分离纯化蛋白质的方法及原理-推荐下载

（2）利用溶解度差别

影响蛋白质溶解度的外部因素有：1、溶液的pH；2、离子强度；3、介电常数；4、温度。但在同一的特定外部条件下，不同蛋白质具有不同的溶解度。

1、等电点沉淀：原理：蛋白质处于等电点时，其净电荷为零，由于相邻蛋白质分子之间没有静电斥力而趋于聚集

沉淀。因此在其他条件相同时，他的溶解度达到最低点。在等电点之上或者之下时，蛋白质分子携带同种符号的净

电荷而互相排斥，阻止了单个分子聚集成沉淀，因此溶解度较大。不同蛋白质具有不同的等电点，利用蛋白质在等

电点时的溶解度最低的原理，可以把蛋白质混合物分开。当pH被调到蛋白质混合物中其中一种蛋白质的等电点时，这种蛋白质大部分和全部被沉淀下来，那些等电点高于或低于该pH的蛋白质则仍留在溶液中。这样沉淀出来的蛋

白质保持着天然的构象，能重新溶解于适当的pH和一定浓度的盐溶液中。

5、盐析与盐溶：原理：低浓度时，中性盐可以增加蛋白质溶解度这种现象称为盐溶.盐溶作用主要是由于蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电层使蛋白质分子彼此排斥，而蛋白质与水分子之间的相互作用却加强，因而溶解度

增高。球蛋白溶液在透析过程中往往沉淀析出，这就是因为透析除去了盐类离子，使蛋白质分子之间的相互吸引增加，引起蛋白质分子的凝集并沉淀。当溶液的离子强度增加到一定程度时，蛋白质溶解程度开始下降。当离子强度

增加到足够高时，例如饱和或半饱和程度，很多蛋白质可以从水中沉淀出来，这种现象称为盐析。盐析作用主要是

由于大量中性盐的加入使水的活度降低，原来溶液中的大部分甚至全部的自由水转变为盐离子的水化水。此时那些

被迫与蛋白质表面的疏水集团接触并掩盖他们的水分子成为下一步最自由的可利用的水分子，因此被移去以溶剂化

盐离子，留下暴露出来的疏水基团。蛋白质疏水表面进一步暴露，由于疏水作用蛋白质聚集而沉淀。

盐析沉淀的蛋白质保持着他的天然构象，能再溶解。盐析的中性盐以硫酸铵为最佳，在水中的溶解度很高，而溶

解度的温度系数较低。

3、有机溶剂分级分离法：与水互溶的有机溶剂（甲醇、乙醇和丙酮等）能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。在

室温下有机溶剂会引起蛋白质变性，如果预先将有机溶剂冷却到-40°C以下，然后在不断搅拌下逐滴加入有机溶剂，以防局部浓度过高，那么变性可以得到很大程度缓解。蛋白质在有机溶剂中的溶解度也随温度、pH和离子强度而变化。在一定温度、pH和离子强度条件下，引起蛋白质沉淀的有机溶剂的浓度不同，因此控制有机溶剂浓度也可以分离纯化蛋白质。

有机溶剂引起蛋白质沉淀的主要原因之一是改变了介质的介电常数。有机溶剂的加入使水溶液的介电常数降低。介

电常数的降低将增加两个相反电荷之间的吸引力。蛋白质分子表面可解离基团的离子化程度减弱，水化程度降低，

因此促进了蛋白质分子的聚集和沉淀。

水溶性非离子聚合物如聚乙二醇与蛋白质亲水集团发生相互作用并在空间上阻碍了蛋白质与水相接近。蛋白质在聚

乙二醇中的溶解度明显的依赖于聚乙二醇的分子量。

4、温度对蛋白质溶解度的影响：在一定温度范围内，约0~40℃之间，大部分球状蛋白的溶解度随温度升高而增加，在40~50℃以上，大部分蛋白质变得不稳定并开始变性，一般在中性pH介质中即失去溶解力。大多数蛋白质在低温下比较稳定，因此蛋白质的分级分离操作一般都在0℃或更低的温度下进行。

（三）根据电荷不同

根据蛋白质的电荷不同即酸碱性质不同分离蛋白质混合物的方法有电泳和离子交换层析两类。

1、电泳：在外电场的作用下，带点颗粒将向着与其电性相反的电极移动，这种现象称为电泳。电泳技术可用于氨

基酸、肽、蛋白质和核苷酸等生物分子的分析分离和制备。

区带电泳是由于在支持物上电泳蛋白质混合物被分离为若干区带。

电泳前用缓冲液浸润薄膜或滤纸等支持物或用缓冲液直接配置成凝胶，将待分离的蛋白质样品加在它的一端或中央，支持物的两端与电极连接，通电电泳。电泳完毕，各个组分分布在不同的区域，用显色剂（蛋白质可用考马斯亮蓝

或氨基黑等染色）显色后可以显示出各个组分。

氨基酸混合物特别是寡聚核苷酸混合物一次电泳往往不能完全分开。这种情况可以将第一次电泳分开的斑点通过支

持介质间的接触印迹转移到第二个支持介质上，旋转90°，进行第二次电泳。这种方法称为双向电泳。

2、聚丙烯酰胺凝胶电泳：以聚丙烯酰胺凝胶为支持物，一般制成凝胶柱或凝胶板，凝胶是由相连的两部分组成

（小的部分是浓缩胶，大的部分为分离胶），这两部分凝胶的浓度、缓冲液组分和离子强度、pH以及电场强度都是

不同的，即不连续性。电泳时样品首先在不连续的两相间积聚浓缩而成很薄的起始区带，然后再进行电泳分离。

电泳有三种物理效应：1、样品的浓度效应；2、凝胶对被分离分子的筛选效应；3、一般电泳分离的电荷效应。

3、毛细管电泳：高效毛细管电泳、毛细管区带电泳、自由溶液毛细管电泳、毛细管电泳，可分离氨基酸、肽、蛋

白质、DNA片段和核酸以及多种小分子，也可用于手性化合物的分离。

毛细管减少了由于热效应产生的许多问题，可以提高热散失，有助于消除由于热引起的扩散增加而造成的对流和区

带变宽，因此管中不需要加入稳定介质即可进行自由流动电泳。

电泳迁移引起溶液中荷电分子向相反电荷的电极移动，虽然被分析样品因电泳迁移而分离，然而电渗作用使溶液向

负极流动，而且电渗电流很强，其速度一般比样品的电泳速率答，因此所有的正、负离子和中性分子都被推向负极。对荷正电分子来说，电泳迁移和电渗流效果是一致的，而且移动最快，最先达到负极。随着被分离的分子接近负极，它们都将通过紫外检测器并把信号传递给记录仪。所得结果是被分离组分的紫外吸收对时间的峰谱。

4、等点聚焦（IEF）分离蛋白质混合物是在具有pH梯度的介质（如浓蔗糖溶液）中进行。在外电场作用下各种蛋

白质将移向并聚焦在等于其等电点的梯度处，并形成一个很窄的区带。

pH梯度制作一般利用两性电解质，它是脂肪族多胺和多羧类的同系物，它们具有相近但不相同的解离常数和等电点。在外电场作用下，自然形成pH梯度。

5、层析聚焦：根据蛋白质的等电点差异分离蛋白质混合物的柱层析方法。

原理：当用特种缓冲液滴洗填充在柱中的特种多缓冲交换剂时，就会在层析柱中自上而下自动的建立起连续的pH

梯度；同时加在柱上端的蛋白质样品也随多缓冲液的展开按各自的等电点聚焦在相应的pH区段。并在展开过程中

随pH梯度下移，蛋白质混合物的各组分先后从柱中流出，达到分离纯化的目的。

6、离子交换层析：

纤维素离子交换剂：适用于大分子的分离，具有松散的亲水性网状结构。有较大的表面积，大分子可以自由通过。

洗脱条件温和，蛋白质回收率高

交联葡聚糖离子交换剂：即可以根据分子的净电荷数量，又可以根据分子的大小（分子筛效应）进行分离。

蛋白质对离子交换剂的结合力取决于彼此之间相反电荷基团的静电吸引，而这又和溶液的pH有关，因为pH决定离

子交换剂和蛋白质的电离程度。盐浓度的微小变化就会直接影响它对蛋白质电荷吸附容量。因此蛋白质混合物的分

离可以由改变溶液中的盐离子强度和pH完成，对离子交换剂结合力小的蛋白质先从层析柱中洗脱出来。

层析洗脱，采用保持洗脱液成分一直不变的方式洗脱，也可以采用改变洗脱的盐浓度或（和）pH的方式洗脱。后一种方式又分为：跳跃式洗脱和渐进式的连续改变。采取前一种方式洗脱称为分段洗脱，后一种方式为梯度洗脱。梯

度洗脱一般分离效果好，分辨效率高，特别是使用交换容量小，对盐浓度敏感的离子交换机，多采用梯度洗脱。

洗脱时，必须控制洗脱体积（与柱床体积相比）和洗脱液的盐离子浓度和pH。洗脱液体积和盐浓度变化形式（梯度形式）直接影响层析的分辨率。

通常采用的梯度形式有线性（形），凸形，凹形和复合型四种。

7、SDS-PAGE 全称十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳

原理：通过加热和SDS可以使蛋白质变性，多亚基的蛋白质也解离为单亚基，处理后的样品中肽链是处于无二

硫键连接的，分离的状态。电泳时SDS-蛋白质复合物在凝胶中的迁移率不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而主要取决于蛋白质分子量。所以SDS-PAGE常用来分析蛋白质的纯度和大致测定蛋白质的分子量。

8、离子交换层析：原理：氨基酸分离常用阳离子交换树脂，树脂被处理成钠型，将混合氨基酸上柱，氨基酸主要

以阳离子形式存在，在树脂上与钠离子发生交换，而被挂在树脂上。

（4）利用选择性吸附剂的纯化方法

某些称为吸附剂的固体物质具有吸附能力，能够将其他种类的分子吸附在自己的表面，吸附力的强弱因被吸附物质

的性质而异。吸附过程涉及范德华力相互作用和请见氢键非离子吸引。吸附层析就是利用待纯化的分子和杂质分子

与吸附剂之间的吸附能力和解吸性质不同而达到分离目的的。典型的吸附剂有硅胶、氧化铝、活性炭等。硅胶适用

于分离碱性物质，氧化铝适用于分离酸性物质，活性炭是一种非极性吸附剂。一般选择其极性与待分离的混合物中

极性最大组分的极性相当的洗脱液。因此，如果待分离物含有羟基，则选择醇类，含羰基则选用丙酮或脂类。烃类

如己烷、庚烷和甲苯则用于非极性物质的分离。吸附层析可采用薄层或柱方式进行。

1、羟磷灰石层析：用于分离蛋白质或核酸。最重要的用途之一就是吧单链DNA和双链DNA分开。羟磷灰石对双链DNA亲和力很大，一直用羟磷灰石层析能从含RNA和蛋白质的细胞提取液中选择性的出去DNA。

2、疏水作用层析：根据蛋白质表面的疏水性差别发展起来的一种纯化技术。这种差别也用于盐分级分离。连在支

持介质上的疏水集团与蛋白质表面暴露出来的集团结合。

由于疏水作用层析要求盐析化合物如硫酸铵的存在以促进蛋白质分子表面的疏水区暴露。为使吸附达到最大，可将蛋白质样品的pH调至等电点附近。洗脱方式包括：逐渐降低离子强度或增加pH的洗脱液，或使用对固定相的亲和力以对蛋白质更强的置换剂进行置换洗脱。但是某些洗脱条件可引起蛋白质变性。

（5）利用对配体的特异生物学亲和力的纯化方法

亲和层析：利用蛋白质分子对其配体分子进行特有的识别能力，也即生物学亲和力，建立起来的一种有效的纯化方法。只需要进行一步的处理即可将某种所需蛋白质从复杂的混合物中分离出来，并且纯度相当高。

基本原理：把待纯化的某一蛋白质的特意配体通过适当的化学反应共价地连接到像琼脂糖凝胶一类的载体表面的功能基上。一般在配体和多糖载体之间插入一段长度适当的连接臂或称间隔臂，使配体与凝胶之间保持足够的距离，不致因载体表面的位阻妨碍待分离的分子与配体结合。

当蛋白质混合物加入填有亲和介质的层析柱时，待纯化的某一蛋白质则被吸附在含配体的琼脂糖颗粒表面上而其他的蛋白质因对该配体无特异的结合部位而不被吸附，他们通过洗涤即可除去，被特异结合的蛋白质可用含游离的相应配体溶液把它从柱上洗脱下来。

凝集素亲和层析、免疫亲和层析、金属螯合层析、染料配体层析和共价层析等属于亲和层析。

（6）高效液相层析和快速蛋白质液相层析

高效液相层析（HPLC）：载体的颗粒愈小，则分辨率愈高，但是洗脱液的流速也愈慢。

反相HPLC广泛用于分离非极性化合物。固定相是非极性的，而流动相是相对极性的。固定相与被分离物只可能有疏水作用，流动相组成的小小变化，例如加入盐、改变pH或有机溶剂量就能成功的影响分离特性。

快速蛋白质液相层析（FPLC）专门用于蛋白质分离，是基于反相、亲和、排阻、疏水作用、离子交换和等点聚焦层析，能用于分离微量样品。

蛋白质含量的测定：凯氏定氮法、双缩脲法、Folin—酚试剂法、紫外吸收法、染料结合法和胶体金测定法。Folin—酚试剂能定量的与亚铜离子反应，亚铜离子是由蛋白质的易氧化成分还原铜离子而产生的。

BCA法，BCA试剂在碱性溶液中与亚铜离子反应生成紫色复合物，该反应比Folin—酚试剂的反应更强。

紫外吸收法：280nm 芳香族化合物的光学效应

考马斯亮蓝结合法：灵敏度高，检测为微克

胶体金测定法：灵敏度最高，胶体金是一种带负电荷的疏水胶体，呈洋红色，遇蛋白质转变为蓝色，颜色改变与蛋白质有定量关系，因此可用于蛋白质的定量。

测定蛋白质混合物中某一特定蛋白质的含量通常要用具有高度特异性的生物学方法。具有酶或激素性质的蛋白质可以利用他们的酶活性或激素活性来测定含量。

大多数蛋白质在注入适当动物的血流中时，会产生抗体。利用抗体抗原反应，也可以测定某一特定蛋白质的含量。蛋白质纯度检测：电泳、沉降、HPLC和溶解度分析

电泳分析有等点聚焦、聚丙烯酰胺凝胶电泳、SDS-PAGE、毛细管电泳。纯的蛋白质在一系列不同的pH条件下进行电泳时，都将以单一的速度移动，它的电泳图谱只呈现一个条带。

HPLC常用于多肽、蛋白质纯度的鉴定。纯蛋白质样品在HPLC的洗脱图谱上呈现出单一的对称峰。

纯的蛋白质在一定的溶剂系统中具有恒定的溶解度，而不依赖与存在于溶液中未溶解固体的数量。用恒浓度法鉴定蛋白质纯度在理论上是严格的，以加入的固体蛋白质对溶解的蛋白质作图。如果蛋白质制品是纯的，那么溶解度曲线只呈现一个折点，在这个折点以前，直线的斜率为1、之后为0。不纯的蛋白质的溶解度曲线常常呈现2个或者2个以上的折点。

N-末端分析也用于鉴定纯度，因为均一的单链蛋白质样品中，N端残基只可能有一种氨基酸。

必须指出，采用任何单独一种方法鉴定所得结果只能作为蛋白质均一性的必要条件而不是充分条件。很少几个蛋白质能够全部满足上面的严格要求。

蛋白质分离纯化的步骤

蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤： （一）材料的预处理及细胞破碎 分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法有： 1. 机械破碎法 这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。 2. 渗透破碎法 这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。 3. 反复冻融法 生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。这种方法简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。 4. 超声波法 使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。 5. 酶法 如用溶菌酶破坏微生物细胞等。 （二）蛋白质的抽提 通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠、tritonX-100 等），使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。（三）蛋白质粗制品的获得选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。常用的有下列几种方法： 1.等电点沉淀法不同蛋白质的等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分离。 2.盐析法 不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同，所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质，并能再度溶解而不变性。 3.有机溶剂沉淀法 中性有机溶剂如乙醇、丙酮，它们的介电常数比水低。能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低，进而从溶液中沉淀出来，因此可用来沉淀蛋白质。此外，有机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层，促使蛋白质分子变得不稳定而析出。由于有机溶剂会使蛋白质变性，使用该法时，要注意在低温下操作，选择合适的有机溶剂浓度。 （四）样品的进一步分离纯化

微生物菌种的分离和纯化方法

从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。在分子生物学的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”，防止其他微生物的混入。 1、用固体培养基分离和纯化 单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体，称为菌落。当固体培养基表面众多菌落连成一片时，便成为菌苔。不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征，可以成为对该微生物进行分类、鉴定的重要依据。大多数细菌、酵母菌、以及许多真菌和单细胞藻类能在固体培养基上形成孤立的菌落，采用适宜的平板分离法很容易得到纯培养。所谓平板，即培养平板的简称，它是指固体培养基倒入无菌平皿，冷却凝固后，盛固体培养基的平皿。这方法包括将单个微生物分离和固定在固体培养基表面或里面。固体培养基用琼脂或其它凝胶物质固化的培养基，每个孤立的活微生物体生长、繁殖形成菌落，形成的菌落便于移植。最常用的分离、培养微生物的固体培养基是琼脂固体培养基平板。这种由Kock建立的采用平板分离微生物纯培养的技术简便易行，100多年来一直是各种菌种分离的最常用手段。1.1 稀释倒平板法 首先把微生物悬液作一系列的稀释（如1:10、1:100、1:1000、1:10000），然后分别取不同稀释液少许，与已熔化并冷却至50℃左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平板，保温培养一定时间即可出现菌落。如果稀释得当，在平板表面或琼脂培养基中就可出现分散的单个菌落，这个菌落可能就是由一个细菌细胞繁殖形成的。随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。 1.2 涂布平板法 因为将微生物悬液先加到较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究中常用的纯种分离方法是涂布平板法。其做法是先将已熔化的培养基倒入无菌平皿，

酶的分离纯化方法介绍

酶的分离纯化方法介绍 酶的分离纯化一般包括三个基本步骤：即抽提、纯化、结晶或制剂。首先将所需的酶从原料中引入溶液，此时不可避免地夹带着一些杂质，然后再将此酶从溶液中选择性地分离出来，或者从此溶液中选择性地除去杂质，然后制成纯化的酶。 关键词：酶抽提纯化结晶制剂细胞破碎cell disruption 盐析亲和沉淀有机溶剂沉淀 生物细胞产生的酶有两类： 一类由细胞内产生后分泌到细胞外进行作用的酶，称为细胞外酶。这类酶大都是水解酶，如酶法生产葡萄糖所用的两种淀粉酶，就是由枯草杆菌和根酶发酵过程中分泌的。这类酶一般含量较高，容易得到； 另一类酶在细胞内产生后并不分泌到细胞外，而在细胞内起催化作用，称为细胞内酶，如柠檬酸、肌苷酸、味精的发酵生产所进行的一系列化学反应，就是在多种酶催化下在细胞内进行的，在类酶在细胞内往往与细胞结构结合，有一定的分布区域，催化的反应具有一定的顺序性，使许多反应能有条不紊地进行。酶的来源多为生物细胞。生物细胞内产生的总的酶量虽然是很高的，但每一种酶的含量却很低，如胰脏中期消化作用的水解酶种类很多，但各种酶的含量却差别很大。 因此，在提取某一种酶时，首先应当根据需要，选择含此酶最丰富的材料，如胰脏是提取胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、淀粉酶和脂酶的好材料。由于从动物内脏或植物果实中提取酶制剂受到原料的限制，如不能综合利用，成本又很大。目前工业上大多采用培养微生物的方法来获得大量的酶制剂。从微生物中来生产酶制剂的优点有很多，既不受气候地理条件限制，而且动植物体内酶大都可以在微生物中找到，微生物繁殖快，产酶量又丰富，还可以通过选育菌种来提高产量，用廉价原料可以大量生产。 由于在生物组织中，除了我们所需要的某一种酶之外，往往还有许多其它酶和一般蛋白质以及其他杂质，因此为制取某酶制剂时，必须经过分纯化的手续。 酶是具有催化活性的蛋白质，蛋白质很容易变性，所以在酶的提纯过程中应避免用强酸强碱，保持在较低的温度下操作。在提纯的过程中通过测定酶的催化活性可以比较容易跟踪酶在分离提纯过程中的去向。酶的催化活性又可以作为选择分离纯化方法和操作条件的指标，在整个酶的分离纯化过程中的每一步骤，始终要测定酶的总活力和比活力，这样才能知道经过某一步骤回收到多少酶，纯度提高了多少，从而决定着一步骤的取舍。 酶的分离纯化一般包括三个基本步骤：即抽提、纯化、结晶或制剂。首先将所需的酶从原料中引入溶液，此时不可避免地夹带着一些杂质，然后再将此酶从溶液中选择性地分离出来，或者从此溶液中选择性地除去杂质，然后制成纯化的酶制剂。下面就酶的分离纯化的常用方法作一综合介绍： 一、预处理及固液分离技术 1.细胞破碎（cell disruption） 高压均质器法：此法可用于破碎酵母菌、大肠菌、假单胞菌、杆菌甚至黑曲霉菌。将细胞悬浮液在高压下通入一个孔径可调的排放孔中，菌体从高压环境转到低压环境，细胞就容易破碎。菌悬液一次通过均质器的细胞破碎率在12%-67%。细胞破碎率与细胞的种类有关。

磁珠法分离纯化DNA原理及其步骤

磁珠法分离纯化DNA原理及其步骤 日期：2012-05-22 来源：互联网 标签：核酸纯化核酸分离磁珠法纯化DNA 摘要: 磁珠法纯化DNA主要是利用利息交换吸附材料吸附核酸，从而将核酸和蛋白质等其细胞中其他物质分离。本文主要概述了磁珠法纯化DNA原理、核酸分离与纯化的原则、核酸分离与纯化的步骤。 欢度大力神杯之夏，参与BRAND竞猜活动，获赠BRAND产品！ GeneCopoeia：qPCR mix免费试用体验活动开始！ 磁珠法纯化DNA主要是利用利息交换吸附材料吸附核酸，从而将核酸和蛋白质等其细胞中其他物质分离。本文主要概述了磁珠法纯化DNA原理、核酸分离与纯化的原则、核酸分离与纯化的步骤。 磁珠法纯化DNA原理 磁珠法核酸纯化技术采用了纳米级磁珠微珠，这种磁珠微珠的表面标记了一种官能团，能同核酸发生吸附反应。硅磁(Magnetic Silica Particle)就是指磁珠微珠表面包裹一层硅材料，来吸附核酸，其纯化原理类型于玻璃奶的纯化方式。离心磁珠是指磁珠微珠表面包裹了一层可发生离心交换的材料(如DEAE，COOH)等，从而达到吸附核酸目的。不同性质的磁珠微珠所对应的纯化原理是不一致。使用磁珠法来纯化核酸的最大优点就是自动化。磁珠在磁场条件下可以发生聚集或分散，从而可彻底摆脱离心等所需的手工操作流程。Omega拥有全面的磁珠法核酸分离试剂盒，基于这种技术的试剂盒，名称前都有’Mag-Bind’。 核酸分离与纯化的原则 核酸在细胞中总是与各种蛋白质结合在一起的。核酸的分离主要是指将核酸与蛋白质、多糖、脂肪等生物大分子物质分开。在分离核酸时应遵循以下原则:保证核酸分子一级结构的完整性：排除其他分子污染。 核酸分离与纯化的步骤 大多数核酸分离与纯化的方法一般都包括了细胞裂解、酶处理、核酸与其他生物大分子物质分离、核酸纯化等几个主要步骤。每一步骤又可由多种不同的方法单独或联合实现。 1. 细胞裂解:核酸必须从细胞或其他生物物质中释放出来。细胞裂解可通过机械作用、化学作用、酶作用等方法实现。 (1) 机械作用:包括低渗裂解、超声裂解、微波裂解、冻融裂解和颗粒破碎等物理裂解方法。这些方法用机械力使细胞破碎,但机械力也可引起核酸链的断裂,因而不适用于高分子量长链核酸的分离。有报道超声裂解法提取的核酸片段长度从< 500bp ～> 20kb 之间,而颗粒匀浆法提取的核酸一般< 10kb。

蛋白质纯化的方法选择

蛋白质纯化的方法选择 随着分子生物学的发展，越来越多的科研人员熟练掌握了分子生物学的各种试验技术，并研制成套试剂盒，使基因克隆表达变得越来越容易。但分子生物学的上游工作往往并非是最终目的，分子克隆与表达的关键是要拿到纯的表达产物，以研究其生物学作用，或者大量生产出可用于疾病治疗的生物制品。相对与上游工作来说，分子克隆的下游工作显得更难，蛋白纯化工作非常复杂，除了要保证纯度外，蛋白产品还必须保持其生物学活性。纯化工艺必须能够每次都能产生相同数量和质量的蛋白，重复性良好。这就要求应用适应性非常强的方法而不是用能得到纯蛋白的最好方法去纯化蛋白。在实验室条件下的好方法却可能在大规模生产应用中失败，因为后者要求规模化，且在每日的应用中要有很好的重复性。本文综述了蛋白质纯化的基本原则和各种蛋白纯化技术的原理、优点及局限性，以期对蛋白纯化的方法选择及整体方案的制定提供一定的指导。 1、蛋白纯化的一般原则 蛋白纯化要利用不同蛋白间内在的相似性与差异，利用各种蛋白间的相似性来除去非蛋白物质的污染，而利用各蛋白质的差异将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来。每种蛋白间的大小、形状、电荷、疏水性、溶解度和生物学活性都会有差异，利用这些差异可将蛋白从混合物如大肠杆菌裂解物中提取出来得到重组蛋白。蛋白的纯化大致分为粗分离阶段和精细纯化阶段二个阶段。粗分离阶段主要将目的蛋白和其他细胞成分如DNA、RNA等分开，由于此时样本体积大、成分杂，要求所用的树脂高容量、高流速，颗粒大、粒径分布宽．并可以迅速将蛋白与污染物分开，防止目的蛋白被降解。精细纯化阶段则需要更高的分辨率，此阶段是要把目的蛋白与那些大小及理化性质接近的蛋白区分开来，要用更小的树脂颗粒以提高分辨率，常用离子交换柱和疏水柱，应用时要综合考虑树脂的选择性和柱效两个因素。选择性树脂与目的蛋白结合的特异性，柱效则是指各蛋白成分逐个从树脂上集中洗脱的能力，洗脱峰越窄，柱效越好。仅有好的选择性，洗脱峰太宽，蛋白照样不能有效分离。 2、各种蛋白纯化方法及其优、缺点 2．1 蛋白沉淀蛋白能溶于水是因为其表面有亲水性氨基酸，在蛋白质的等电点处若溶液的离子强度特别高或者特别低，蛋白则倾向于从溶液中析出。硫酸铵是沉淀蛋白最常用的盐，因为它在冷的缓冲液中溶解性好，冷的缓冲液有利于保持目的蛋白的活性。硫酸铵分馏常用作试验室蛋白纯化的第一步，它可以初步粗提蛋白质，去除非蛋白成分。蛋白质在硫酸铵沉淀中较稳定，可以短期在这种状态下保存中间产物，当前蛋白质纯化多采用这种办法进行粗分离翻。在规模化生产上硫酸铵沉淀方法仍存在一些问题，硫酸铵对不锈钢器具的腐蚀性很强。其他的盐如硫酸钠不存在这种问题，但其纯化效果不如硫酸铵。除了盐析外蛋白还可以用多聚物如PEG和防冻剂沉淀出来，PEG是一种惰性物质，同硫酸铵一样对蛋白有稳定效果，在缓慢搅拌下逐渐提高冷的蛋白溶液中的PEG浓度，蛋白沉淀可通过离心或过滤获得，蛋白可在这种状态下长期保存而不损坏。蛋白沉淀对蛋白纯化来说并不是多么好的方法，因为它只能达到几倍的纯化效果，而我们在达到目的前需要上千倍的纯化。其好处是可以把蛋白从混杂有蛋白酶和其他有害杂质的培养基及细胞裂解物中解脱出来。 2．2 缓冲液的更换虽然更换缓冲液不能提高蛋白纯度，但它却在蛋白纯化方案中起着极其重要的作用。不同的蛋白纯化方法需要不同pH及不同离子强度的缓冲液。假如你用硫酸铵将蛋白沉淀出来，毫无疑问蛋白是处在高盐环境中，需要想办法脱盐，可用的方法有利用半透膜透析，通过勤换透析液体去除盐分，此法尚可，但需几个小时，通常要过夜，也难以用于大规模纯化中。新型的设备将透析膜夹在两个板中间，板的一侧加缓冲液，另一侧加需脱盐的蛋白溶液，并在蛋白溶液一侧通过泵加压，可以使两侧溶液在数小时内达到平衡，若增加对蛋白溶液的压力，还可迫使水分和盐更多通过透析膜进入透析液达到对蛋白浓缩的目的。也有出售的脱盐柱，柱内的填料是小孔径的颗粒，蛋白分子不能进入孔内，先于高浓度盐离子从柱中流出，从而使二者分离。蛋白纯化的每一步都会造成目的蛋白的丢失，缓冲液平衡的步骤尤甚。蛋白会结合在任何它能接触的表面上，剪切力、起泡沫和离子强度的快速变化很容易让蛋白失活。 2．3 离子交换色谱这是在所有的蛋白纯化与浓缩方法中最有效方法。基于蛋白与离子交换树脂间的相互电荷作用，通过选择不同的缓冲液，同一种蛋白既可以和阴离子交换树脂（能结合带负电荷的分子）结合，也可以和阳离子交换树脂结合。树脂所用的带电基团有四种：二乙基氨基乙基用于弱的阴离子交换树脂；羧甲基用于弱的阳离子交换树脂；季铵用于强阴离子交换树脂；甲基磺酸酯用于强阳离子交换树脂。蛋白质由氨基酸组成，氨基酸在不同的pH环境中所带总电荷不同。大多数蛋白在生理pH（pH6～8）下带负电荷，需用阴离子交换柱纯化，极端的pH下蛋白会变性失活．应尽量避免。由于在某个特定的pH下不同的蛋白所带电荷数不同，与树脂的结合力也不同，随着缓冲液中盐浓度的增加或pH的变化，蛋白按结合力的强弱被依次洗脱。在工业化生产中更多地是改变盐浓度而不是去改变pH值，因为前者更容易控制。在实验室中几乎总是用盐浓度梯度去洗脱离子交换柱，利用泵的辅助可以使流入柱的缓冲液中盐浓度平稳地上升，当离子强度能够中和蛋白的电荷时，蛋白就被从柱上洗脱下来。但在工业生产中盐浓度很难精确控制，所以常用分步洗脱而不足连续升高的盐梯度。与排阻层析相比，离子交换特异性更好，有更多的参数可以调整以获得最优的纯化效果，树脂也比较便宜。值得一提的是，即便是用最精确控制的条件，仅用离子交换单一的方法也得不到纯的蛋白，还需要其他的纯化步骤。

蛋白质的分离纯化和表征

蛋白质的分离纯化和表征 第一节蛋白质的酸碱性质 各个解离基团的pK 值与游离氨基酸的不完全相同。等电点要用等电聚焦等方法测定。 第二节蛋白质分子的大小与形状

一、根据化学组成测定最低相对分子质量 假定某种微量成分只有一个，测出其百分含量后，可用比例式算出最低相对分子质量。 若测出两种微量成分的百分含量，分别用比例式算出的最低相对分子质量不相同时，可计算两个最低相对分子质量近似的最小公倍数。 例题：一种纯酶含亮氨酸（Mr 131）1.65%，含异亮氨酸（Mr131）2.48%，求最低相对分子质量。 解：按照Leu 的百分含量计算，最低Mr X1： X1=(100′ 131)/1.65=7939.4。 按照Ile 的百分含量计算最低Mr X2： X2=(100′ 131)/2.48=5282.3。 由于X1 和X2 数字差异较大，提示这种酶含Leu 和Ile 不止1 个，为了估算Leu 和Ile 的个数，首先计算： X1/X2=7939.4/5282.3≈1.5。 这种酶含任何氨基酸的个数均应是整数，说明该酶至少含有2 个Leu，3 个Ile，其最低相对分子质量为： 7939.4 ′2 =15878.8或5282.3×3=15846.9。 二、渗透压法测定相对分子质量 三、沉降分析法测定相对分子质量

基本原理： （一）离心力(centrifugal force，Fc) 当一个粒子（生物大分子或细胞器）在高速旋转下受到离心力作用时，此离心力“Fc”由下式定义： F=m·a=m·ω2 r a—粒子旋转的加速度，m—沉降粒子的有效质量，ω—粒子旋转的角速度，r—粒子的旋转半径(cm)。 （二）相对离心力(relative centrifugal force，RCF) 由于各种离心机转子的半径或者离心管至旋转轴中心的距离不同，离心力而受变化，因此在文献中常用“相对离心力”或“数字×g”表示离心力，只要RCF 值不变，一个样品可以在不同的离心机上获得相同的结果。 RCF 就是实际离心场转化为重力加速度的倍数。

分离纯化(1)

1.生物药物:是利用生物体、生物组织或其成分，综合应用生物化学、微生物免疫学、和药 学等的原理与方法制造的一大类用于预防、治疗、诊断的制品。 2.生物制品：主要指菌苗、毒素、应变原与血液制品等。 3.合成与部分合成生物药物：以天然药物为分子母体，经化学或生物学方法修饰改造合成 的生物药物。 4.基因药物：以基因物质（RNA或DNA及其衍生物）作为治疗的药物基础，包括基因治 疗用的重组目的DNA片段、重组疫苗、反义药物和核酶等。 5.反义药物：以人工合成的十至几十个反义寡核苷酸序列与模板DNA或mRNA互补形成 稳定的双键结构，抑制靶基因的转录和mRNA的翻译，从而起到抗肿瘤和抗病毒的作用。 6.疫苗：使用病毒或立克次氏体，接种于动物、鸡胚或组织培养后，加以处理制成，可分 为弱毒疫苗和死毒疫苗。 7.类毒素：使用细菌产生的外毒素加入甲醛处理后，使之变为无毒性但仍旧有免疫原性的 制剂。 8.细胞破碎：采用一定的方法，在一定程度上破坏细胞壁和细胞膜，设法使胞内产物最大 程度的释放到液相当中，破碎后的细胞浆液经固液分离除去细胞碎片后，再采用不同的分离手段进一步纯化。 9.过滤：在外力的作用下，悬浮液中的液体通过多孔介质的孔道而固体颗粒被截留下来， 从而实现固液分离的操作。 10.料液：在溶剂萃取中，被提取的溶液被称为料液。 溶质：在溶剂萃取中，欲提取的物质被称为溶质。 萃取剂：用以进行萃取的溶剂。 11.反萃取：将萃取液与反萃取剂（一般为水溶液）相接触，使某种被萃取的有机相溶质转 入水相的过程。 12.萃取液：含溶质的萃取剂溶液。 萃余液：被萃取出溶质以后的溶液。 13.双水相萃取：又称水溶液两相分配技术，它利用物质在互不相溶的两水相间分配系数的 差异来进行萃取的方法。 14.临界胶束浓度（CMC）：是胶束形成时所需表现活性剂的最低浓度。 15.正常胶束：将表面活性剂溶于水中，当其浓度超过临界胶束浓度时，表面活性剂就会在 水溶液中聚集在一起而形成聚集体，通常情况下，这种聚集体是水溶液中的胶束，被称为正常胶束。 16.反胶束：将表面活性剂溶于非极性的有机溶剂中，并使其浓度超过临界胶束浓度，便会 在有机溶剂内形成聚集体，这种聚集体被称为反胶束。 17.超临界流体：在临界温度和临界压力以上的流体，高于临界温度和临界压力而接近临界 点的状态。 18.超临界流体萃取技术：是利用处于临界压力和临界温度以上的一些溶剂流体所具有（特 异增加物质溶解能力）来进行分离纯化的技术。 19.固相析出技术：通过加入某种试剂或改变溶液条件，使生化产物以固体形式（沉淀和结 晶）从溶液中沉降析出的分离纯化技术称为固相析出技术。 20.盐析法;是利用各种生物分子在浓盐溶液中溶解度的差异，通过向溶液中引入一定数量的 中性盐，使目的物或杂蛋白以沉淀析出，达到纯化目的的方法。 21.有机溶剂沉淀：向水溶液中加入一定量亲水性的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉 淀析出的分离纯化方法。 22.凝胶层析：又称分子筛层析，是将样品混合物通过一定孔径的凝胶固定相，由于各组分 流经体积的差异，使不同分子量的祖坟的一份力的层析方法。 23.类分离（组分离）：将分子量极为悬殊的两类物质分开的方法。 24.分级分离：将分子量相差不大的大分子物质加一分离的方法。 25.离子交换法：利用溶液中带电粒子与离子交换剂之间结合力的差异进行物质分离的操作 方法。 26.有效粒径：指筛分树脂时，10%体积的树脂颗粒通过，而90%体积的树脂颗粒保留的筛 孔直径。 27.均一系数：指能通过60%体积（筛上体积40%）树脂的筛孔直径与能通过10%体积（筛 上体积90%）的树脂的筛孔直径之比。均一系数越接近1，表明树脂颗粒越均匀，在文献上常常见到用筛目数表示树脂粒度。 28.树脂再生：使用过的树脂重新获得使用性能的处理过程。 29.转型：树脂去除后，为了发挥其交换能力，按照使用要求人为地赋予平衡离子的过程。 30.毒化：指树脂失去交换性能后，不能用一般的再生手段重获交换能力的现象。 31.洗脱：离子交换完成后，将树脂所吸附的物质释放出来重新转入溶液的过程。

常用的分离纯化手段

常用的分离纯化手段 分离 发布日期:2012-8-1有效日期至:2013-1-28查看联系方式 发布单位: 杭州哲博化工科技有限公司分析检测中心查看该会员所有的供求信息查看该会员所有的产品信息 常用的分离纯化手段 资深专家团队---专业检测机构---精准分析服务----先进仪器设备--雄厚技术实力赵老师18 96 8197 425 哲博检测中心，浙大国家大学科技园提供【各种精细化工和高分子材料性能检测，成分分析，配方还原，工艺失效分析】【名校科研院所博士领衔、专业分析专家】 关键词：分离纯化配方分析成分分析 1. 化学分离法 蒸馏与分馏 分离沸点与挥发度相差较大组分的有效方法。有常压蒸馏，减压蒸馏，水蒸气蒸馏。适用于混合液体及液固的分离。 萃取 利用物质在不同溶剂中溶解度的不同和分配系数的差异，使物质达到相互分离的方法。适用于液固，液液的分离。 提取 利用不同的溶剂，从固体样品的基体中，使某种组分得到分离和浓缩。主要利用索氏提取器。如高聚物与填料，高聚物材料中微量助剂的提取与浓缩处理。缺点：①易引起热不稳定的组分变质②溶剂中的杂质也被浓缩③溶剂用量大 结晶与沉淀（溶解沉淀法） 利用样品中各组分在溶剂中的溶解度差异，使某些组分从浓溶液中生成结晶分离出来，是纯化物质的一种有效的方法。适用与高聚物的分离。 过滤与膜分离 过滤是分离液-固非均一体系常用的分离方法。适用于>1μm的颗粒。 膜分离适用于分离< 1μm的胶体颗粒。分为固体高分子膜，阳离子膜，阴离子膜。 灰化，酸化，微波消解—用于无机物的分离。 2. 色谱分离法： 柱色谱法—分离有机化合物的有效手段。分为： 硅胶填充柱—适用于分离大多数弱极性，中等极性和较强极性的化合物。 氧化铝填充柱—适用于分离非极性，弱极性化合物 聚酰胺填充柱—可用于染料，表面活性剂的分离。 阳离子交换柱—分离阳离子，适用于阳离子表面活性剂。 阴离子交换柱—分离阴离子，适用于阴离子表面活性剂。 凝胶色谱法 分为： 凝胶过滤色谱（GFC）—用于分离水溶性大分子。 凝胶渗透色谱（GPC）—用于有机溶剂中可溶的高聚物分子量分布分析及分离。 薄层色谱法—适用于有机化合物的分离。 纸色谱法—主要用于强极性和水溶性化合物，如氨基酸，糖类，有机酸及盐等的分离，亦可用于多种金属阳离子，阴离子的分离与鉴定。 气相色谱法—热稳定好，易挥发的中，小分子量的有机化合物的分离。

蛋白质的分离纯化方法(参考资料)

蛋白质的分离纯化方法 2.1根据分子大小不同进行分离纯化 蛋白质是一种大分子物质,并且不同蛋白质的分子大小不同,因此可以利用一些较简单的方法使蛋白 质和小分子物质分开,并使蛋白质混合物也得到分离。根据蛋白质分子大小不同进行分离的方法主要有透析、超滤、离心和凝胶过滤等。透析和超滤是分离蛋白质时常用的方法。透析是将待分离的混合物放入半透膜制成的透析袋中,再浸入透析液进行分离。超滤是利用离心力或压力强行使水和其它小分子通过半透膜,而蛋白质被截留在半透膜上的过程。这两种方法都可以将蛋白质大分子与以无机盐为主的小分子分开。它们经常和盐析、盐溶方法联合使用,在进行盐析或盐溶后可以利用这两种方法除去引入的无机盐。由于超滤过程中,滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞,以致超滤速度减慢,截流物质的分子量也越来越小。所以在使用超滤方法时要选择合适的滤膜,也可以选择切向流过滤得到更理想的效果离心也是经常和其它方法联合使用的一种分离蛋白质的方法。当蛋白质和杂质的溶解度不同时可以利用离心的方法将它们分开。例如,在从大米渣中提取蛋白质的实验中,加入纤维素酶和α-淀粉酶进行预处理后,再用离心的方法将有用物质与分解掉的杂质进行初步分离[3]。使蛋白质在具有密度梯度的介质中离心的方法称为密度梯度(区带)离心。常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度。可以根据所需密度和渗透压的范围选择合适的密度梯度。密度梯度离心曾用于纯化苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白,得到的产品纯度高但产量偏低。蒋辰等[6]通过比较不同密度梯度介质的分离效果,利用溴化钠密度梯度得到了高纯度的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白。凝胶过滤也称凝胶渗透层析,是根据蛋白质分子大小不同分离蛋白质最有效的方法之一。凝胶过滤的原理是当不同蛋白质流经凝胶层析柱时,比凝胶珠孔径大的分子不能进入珠内网状结构,而被排阻在凝胶珠之外,随着溶剂在凝胶珠之间的空隙向下运动并最先流出柱外;反之,比凝胶珠孔径小的分子后流出柱外。目前常用的凝胶有交联葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶等。在甘露糖蛋白提纯的过程中使用凝胶过滤方法可以得到很好的效果,纯度鉴定证明产品为分子量约为32 kDa、成分是多糖∶蛋白质(88∶12)、多糖为甘露糖的单一均匀糖蛋白[1]。凝胶过滤在抗凝血蛋白的提取过程中也被用来除去大多数杂蛋白及小分子的杂质[7]。 2.2 根据溶解度不同进行分离纯化 影响蛋白质溶解度的外部条件有很多,比如溶液的pH值、离子强度、介电常数和温度等。但在同一条件下,不同的蛋白质因其分子结构的不同而有不同的溶解度,根据蛋白质分子结构的特点,适当地改变外部条件,就可以选择性地控制蛋白质混合物中某一成分的溶解度,达到分离纯化蛋白质的目的。常用的方法有等电点沉淀和pH值调节、蛋白质的盐溶和盐析、有机溶剂法、双水相萃取法、反胶团萃取法等。 等电点沉淀和pH值调节是最常用的方法。每种蛋白质都有自己的等电点,而且在等电点时溶解度最

蛋白质提取与制备的原理和方法

蛋白质提取与制备的原理和方法 蛋白质提取与制备蛋白质种类很多，性质上的差异很大，既或是同类蛋白质，因选用材料不同，使用方法差别也很大，且又处于不同的体系中，因此不可能有一个固定的程序适用各类蛋白质的分离。但多数分离工作中的关键部分基本手段还是共同的，大部分蛋白质均可溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液中，少数与脂类结合的蛋白质溶于乙醇、丙酮及丁醇等有机溶剂中。因此可采用不同溶剂提取、分离及纯化蛋白质和酶。 蛋白质与酶在不同溶剂中溶解度的差异，主要取决于蛋白分子中非极性疏水基团与极性亲水基团的比例，其次取决于这些基团的排列和偶极矩。故分子结构性质是不同蛋白质溶解差异的内因。温度、pH、离子强度等是影响蛋白质溶解度的外界条件。提取蛋白质时常根据这些内外因素综合加以利用。将细胞内蛋白质提取出来。并与其它不需要的物质分开。但动物材料中的蛋白质有些可溶性的形式存在于体液（如血浆、消化硫等）中，可以不必经过提取直接进行分离。蛋白质中的角蛋白、胶原及丝蛋白等不溶性蛋白质，只需要适当的溶剂洗去可溶性的伴随物，如脂类、糖类以及其他可溶性蛋白质，最后剩下的就是不溶性蛋白质。这些蛋白质经细胞破碎后，用水、稀盐酸及缓冲液等适当溶剂，将蛋白质溶解出来，再用离心法除去不溶物，即得粗提取液。水适用于白蛋白类蛋白质的抽提。如果抽提物的pH用适当缓冲液控制时，共稳定性及溶解度均能增加。如球蛋白 类能溶于稀盐溶液中，脂蛋白可用 稀的去垢剂溶液如十二烷基硫酸钠、洋地黄皂苷（Digitonin）溶液或有机溶剂来抽提。其它不溶于水的蛋白质通常用稀碱溶液抽提。 蛋白质类别和溶解性质 白蛋白和球蛋白: 溶于水及稀盐、稀酸、稀碱溶液，可被50%饱和度硫酸铵析出。 真球蛋白: 一般在等电点时不溶于水，但加入少量的盐、酸、碱则可溶解。 拟球蛋白: 溶于水，可为50%饱和度硫酸铵析出 醇溶蛋白: 溶于70～80%乙醇中，不溶于水及无水乙醇 壳蛋白: 在等电点不溶于水，也不溶于稀盐酸，易溶于稀酸、稀碱溶液 精蛋白: 溶于水和稀酸，易在稀氨水中沉淀 组蛋白: 溶于水和稀酸，易在稀氨水中沉淀 硬蛋白质: 不溶于水、盐、稀酸及稀碱 缀合蛋白(包括磷蛋白、粘蛋白、糖蛋白、核蛋白、脂蛋白、血红蛋白、金属蛋白、黄素蛋白和氮苯蛋白等) : 此类蛋白质溶解性质随蛋白质与非蛋白质结合部分的不同而异，除脂蛋白外，一般可溶于稀酸、稀碱及盐溶液中，脂蛋白如

《生物分离与纯化技术》授课教案

《生物分离与纯化技术》授课教案 第一章绪论 教学目的：熟悉生物物质的概念、种类和来源；了解分离纯化技术及其基本原理；熟悉分离纯化工艺的优化、放大和验证工作；掌握分离纯化的特点与一般步骤；了解生物分离纯化技术的发展历史；熟悉生物分离纯化技术的发展趋势。 教学重点：生物物质的概念、种类和来源；分离纯化工艺的优化、放大和验证工作；分离纯化的特点与一般步骤；生物分离纯化技术的发展趋势。 教学难点：分离纯化技术及其基本原理；分离纯化工艺的优化、放大和验证工作。教学课时：4 学时 教学方法：多媒体教学 教学内容： 第一节生物分离与纯化的概念与原理 一、生物物质的概念、种类和来源 1. 生物物质：氨基酸及其衍生物类、活性多肽类、蛋白质、酶类、核酸及其降解 物、糖、脂类、动物器官或组织制剂、小动物制剂、菌体制剂 2. 生物物质来源：动物器官与组织、植物器官与组织、微生物及其代谢产物、细胞培养产物、血液、分泌物及其代谢物 二、生物分离纯化概念 指从发酵液、动植物细胞培养液、酶反应液或动植物组织细胞与体液等中分离、纯化生物产品的过程。 三、生物分离纯化技术

生物技术 上游：基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程及组织工程；下游：生物产品的回收——生物分离与纯化技术，主要包括离心技术、细胞破碎技术、萃取技术、固相析出技术、色谱技术和膜分离技术等。 四、分离纯化基本原理 有效识别混合物中不同组分间物理、化学和生物学性质的差别，利用能够识别这些差别的分离介质或扩大这些差别的分离设备来实现组分间的分离或目标产物的纯化。

第二节分离纯化策略 一、生物分离纯化技术的特点 1. 环境复杂、分离纯化困难 2. 含量低、工艺复杂

蛋白质分离与纯化教学设计课题

蛋白质分离与纯化教学设计 一、教学背景分析 【教材分析】 “蛋白质的分离与纯化”实验是《高中生物》选修1生物技术实践 5.3血红蛋白的提取与分离中的容。本节课的主要容包括蛋白质的提取、分离纯化等基本知识，主要要求学生掌握凝胶电泳的实验原理以及操作方法。“血红蛋白分离与纯化”实验不仅是学习血红蛋白的提取、分离纯化方法，而且也是进一步掌握蛋白质的组成、结构和功能的基础。 【学情分析】 到目前为止，学生已经学习了蛋白质的相关知识，对蛋白质有了一定的了解，“蛋白质的分离与纯化”实验目的是使学生体验从复杂细胞混合物体系中提取和纯化生物大分子的基本原理、过程和方法，虽然操作难度较大，但原理清晰，动手机会较多，学习兴趣很高。学生有必修“生命活动的主要承担者——蛋白质”的基础，在一定程度上掌握了蛋白质的组成、结构和功能等基础知识，学生在进行实验前还是能大概了解影响蛋白质分离纯化的因素的，再者经过老师的指导，实验能取得良好的结果的。 二、教学目标 【知识目标】 1.了解从血液中提取蛋白质的原理与方法。 2.说出凝胶电泳的基本原理与方法。 【能力目标】 运用凝胶电泳对蛋白质进行分离纯化。 【情感态度与价值观目标】 1.培养学生科学实验的观点。 2.初步形成科学的思维方式，发展科学素养和人文精神。 三、教学重难点

【教学重点】 从血液中提取蛋白质；凝胶电泳分离纯化蛋白质。 【教学难点】 样品预处理，色谱柱的装柱，纯化分离操作。 四、实验实施准备 【教师准备】 1.分组。学生按学科能力的强中弱平均分组，各组尽量平衡，各组自行分工，并由实验员统一安排实验过程。 2.实验材料：血液 仪器：试管、胶头滴管、烧杯、玻璃棒、离心机、研磨器、透析袋、电泳仪等。 试剂：20mmol/L磷酸缓冲液（pH为8．6）、蒸馏水、聚丙烯酸铵、生理盐水、5％醋酸水溶液等。 【学生准备】 1.预习实验“蛋白质分离纯化”，了解蛋白质的相关信息。 2.进行分组。 五、教学方法 【教法】分析评价法、任务驱动法、直观演示法 【学法】自主学习法、合作交流法 六、教学媒体 黑板、多媒体 七、课时安排 两个课时（80min） 一个课时用来讲述理论部分知识：样品处理与色谱柱分离纯化蛋白质的原理与方法； 另一课时用来进行实验。

分离纯化蛋白质的方法及原理

（二）利用溶解度差别 影响蛋白质溶解度的外部因素有：1、溶液的pH；2、离子强度；3、介电常数；4、温度。但在同一的特定外部条件下，不同蛋白质具有不同的溶解度。 1、等电点沉淀：原理：蛋白质处于等电点时，其净电荷为零，由于相邻蛋白质分子之间没有静电斥力而趋于聚集沉淀。因此在其他条件相同时，他的溶解度达到最低点。在等电点之上或者之下时，蛋白质分子携带同种符号的净电荷而互相排斥，阻止了单个分子聚集成沉淀，因此溶解度较大。不同蛋白质具有不同的等电点，利用蛋白质在等电点时的溶解度最低的原理，可以把蛋白质混合物分开。当pH被调到蛋白质混合物中其中一种蛋白质的等电点时，这种蛋白质大部分和全部被沉淀下来，那些等电点高于或低于该pH的蛋白质则仍留在溶液中。这样沉淀出来的蛋白质保持着天然的构象，能重新溶解于适当的pH和一定浓度的盐溶液中。 5、盐析与盐溶：原理：低浓度时，中性盐可以增加蛋白质溶解度这种现象称为盐溶.盐溶作用主要是由于蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电层使蛋白质分子彼此排斥，而蛋白质与水分子之间的相互作用却加强，因而溶解度增高。球蛋白溶液在透析过程中往往沉淀析出，这就是因为透析除去了盐类离子，使蛋白质分子之间的相互吸引增加，引起蛋白质分子的凝集并沉淀。当溶液的离子强度增加到一定程度时，蛋白质溶解程度开始下降。当离子强度增加到足够高时，例如饱和或半饱和程度，很多蛋白质可以从水中沉淀出来，这种现象称为盐析。盐析作用主要是由于大量中性盐的加入使水的活度降低，原来溶液中的大部分甚至全部的自由水转变为盐离子的水化水。此时那些被迫与蛋白质表面的疏水集团接触并掩盖他们的水分子成为下一步最自由的可利用的水分子，因此被移去以溶剂化盐离子，留下暴露出来的疏水基团。蛋白质疏水表面进一步暴露，由于疏水作用蛋白质聚集而沉淀。 盐析沉淀的蛋白质保持着他的天然构象，能再溶解。盐析的中性盐以硫酸铵为最佳，在水中的溶解度很高，而溶解度的温度系数较低。 3、有机溶剂分级分离法：与水互溶的有机溶剂（甲醇、乙醇和丙酮等）能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。在室温下有机溶剂会引起蛋白质变性，如果预先将有机溶剂冷却到-40°C以下，然后在不断搅拌下逐滴加入有机溶剂，以防局部浓度过高，那么变性可以得到很大程度缓解。蛋白质在有机溶剂中的溶解度也随温度、pH和离子强度而变化。在一定温度、pH和离子强度条件下，引起蛋白质沉淀的有机溶剂的浓度不同，因此控制有机溶剂浓度也可以分

蛋白质的分离纯化方法

蛋白质的分离纯化方法 根据分子大小不同进行分离纯化 蛋白质是一种大分子物质,并且不同蛋白质的分子大小不同,因此可以利用一些较简单的方法使蛋白 质和小分子物质分开,并使蛋白质混合物也得到分离。根据蛋白质分子大小不同进行分离的方法主要有透析、超滤、离心和凝胶过滤等。透析和超滤是分离蛋白质时常用的方法。透析是将待分离的混合物放入半透膜制成的透析袋中,再浸入透析液进行分离。超滤是利用离心力或压力强行使水和其它小分子通过半透膜,而蛋白质被截留在半透膜上的过程。这两种方法都可以将蛋白质大分子与以无机盐为主的小分子分开。它们经常和盐析、盐溶方法联合使用,在进行盐析或盐溶后可以利用这两种方法除去引入的无机盐。由于超滤过程中,滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞,以致超滤速度减慢,截流物质的分子量也越来越小。所以在使用超滤方法时要选择合适的滤膜,也可以选择切向流过滤得到更理想的效果离心也是经常和其它方法联合使用的一种分离蛋白质的方法。当蛋白质和杂质的溶解度不同时可以利用离心的方法将它们分开。例如,在从大米渣中提取蛋白质的实验中,加入纤维素酶和α-淀粉酶进行预处理后,再用离心的方法将有 用物质与分解掉的杂质进行初步分离[3]。使蛋白质在具有密度梯度的介质中离心的方法称为密度梯度(区带)离心。常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度。可以根据所需密度和渗透压的范围选择合适的密度梯度。密度梯度离心曾用于纯化苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白,得到的产品纯度高但产量偏低。蒋辰等[6]通过比较不同密度梯度介质的分离效果,利用溴化钠密度梯度得到了高纯度的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白。凝胶过滤也称凝胶渗透层析,是根据蛋白质分子大小不同分离蛋白质最有效的方法之一。凝胶过滤的原理是当不同蛋白质流经凝胶层析柱时,比凝胶珠孔径大的分子不能进入珠内网状结构,而被排阻在凝胶珠之外,随着溶剂在凝胶珠之间的空隙向下运动并最先流出柱外;反之,比凝胶珠孔径小的分子后流出柱外。目前常用的凝胶有交联葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶等。在甘露糖蛋白提纯的过程中使用凝胶过滤方法可以得到很好的效果,纯度鉴定证明产品为分子量约为32 kDa、成分是多糖∶蛋白质(88∶12)、多糖为甘露糖的单一均匀糖蛋白[1]。凝胶过滤在抗凝血蛋白的提取过程中也被用来除去大多数杂蛋白及小分子的杂质[7]。 根据溶解度不同进行分离纯化 影响蛋白质溶解度的外部条件有很多,比如溶液的pH值、离子强度、介电常数和温度等。但在同一条件下,不同的蛋白质因其分子结构的不同而有不同的溶解度,根据蛋白质分子结构的特点,适当地改变外部条件,就可以选择性地控制蛋白质混合物中某一成分的溶解度,达到分离纯化蛋白质的目的。常用的方法有等电点沉淀和pH值调节、蛋白质的盐溶和盐析、有机溶剂法、双水相萃取法、反胶团萃取法等。 等电点沉淀和pH值调节是最常用的方法。每种蛋白质都有自己的等电点,而且在等电点时溶解度最

总结生物药物分离纯化的方法

总结归纳本课程介绍的可用于物质分离纯化的方法，并说出每种方法的原理。 萃取分离法 溶剂萃取法原理： 利用物质在两种互不相溶的液相中分配特性不同而进行的分离 设法使一种溶解于液相的物质传递到另一液相的操作 pH影响分配系数-表观分配系数 双水相萃取原理：利用生物物质在互不相溶的两水相间分配系数的差异进行分离的过程 反胶束萃取原理：表面活性剂溶于非极性溶剂中，并使其浓度超过临界胶束浓度，便会在有机溶剂内形成聚集体，非极性基团在外，极性基团则排列在内，形成一个极性核，此极性核具有溶解极性物质的能力。当含有此种反胶束的有机溶剂与蛋白质的水溶液接触后，蛋白质及其他亲水性物质能够溶于极性核内部的水中，由于周围的水层和极性基团的保护，蛋白质不与有机溶剂接触，从而不会造成失活。 超临界萃取原理：当气体物质处于其临界温度(Tc)和临界压力(Pc)以上时，不会凝缩为液体，只是密度增大，具有许多特殊的物理化学性质：流体的密度接近于液体的密度,粘度接近于气体；在临界点附近,超临界流体的溶解度对温度和压力的变化非常敏感； 固相析出分离法 盐析法原理： 盐析法是利用各种生物分子在浓盐溶液中溶解度的差异，通过向溶液中引入一定数量的中性盐，使目的物或杂蛋白以沉淀析出，达到纯化目的的方法。 破坏双电层：在高盐溶液中，带大量电荷的盐离子能中和蛋白质表面的电荷，使蛋白质分子之间电排斥作用相互减弱而能相互聚集起来。 破坏水化层：中性盐的亲水性比蛋白质大，盐离子在水中发生水化而使蛋白质脱去了水化膜，暴露出疏水区域，由于疏水区域的相互作用，使其沉淀。 有机溶剂沉淀法原理： 1、降低了介质的介电常数，使溶质分子之间的静电引力增加，聚集形成沉淀。 2、水溶性有机溶剂本身的水合作用降低了自由水的浓度，压缩了亲水溶质分子表面原有水化层的厚度，降低了它的亲水性，导致脱水凝集。 等电点沉淀法原理： Pl时分子表面静电荷未零，双电层及水化膜的削弱或破坏，分子间引力增加，溶解度降低。常与盐析法、有机溶剂沉淀法或其他沉淀剂一起配合使用。主要：去除杂蛋白，而不用于沉淀目的物。 成盐沉淀法原理： 1.金属离子沉淀 所用的金属离子，包括Mn2+、Fe2+、Co2+、Ni2+、Zn2+、Ca2+、Ba2+、Mg2+等。 蛋白质和酶分子中因为含有羟基、氨基、咪唑基和硫氢基等，均可以和上述金属离子作用形成盐复合物。 分离沉淀→复合物分解→除金属离子（离子交换或金属螯合剂EDTA） 2.有机酸类复合盐 含氮有机酸如苦味酸、苦桐酸和鞣酸等能够与有机分子的碱性功能团形成复合物而沉析出。工业上用此法制备蛋白质时，需采取较温和的条件，有时还加入一定的稳定剂，以防止蛋白质变性。 亲和沉淀法原理：

的分离纯化.doc

mRNA的分离纯化 【实验原理】 真核生物的mRNA分子是单顺反子，是编码蛋白质的基因转录产物。真核生物的所有蛋白质归根到底都是mRNA的翻译产物，因此，高质量mRNA的分离纯化是克隆基因、提高cDNA文库构建效率的决定性因素。哺乳动物平均每个细胞含有约1x10-5g RNA，理论上认为每克细胞可分离出5～10mg RNA。其中rRNA为75％～85％，tRNA占10％～16％，而mRNA仅占1%～5％，并且mRNA分子种类繁多，分子量大小不均一，表达丰度也不一样。 真核生物mRNA有特征性的结构，即具有5’端帽子结构（m7G）和3’端的poly(A)尾巴——绝大多数哺乳动物细胞的3’端存在20~300个腺苷酸组成的poly（A）尾，通常用poly（A+）表示，这种结构为真核mRNA分子的提取、纯化，提供了极为方便的选择性标志，寡聚（dT）纤维素或寡聚（U）琼脂糖亲合层析分离纯化mRNA的理论基础就在于此。 一般mRNA分离纯化的原理就是根据mRNA 3’末端含有多poly(A)尾巴结构特性设计的。当总RNA流经寡聚（dT）（即oligo(dT)）纤维素柱时，在高盐缓冲液作用下，mRNA被特异地吸附在oligo(dT)纤维素柱上，在低盐浓度或蒸馏水中，mRNA可被洗下，经过两次oligo(dT)纤维素柱，即可得到较纯的mRNA。 目前常用的mRNA的纯化方法有： （1）寡聚（dT）－纤维素柱层析法，即分离mRNA的标准方法； （2）寡聚（dT）－纤维素液相离心法，即用寡聚（dT）－纤维素直接加入到总的RNA溶液中并使mRNA与寡聚（dT）－纤维素结合，离心收集寡聚（dT）－纤维素／mRNA 复合物，再用洗脱液分离mRNA，然后离心除去寡聚（dT）－纤维素；

水纯化方法简介

和泰The lab Pure water technology 水纯化方法简介 1.微孔过滤法 微孔过滤法包括三种类型：深层过滤(depth)、筛网过滤(screen)及表面过滤(surface)。深层滤膜是以编织纤维或压缩材料制成的基质，利用随机性吸附或是捕捉方式来滞留颗粒。筛网滤膜基本上是具有一致性的结构，就像筛子一般，将大于孔径的颗粒，都滞留在表面上(这种滤膜的孔径大小是非常精确的)，而表面过滤则是多层结构，当溶液通过滤膜时，较滤膜内部孔隙大的颗粒将被滞留下来，并主要堆积在滤膜表面上。 由于上述三种滤膜的功能不同，因此对滤膜之间的分辨非常重要。由于深层过滤是一种较为经济的方式，可去除98%以上的悬浮固体，同时保护下游的纯化单元不会败坏或堵塞，因此通常被作为预过滤处理。表面过滤可去除%以上的悬浮固体，所以也可作为预过滤处理或澄清用。微孔薄膜(筛网滤膜)一般被置于纯化系统中的最终使用点，以去除最后残留的微量树脂碎片、碳屑、胶质颗粒和微生物。例如：μm微孔滤膜，其可滤过所有的细菌，通常用于将静脉注射用的液体、血清及抗生素进行除菌用。 2.活性碳吸附法 有机物可能是阳离子、阴离子或非离子性的物质，离子交换树脂可去除原水中一些可溶性的有机酸和有机碱(阴离子和阳离子)，但有些非离子性的有机物却会被树脂包覆，这过程称为树脂的“污染阻塞”现象，不但会减少树脂的寿命，而且降低其交换能力。为保护离子交换树脂，可将活性碳过滤器安装在离子交换树脂之前，以去除非离子性的有机物。 活性碳的吸附过程是利用活性碳过滤器的孔隙大小及有机物通过孔隙时的渗透率来达到的。吸附率和有机物的分子量及其分子大小有关，某些颗粒状的活性碳较能有效的去除氯胺。活性碳也能去除水中的自由氯，以保护纯水系统内其他对氧化剂敏感的纯化单元。 活性碳通常与其他的处理方法组合应用。在设计纯水系统时，活性碳与其他相关纯化单位的相关配置，是一项极为重要的项目。 3.反渗透法 反渗透(RO)法是可达到90%~99%杂质去除率中最经济的方法。RO膜的滤孔结构较UF膜还要致密，RO膜可去除所有的颗粒、细菌以及分子量大于300的有机物(包括热源)。