分子生物学技术
分子生物学技术
近年来，心血管疾病的发病率和死亡率急剧增加，已成为危害我国人民群众生命和健康的重大疾病。人们逐渐认识到,包括心血管疾病在内的许多疾病的生理、病理机制的本质问题是相关基因的表达及其调控。随着研究的深入, 心血管疾病的研究已深入到分子生物学水平。人们寻找疾病相关基因, 研究其表达调控机制, 希望在分子水平阐明疾病发生机制, 以期更有效地进行疾病的诊断、治疗。相应地, 很多分子生物学研究技术也应用到对心血管疾病的研究中来, 成为不可或缺的基本手段, 如分子杂交技术、聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR）技术、反义核酸技术、DNA微阵列、转基因技术等等。分子诊断学是以分子生物学理论为基础，利用分子生物学的技术和方法研究人体内源性或外源性生物大分子和大分子体系的存在、结构或表达调控的变化，为疾病的预防、预测、诊断、治疗和转归提供信息和决策依据的一门学科。1953年Watson & Crich发现DNA 双螺旋结构, 标志着分子生物学时代的到来。随着研究的进展, 人们对心血管疾病的研究也逐步深入到分子水平, 很多分子生物学的研究技术也在疾病机理、药物机理的研究中广泛应用, 成为基本的研究手段。人类基因组计划完成后, 生命科学研究进入后基因组时代, 进行功能基因组学、蛋白质组学的研究, 相应的实验技术也广泛应用并不断发展。
在过去的短短的10余年中,检验医学发展日新月异、发展迅猛,临床实验室的实验设备已高度自动化及网络化，“实验室全自动化”（Total Laboratory Automation,TLA）、分子诊断（MolecularDiagnostics）、床旁检验（Point of Care Tests,POCT）、循证检验医学（Evidence basedlaboratory medicine,EBLM）的兴起为心血管疾病的诊疗提供了极大帮助。
一、分子生物学技术
由于分子生物学技术的快速发展,以及人类基因组序列认识的逐渐完善,以PCR为代表的体外核酸扩增技术已在临床基因诊断中得以较为广泛的应用,如病毒、细菌的基因快速检测,遗传性疾病的诊断,肿瘤的基因诊断等。实时荧光定量PCR技术的应用,不仅使临床基因检测更加快速,而且使基因检测进入定量阶段,这特别有利于某些疾病治疗效果的评价。免疫检验中的放射免疫分析（Radioimmunoassay，RIA）,酶免疫分析（Enzyme Iimrrmnoassay，EIA）,金标记免疫分析,荧光免疫分析（Fluoroimmunoassay，FIA）,时间分辨荧光免疫分析（Time-resolved Fluoroimmunoassay，TRFIA）,化学发光免疫分析（Chemiluminescence Immunoassay，CLI A）,电化学发光免疫分析（Electro-Chemiluminescence Immunoassay ，ECLI）技术的临床应用不仅拓宽了免疫学检测的领域,同时提高了免疫学检测的灵敏度,促进了免疫检测的自动化。特别是化学发光免疫分析、电化学发光免疫分析技术的诞生,使得免疫学检验进入了一个新的时代,检测灵敏度可达pg水平,其检测速度、分析自动化程度及分
析准确性也是其它免疫学方法无法比拟的。流式细胞术进入临床实验室极大地拓宽了临床检验的范围,可应用于细胞DNA、RNA定量及细胞周期分析、细胞表面标志物分析、凋亡细胞的检测等,促进了细胞生物学的临床应用。
生物芯片技术是生命科学研究中继基因克隆技术、基因自动测序技术、PCR 技术后的又一次革命性技术突破。生物芯片已在高通量基因测序、基因表达研究已经发挥了其重要作用,也将在后基因组时代研究蛋白质功能及蛋白质间的相互作用方面发挥其极其重要的作用。由于生物芯片具有高通量、可同时快速检测多种待检分子的特点,故研究适用于临床实验诊断需要的低密度生物芯片近年来已成为检验医学的研究热点之一,用于肝炎病毒、HPV检测及分型、结核分枝杆菌、人巨细胞病毒、幽门螺杆菌、地中海贫血、性传播性疾病等的检测及诊断的基因芯片已相继问世;用于微量蛋白质、激素、肿瘤标志物监测的蛋白质芯片也已得到初步应用。
分子诊断就是利用现代分子生物学和分子遗传学的技术方法，直接检测基因结构及其表达水平是否正常，从而对疾病作出诊断的方法。分子诊断以基因作为检查材料和探查目标，属于“病因诊断”针对性强。目前已经能够进行分子诊断的疾病包括:①染色体疾病的诊断和产前筛查。②单基因遗传病的分子诊断和产前诊断。单基因遗传疾病是由单个基因发生突变引起的疾病。已发现的人类单基因遗传病多达400种以上。目前,已经了解许多单基因遗传疾病的致病基因以及发病机制,如Marfan综合征、先天性肾上腺皮质增生症、糖原累积症、家族性高胆固醇血症。③多基因疾病的分子诊断。多基因疾病是危害人类健康的多发病、常见病,如恶性肿瘤、心血管疾病（动脉粥样硬化、高血压等）、糖尿病、精神-心理疾病（精神分裂症、忧郁症等）。这些疾病的分子病因十分复杂,可采用已知基因标志的连锁分析和关联分析方法,对未患病个体进行患病危险性预测,以及对上述疾病进行亚型的基因分型和鉴定等辅助诊断,以利于疾病的正确治疗。④感染性疾病的基因诊断。⑤恶性肿瘤的分子诊断。
二、心血管疾病检测常用的分子生物学技术
心血管疾病是一种与多基因有关的复杂疾病，其发生、发展与多基因位点变异及表达异常有关。高血压、冠心病等心血管疾病, 是由于环境与遗传因素相互作用引起, 涉及多基因的参与, 机制复杂, 分离与克隆相关基因是了解这些疾病机理的基础。研究相关细胞和组织在生理、病理或药物处理状态下的基因表达谱, 分析基因表达差异, 可以为筛选疾病候选基因, 阐释疾病的机理提供重要信息。
分子诊断的常用技术方法有：①核酸分子杂交技术，包括Southern印迹（Southern blot杂交），Northern印迹（Northern blot杂交），斑点杂交（dot blot），原位杂交（insituhybridization）等；②PCR及相关应用技术，包括等位基因特异寡核苷酸探针（Allele Specific Oligoneucliotides，ASO）杂交法、单链构象多态（Single Strand Conformation Polymorphism，SSCP）分析、DNA限制性片段长度多态性（Restrictionfragment Length Polymorphism，RFLP）分析、微卫星DNA
分析技术等。③基因测序是基因突变检测的最直接最准确的方法它不仅可确定突变的部位还可确定突变的性质。④基因组学及分析技术，包括基因芯片、DNA 微阵列（DNA microarray）技术等，利用核酸分子杂交原理，可用于大规模筛选和基因表达研究。⑤蛋白质组学及分析技术，作为功能基因组研究的重要支柱，研究的是在不同时间和空间发挥功能的特定蛋白质群体，从而揭示和说明生命活动的基本规律。⑥荧光原位杂交染色体分析技术（FISH），这项实用技术不仅可用于基因在染色体上的定位研究，而且可直接用于实验室诊断。⑦波谱核型分析技术（Spectral karyotyping，SKY）主要用于肿瘤细胞的遗传学分析，检测复杂的细胞遗传学异常，也可用于比较细胞遗传学的种间进化差异性研究等方面。⑧分子生物学相关技术的发展及作用，其中应用较多的有：一是毛细管电泳技术（capillary electrophoresis，CE）现已广泛应用于病原体、肿瘤和遗传病的基因诊断，如病原体特异基因检测、基因突变检测、序列分析等；二是液质联用质谱技术（LC/MS/MS），可在短时间内通过检测血液中氨基酸或酰基肉碱水平异常可快速筛选出近30种基因遗传性代谢紊乱疾病在多肽、激素、寡核苷酸以及药物成分分析等方面应用广泛；三是变性高效液相色谱技术，可自动检测单碱基替代及小片段核苷酸的插人或缺失。
（一）DNA 微阵列（DNA microarrays）
DNA微阵列（DNA microarrays）广泛应用于基因的序列分析、基因组图谱分析、基因突变与基因多态性分析以及疾病的基因诊断等方面。1999年基因微阵列技术应用于心血管系统的研究以来,在心血管病相关基因差异表达分析、疾病分子分型、基因突变检测和多态性分析等方面取得了一些进展。
DNA微阵列也叫DNA芯片、基因芯片（genechip），将数以万计的DNA探针固化于支持物表面上,产生二维DNA探针阵列,然后与标记的样品进行杂交,通过检测杂交信号来实现对生物样品快速、并行、高效的检测或医学诊断。由于常用硅芯片作为固相支持物,运用了计算机芯片的制备技术,所以称之为基因微阵列或基因芯片技术。其基本原理是分子杂交,类似于Southern和Northern印迹杂交技术,通过探针与固定于芯片上的大量cDNA、表达序列标签（Expressed Sequence Tags，EST）或寡核苷酸的杂交，通过检测杂交信号的强弱进而判断样品中靶分子的数量，具有高通量、简便、微缩、集约化、平行化等优点。
基因表达谱芯片和基因诊断芯片是基因芯片的两种重要形式,前者可以提供待测组织的基因表达谱,即组织中基因整体的表达情况;后者则主要是通过检测疾病相关基因突变或者表达改变等信号来诊断疾病的发生。
人类共有35000多个基因,2001年哈佛大学附属医院心血管研究中心用3种统计方法确定了26000多个与人类心血管系统有关的基因,结果表明与人类心血管系统有关的基因占人体基因的3/4,这也是全世界第一次建立这样的基因库。并确定了200多个与心功能衰竭有关系的病态基因。心血管系统生理功能和病理改变的分子机制十分复杂,与心血管系统生理和病理过程相关的信号转导系统也是一个综合的调控网络,其状态的描述是传统的单因素研究理论和方法所不能承担
的,需要借助复杂系统的研究理论和方法来完成。而以往对心血管疾病的研究,都是采取一种疾病用一个基因检测的传统方法,存在诸多不便,不能满足当前医学领域飞速发展的需求。而微阵列芯片利用高度集成的cDNA/EST片段或寡核苷酸微阵列,使大规模、高通量同时检测成千上万种组织或细胞内的基因的表达成为可能,达到了一定意义上的全基因表达谱的检测。EST是长150～500bp的基因表达序列片段,EST技术是将mRNA反转录成cDNA并克隆到载体构建成cDNA文库后,大规模随机挑选cDNA克隆,对其5′或3′端进行一步法测序,所获序列与基因数据库已知序列比较,从而获得对生物体生长发育、繁殖分化、遗传变异、衰老死亡等一系列生命过程认识的信息。心血管系统基因组DNA数目庞大,含有重复序列和非编码序列,如完全采用克隆筛选和排列的方法获得其编码基因序列,大量的时间和精力将被消耗在模板DNA的制备上。因此采用此技术在短期内即得到大量来自cDNA文库的表达序列,即表达标签序列（ESTs）,将其制备成ESTs微阵列是目前寻找和发现新基因及心血管疾病相关基因的快速有效方法。
目前,在心脏的研究中,微阵列芯片技术主要用于检测心肌重塑模型（包括缺血损伤、拟神经递质/激素刺激造成的心肌重塑和不同发育阶段的心肌重塑等模型）的基因表达谱、病毒性心肌炎的针对治疗及心血管疾病的基因表达差异与病理状态下分子机制的研究等方面。
DNA微阵列技术近年被应用于冠状动脉疾病、心肌梗死、心衰和一些先天性心脏病的研究中, 用来比较患者的基因表达差异, 也用于研究内皮细胞、血管平滑肌细胞、免疫细胞在心肌梗死、冠状动脉疾病中的变化。
（二）基因表达序列分析（Serial Analysis of Gene Expression, SAGE）SAGE 技术最初由Velculescu 等人建立, 与微阵列技术一样, SAGE 技术可同时扫描上千个基因的表达, 可获得完整的转录谱, 是一个非常有效的分析基因表达的方法。
SAGE技术基本原理是, 在一个基因转录本内部特定位置上, 有能代表一个基因的短序列标签,多个SAGE标签连结在一起, 连到克隆载体上, 测序。每个SAGE 标签理论上代表一个转录本, 基因表达差异可以通过比较特定SAGE 标签在不同文库间表达丰度的差异来表示。相对于微阵列技术,SAGE 在心血管疾病研究中的应用还是较为有限。
目前, 正常人心脏的SAGE文库已经建立, 也有报道建立了正常鼠心脏的基因表达谱。在心血管发育、动脉粥样硬化、脂代谢调节等许多领域都可应用SAGE技术。在Schwartz等的研究中, 利用SAGE 技术识别鼠心脏血管紧张素Ⅱ（ANGⅡ）调节靶位点, 发现了一些新的ANGⅡ调节靶位点。
（三）代表性差异分析（representational difference analysis of cDNA, cDNA RDA）Hubank等1994年建立cDNA RDA 技术。之后cDAN RDA 被广泛应用于各个领域的基因克隆, 如肿瘤特异基因、分化相关基因、器官特异基因、刺激信号诱导表达基因等。这项技术的原理为: 用识别4个碱基的限制性内切酶对双
链cDNA进行消化, 理论上将产生平均大小为256bp的DNA片段, 因此细胞中绝大多数表达的基因至少有两个酶切位点, 即产生一个两端带有可识别和处理的末端片段, 可以进行后续的扩增、消减、富集等操作。
在对心血管疾病的研究中, 如内皮细胞, 动脉硬化斑块等, 也有RDA技术的应用。Tyson等应用RDA方法研究正常人和动脉粥样硬化患者血管中基因表达差异, 发现了包括炎症反应、免疫反应的相关基因在内的31个差异表达的基因, 为粥样硬化形成机理的免疫反应学说提供证据。
（四）蛋白质组学方法
蛋白质组（proteome）指一个细胞或一种组织基因组所表达的全部蛋白质。是由Wilkins 在1994 年首先提出, 并于1995年首次在文献中阐述。蛋白质组学方法是通过对比正常细胞与不同处理条件下的细胞或疾病细胞蛋白质表达谱的不同, 发现不同情况下蛋白质表达的变化, 是一种在蛋白质水平的差异显示。
该技术基本方法为: ①样品制备; ②蛋白质的分离, 常用分离方法有双向凝胶电泳（2- DE）、离子交换、分子筛法、高效液相色谱法（HPLC）、毛细管电泳、质谱（MS）等技术; ③蛋白质成像; ④蛋白质的鉴定: 在分离及检测之后, 要进行蛋白质鉴定。
蛋白质组学技术在心血管疾病研究中广泛应用。研究者已在心血管蛋白质组研究中识别了能量代谢相关蛋白、细胞骨架蛋白、热休克蛋白等多种蛋白质的变化。
在扩张型心肌病的分子机制方面, 已发现近100种心肌在扩张型心肌病的心肌中蛋白质明显减少, 大致分为三类: 细胞骨架及肌纤维蛋白, 与线粒体及能量产生相关的蛋白, 与应激反应相关蛋白。
在对心血管疾病中平滑肌细胞机能紊乱的研究中, 也有蛋白质组学方法的应用。Dupont等用2- D方法研究动脉平滑肌细胞, 发现患者中有83个细胞内蛋白、18 个分泌蛋白表达不同。Mayr 等应用2- D 与MS研究PKC delta 对血管平滑肌细胞的作用, 结果PKC 缺少的细胞中有30 种以上的蛋白质改变, 包括涉及葡萄糖代谢、脂代谢的酶,及谷光甘肽循环、细胞骨架相关蛋白。证明PKC delta在葡萄糖代谢、脂代谢、控制细胞氧化还原态、SMC 细胞分化的过程中是关键调节因素。
在基因表达分析方法中, 没有一种方法能够适合于所有要研究的问题, 需要根据所研究问题的特点, 选择不同的方法, 也可以将几种方法结合使用。上文中的几种技术都有自己的缺点, 包括成本问题、灵敏度问题、操作复杂等。具体实验中还需根据不同目的、不同实验许可条件进行选择。另外, 新技术的出现往往会带来科学研究的巨大进展,PCR 技术就是一个很好的例证, 因此, 发展新技术也是科学研究中一个不可忽视的重要方向。
（五）第二代测序技术的发展
随着二十世纪中期 DNA 双螺旋结构的发现，至今生命科学可谓是在半个世
纪的时间里进行了迅猛的发展，人类对自己的机体了解程度越来越深刻，对于疾病的认识需求也越来越迫切，利用遗传信息来了解疾病，更是从源头来了解疾病本身，并由此延伸出多个学科。进行基因组学研究最基础的技术手段是DNA 测序技术，在双螺旋结构发现后，科学家迅速展开了对测序技术的研究，第一代测序就是在这样的背景下出现的，上个世纪七十年代先后出现了两种测序技术，产生了划时代的影响，其中一种是至今为止还在使用并且做出突出贡献的sanger 测序法，是由 Frederick Sanger 发明的，称为双脱氧链终止测序法。另外一种是化学讲解法，由 Walter Gilbert 发明。虽然第一代测序在发明之后的时间里为人类基因组学研究贡献了不可磨灭的贡献，完成了很多相关基因组学研究工作，其中规模庞大人类基因组计划（Human Genome Project，HGP），前后跨越两个世纪，将近 13 年时间，耗费 30 亿美元，集中了全球最顶尖的生物学专家，仅仅是完成了单个人体的基因组图谱。由此可以看出，第一代测序存在着耗时长、耗费大等问题，不适合大规模应用于人类疾病的基因组学研究。进入二十一世纪之后第二代测序技术（Next Generation Sequencing，NGS）得到飞速发展，尽管 NGS 在 2004 年才开始得到商业应用，但是它已经有能力影响到我们对全基因组生物学问题的探索，并且在短短的几年时间，已经有超过 100 项关于 NGS 的技术平台被开发出来，这些技术不仅仅耗时短、耗费低、通量高，而且也加速促进人类对测序数据读取的多样性需求，使 DNA 测序技术大规模应用人类疾病研究成为了可能，因此 NGS 完全彻底地改变了我们对基因组学的研究，开放了许多新的研究领域，包括始祖基因的探索、生物多样性的特征描述以及复杂疾病未知病因的识别等等，并且随着 NGS 的迅猛发展，与此相关的生物信息学技术也随之快速发展。
经过几年的发展，目前应用于大规模并行测序的主流平台主要包括：Roche 公司的 454 FLX、Illumina 公司的 Solexa Genome Analyzer/HiSeq System 和美国应用生物系统公司 the Applied Biosystems SOLiDTM System。这三家公司研发的NGS 平台代表了目前高通量测序技术水平，也是应用最为广泛的主流平台。如
表1-1 所示，这三种技术有着各自的特点。
表1-1 第二代测序技术的比较
Table 1-1 Comparison of Next-Generation Sequencing Systems. 测序平台测序原理读长精确度测定序列输出数据量时间
454 FLX 焦磷酸测序700bp 99.9% 1M 0.7Gb 24 小时
50bp(SE)
Solexa 边合成边测序50bp(PE) 98% 3G 600Gb 3~10 天
100(PE)
50+35?bp
or 7 天(SE) SOLiD 连接法测序99.9% 1200M 120Gb
50+50?bp 14 天(PE) 注：SE=Single-end; Paired-end=PE; bp=base pair
作为第一个商业化应用的第二代测序平台，Roche 公司的 454 FLX 系统采用的是焦磷酸测序技术。其基本原理是：在每一轮的核苷酸合成中通过加入DNA 聚合酶导致焦磷酸盐的释放，从而引起一系列的下游反应，最终依靠荧光素酶等生物酶产生可捕捉的光学信号。具体过程如图 1-1 所示。从图 1 和表 1我们可以看出，焦磷酸测序技术的特点是：它的读长可以达到 700bp，准确率为99.9%，并且 24 小时内就可以完成 0.7Gb 的数据输出量，最突出的优点就是速度和核酸读取长度，但是数据产出量与另外两种测序平台相比较少，并且高额的费用也是 454 平台广泛使用的一个挑战。
图1-1焦磷酸测序技术原理
NGS 还可以应用于肿瘤标志物的检测、感染性疾病的诊断及耐药性检测。目前已经应用于医学临床检测的项目包括：遗传性肿瘤易感基因检测、个体化用药指导、无创产前 DNA 检测、新生儿遗传代谢病筛查以及单基因遗传病检测等。1997 年牛津大学的研究团队首次从孕妇血浆中提取到胎儿DNA，并应用于性别诊断。DNA 测序技术发展至今，针对胎儿利用 NGS 进行无创产前诊断技术已经成功应用于临床，降低了不良胎儿的出生率。对于乳腺癌患者来说，如果能够在发病早期通过 NGS 检测到 BRCA 基因高表达，就可以及时给与干预，甚至使患者得到治愈的机会，Feliubadaló的研究团队已经证实 BRCA 基因的突变会导致乳腺癌的发生，也是目前较为准确的 NGS 预测疾病发生的应用之一。曾经造成较为严重公共卫生问题的 H7N9 流感病毒是由中国卫生部病原体系统生物学重点实验室研究人员通过 NGS 技术鉴定发现的。靶基因治疗药物注射用曲妥珠单抗，又名赫赛汀，已经成为人类表皮生长因子受体 2(human epidermalgrowth factor receptor-2, HER2)过度表达的转移性乳腺癌的一线用药，并且逐步开展的临床试验表明在许多上皮性肿瘤中，如果 HER2 表达过高，赫赛汀是适用的，可以有效提高患者的生存率。
三、分子生物学技术在心血管疾病中的应用
（一）在筛查心血管疾病中的应用
基因筛查并非金标准，发现突变并不能完全预测、预后或确诊，因为有些致病細携带者可能终生不发病尤其是错义突变，需要进一步进行功能研究。但是基因筛查相对于临床诊断有很好的时效性，可以在发病前或在出现严重临床事件前及时采取相应的预防措施，降低猝死率。每一种检查都有一定的特异度和灵敏度，不能将各种疾病不完全外显造成假阳性而完全否定基因诊断的前景，存在致病基因突变有进一步发展致病的易感性，因此对于这部分病人建议进行跟踪随访。尽
管目前研究还不能明确肯定特定基因突变对患者临床及预后的价值，但基因筛查对心血管患者的诊断和临床治疗仍具有不可估量的意义。
应用分子诊断技术进行疾病筛查，可以实现目前的诊断——治疗模式，转向预测——预防及个体化模式。应用分子诊断技术，可对部分心血管疾病进行筛查。青少年猝死的常见原因为肥厚型心肌病。深入了解肥厚型心肌病的遗传基础对理解这种最常见的心血管遗传疾病及给予最适合的处理具有重要意义。肥厚型心肌病发病涉及的基因有很多种，每种基因的突变部位又分布在不同的外显子及内含子上，因此，对肥厚型心肌病进行人群筛选必须寻找一种经济方便的方法。应用分子诊断技术进行基因筛査改变了传统的肥厚性心肌病（Hypertrophic Cardiomyopathy，HCM）诊断方法，患者可以不依赖心室肥厚，而在发病以前就可以得到诊断（临床前诊断）。2010年V oelkerding等人报道：应用新一代测序技术（Next generation sequencing，NGS）为肥厚性心肌病的筛查及诊断提供了新方法。学者们用长片段PCR技术扩增HCM中的基因片段，发现Myosin，heavy chain 6、7（MYH6、7）、Myosin，light chain 2、3（MYL2、3）等16个基因中共有个突变点可以用来筛查HCM，提高了疾病筛查的敏感性。
现在的研究也表明，致心律失常性右室心肌病（Arrhythmogenic Right Ventricular Cardiomyopathy，ARVC）是一种桥粒病桥粒功能异常是致病的最后通路，非桥粒基因可能通过影响桥粒发挥作用，而非桥粒基因迄今为止发现的家系及突变数目有限，因此建议先筛査桥粒成分基因，可对ARVC进行筛查。2013年Campuzano等人针对家族中有成员发生心脏性猝死的15个西班牙家族进行基因检测及全身体格检查后发现DSP-p.Q986X的遗传变异对致心律失常性右室心肌病的发生具有预示意义。对于原发性高血压，尽管没有一个研究能够明确的易感基因但是针对多个基因的多个单核苷酸多态性进行筛查分析，可以实现在分子生物水平预防和治疗原发性高血压。
（二）在诊断心血管疾病中的应用
对不同的疾病需要采用不同的基因诊断策略以求达到最佳的诊断效能。目前分子诊断技术对于心血管疾病的基因诊断，主要应用于以下几个方面：
1．免疫法检测转录因子
免疫法检测转录因子是将预先制备好的与相应转录因子特异结合的双链DNA通过核酸粘附液包被于酶链板孔中，与待测样品充分反应后，进行相应转录因子的免疫反应及显色反应，从而达到检测核转录因子活性的目的。本项分子诊断技术中DNA的包被不需特殊的预活化试剂和特殊的表面，具有包被省时、检测过程简便、无需特殊的仪器设备、适合作高通量检测、无放射性污染、灵敏度高和定量准确等优点。
与心脏发育、生长相关的遗传因素可直接导致许多心脏疾病的形成。转录因子Nkx2.5是心脏前体细胞分化的最早期标志之一，与心脏发育密切相关，Nkx2.5基因突变导致先天性心脏病的发生。2013年Huang通过免疫法和基因及基因功能分析发现，转录因子Nkx2.5基因上游增强子的两个杂合DNA变异序列对小
部分室间隔缺损的先天性心脏病发挥作用，通过这样的遗传研究能为先心病的治疗提供策略。
2．聚合酶链反应法检测外显因子
PCR是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，为最常用的分子生物学技术之一。PCR能快速特异扩增任何已知目的基因或DNA片段，并能轻易在皮克（pg）水平起始DNA混合物中的目的基因扩增达到纳克、微克、毫克级的特异性DNA片段。因此，PCR技术一经问世就被迅速而广泛地用于分子生物学的各个领域。它不仅可以用于基因的分离、克隆和核苷酸序列分析，还可以用于突变体和重组体的构建基因表达调控的研究，基因多态性的分析，遗传病和传染病的诊断等诸多方面。
GATA-4基因与先天性心脏病关系密切在心脏的发育过程中发挥着重要作用，它的单个或多个基因的突变及异常表达均可能会导致心脏畸形的发生，如房间隔缺损、法洛四联症、室间隔缺损等，应用PCR技术对血液标本中GATA-4基因3，4，5，6外显子对引物进行PCR检测，扩增产物进行琼脂糖凝胶中电泳，可进行定性定量分析，即可对冠心病（Coronary Heart Disease，CHD）进行诊断。另外，2013年最新研究发现，Wei等人通过PCR技术发现GATA-5基因中有两个杂合突变位点p.R187G和p.H207R，均可导致法洛四联症的发生，并为人法洛四联症的早期预防和等位基因治疗法提供策略。
3．基因单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）检测SNP是一种最常见的可遗传变异，可分为两种形式，一是基因编码区的SNP，称为cSNP；二是遍布于基因组的大量单碱基变异，已广泛地应用于疾病的连锁分析及关联分析、肿瘤的杂合性缺失研究、疾病遗传机制研究、个性化用药研究等诸多领域。例如ARVC可以对PKP-2、TGFB-3和DSP等相关突变基因进行单核苷酸多态性检测，分析基因型的差异，以探讨其基因多态性与疾病的相关性。也可以将检测结果通过与人类基因组序列多态性数据库（dbSNP）进行序列比较，选择相应的多态性位点并在家系其他成员中进行序列测定和比较分析，可得出相应的结论。
4．基因突变检测
根据心血管疾病相关的目标基因，提取病人基因组DNA，可应用基因扩增和单链构象多态分析（PCR-SSCP）等分析技术，与正常对照组比较，即可对突变基因进行检测。同时，还可将扩增产物上高效液相色谱技术（Denaturing High Performance Liquid Chromatography，DHPLC）进行分析，与正常组比较，分析其差异性，只要存在差异便可认为有异常。PCR-SSCP是在不测序情况下检测核酸变异的敏感方法。SSCP突变检出敏感性35%~100%不等，当DNA片段长度在300bp以内时，SSCP分析检测基因突变的准确性为90%~100%。采用SSCP 分析与毛细管电泳方法相结合技术，结果可使基因突变的检出敏感性达100%，并具有高通量检测的优点。例如，对先天性长QT综合征（CLQTS），可对其中的LQT1-3（KCNQ1、KC-NH2、SCN5A）等相关突变基因进行检测，分析基因
型的差异，即可对这种遗传学心肌病进行诊断。
5．致病基因DNA测序
DNA测序技术使直接检测核苷酸突变成为可能，而不仅仅是基因片段的多态性分析使临床分子诊断更加精确。常用于探针设计、特异引物合成、基因结构分析等，在遗传病诊断、微生物种属鉴定、肿瘤诊断等领域广泛应用，人类基因组计划就是由于大规模自动化测序技术的发展而顺利完成的。但由于DNA测序方法复杂一般临床实验室无法进行，有必要时可委托有条件的公司或研究机构进行。各种基因序列可由Genbank上获得，根据基因序列设计特异性引物，进行基因扩增，扩增产物可以进行测序检测，通过与人类基因组序列数据库（Build 36.3）进行序列比较也可将测序结果与正常序列进行比对即可得出结果。目前大部分遗传性高血压的基因诊断多依赖于直接的DNA测序技术，通过对致病基因的序列分析，可发现导致基因功能异常的各种形式的突变。
6．DNA甲基化检测
很多研究显示，基因表观遗传学的改变与动脉粥样硬化有着密切的关系，例如诱导同型半胱氨酸含量升高，可以改变人血管平滑肌细胞DNA甲基化的改变，从而导致动脉粥样硬化的发生，异常的DNA甲基化使血管平滑肌细胞增殖，并从中膜迁移至内膜参与形成动脉粥样硬化斑块。除全基因组甲基化的变化与冠心病相关，一些特异性的基因甲基化也影响动脉粥样硬化的进展，如雌激素受体基因、P53基因、细胞外超氧化物歧化酶基因等。通过对动脉粥样硬化相关的DNA 甲基化水平进行检测，即可了解动脉粥样硬化的进程。常用的甲基化检测方法有：限制性内切酶法、亚硫酸氢盐处理法和DNA芯片技术等。同样的方法可以应用于原发性高血压的诊断。
7．miRNA检测
miRNA参与调控动脉粥样硬化相关因素，包括内皮细胞的生长、分化、死亡和凋亡，以及内皮祖细胞、炎症细胞、细胞因子、脂质的调节等，从而促进动脉粥样硬化的发生发展。对相关的miRNA进行检测，可对动脉粥样硬化的发生、发展及预后进行诊断，目前国内外miRNA检测方法主要有：miRNA芯片、高通量测序法（Ⅱlina/Solexa）、Northern blot法和荧光实时定量逆转录PCR （QRT-PCR）法等。最新研究发现，通过QRT-PCR的方法证实MicroRNA-663是调节血管平滑肌细胞表型的改变的开关，同时可以调节血管新生内膜的形成，从而影响动脉粥样硬化的发生发展。
（三）在治疗心血管疾病中的应用
1．新药研发应用
由于大部分心血管疾病与基因相关，而且往往与多基因相关，因而，利用DNA芯片可以寻找基因与疾病的相关性，从而研制出相应的药物和提出新的治疗方法。新药物的开发常需筛选上千种化合物，在寻找作用于蛋白质的药物时如利用靶蛋白制成芯片来直接筛选与其作用的化合物，将极大地提高药物开发的效率，实现高通量和自动化。同时，蛋白质芯片有助于研究药物与其效应相关蛋白
质之间的相互作用，也是寻找药物作用靶点的有力工具。
2．个性化药物治疗
药物基因组学（pharmacogcnomics）是一门基于功能基因组学与分子药理学的科学，它从基因水平研究基因多态性与药物效应多样性之间的关系。应用药物基因组学可以指导个体化医疗（personalized medicine）方案的制定，提高用药的安全性和有效性避免严重不良反应，减少药物治疗的风险和费用。同时可以根据药物基因多态性检测结果选择适合的治疗药物，避免一些副作用的发生。还可以根据药物代谢酶的基因多态性设计合适的用药剂量。例如，先天性长QT综合征（CLQTS）是一种以编码离子通道基因突变为基础的遗传性疾病其治疗必须针对各个遗传背景的差异而选择针对性的个体化治疗。
3．治疗方案选择
儿茶酚胺敏感性多形性室性心动过速（Catecholaminergic Polymorphic Ventricular Tachycardia，CPVT）是一种遗传性心肌病基因检测对该病的诊治至关重要。症状发生前获得该病遗传学诊断可及时对此种高致命性疾病进行预防，对疑似患者的早期诊断和治疗非常重要，如果诊断RyR2突变，可进行性别危险分层，男性患者预后更差，因此对该组人群应进行有效监测和积极治疗。
（四）预后评价
随着HCM致病基因的不断发现，进行了不少基因型与表型及预后关系的分析，研究，提出分子诊断可能会对患者的危险度分层有帮助，尤其是对猝死危险性，并且提出了“良性突变”和“恶性突变”的观点。有些基因突变的携带者症状出现晚或症状轻微甚至可正常存活如A-原肌凝蛋白及cTnI上的某些突变；而有些突变携带者症状出现早，病情严重，甚至发生猝死报道较多的为cTnT和B-MHC上的某些基因突变。既往研究表明肌球蛋白结合蛋白C基因突变携带者预后较好，而B-MHC基因突变预后较差，cTnI基因突变携带者虽然心脏肥厚不明显，但猝死发生率高。常规对患者进行基因突变位点筛查可以提供重要的诊断和预后信息。
总之，分子诊断技术在心血管疾病诊疗上的应用，可实现以下几个方面的转变。第一，可实现治疗模式的转变，从注重疾病诊治到对生命全过程的健康监测，重预防，治未病。第二可实现学科研究重点的前移从生命后期前移至生命前期疾，病发生之前以至个体发生之前控制出生缺陷。第三，可推行个性化治疗。但是我们也要清醒的认识到，分子诊断技术在心血管疾病的诊疗上还处于初级阶段，离临床的推广应用还有很长段距离，也应成为医学利学工作者奋斗的目标。
（柯晓）
分子生物学前沿技术
分子生物学前沿技术 The Standardization Office was revised on the afternoon of December 13, 2020
激光捕获显微切割Laser capture microdissection (LCM) technology是在不破坏组织结构，保存要捕获的细胞和其周围组织形态完整的前提下，直接从冰冻或石蜡包埋组织切片中获取目标细胞，通常用于从中精确地分离一个单一的细胞。 背景：机体组织包含有上百种不同的细胞，这些细胞各自与周围的细胞、基质、血管、腺体、炎症细胞或相互粘附。在正常或发育中的组织器官内，细胞内信号、相邻细胞的信号以及体液刺激作用于特定的细胞，使这些细胞表达不同的基因并且发生复杂的分子变化。在状态下，如果同一类型的细胞发生了相同的分子改变，则这种分子改变对于疾病的发生可能起着关键性的作用。然而，发生相同分子改变的细胞可能只占组织总体积的很小一部分；同时，研究的目标细胞往往被其它组织成分所环绕。为了对疾病发生过程中的组织损害进行分子水平分析，分离出纯净的目标细胞就显得非常必要。1996年，美国国立卫生院（NIH）国家肿瘤研究所的[2]开发出激光捕获显微切割技术（Laser capture microdissection ， LCM ），次年，美国Arcturus Engineering公司成功研制激光捕获显微切割系统，并实现商品化销售。应用该技术可以在显微镜直视下快速、准确获取所需的单一细胞亚群，甚至单个细胞，从而成功解决了组织中细胞异质性问题。这项技术现已成为美国“肿瘤基因组解剖计划”的一项支撑技术[1]。 原理：LCM的基本原理是通过一低能脉冲激活热塑膜———乙烯乙酸乙烯酯（ethylene vinylacetate，EVA）膜（其最大吸收峰接近
分子生物学常用技术 习题
第五章常用分子生物学技术的原理及其应用习题（引自网络精品课程） 一、选择题 （一）A型题 1 ．分子杂交实验不能用于 A ．单链DNA 与RNA 分子之间的杂交 B ．双链DNA 与RNA 分子之间的杂交 C ．单链RNA 分子之间的杂交 D ．单链DNA 分子之间的杂交 E ．抗原与抗体分子之间的杂交 2 ．关于探针叙述错误的是 A ．带有特殊标记 B ．具有特定序列 C ．必须是双链的核酸片段 D ．可以是基因组DNA 片段 E ．可以是抗体 3 ．下列哪种物质不能用作探针 A ．DNA 片段 B ．cDNA C ．蛋白质 D ．氨基酸 E ．RNA 片段 4 ．印迹技术可以分为 A ．DNA 印迹 B ．RNA 印迹 C ．蛋白质印迹 D ．斑点印迹 E ．以上都对 5 ．PCR 实验延伸温度一般是 A ．90 ℃ B ．72 ℃ C ．80 ℃ D ．95 ℃ E ．60 ℃ 6 ．Western blot 中的探针是 A ．RNA B ．单链DNA C ．cDNA D ．抗体 E ．双链DNA 7 ．Northern blotting 与Southern blotting 不同的是 A ．基本原理不同 B ．无需进行限制性内切酶消化 C ．探针必须是RNA D ．探针必须是DNA E ．靠毛细作用进行转移 8 ．可以不经电泳分离而直接点样在NC 膜上进行杂交分析的是 A ．斑点印迹 B ．原位杂交 C ．RNA 印迹 D ．DNA 芯片技术 E ．DNA 印迹 9 ．下列哪种物质在PCR 反应中不能作为模板 A ．RNA B ．单链DNA C ．cDNA D ．蛋白质 E ．双链DNA 10 ．RT-PCR 中不涉及的是 A ．探针 B ．cDNA C ．逆转录酶 D ．RNA E ．dNTP 11 ．关于PCR 的基本成分叙述错误的是 A ．特异性引物 B ．耐热性DNA 聚合酶 C ．dNTP D ．含有Zn 2+ 的缓冲液 E ．模板 12 ．DNA 链末端合成终止法不需要 A ．ddNTP B ．dNTP C ．引物标记 D ．DNA 聚合酶 E ．模板 13 ．cDNA 文库构建不需要 A ．提取mRNA B ．限制性内切酶裂解mRNA C ．逆转录合成cDNA D ．将cDNA 克隆入质粒或噬菌体 E ．重组载体转化宿主细胞 14 ．标签蛋白沉淀是 A ．研究蛋白质相互作用的技术 B ．基于亲和色谱原理 C ．常用标签是GST D ．也可以是6 组氨酸标签 E ．以上都对 15 ．研究蛋白质与DNA 在染色质环境下相互作用的技术是 A ．标签蛋白沉淀 B ．酵母双杂交 C ．凝胶迁移变动实验 D ．染色质免疫沉淀法 E ．噬菌体显示筛选系统 16 ．动物整体克隆技术又称为
分子生物学前沿技术
激光捕获显微切割Laser capture microdissection (LCM) technology是在不破坏组织结构，保存要捕获的细胞和其周围组织形态完整的前提下，直接从冰冻或石蜡包埋组织切片中获取目标细胞，通常用于从组织中精确地分离一个单一的细胞。 背景：机体组织包含有上百种不同的细胞，这些细胞各自与周围的细胞、基质、血管、腺体、炎症细胞或免疫细胞相互粘附。在正常或发育中的组织器官内，细胞内信号、相邻细胞的信号以及体液刺激作用于特定的细胞，使这些细胞表达不同的基因并且发生复杂的分子变化。在病理状态下，如果同一类型的细胞发生了相同的分子改变，则这种分子改变对于疾病的发生可能起着关键性的作用。然而，发生相同分子改变的细胞可能只占组织总体积的很小一部分；同时，研究的目标细胞往往被其它组织成分所环绕。为了对疾病发生过程中的组织损害进行分子水平分析，分离出纯净的目标细胞就显得非常必要。1996年，美国国立卫生院（NIH）国家肿瘤研究所的[2]开发出激光捕获显微切割技术（Laser capture microdissection ，LCM ），次年，美国Arcturus Engineering公司成功研制激光捕获显微切割系统，并实现商品化销售。应用该技术可以在显微镜直视下快速、准确获取所需的单一细胞亚群，甚至单个细胞，从而成功解决了组织中细胞异质性问题。这项技术现已成为美国“肿瘤基因组解剖计划”的一项支撑技术[1]。 原理：LCM的基本原理是通过一低能红外激光脉冲激活热塑膜———乙烯乙酸乙烯酯（ethylene vinylacetate，EVA）膜（其最大吸收峰
接近红外激光波长），在直视下选择性地将目标细胞或组织碎片粘到该膜上[2]。LCM 系统包括倒置显微镜、固态红外激光二极管、激光控制装置、控制显微镜载物台（固定载玻片）的操纵杆、电耦合相机及彩色显示器。用于捕获目标细胞的热塑膜直径通常为6mm，覆在透明的塑料帽上，后者恰与后继实验所用的标准 0.5ml离心管相匹配。 机械臂悬挂控制覆有热塑膜的塑料帽，放到脱水组织切片上的目标部位。显微镜直视下选择目标细胞，发射激光脉冲，瞬间升温使EVA膜局部熔化。熔化的EVA膜渗透到切片上极微小的组织间隙中，并在几毫秒内迅速凝固。组织与膜的粘合力超过了其与载玻片间的粘合力，从而可以选择性地转移目标细胞。激光脉冲通常持续0.5~5.0毫秒，并且可在整个塑料帽表面进行多次重复，从而可以迅速分离大量的目标细胞。将塑料帽盖在装有缓冲液的离心管上，将所选择的细胞转移至离心管中，从而可以分离出感兴趣的分子进行实验[3]。 EVA膜约100~200μm厚，能够吸收激光产生的绝大部分能量，在瞬间将激光束照射区域的温度提高到90°C，保持数毫秒后又迅速冷却，保证了生物大分子不受损害。采用低能量红外激光的同时也可避免损伤性光化学反应的发生。 优缺点：LCM最显著的优点在于其迅速、准确和多用途的特性。结合组织结构特点以及所需的切割精确度，通过选择激光束的直径大小，可以迅速获取大量的目标细胞。LCM与以显微操作仪为基础的显微切割技术相比[4]，具有以下优点：(1)分离细胞速度快，无需精巧的操作技能；(2)捕获细胞和剩余组织的形态学特征均保持完好，可以较
常用的分子生物学内容和相关技术
常用的分子生物学内容和相关技术 一、分子克隆（分子操作） 大肠杆菌中1．原核表达系统（PET28a，PET30a 等） 融合蛋白抗原免疫动物 原核表达系统蛋白转导系统（TAT） 大肠杆菌中
2．真核表达系统（pcDNA3）：用于transfection（基因转染） 在培养的动物细胞中 分子克隆的方法： ●选择合适的表达载体 ●选择酶切位点，设计PCR引物并合成 ●制备待克隆的靶基因
?PCR（来源培养细胞或组织、植物的mRNA cDNA） ?RT-PCR ?质粒中已克隆的目的片段 ?人工合成cDNA片段 退火后形成双链 二、细胞培养 ?动物细胞 ?植物细胞 ?原代细胞培养 ?传代细胞培养 三、探讨功能： 与细胞生长、增殖、凋亡的关系，检测mRNA、蛋白质的表达变化及意义 ?内源基因：或使内源基因表达抑制（RNAi, down-regulation）或缺失、突变 ?外源基因：通过transfection（基因转染）、电转移、显微微注射等方法将外源基因导入培养的细胞中过 表达（overexpression），在mRNA、蛋白质水平上 表达上调（up-regulation） ?信号传导：protein-protein interaction
◆Two hybrid system ◆Western blot ◆免疫荧光双标记图像分析 ?细胞:BrdU,Flow Cytometry（cell cycle，apoptosis） ?动物：成瘤 四、检测表达 ?DNA:Reporter gene(promoter activity),Hybridization （DNA-Southern blot，RNA-Northern blot，tissues or cells-in situ） ?RNA:RT-PCR，Real-time PCR,microRNA Gene chips:cDNA,microRNAs ?Proteins （tissues or cells-Western blot or immunohistochemistry，serum or conditional medium–ELISA）
分子生物学技术
分子生物学技术 近年来，心血管疾病的发病率和死亡率急剧增加，已成为危害我国人民群众生命和健康的重大疾病。人们逐渐认识到,包括心血管疾病在内的许多疾病的生理、病理机制的本质问题是相关基因的表达及其调控。随着研究的深入, 心血管疾病的研究已深入到分子生物学水平。人们寻找疾病相关基因, 研究其表达调控机制, 希望在分子水平阐明疾病发生机制, 以期更有效地进行疾病的诊断、治疗。相应地, 很多分子生物学研究技术也应用到对心血管疾病的研究中来, 成为不可或缺的基本手段, 如分子杂交技术、聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR）技术、反义核酸技术、DNA微阵列、转基因技术等等。分子诊断学是以分子生物学理论为基础，利用分子生物学的技术和方法研究人体内源性或外源性生物大分子和大分子体系的存在、结构或表达调控的变化，为疾病的预防、预测、诊断、治疗和转归提供信息和决策依据的一门学科。1953年Watson & Crich发现DNA 双螺旋结构, 标志着分子生物学时代的到来。随着研究的进展, 人们对心血管疾病的研究也逐步深入到分子水平, 很多分子生物学的研究技术也在疾病机理、药物机理的研究中广泛应用, 成为基本的研究手段。人类基因组计划完成后, 生命科学研究进入后基因组时代, 进行功能基因组学、蛋白质组学的研究, 相应的实验技术也广泛应用并不断发展。 在过去的短短的10余年中,检验医学发展日新月异、发展迅猛,临床实验室的实验设备已高度自动化及网络化，“实验室全自动化”（Total Laboratory Automation,TLA）、分子诊断（MolecularDiagnostics）、床旁检验（Point of Care Tests,POCT）、循证检验医学（Evidence basedlaboratory medicine,EBLM）的兴起为心血管疾病的诊疗提供了极大帮助。 一、分子生物学技术 由于分子生物学技术的快速发展,以及人类基因组序列认识的逐渐完善,以PCR为代表的体外核酸扩增技术已在临床基因诊断中得以较为广泛的应用,如病毒、细菌的基因快速检测,遗传性疾病的诊断,肿瘤的基因诊断等。实时荧光定量PCR技术的应用,不仅使临床基因检测更加快速,而且使基因检测进入定量阶段,这特别有利于某些疾病治疗效果的评价。免疫检验中的放射免疫分析（Radioimmunoassay，RIA）,酶免疫分析（Enzyme Iimrrmnoassay，EIA）,金标记免疫分析,荧光免疫分析（Fluoroimmunoassay，FIA）,时间分辨荧光免疫分析（Time-resolved Fluoroimmunoassay，TRFIA）,化学发光免疫分析（Chemiluminescence Immunoassay，CLI A）,电化学发光免疫分析（Electro-Chemiluminescence Immunoassay ，ECLI）技术的临床应用不仅拓宽了免疫学检测的领域,同时提高了免疫学检测的灵敏度,促进了免疫检测的自动化。特别是化学发光免疫分析、电化学发光免疫分析技术的诞生,使得免疫学检验进入了一个新的时代,检测灵敏度可达pg水平,其检测速度、分析自动化程度及分
分子生物学前沿技术培训资料
分子生物学前沿技术
激光捕获显微切割Laser capture microdissection (LCM) technology是在不破坏组织结构，保存要捕获的细胞和其周围组织形态完整的前提下，直接从冰冻或石蜡包埋组织切片中获取目标细胞，通常用于从组织中精确地分离一个单一的细胞。 背景：机体组织包含有上百种不同的细胞，这些细胞各自与周围的细胞、基质、血管、腺体、炎症细胞或免疫细胞相互粘附。在正常或发育中的组织器官内，细胞内信号、相邻细胞的信号以及体液刺激作用于特定的细胞，使这些细胞表达不同的基因并且发生复杂的分子变化。在病理状态下，如果同一类型的细胞发生了相同的分子改变，则这种分子改变对于疾病的发生可能起着关键性的作用。然而，发生相同分子改变的细胞可能只占组织总体积的很小一部分；同时，研究的目标细胞往往被其它组织成分所环绕。为了对疾病发生过程中的组织损害进行分子水平分析，分离出纯净的目标细胞就显得非常必要。1996年，美国国立卫生院（NIH）国家肿瘤研究所的[2]开发出激光捕获显微切割技术（Laser capture microdissection ，LCM ），次年，美国Arcturus Engineering公司成功研制激光捕获显微切割系统，并实现商品化销售。应用该技术可以在显微镜直视下快速、准确获取所需的单一细胞亚群，甚至单个细胞，从而成功解决了组织中细胞异质性问题。这项技术现已成为美国“肿瘤基因组解剖计划”的一项支撑技术[1]。 原理：LCM的基本原理是通过一低能红外激光脉冲激活热塑膜———乙烯乙酸乙烯酯（ethylene vinylacetate，EVA）膜（其最大吸
分子生物学常用技术考试题目及答案
1．P C R反应过程中，引物粘合所需温度一般是A．72℃ B．85℃ C．75℃ D．65℃ E．55℃ 2．PCR反应过程中，引物延伸所需温度一般是 A．95℃ B．82℃ C．72℃ D．62℃ E．55℃ 3．PCR反应体系不包括 A．模板DNA B．Taq DNA聚合酶C．特异性引物A、B D．ddNTP E．含Mg2+的缓冲液 4．PCR的循环次数一般为 A．5～10次B．10～15次C．15～20次D．20～25次E．25～30次 5．PCR反应体系与双脱氧末端终止法测序体系不同的是缺少 A．模板B．引物C．DNA聚合酶D．ddNTP E．缓冲液 6．Sanger法测序不需要 A．Klenow小片段B．引物C．dNTP D．标记dNTP E．ddNTP 7．Sanger法测序的基本步骤不包括 A．标记模板B．模板-引物杂交C．引物的延长与合成阻断 D．电泳E．放射自显影直读图 8．Sanger法测序的四个反应体系中应分别加入不同的 A．模板B．引物C．标记dNTP D．DNA聚合酶E．ddNTP 9．人类基因组计划的主要研究内容不包括 A．遗传图分析B．物理图分析C．转录图分析 D．序列图分析E．蛋白质功能分析 10．1996年，英国科学家克隆的Dolly羊所采用的技术是 A．转基因技术B．核转移技术C．基因剔除技术
D．肽核酸技术E．反义核酸技术 11．Maxam-Gilbert法与Sanger法测序的共同点是均需 A．引物B．Klenow大片段C．ddNTP D．化学裂解试剂E．电泳后放射自显影读图 12．Sanger法测序所得直读图像中，由终点至始点所读序列为 A．待测DNA5ˊ→3ˊ的碱基序列B．待测DNA3ˊ→5ˊ的碱基序列 C．待测DNA互补链3ˊ→5ˊ的碱基序列D．待测DNA互补链5ˊ→3ˊ的碱基序列E．引物5ˊ→3ˊ的碱基序列 13．PCR实验的特异性主要取决于 A．DNA聚合酶的种类B．反应体系中模板DNA的量 C．引物序列的结构和长度D．四种dNTP的浓度E．循环周期的次数14．基因剔除（knock out）的方法主要被用来研究 A．基因的结构B．基因的功能C．基因的表达 D．基因的调控E．基因的突变 15．反义核酸作用主要是 A．封闭DNA B．封闭RNA C．降解DNA D．降解DNA E．封闭核糖体的功能 16．有关Sanger法测序的叙述，不正确的是 A．只需标记一种dNTP B．一般应去除DNA聚合酶I 的5ˊ→3ˊ外切酶活性C．与dNTP相比阻断剂应尽可能的多D．反应时间不必太长 E．应采用超薄高压电泳 17．经电泳后将DNA转移至NC膜上的技术是 A．Southern blotting B．Northern blotting C．Western blotting D．Eastern blotting E．in situ hybridization
第十二章 常用分子生物学技术的原理及其应用
第十二章常用分子生物学技术的原理及其应用 一、选择题 A型题 1、用来分析蛋白质的技术是 A、Northern blotting B、Southern blotting C、Western blotting D、亲和层析 E、离子交换层析 2、用来分析DNA的技术是： A、Northern blotting B、Southern blotting C、Western blotting D、亲和层析 E、离子交换层析 3、下列哪一种不是核酸探针的标记 A、同位素标记 B、非同位素标记 C、地高辛标记 D、生物素标记 E、辣根过氧化物酶标记 4、当双链DNA经加热变性后，按下列哪种方式放置可获得单链DNA？ A、37℃水浴 B、室温 C、4℃冰箱 D、冰水或颗粒冰内 E、100℃水浴 5、与Southern blotting比较，核酸的Dot blotting中可省略的步骤是 A、电泳 B、核酸样品固定于NC膜 C、杂交信号检测 D、标记探针 E、制备样本核酸 6、原位杂交是指 A、在NC膜上进行杂交分析 B、在组织切片或细胞涂片上进行杂交分析 C、直接将核酸点在NC膜上进行杂交分析 D、在PVDF膜上进行杂交分析 E、在凝胶电泳中进行杂交分析 7、关于PCR引物的选择，下列哪项是错误的？ A、由于变性温度在95℃，故可选择具有二级结构的引物 B、尽可能选择(G+C)含量在50%左右并随机分配的引物 C、避免连续的多聚嘌呤顺序 D、反应过程中，每种引物的浓度一般在0、1 – 0、5 mol/L E、应避免两引物末端重叠形成二聚体 8、有关DNA链末端终止法的不正确说法是 A、需要dNTP B、需要ddNMP C、需要ddNTP D、dNTP:ddNTP的比例要合适 E、需要放射线同位素和荧光染料 9、用PCR技术完成对某一遗传病的疾病基因纯合性缺失的研究过程中不需要的 步骤为： A、受检者血白细胞的分离 B、白细胞DNA的制备 C、配制PCR反应体系 D、PCR反应及其产物的琼脂糖电泳 E、反应产物的SSCP分析 10、在DNA测序的化学裂解法中需要
常用的分子生物学基本技术
常用的分子生物学基本技术 核酸分子杂交技术 由于核酸分子杂交的高度特异性及检测方法的灵敏性，它已成为分子生物学中最常用的基本技术，被广泛应用于基因克隆的筛选，酶切图谱的制作，基因序列的定量和定性分析及基因突变的检测等。其基本原理是具有一定同源性的原条核酸单链在一定的条件下（适宜的温室度及离子强度等）可按碱基互补原成双链。杂交的双方是待测核酸序列及探针（probe）,待测核酸序列可以是克隆的基因征段，也可以是未克隆化的基因组DNA和细胞总RNA。核酸探针是指用放射性核素、生物素或其他活性物质标记的，能与特定的核酸序列发生特异性互补的已知DNA或RNA片段。根据其来源和性质可分为cDNA探针、基因组探针、寡核苷酸探针、RNA探针等。 固相杂交 固相杂交（solid-phase hybridization）是将变性的DNA固定于固体基质（硝酸纤维素膜或尼龙滤膜）上，再与探针进行杂交，故也称为膜上印迹杂交。 斑步杂交（dot hybridization） 是道先将被测的DNA或RNA变性后固定在滤膜上然后加入过量的标记好的DNA或RNA探针进行杂交。该法的特点是操作简单，事先不用限制性内切酶消化或凝胶电永分离核酸样品，可在同一张膜上同时进行多个样品的检测；根据斑点杂并的结果，可以推算出杂交阳性的拷贝数。该法的缺点是不能鉴定所测基因的相对分子质量，而且特异性较差，有一定比例的假阳性。 印迹杂交（blotting hybridization） Southern印迹杂交：凝胶电离经限制性内切酶消化的DNA片段，将凝胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至硝基纤维素膜或其他固相支持物上，经干烤固定，再与相对应结构的已标记的探针进行那时交反应，用放射性自显影或酶反应显色，检测特定大小分子的含量。可进行克隆基因的酶切图谱分析、基因组基因的定性及定量分析、基因突变分析及限制性长度多态性分析（RELP）等。 Northern印迹杂交:由Southerm印杂交法演变而来，其被测样品是RNA。经甲醛或聚乙二醛变性及电泳分离后，转移到固相支持物上，进行杂交反应，以鉴定基中特定mRNA分子的量与大小。该法是研究基因表达常用的方法，可推臬出癌基因的表达程度。 差异杂交（differential hybridization） 是将基因组文库的重组噬菌体DNA转移至硝酸纤维素膜上，用两种混合的不同cDNA探针（如：转移性和非转移性癌组织的mRNA逆转录后的cDNA）分别与滤膜上的DNA杂交，分析两张滤膜上对应位置杂交信息以分离差异表达的基因。适用于基因组不太复杂的真核生物（如酵母）表达基因的比较，假阳性率较低。但对基因组非常复杂的盐酸核生物（如人），则因工作量太大，表达的序列所占百分比较低（仅5％左右），价值不大。
常用的分子生物学基本技术
常用的分子生物学基本技术?核酸分子杂交技术 ?由于核酸分子杂交的高度特异性及检测方法的灵敏性,它已成为分子生物学中最常用的基本技术,被广泛应用于基因克隆的筛选，酶切图谱的制作，基因序列的定量和定性分析及基因突变的检测等。其基本原理是具有一定同源性的原条核酸单链在一定的条件下（适宜的温室度及离子强度等）可按碱基互补原成双链。杂交的双方是待测核酸序列及探针（ｐrｏbe),待测核酸序列可以是克隆的基因征段,也可以是未克隆化的基因组DＮA和细胞总RNＡ。核酸探针是指用放射性核素、生物素或其他活性物质标记的,能与特定的核酸序列发生特异性互补的已知DNA或ＲNA片段。根据其来源和性质可分为cDNA探针、基因组探针、寡核苷酸探针、RNA探针等。? 固相杂交 ?固相杂交（soｌｉd－phase ｈｙbｒｉdizatｉon)是将变性的DNＡ固定于固体基质(硝酸纤维素膜或尼龙滤膜）上,再与探针进行杂交，故也称为膜上印迹杂交。? 斑步杂交(dot hyｂrｉｄizａtｉoｎ）??是道先将被测的DNA或RNA变性后固定在滤膜上然后加入过量的标记好的DNA或ＲNA探针进行杂交。该法的特点是操作简单,事先不用限制性内切酶消化或凝胶电永分离核酸样品,可在同一张膜上同时进行多个样品的检测;根据斑点杂并的结果，可以推算出杂交阳性的拷贝数。该法的缺点是不能鉴定所测基因的相对分子质量,而且特异性较差，有一定比例的假阳性。 印迹杂交(blｏttｉng hybridizatioｎ） ?Southｅrn印迹杂交：凝胶电离经限制性内切酶消化的ＤNA片段，将凝胶上的DＮA变性并在原位将单链ＤNA片段转移至硝基纤维素膜或其他固相支持物上,经干烤固定，再与相对应结构的已标记的探针进行那时交反应，用放射性自显影或酶反应显色,检测特定大小分子的含量。可进行克隆基因的酶切图谱分析、基因组基因的定性及定量分析、基因突变分析及限制性长度多态性分析(ＲELP)等。 ?Ｎortｈeｒn印迹杂交:由Southeｒm印杂交法演变而来，其被测样品是RNA。经甲醛或聚乙二醛变性及电泳分离后,转移到固相支持物上，进行杂交反应,以鉴定基中特定mRＮＡ分子的量与大小。该法是研究基因表达常用的方法,可推臬出癌基因的表达程度。? 差异杂交(differential hybridｉzatｉon) ?是将基因组文库的重组噬菌体DNA转移至硝酸纤维素膜上,用两种混合的不同ｃDNA探针(如:转移性和非转移性癌组织的mRNＡ逆转录后的ｃDNA)分别与滤膜上的DNA杂交，分析两张滤膜上对应位置杂交信息以分离差异表达的基因。适用于基因组不太复杂的真核生物（如酵母）表达基因的比较，假阳性率较低。但对基因组非常复杂的盐酸核生物(如人),则因工作量太大,表达的序列所占百分比较低（仅5％左右),价值不大。 ?cDＮA微点隈杂交（cDＮＡmiｃroａｒray hybriｄizａtion）? 是指将cDNA克隆或cDNA的ＰCR产物以高度的列阵形式排布并结合于固相支持物上(如:尼龙膜或活化的载玻片)以微点阵,然后用混合的不同DNＡ探针与微点阵上的DNA进行杂交。再利用荧光、化学发光、共聚焦显微镜等技术扫描微点阵上的杂交信息。它比差异杂交技术的效率高、速度快、成本低，适用于大规模的分析。已成商品问世。其缺点是无法克服保守的同源序列及重序对杂交信息的干扰。??寡核苷酸微点隈杂交(oligonucleotｉｄｅmicｒoarraｙhybridizatiｏn)? 是在特殊的固相支持物上原位合成寡核苷酸,使它共价结合于支持物表面，与平均长度为20-50nt的混合RNA或cDNA探针进行杂交，以提高杂交的特异性和灵敏度。应用共聚焦显微镜可检测跨越三个数量级的杂交信息。适用于低丰度mRNA的检测,以区分基因家族不同成员的差异表达特征，或鉴定同一转录在不同组织和细胞中的选择性剪接。但有工作量较大、
分子生物学常用实验技术
分子生物学常用实验技术 第一章质粒DNA的分离、纯化和鉴定 第二章 DNA酶切及凝胶电泳 第三章大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 第四章 RNA的提取和cDNA合成 第五章重组质粒的连接、转化及筛选 第六章基因组DNA的提取 第七章 RFLP和RAPD技术 第八章聚合酶链式反应(PCR)扩增和扩增产物克隆 第九章分子杂交技术 第十章测序技术 第一章质粒DNA的分离、纯化和鉴定 第一节概述 把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术,送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体(Vector)。细菌质粒是重组DNA技术中常用的载体。 质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子,大小从1-200kb不等,为双链、闭环的DNA分子,并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数,并表达所携带的遗传信息。质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，如离开宿主细胞则不能存活,而宿主即使没有它们也可以正常存活。质粒的存在使宿主具有一些额外的特性,如对抗生素的抗性等。F质粒(又称F因子或性质粒)、R质粒(抗药性因子)和Col质粒(产大肠杆菌素因子)等都是常见的天然质粒。 质粒在细胞内的复制一般有两种类型:紧密控制型(Stringent control)和松驰控制型(Relaxed control)。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制,当染色体不复制时,它也不能复制,通常每个细胞内只含有1个或几个质粒分子,如F因子。后者的质粒在整个细胞周期中随时可以复制,在每个细胞中有许多拷贝,一般在20个以上,如Col E1质粒。在使用蛋白质合成抑制剂-氯霉素时,细胞内蛋白质合成、染色体DNA复制和细胞分裂均受到抑制,紧密型质粒复制停止,而松驰型质粒继续复制,质粒拷贝数可由原来20多个扩增至1000-3000个,此时质粒DNA占总DNA的含量可由原来的2%增加至40-50%。 利用同一复制系统的不同质粒不能在同一宿主细胞中共同存在,当两种质粒同时导入同一细胞时,它们在复制及随后分配到子细胞的过程中彼此竞争,在一些细胞中,一种质粒占优势,而在另一些细胞中另一种质粒却占上风。当细胞生长几代后,占少数的质粒将会丢失,因而在细胞后代中只有两种质粒的一种，这种现象称质粒的不相容性(Incompatibility)。但利用不同复制系统的质粒则可以稳定地共存于同一宿主细胞中。 质粒通常含有编码某些酶的基因,其表型包括对抗生素的抗性,产生某些抗生素,降解复杂有机物,产生大肠杆菌素和肠毒素及某些限制性内切酶与修饰酶等。 质粒载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的。与天然质粒相比,质粒载体通常带有一个或一个以上的选择性标记基因(如抗生素抗性基因)和一个人工合成的含有多个限制性内切酶识别位点的多克隆位点序列,并去掉了大部分非必需序列,使分子量尽可能减少,以便于基因工程操作。大多质粒载体带有一些多用途的辅助序列,这些用途包括通过组织化学方法肉眼鉴定重组克隆、产生用于序列测定的单链DNA、体外转录外源DNA序列、鉴定片段的插入方向、外源基因的大量表达等。一个理想的克隆载体大致应有下列一些特性：（1）分子量小、多拷贝、松驰控制型；（2）具有多种常用的限制性内切酶的单切点；（3）能插入较大的外源DNA片段；（4）具有容易操作的检
分子生物学实验技术实验内容
2006年《分子生物学实验技术》实验内容 一、RT-PCR （一）总RNA的提取 实验安排： 每两人抽提一管。为了使操作同步以节省时间，各组样品请一起离心。 操作步骤： TM（苯冰预冷的900μlLS-Biotragents液体样品加入1.5ml Ep管中，再加入1、将100μl酚和异硫氰酸胍的混合物）。 2、将样品剧烈混合后，在室温放置5min。 3、加入200μl氯仿，颠倒Ep管混和两次，并剧烈振荡混和10s。 4、在4℃条件下，以10000×g离心15min。 5、将上层水相转移到一个新的Ep管中，加入等体积的异丙醇（Isopropanol）并混匀，然后在4℃放置至少10min。 6、在4℃条件下，以10000×g离心15min后，小心并尽可能地去除全部上清夜。 7、用1ml 75%乙醇洗涤RNA沉淀和管壁。 8、将RNA沉淀进行干燥（不能完全干燥）处理后，用10μl无RNase污染的水（RNase-Free Water）将RNA溶解并于-20℃保存。 注意事项： 1、所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。 2、所用的塑料材料，如吸头、离心管等需用0.1% DEPC水浸泡过夜。 3、配制的溶液应尽可能用0.1% DEPC，在37℃处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。 4、操作人员需在超净工作台上操作，并戴一次性口罩、手套，实验过程中手套要勤换。 （二）反转录 实验安排： 每人做一管。 反应体系（20μl）：按下列顺序加样
μl45×Buffer μl6dNTPs μl1RNA酶抑制剂 μl1Oligo（dT）μ随机引 μ反转录AMV1 μ提取RNA6 总体μ20 1h 42反应条件：℃ 注意事项：反应体系中，应先1、加样时，一般从体积大的开始加，样品最后加。如在一般的PCR 、引物，最后加酶和模板。dNTPsBuffer加水、、2、液体应直接加到管底，且每加一种试剂后应更换新的吸头。3、加完所有试剂后，应用手指轻弹混匀，然后低速离心数秒以收集管壁上沾有的液体。℃，以防酶失活。4、酶类试剂应放置在冰盒上取用，用完后立即放回-20 PCR （三）实验安排：每人做一管。 ：按下列顺序加样μl）反应体系（50 ddHO 32.7μl 2510×PCR Buffer μl 4μldNTPs 2P1 μl 2μlP2 0.3Taq μl 4cDNA template μl μl50Total 反应程序： 预变性94℃2min 30s 变性94℃ 45s 退火50℃ 1min 延伸72℃
分子生物学基本技术
分子生物学基本技术 包括核酸的纯化，体外合成、分子杂交、基因克隆、基因表达研究技术等第一节DNA的体外合成 一、DNA的化学合成（无要求）－亚磷酸三酯法 DNA的化学合成广泛用于合成寡核苷酸探针和引物，有时也用于人工合成基因和反义寡核苷酸。目前寡核苷酸均是用DNA合成仪合成的，大多数DNA合成仪是以固相亚磷酸三酯法为基础设计制造的 合成的原理： 核酸固相合成的基本原理是将所要合成的核酸链的末端核苷酸先固定在一种不溶性高分子固相载体上，然后再从此末端开始将其他核苷酸按顺序逐一接长。每接长一个核苷酸残基则经历一轮相同的操作，由于接长的核酸链始终被固定在固相载体上，所以过量的未反应物或反应副产物可通过过滤或洗涤的方法除去。合成至所需长度后的核酸链可从固相载体上切割下来并脱去各种保护基，再经纯化即可得到最终产物。（末端核苷酸的3′-OH与固相载体成共价键，5′-OH被二甲氧基三苯甲基(DMT)保护，下一个核苷酸的5′-OH亦被DMT保护，3′-OH上的磷酸基上氨基亚磷酸化合物活化。碱基上的氨基用苯甲酸保护。每延伸一个核苷酸需四步化学反应 (1) 脱DMT游离出5′-OH 。(2) 缩合（偶联反应）：新生成的5′-OH与下一个核苷活化的3′单体缩合成亚磷酸三酯使链增长(3) 盖帽（封端反应）：有少量(小于0.5%)未缩合的5′-OH 要在甲基咪唑或二甲氨基吡啶催化下用乙酸苷乙酰化封闭，以防进一步缩合造成错误延伸。(4) 氧化：新增核苷酸链中的磷为三价亚磷，需用碘氧化成五价磷（磷酸三酯）。 上述步骤循环一次，核苷酸链向5′方向延伸一个核苷酸 二、聚合酶链式反应技术 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)是一种体外特定核酸序列扩增技术。 一)PCR的基本原理 双链DNA热变性成两条单链，降温使反应体系中的两个引物分别与两条DNA单链两侧的序列特异性复性，在合适的条件下，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，利用反应体系中的4种dNTP 合成其互补链(延伸)，在适宜的条件下，这种变性→复性→延伸的循环重复1次DNA的量可以增加1倍，30次循环后，DNA的量增加230倍。 (二)典型PCR的反应体系 1.耐热DNA聚合酶： 耐热DNA聚合酶包括Taq DNA聚合酶，Tth DNA聚合酶，VENT DNA 聚合酶，Sac DNA聚合酶。其中Taq聚合酶应用最广泛。Taq酶在92.5℃、95℃和97.5℃时半衰期分别为40min、30min和5-6min，故PCR中变性温度不宜高于95℃。Taq酶的最适温度是72 ℃，较高温度下的DNA合成错
分子生物学技术
载体构建 通过载体构建的方法可将目的基因构建在真核/原核表达系统中，然后运送至受体细胞中，在该细胞中实现目的基因的过表达、KD等。我们公司拥有丰富的载体资源，包含慢病毒载体、腺病毒载体、逆病毒载体以及多种过表达载体、Knock down等，能够实现含目的基因的病毒包装及过表达、KD等。 载体架构流程图 GST pull-down 1.技术简介 GST pull-down实验是一个有效验证酵母双杂交系统的体外试验技术。将靶蛋白质-GST融合蛋白质亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上，作为与目的蛋白质亲和的支撑物，充当一种\“诱饵蛋白质\”，目的蛋白质溶液过柱，可从中捕获与之相互作用的\“捕获蛋白质(目的蛋白质)\”，洗脱结合物通过SDS-PAGE 电泳分离，最后经western blot，从而证实两种蛋白质间的相互作用；\“诱饵蛋白质\”和\“捕获蛋白质\”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白质、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。 2.实验原理
利用重组技术将PES1蛋白与GST（Glutathione S transferase）融合表达，融合蛋白通过GST与琼脂糖微球上结合的GTH（Glutathione）亲和结合。因此，如果PES1与NPM1之间有直接相互作用，当结合了PES1蛋白的GTH微球的与含有NPM1蛋白的细胞裂解液混合孵育，再通过离心富集GST微球，得到的样品中可以检测到NPM1。 3.实验目的 在体外检测NPM1(nucleophosmin )与Pes1(pescadillo)之间的直接相互作用，确定PES1与NPM1相互作用的结构域。 4. 实验流程 5.技术服务 1）验证两种蛋白质间相互作用 2）验证目的蛋白与细胞裂解物蛋白互作