析样品经过标记后与固定在芯片上的探针杂交。其技术流程主要包括芯片的制备、待测样本的制备和标记、杂交反应、结果检测和数据处理分析等。与传统的核酸印迹杂交技术相比，基因芯片具有可信度高、信息量大、操作简单、重复性强以及可以反复利用等诸多优点［4］。
植物病毒分子检测方法概述
植物病毒分子检测方法概述 邵碧英 (福建出入境检验检疫局 福州 350001) 植物病毒粒体主要由核酸和蛋白外壳构成,蛋白外壳由许多外壳蛋白(CP)组成。 CP和核酸因病毒的不同而异,是检测、鉴定植物病毒的主要依据。广义的植物病毒分子检测方法包括蛋白质检测(或血清学试验)和核酸检测方法,本文分别介绍。 1 以病毒外壳蛋白为基础的检测方法 植物病毒的CP具有抗原性,很多病毒可以被提纯并制备成高效价的抗血清,根据特异性的抗原抗体反应可检测植物病毒的存在。血清学方法有很多,应用较广泛的是酶联免疫吸附反应,在此基础上加以改进也发展了一些新的检测方法。 111 酶联免疫吸附反应(EL ISA) EL ISA是一种采用固相(主要为聚苯乙烯酶联板)吸附,将免疫反应和酶的高效催化反应有机结合的方法。酶标抗体(或抗抗体)与相应抗原反应时形成酶标记的免疫复合物,酶遇到相应的底物时产生颜色反应,颜色深浅与抗原量正相关。该方法已被用于各种植物病毒检测。 后来发展的用酶标A蛋白取代酶标抗抗体的EL ISA被称为A蛋白酶联吸附法(SPA-EL ISA)。几种植物病毒的SPA-EL ISA诊断试剂盒已被研制成功[1]。 EL ISA方法简单,灵敏度高,特异性强,适于大量样品的检测。 112 斑点免疫吸附法 20世纪80年代发展的以硝酸纤维素膜(NCM)为固相载体的酶联免疫吸附试验—斑点免疫吸附法,检测原理类似于EL ISA,但酶与底物反应产生不溶性产物,在NCM 上形成有色斑点,斑点颜色深浅与抗原的量成正比。也已用于各种病毒检测。 斑点法简便,反应时间短,反应结果可长期保存,不需任何特殊设备,也适合于大量样品的测定。 113 直接组织斑免疫测定法(IDD TB)与EL ISA相比,斑点法更为简便,但仍然需要提取病毒的粗提液或提纯制剂,试验过程较繁琐。改进后的直接组织斑免疫测定是直接把植物组织切块固定于膜上,然后利用抗原抗体特异反应来检测植物病毒。 鞠振林等[2]以IDD TB检测病组织中的马铃薯X病毒Potato virus X等多种病毒获得较好结果。徐明全等[3]采用IDD TB法从兰花叶片中检测到建兰花叶病毒Cymbidium mosaic virus。把石斛兰叶片从叶尖至叶尾每0.5cm切割1次并压印在膜上,检测结果可直接显示出感染病毒的具体部位。 组织印迹法明显比EL ISA和DIBA的试验程序简单、快速。但病毒在植物的不同部位分布不均匀,同一样品要重复多次,以提高检测的准确性。 114 电印迹免疫分析(EBLA) 电印迹免疫分析方法首先用SDS2PA GE 分离病毒CP,把蛋白带转移到膜上,再进行抗原杭体反应,根据CP分子量和吸附特异性抗血清的特殊带来判断该病毒的存在与否。 EBLA和EL ISA、DIBA相比具有明显的优点,通过电泳将植物病毒的CP和植物组织中的其它蛋白分离开来,排除了杂蛋白的干扰,可检测低浓度的植物病毒。此方法 — 7 7 3 —
计算机病毒与防范基础知识考试题及答案【最新】
计算机病毒与防范基础知识考试题及答案 (单选);姓名得分: 注:每题5分，满分100分; 1.下面是关于计算机病毒的两种论断，经判断___; (1)计算机病毒也是一种程序，它在某些条件上激活;A)只有(1)正确B)只有 (2)正确;C)(1)和(2)都正确D)(1)和(2)都不正; 2.通常所说的“计算机病毒”是指______; A)细菌感染 B)生物病毒感染; C)被损坏的程序 D)特制的具 计算机病毒知识测试题(单选) 姓名得分: 注: 每题5分，满分100分
1.下面是关于计算机病毒的两种论断，经判断______ (1)计算机病毒也是一种程序，它在某些条件上激活，起干扰破坏作用，并能传染到其他程序中去;(2)计算机病毒只会破坏磁盘上的数据. A)只有(1)正确 B)只有(2)正确 C)(1)和(2)都正确 D)(1)和(2)都不正确 2.通常所说的“计算机病毒”是指______ A)细菌感染 B)生物病毒感染 C)被损坏的程序 D)特制的具有破坏性的程序 3.对于已感染了病毒的U盘，最彻底的清除病毒的方法是_____ A)用酒精将U盘消毒 B)放在高压锅里煮 C)将感染病毒的程序删除 D)对U盘进行格式化
4.计算机病毒造成的危害是_____ A)使磁盘发霉 B)破坏计算机系统 C)使计算机内存芯片损坏 D)使计算机系统突然掉电 5.计算机病毒的危害性表现在______ A)能造成计算机器件永久性失效 B)影响程序的执行，破坏用户数据与程序 C)不影响计算机的运行速度 D)不影响计算机的运算结果，不必采取措施 6.计算机病毒对于操作计算机的人，______ A)只会感染，不会致病 B)会感染致病 C)不会感染 D)会有厄运
植物病毒病检测方法
植物病毒病检测方法 植物病毒病是农业生产上一种重要病害，严重影响农作物的产量和质量, 目前还没有1种治疗效果较理想的药剂，对发病植株做到早期诊断及提前检测就显得尤为重要。植物病毒学历经近百年的发展，植物病毒的检测方法与手段也在不断发展与改进。常用的方法有侵染力测定法、血清学方法、电子显微镜计数和分子生物学法等。 1.4.1侵染力测定法 侵染力测定法是将病毒样本接种在植物上，根据侵染力的大小定量。它的灵敏度在所有定量法中是比较高的，而且是其他定量法的基础。设计一种新的定量法，如果不经过侵染力的验证，将无法判断测定的是病毒或者是具有侵染力的病毒。侵染力测定法包括局部枯斑法、淀粉－碘斑法、系统感染率的测定法等。侵染力测定多用粗汁液来接种，为了避免抑制物质的作用和使半叶枯斑数目控制在一定范围，须用缓冲液稀释接种物。 局部枯斑法1929年F.O.Holmes发现TMV在心叶烟（Nicotiana glutinosa）接种叶片上引起局部坏死斑点，在一定的病毒浓度范围内，所产生的斑点数目与病毒浓度成正比例。这一发现成为病毒侵染性定量测定的基础（田波，1987）。所有机械传染的病毒都有可能应用局部斑点法，但实际上只有少数病毒具有可用于定量测定的局部斑寄主。一个待测样品所形成的斑点数目除取决于接种物中病毒浓度外，还受试验植物种类、环境条件和接种物中是否含有病毒抑制物质的影响。 淀粉－碘斑法当所研究的病毒没有过敏性枯斑寄主时，采用此法。Holmes（1931）发现TMV接种的烟叶上有时形成明显的黄化斑块，但不能用于计数。将这种接种叶用95％乙醇加热到80℃固定，然后用I2和KI混合液（10克I2，30克KI，1500毫升H2O）染色时，则侵染点处出现淀粉－碘的蓝色反应。当下午采摘叶片，褪色过夜，然后用碘液染色，则侵染点较周围组织着色浅；当采摘叶片前，植株先在黑暗中放几个小时，再用碘液染色，则侵染点组织着色深。这是由于病毒侵染既降低光合组织中碳水化合物的形成，也降低碳水化合物从光合组织中的运出。淀粉－碘染色的强弱受环境条件的影响较大，不如局部枯斑法可靠，但在标准化条件下仍可用于侵染性的定量测定。 侵染性滴度法当上述方法都不适用时，可采用侵染性滴度法。即把欲测定样品用缓冲液稀释，可用十倍稀释、成倍稀释、半倍稀释或更低稀释。这种方法的缺点是需用大量实验
病毒分子生物学鉴定常用技术
实验二十三病毒核酸检测常用技术 （Techniques of Detecting Nucleic Acid of Viruses in Common Use ） 近年来随着分子生物学的发展，基因检测技术在微生物学实验室诊断中也取得了长足的进展。由于部分病原微生物的基因组已成功地被克隆并进行了核苷酸序列测定，因此根据病原微生物的基因特点，应用分子生物学技术检测样品中有无相应病原微生物的核酸，从而可以特异、灵敏地判定标本中是否含有相应的病原微生物。在微生物学的研究及感染性疾病的诊断中，最常使用的微生物核酸检测技术有PCR、RT-PCR、核酸杂交等技术，现对病毒核酸（DNA、RNA）的分离、PCR、RT-PCR、核酸杂交等技术的基本原理、操作方法、应用及影响因素等进行概述。 实验 1 PCR 检测传染性喉气管炎病毒核酸 【目的要求】 通过本实验使学生初步了解和熟悉病毒核酸（DNA）的分离与PCR技术的基本原理、操作方法、影响因素和应用。 【基本原理】 鸡传染性喉气管炎(Infectious laryngotracheitis, ILT)是由疱疹病毒科、α-疱疹病毒亚科的喉气管炎病毒(Infectious laryngotracheitis Virus, ILTV)引起的一种急性上呼吸道传染病, 常表现呼吸困难、产蛋鸡产蛋下降和死亡, 是危害养鸡业发展的重要疫病之一。但在临诊上极易与其它一些呼吸道疾病相混淆, 如禽流感、新城疫、传染性支气管炎、支原体感染等。常规检测IL TV 的方法有病原分离鉴定和血清学试验, 这些方法虽经典，但费时且敏感性差, 不能检测亚临床感染, 而传染性喉气管炎潜伏感染是疾病的一种重要表现形式。聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是目前比较快速、敏感、特异的检测手段，已被广泛应用在病毒核酸检测方面。本实验以PCR方法检测鸡传染性喉气管炎病毒核酸为例，对PCR方法进行介绍。 PCR是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，典型的PCR由（1）高温变性模板；（2）引物与模板退火；（3）引物沿模板延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的DNA得以迅速扩增。其主要步骤是：将待扩增的模板DNA置高温下（通常为93～94℃）使其变性解成单链；人工合成的两个寡核苷酸引物在其合适的复性温度下分别与目的基因两侧的两条单链互补结合，两个引物在模板上结合的位置决定了扩增片段的长短；耐热的DNA聚合酶（Taq酶）在72℃将单核苷酸从引物的3’端开始掺入，以目的基因为模板从5’→3’方向延伸，合成DNA的新互补链。如此反复进行，每一次循环所产生的DNA 均能成为下一次循环的模板，每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍，PCR产物得以2n的批数形式迅速扩增，经过25～30个循环后，理论上可使基因扩增109倍以上，实际上一般可达106～107倍（图23-1）。
计算机病毒行为特征的检测方法
2012.4 37 计算机病毒行为特征的 检测分析方法 谢辰 国际关系学院 北京 100091 摘要：在研究计算机病毒之前，如果我们能先对被研究病毒的行为特征有足够的了解，那么对于之后的反汇编代码分析以及查杀工作都会起到事半功倍的效果。本文先介绍了计算机病毒行为特征，然后通过实验的方法，利用虚拟机和软件分析技术，从动态和静态两个角度，以new orz.exe 病毒为例，来阐述和总结检测分析计算机病毒行为特征的方法。 关键词：计算机病毒；行为特征；虚拟机；软件分析技术 0 引言 随着互联网技术的日渐普及和高速发展，全球化通信网络已经成为大势所趋。但网络在提供巨大便利的同时，也存在种种安全隐患和威胁，其中危害最大影响最广的莫过于计算机病毒。在网络带宽不断升级的今天，计算机病毒的传播速度和变种速度也随之加快，问题也越来越严重，引起了人们的广泛关注，并成为当前计算机安全技术研究的热点。据国内外各大反病毒公司统计，2008 年截获的各类新病毒样本数已经超过1000万，日均截获病毒样本数万。对于现如今计算机病毒变种的不断增加，反计算机病毒的一个研究方向便是怎样在不对病毒汇编代码分析的前提下，分析出已知或未知的计算机病毒的全部行为特征。 1 计算机病毒行为特征 (1) 传染性 传染性是计算机病毒最重要的特征，是判断一段程序代码是否为计算机病毒的依据。计算机病毒是一段人为编制的计算机程序代码，这段程序代码一旦进入计算机并得以执行，它会搜寻其他符合其传染条件的程序或存储介质，确定目标后再将自身代码插入其中，达到自我繁殖的目的。是否具有传染性是判别一个程序是否为计算机病毒的重要条件。 (2) 非授权性 病毒隐藏在合法程序中，当用户调用合法程序时窃取到系统的控制权，先于合法程序执行，病毒的动作、目的对用户是未知的，是未经用户允许的。 (3) 隐蔽性 病毒一般是具有很高编程技巧、短小精悍的程序，它们一般附着在合法程序之中，也有个别的以隐含文件形式出现，目的是不让用户发现它的存在。如果不经过代码分析，病毒程序与合法程序是不容易区别开来的。 (4) 潜伏性 大部分的病毒传染系统之后一般不会马上发作，它可长期隐藏在系统中，只有在满足其特定条件时才启动破坏模块。如著名的在每月26日发作的CIH 病毒。 (5) 破坏性 病毒可分为良性病毒与恶性病毒。良性病毒多数都是编制者的恶作剧，它对文件、数据不具有破坏性，但会浪费系统资源。而恶性病毒则会破坏数据、删除文件或加密磁盘、格式化磁盘等。 (6) 不可预见性 从对病毒检测方面看，病毒还有不可预见性。不同种类的病毒，它们的代码千差万别。虽然反病毒技术在不断发展，但是病毒的制作技术也在不断的提高，病毒总是先于相应反病毒技术出现。 (7) 可触发性 计算机病毒一般都有一个或者几个触发条件。如果满足其触发条件，将激活病毒的传染机制进行传染，或者激活病毒的表现部分或破坏部分。病毒的触发条件越多，则传染性越强。
实验 15 植物病毒病害抗性鉴定
实验15 植物病毒病害抗性鉴定 植物病毒是导致粮、菜、果、花卉产量下降、品质变劣的重要原因之一。自1892年俄国Iwanowsky发现烟草花叶病毒以来，己被正式命名的植物的病毒789种，并明确病毒只含有一种类型的核酸，即核糖核酸（RNA）或脱氧核糖核酸（DNA）， 70年代后发现了只含有小分子量 RNA、不含蛋白质、侵染活性很高的类病毒25种，80年代后发现了含有线状病毒基因组RNA和与类病毒相似的环状RNA的拟病毒40种。 植物病毒种类多，繁殖速率快，传播途径广，并且缺少有效防治药剂和措施。因此，植物病毒病一旦流行，危害之重，己超过真菌、细菌病害。因此，加强植物病毒研究，减轻植物病毒危害，对国民经济的发展具有重要意义。 本实验重点学习目前普遍采用的几种植物病毒病害检测及抗性鉴定的方法及步骤。 一、试材及用具 1．试材发病的植物组织及家兔等。 2．仪器及试剂高速冰冻离心机，离心管以及分子量为6000的聚乙二醇（PEG6000）、氯仿等。 二、方法步骤 （一）病毒检测 可用于植物病毒检测的方法主要有生物学测定、血清学检测、电镜检测、免疫电镜以及酶联免疫吸附反应（ELISA）、免疫PCR等分子生物学方法，其中血清学检测是快速、准确、 图5－1 病毒抗原的分离与纯化
灵敏度高、成本低的病毒检测方法，可用于实际检验检测工作中去。本实验重点介绍，其它方法可查阅有关文献资料。 利用血清学技术进行病毒检测，主要依据血清学反应（免疫学反应），即抗原与抗体之间发生的各种作用。抗原指的是能诱导产生抗体的一类物质，它可以是病毒、细菌、真菌、植物菌原体等微生物，也可以是酶类、DNA、RNA、类脂、多糖等有机化合物，甚至还可以是叶片、枝条等各类组织。抗体是指由抗原注射到动物体内诱导产生的、并能与抗原在体外进行特异性反应的一类物质，庄要是一些免疫球蛋白。含有抗体的血清通常称为抗血清。抗原能与由其诱导产生的抗体发生凝集、沉淀等反应，利用病原物中特异性强的抗原与相应的抗体反应，就能实现对病原物（病毒）的检测、鉴定。目前国际上己制备出 200余种重要植物病毒抗血清。我国农业部植检所为满足植物病毒检疫的研究和需要，先后制备出 30余种植物病毒抗血清。因此，利用血清学技术检测病毒，主要包括如下三个环节：1．病毒抗原的分离与纯化利用高速冰冻离心机等设备以及聚乙二醇（PEG）、氯仿等化学药品，从冰冻的病组织中分离、纯化病毒抗原。其操作步骤如图5－1所示。 2．病毒抗血清的制备病毒抗血清的制备主要包括试验动物选择、抗原注射、血样采集以及抗血清的收集与保存等过程，可用图5－2表示： 图5－2 病毒抗血清的制备与保存 3．血清学反应将抗血清及抗原进行一系列稀释后，采用试管沉淀、小试管环状沉淀、玻片凝集、免疫双扩散、免疫电泳及荧光抗体等反应方法进行血清学反应，从而实现对病毒的检测与鉴定。 （二）病毒病抗性鉴定 病毒检测的对象是病原物（病毒），是对病毒定性（病毒的有无及其种类）与定量的分析鉴定，而抗性鉴定的对象是寄主，即植物品种或种质对特定病毒的抵抗能力。目前植物病毒病抗性鉴定所采用的方法，大都为大田病圃法。例如，刘琴等（2002）对110个小麦引进品种在自然病圃区进行了对小麦黄花叶病的抗性鉴定。主要做法是，每个品种分别播种，设置对照与重复，于病害发生期调查发病率。所采用的病情分级标准是： 1级 抗（R）：发病率0%～9.9%；
植物的病毒检测技术
植物的病毒检测技术 植物病毒病害是一类重要病害,几乎在各类作物上都有发生,严重影响农作物的产量和质量,用一般的方法难以防治,是生产上的一大难题。种植无病毒种子、苗木是一种非常有效的防治措施。因而如何对种子、苗木等无性繁殖材料以及在发病早期对植株进行快速准确地检测诊断就显得尤为重要。最初植物病毒检测主要依靠生物学性状,但生物学方法费时费力,检测周期长,而且易受环境条件的影响,反应不稳定、重复性差。目前植物病毒检测主要是血清学检测(以病毒外壳蛋白为基础)和核酸检测,前者主要包括ELISA、快速免疫滤纸测定、免疫胶体金技术、免疫毛细管区带电泳、免疫PCR 等;后者主要有PCR、分子信标、实时RT-PCR和核酸杂交等。 1 血清学检测方法 1．1 酶联免疫吸附测定(ELISA) 酶联免疫吸附测定是一种采用固相(主要为聚苯乙烯酶联板) 吸附,将免疫反应和酶的高效催化反应有机结合的方法,其基本原理是以酶催化的颜色反应指示抗原抗体的结合。该方法首先将同源特异抗体吸附在反应器皿底部，加入欲测试的含病毒的样品，病毒与抗体结合，病毒颗粒被固定，再加入标记的特异抗体和酶的底物，酶与底物反应后会出现有颜色的溶液其强度与病毒浓度成正比，用此方法可测定出病毒的浓度。ELISA方法简单,灵敏度高,特异性强,适于大量样品的检测,目前该方法已被广泛用于植物病毒检测。在此基础上加以改进又发展了一些新的检测方法,如A 蛋白酶联吸附(SPA-ELISA)、斑点免疫吸附(DIBA)、直接组织斑免疫测定( IDDTB) 、伏安酶联免疫分析[1]、快速ELISA 等。 1．2 快速免疫滤纸测定法(Rapid immuno-filter paper assay , RIPA) 快速免疫滤纸测定类似乳胶凝集反应,其原理是把待测病毒的抗体吸附在乳胶颗粒上,通过大颗粒乳胶间接反应小颗粒病毒的存在。所不同的是RIPA使用了一种红色乳胶,从而使检测更加简单和直观。RIPA[2]目测检测提纯TMV 的灵敏度分别可达 5ng/ml～50ng/ml 。 1.3 免疫胶体金技术( Immunogold2label as2say) 免疫胶体金技术最早起源于电镜方面的研究,由于金在生物学上是惰性的,且有良好的电荷分布,可以和蛋白质(如抗体、A 蛋白等)紧密结合,因此广泛应用于生物学和微生物学的各个领域。其原理是用柠蒙酸钠将氯金酸金离子还原为胶体金。胶体金颗粒在适当的条件下,以静电、非共价键方式吸附抗体IgG(或A蛋白)分子,从而形成稳定的IgG(或A蛋白) - 胶体金复合物。通过抗原抗体特异性结合,抗体(或A蛋白)胶体金复合物就可以结合在抗原上。金颗粒吸附在病毒粒体周围,从而得到明显的鉴别性和可见度[3] 。 随着技术的发展,1971年Taylor 等报道了免疫金染色技术( Immunogold staining) ,1981年Danscher又创建了免疫金- 银染色技术( Immunogold-silver staining) 。自1983年首次成功使用胶体金标记的抗体检测植物病毒以来,该技术逐渐被应用于植物病毒的检测。20 世纪80年代发展起来的斑点免疫金渗滤试验(Dot immunogold fitration assay) 是一种快速免疫胶体金诊断技术,该技术以硝酸纤维素膜为载体,利用微孔滤膜的渗滤浓缩和毛细管作用,使抗体抗原反应和洗涤在一特殊的渗滤装置中迅速完成,从而大大缩短了检测时间。在此基础上,又建立了更为简
浅谈计算机病毒的检测技术
浅谈计算机病毒的检测技术 摘要：在互联网高速发展的今天，计算机病传染性越来越强，危害性也越来越大。计算机病毒的检测方法主要有长度检测法、病毒签名检测法、特征代码检测法、检验和法、行为监测法、感染实验法、病毒智能检测法等。本文对其特点以及优缺点逐一进行了叙述。 关键词：计算机病毒检测技术 一、引言 Internet改变了人们的生活方式和工作方式，改变了全球的经济结构、社会结构。它越来越成为人类物质社会的最重要组成部分。但在互联网高速发展的同时，计算机病毒的危害性也越来越大。在与计算机病毒的对抗中，早发现、早处置可以把损失降为最少。因此，本文对计算机病毒的主要检测技术逐一进行了讨论。计算机病毒的检测方法主要有长度检测法、病毒签名检测法、特征代码检测法、检验和法、行为监测法、感染实验法、病毒智能检测法等。这些方法依据原理不同，检测范围不同，各有其优缺点。 二、计算机病毒的检测方法 (1)长度检测法 病毒最基本特征是感染性，感染后的最明显症状是引起宿主程序增长，一般增长几百字节。在现今的计算机中，文件长度莫名其妙地增长是病毒感染的常见症状。长度检测法，就是记录文件的长度，运行中定期监视文件长度，从文件长度的非法增长现象中发现病毒。知道不同病毒使文件增长长度的准确数字后，由染毒文件长度增加大致可断定该程序已受感染，从文件增长的字节数可以大致断定文件感染了何种病毒。但是长度检测法不能区别程序的正常变化和病毒攻击引起的变化，不能识别保持宿主程序长度不变的病毒。 (2)病毒签名检测法 病毒签名(病毒感染标记)是宿主程序己被感染的标记。不同病毒感染宿主程序时，在宿主程序的不同位置放入特殊的感染标记。这些标记是一些数字串或字符串。不同病毒的病毒签名内容不同、位置不同。经过剖析病毒样本，掌握了病毒签名的内容和位置之后，可以在可疑程序的特定位置搜索病毒签名。如果找到了病毒签名，那么可以断定可疑程序中有病毒，是何种病毒。这种方法称为病毒签名检测方法。但是该方法必须预先知道病毒签名的内容和位置，要把握各种病毒的签名，必须解剖病毒。剖析一个病毒样本要花费很多时间，是一笔很大的开销。 (3)特征代码检测法
计算机病毒原理及防范技术(精简版)
《计算机病毒原理及防范技术》----秦志光张凤荔刘峭著 43.8万字 第1章计算机病毒概述 1.1.1计算机病毒的起源----第一种为科学幻想起源说，第二种为恶作剧，第三种为戏程序（70年代，贝尔实验室，Core War）, 第四种为软件商保护软件起源说。 1.计算机病毒的发展历史-----第一代病毒，传统的病毒， 第二代病毒（1989-1991年），混合型病毒（或“超级病毒”），采取了自我保护措施（如加密技术，反跟踪技术）；第三代病毒(1992-1995年)多态性病毒（自我变形病毒）首创者Mark Washburn-----“1260病毒”；最早的多态性的实战病毒----“黑夜复仇者”（Dark Avenger）的变种MutationDark Avenger ；1992年第一个多态性计算机病毒生成器MtE,第一个计算机病毒构造工具集（Virus Construction Sets）----“计算机病毒创建库”（Virus Create Library）, ”幽灵”病毒；第四代病毒（1996-至今），使用文件传输协议（FTP）进行传播的蠕虫病毒，破坏计算机硬件的CIH，远程控制工具“后门”（Bank Orifice）,”网络公共汽车”（NetBus）等。 2.计算机病毒的基本特征----1.程序性（利用计算机软、硬件所固有的弱点所编制的、具有特殊功能的程序），2、传染性，3、隐蔽性（兼容性、程序不可见性）4、潜伏性（“黑色星期五”，“上海一号”，CIH）,5、破坏性，6、可触发性，7、不可预见性，8、针对性，9、非授权可执行性，10、衍生性。 1.2.2.计算机病毒在网络环境下表现的特征------1.电子邮件成主要媒介（QQ，MSN等即时通讯软件，可移动存储设备，网页，网络主动传播，网络，“钓鱼”），2.与黑客技术相融合（“Nimda”,CodeRed,”求职信”），3.采取了诸多的自我保护机制（逃避、甚至主动抑制杀毒软件），4.采用压缩技术（压缩变形----特征码改变，压缩算法，“程序捆绑器”），5.影响面广，后果严重，6.病毒编写越来越简单，7.摆脱平台依赖性的“恶意网页”。 1.2.3.计算机病毒的生命周期----1.孕育期（程序设计，传播），2.潜伏感染期，3.发病期，4.发现期，5.消化期，6.消亡期。 第2章计算机病毒的工作机制 2.1.1计算机病毒的典型组成三大模块-----1.引导模块（将病毒引入计算机内存，为传染模块和表现模块设置相应的启动条件），2.感染模块（两大功能-----1.依据引导模块设置的传染条件，做判断；2启动传染功能）， 3.表现模块（两大功能----依据引导模块设置的触发条件，做判断；或者说表现条件判断子模块 2.1启动病毒，即表现功能实现子模块） 2.2.1计算机病毒的寄生方式-----1.替代法（寄生在磁盘引导扇区）；2.链接法（链接在正常程序的首部、尾部、或中间）。 2.2.2．计算病毒的引导过程-----1。驻留内存，2.获得系统控制权， 3.恢复系统功能。 2.4.1.计算机病毒的触发机制----1.日期，2.时间， 3.键盘 4.感染触发， 5.启动， 6.访问磁盘次数， 7.调用中断功能触发， 8.CPU型号/主板型号触发。 第三章计算机病毒的表现 3.1.计算机病毒发作前的表现----1.经常无故死机，操作系统无法正常启动，运行速度异常， 4.内存不足的错误， 5.打印、通信及主机接口发生异常， 6.无意中要求对软盘进行写操作， 7.以前能正常运行的应用程序经常死机或者出现非法错误， 8.系统文件的时、日期和大小发生变化， 9.宏病毒的表现现象，10、磁盘空间迅速减少，11.网络驱动器卷或者共享目录无法调用，陌生人发来的电子邮件，13.自动链接到一些陌生的网站。
LAMP技术在病毒检测中的应用
LAMP技术在病毒检测中的应用 发表时间：2013-01-31T16:04:31.107Z 来源：《医药前沿》2012年第31期供稿作者：吴昊1 孙立新2 叶松1 陆军1 杨庆贵2 [导读] LAMP（Loop-mediated Isothermal Amplification）环介导等温扩增技术，是近年来新兴的分子生物学检测技术 吴昊1 孙立新2 叶松1 陆军1 杨庆贵2 （1安徽理工大学医学院病原生物教研室安徽淮南 232001） （2江苏出入境检验检疫局医学媒介生物监测实验室江苏南京 210001） 【摘要】LAMP（Loop-mediated Isothermal Amplification）环介导等温扩增技术，是近年来新兴的分子生物学检测技术。因其特异性强、等温扩增，反应灵敏、操作简单、产物易检测，此项技术已被用于多种病原微生物的检测。本文综述了LAMP技术的原理以及其在几种常见病毒检测项目中的应用。 【关键词】 LAMP 技术原理病毒检测 【中图分类号】R319 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2012）31-0064-02 病原微生物带来的卫生问题时常出现，各种检测手段也不断更新。但由于非特异性扩增、反应操作程序复杂、及仪器昂贵等问题，很多方法在疾病爆发时筛查现场和监测站点的应用受到限制。 LAMP技术是由日本学者Notomi等[1]在2000年开发的一种新型快速的扩增技术，它能在一定温度范围内，通过一个步骤在短时间内对目的片段进行大量有效扩增。其具有高特异性、高效性、快速、低成本、易检测、结果易观察等特点，被广泛用于各种病原体检测和研究中并取得了一定的成就。 1 LAMP技术原理 1.1 扩增机制 LAMP技术利用能够特异性识别靶序列上的6个独立区域的两对内、外引物，及具有链置换活性的BstDNA聚合酶启动循环链置换反应来进行靶序列的扩增[1]。反应中，先由外部引物将内部引物扩增所需要的模板扩增出来，然后由内部引物对靶基因片段进行引导合成。由于内部引物所扩增出的片段含有与该引物5’端DNA片段的反相互补序列，因此这些反相互补序列之间形成茎-环结构，同时，另外一条内部引物与也可形成茎-环结构，片段的两端形成哑铃状结构，如此循环往复的过程最后形成花椰菜形状的茎-环结构，可在15min-60min之内实现109-1010倍的括增[2]。 1.2 结果观察 扩增后可以通过琼脂糖电泳后染色进行观察，更可通过扩增衍生物焦磷酸镁进行观察：阳性的样本会出现白色浑浊沉淀，而阴性则无此现象。同时也可以应用SYBR Green I染色，呈现绿色的为阳性，橙色的为阴性[2]。 2 病毒检测 2.1 日本脑炎病毒 日本脑炎又称乙脑，是由日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus)引起的一种常见的蚊媒传染病。JEV的检测方式很多，如血清学，病毒分离等，但耗时繁琐、敏感性特异性都较低。TORINIWA等[3]利用LAMP技术原理建立了快速Real-time RT-LAMP方法，该方法通过扩增JEV病毒的包膜（E）蛋白基因来定量检测JEV病毒，可将检测用时缩短至1h，检测下限为1PFU并与常规RT-PCR具有相似的敏感性。且不需特殊设备、操作方便，有利于推广其在基层的应用。 2.2 西尼罗河病毒 西尼罗河病毒（West Nile Virus，WNV）是引起西尼罗河热的病原体，近年来在世界部分地区的流行并造成了重大的损失。PARIDA 等[4]创立了一种一步法来检测WNV，通过凝胶电泳或者浊度仪来对扩增结果进行判定。结果显示其敏感性比常规RT-PCR高10倍。 2.3 甲型流感病毒 甲型流感病毒（AIV)具有高度传染性，致病性，以及致死率。对甲流病毒的检测方法主要为病毒分离，抗原和抗体检测以及PCR方法，但是过程费时繁琐。POON等[5]设计了特异性引物，利用LAMP技术成功的检测了H1-H3型的AIV，与PCR方法比较阳性符合率为100%，敏感度可达传统方法的100倍。LAMP技术由于其检测的简便快速且高度敏感，可更多的用于现场检测。 2.4 禽流感病毒的检测 禽流感是由禽类A型流感病毒引起的一种急性、高接触性的传染病，可带来重大损失。禽流感检测方法有各类血清学试验以及免疫学实验等。这些方法都存在着如试验周期较长，操作繁琐，检测材料受限制等不足。国内李启明等[8]对H5N1亚型禽流感病毒进行了RT-LAMP检测，验证和分析后证明其特异性与常规方法一致，并且其灵敏度可达到10个拷贝。侯佳蕾等[6]根据H5亚型禽流感病毒血凝素基因序列设计了引物，并建立了一种针对性的检测诊断方法。结果表明，该方法的灵敏度高于一步RT-PCR法。 2.5 口蹄疫病毒的检测 口蹄疫是由口蹄疫病毒（FMDV）引起的一种急性，热性，高度接触性传染病，主要侵害偶蹄兽并给经济带来极大威胁。血清学检测不足以确定整群动物是否带毒而PCR方法由于需要专门的仪器。吴绍强等[7]以灭活的亚洲I型口蹄疫细胞培养病毒为材料，设计引物并建立了口蹄疫病毒RT-LAMP检测法，为口蹄疫现场快速检测提供了有效的方法。 2.6 丙型肝炎病毒（HCV）的检测 HCV是一种常见的病毒，传播途径为母婴传播和血液传播。目前最常用的方法是ELLSA法检测抗原抗体或PCR法。但是由病毒的抗原量极少，所以常规免疫学方法常无法检测出病毒。PCR方法操作复杂繁琐，特异性较低。李启明等[8]利用LAMP技术的原理，利用特殊引物进行了LAMP扩增，成功的检测HCV基因，实验结果阳性符合率高达98%。这一成果证实了LAMP技术的优势。 2.7 严重急性呼吸窘迫综合征冠状病毒（SARS-CoV）的检测 SARS带来的阴影提醒人们对此类病毒检测的重要性。目前临床上对其检测的方法主要有2种。一是检测SARS-CoV抗体，虽然此法灵敏度较高，但在发病初期不能检出。二是Real-time PCR，这种方法可在发病早期检测出SARS-CoV，但是其需要熟练操作技术以及高成本仪器，不适于常规筛查。POON等[9]利用改良LAMP法对人群的鼻咽分泌物样本进行了检测。结果显示SARS病人中的SARS-CoV检出率为
浅析马铃薯病毒检测技术
马铃薯是我国重要的粮食作物和经济作物,马铃薯在定西市种植也有200多年的历史,在保障全市粮食有效供给和繁荣城乡经济中发挥了十分重要的作用,已由过去的“救命粮”变成了现在的“致富薯”,是定西最具生产潜力、市场优势和开发前景的特色农产品,也是农业增效、农民增收的第一大优势产业。近年来,定西市委、市政府对马铃薯产业高度重视,作为全市农业和农村经济发展的战略性主导产业来扶持,制定了“全市马铃薯产业发展规划”,省上也制定下发了“关于进一步加快发展马铃薯产业的意见”,提出了工作思路和具体目标,促进了本市马铃薯产业的快速发展。2013年全市种植面积达到319.84万亩,总产量506万t,是全国三大马铃薯集中产区之一。但是由于定西经济条件落后,全市的马铃薯种薯的病毒检测并未随着种植面积的扩大而提高和普及,以至于马铃薯各种病每年在生长期发生,严重影响了全市马铃薯的产量和质量。马铃薯病毒已成为马铃薯生产中的重要制约因素,急需大力提高马铃薯种薯的病毒检测,为马铃薯产业的持续快速发展把好第一增长关。 马铃薯病毒检测包括：基础试管苗、马铃薯原原种、大田种薯的检测。严格的检测大大提高了种薯合格率,而种植合格的种薯,每亩可以提高产量500kg 以上。马铃薯的病毒有6种,分别是马铃薯X病毒（PVX）、马铃薯Y病毒（PVY）、马铃薯S病毒（PVS）、马铃薯A病毒（PVA）、马铃薯M病毒（PVM）、马铃薯卷叶病毒（PLRV）。目前最常用的马铃薯病毒检测是用双抗体夹心酶免疫吸附测定法（DAS-ELISA）检测,是用于快速、灵敏、准确的血清学技术,是国际通用的检测方法之一。下面就本市引进的“马铃薯病毒DAS-ELISA检测”全套生产技术进行浅述。 1马铃薯病毒的概况 1.1马铃薯X病毒（PVX） 也称普通花叶病毒,是一种长520～550nm的线状病毒,有时在电镜下能看到病毒颗粒的中心孔。在病毒外壳由亚基形成时,可看到它的横纹,这一点是与马铃薯重花叶病毒在形态结构上的主要区别。一般减产5%～10%,症状是叶片从轻型花叶到叶片有较轻的皱缩。马铃薯X病毒靠汁液传播,也是传播最广泛的一种病毒。 1.2马铃薯Y病毒（PVY） 也称重花叶病毒,是马铃薯第二个重要病毒性病害,是一种长680～900nm的线状病毒,在电镜下找不到它的中心孔和外壳蛋白亚基的横纹,它比PVX更细一些、更长一些。通过感染的块茎长期存在并由蚜虫非持续性地传播,产量损失可达80%。症状随着病毒株系、马铃薯品种及环境条件变化很大。1.3马铃薯A病毒（PVA） 又称轻花叶病毒,在许多方面类似于马铃薯Y病毒。在某些品种中出现时,一般比马铃薯Y病毒轻,产量损失可达40%。马铃薯A病毒引起花叶(有时很严重),同时也发生脉缩和卷曲,叶片可能出现闪光。 1.4马铃薯S病毒（PVS） 也称潜隐性花叶病毒,感病块茎变小,一般减产 浅析马铃薯病毒检测技术 景彩艳 （甘肃省定西市农产品质量安全监督管理站定西743000） 摘要：随着科学技术的不断发展,马铃薯病毒检测技术在日益的完善,DAS-ELISA法已经成为马 铃薯病毒检测的常规方法。容易侵染马铃薯的病毒类型主要有6种,分别是马铃薯的PVX、PVY、PLRV、PVS、PVM、PVA病毒。马铃薯在生长的过程中,因受到各种不同病害的侵染,容易造成减产 和退化。血清学技术是马铃薯病毒检测的主要手段。 关键词：马铃薯病毒；血清学技术；双抗体夹心酶联免疫吸附法 215 --
病毒鉴定的方法有哪些
病毒鉴定的方法有哪些？ 从培养的细胞中分离病毒，然后采用免疫荧光和分子生物学技术进行病毒核酸检测已被成功地用于病毒的鉴定。目前最常用的病毒定量检测方法有以下三大类：用于病毒感染力检测的技术，如病毒空斑形成试验，半数组织培养感染剂量TCID50测定和免疫荧光等；病毒核酸和病毒蛋白检测技术，如实时定量多聚酶链反应（qPCR），免疫印迹，免疫沉淀，酶联免疫吸附测定（ELISA）和血凝试验等；还有就是那些直接对病毒颗粒进行计数的方法，如流式细胞分析或透射电镜技术。 病毒检测方法的局限性 病毒鉴定方法 1.培养细胞的显微学观察 材料和仪器 细胞生长培养基：含10% FBS(胎牛血清), 4-6 mM Glutamine（谷氨酰胺）的高葡萄糖DMEM，若有需要可加入青霉素，链霉素，庆大霉素，两性霉素等 维持培养基：上述新鲜的细胞培养基，但血清FBS浓度减少至为2% 宿主细胞：铺满单层细胞的8孔培养腔室玻片（chamber slides） PBS磷酸缓冲液 Bouin's固定液 吉姆萨（Giemsa）缓冲液 吉姆萨（Giemsa）染色液 丙酮，丙酮：二甲苯（2:1），丙酮：二甲苯（1:2），二甲苯 中性树胶 移液枪头(10 到100 微升) 移液管 生物安全柜（超净台） 二氧化碳培养箱 倒置显微镜
实验方案 接种宿主细胞至Chamber Slides：选择合适的细胞接种密度（比如8-孔Chamber Slides，接种30,000细胞/孔），培养基为细胞生长培养基（10%FBS-DMEM）。轻轻地前后左右摇晃chamber slides使细胞分布均匀。将细胞置培养箱培养过夜，第二天，显微镜下观察细胞确认细胞是否分布均匀并达到80%以上的融合度。 制备不同稀释度的病毒液：标记6支无菌离心管，第1管加入990 μl细胞生长培养基，剩下5管加入900μl细胞生长培养基。按以下方法进行梯度稀释：在第1管中加入10 μl 病毒原液（稀释度1:100）充分混匀，然后从第1管吸100 μl至第2管中混匀，依次类推，进行10倍梯度稀释。管1至管6的稀释度分别为10-3 到10-7。 感染细胞：吸去培养孔中的培养液，每孔加入0.5 mL维持培养液（2%FBS-DMEM），再加入100 μl不同稀释度（10-2 至10-7稀释）的病毒液至其中一孔，留一孔不加作为空白对照。将细胞置二氧化碳培养箱37oC 或34oC 培养1-4周，追踪观察致细胞病变效应（CPE）发生情况。 吉姆萨染色：一旦观察到细胞病变效应，轻轻地用PBS将细胞洗3次，每次5min，然后加入Bouin's固定液固定10 min。用吉姆萨缓冲液洗3次，然和加入Giemsa染液染色1 h，再用吉姆萨缓冲液清洗后依次用丙酮处理15s，2:1的丙酮-二甲苯处理30s，1:2的丙酮-二甲苯处理30s，最后用二甲苯处理10 min紧接着用中性树胶封片。显微镜下观察CPE，包涵体，细胞融合及病毒空泡形成情况。病毒感染细胞后形成的CPE图片范例可以在很多图谱，网站和博客上找到，例如ASM Microbe Library 2.免疫荧光(IF)检测方法 材料和仪器 细胞生长培养基：含10%FBS(胎牛血清), 4-6mM Glutamine（谷氨酰胺）的高葡萄糖DMEM，若有需要可加入青霉素，链霉素，庆大霉素，两性霉素等 宿主细胞：铺满单层细胞的8孔培养腔室玻片（chamber slides） PBS磷酸缓冲液 一抗 FITC标记的二抗 细胞核染料DAPI 5-4 %多聚甲醛（PFA，pH7.4），或者甲醇 移液枪头(10 到100 微升) 离心管 生物安全柜（超净台） 二氧化碳培养箱 荧光显微镜 实验方案 接种宿主细胞至Chamber Slides：选择合适的细胞接种密度（比如8-孔Chamber Slides，接种30,000细胞/孔），培养基为细胞生长培养基（10%FBS-DMEM）。轻轻地前后左右摇晃chamber slides使细胞分布均匀。将细胞置培养箱培养过夜，第二天，显微镜下观察细胞确认细胞是否分布均匀并达到80%以上的融合度。 病毒感染：每孔细胞加0.1 mL病毒储存液，留一孔不加作为阴性对照。将细胞放回CO2 培养箱，37°C 或34°C 培养48h。