胶原蛋白提取
毕业论文外文资料翻译
学院：生物科学与工程学院
专业：生物工程
姓名：李秀莉
学号：120302214
外文出处：Food Chemistry 190(2016) 186-193
附件： 1.外文资料翻译译文；2.外文原文。
附件1：外文资料翻译译文
响应面优化蛋壳膜中胃蛋白酶溶性胶原蛋白提取工艺关键词：
蛋壳膜、响应面优化法、胃蛋白酶溶性胶原蛋白
摘要：
本文利用响应面优化法（RSM）确定了自变量对蛋壳膜中胃蛋白酶溶性胶原蛋白（PSC）提取产率的影响。采用中心复合设计（CCD）的实验设计和结果分析方法，选取最有可能的条件范围进行了优化实验：NaOH浓度（X1：0.4-1.2mol/L）,碱处理时间（X2：6-30h），酶浓度（X3：15-75U/mg）以及水解时间（X4：12-60h）。实验数据用适当的统计学方法通过多元线性回归分析得到一个二阶多项式方程，分析表明最佳提取条件为：NaOH浓度为0.76mol/L，碱处理时间为18h，酶浓度为50U/mg，水解时间为43.42h。在最佳提取条件下的提取率实验值是30.049%，这与预测值30.054%高度一致。
1.前言
胶原蛋白是脊椎动物的主要结构蛋白，大约占一个动物总蛋白的30%（Muyonga, Cole, & Duodo, 2004)。胶原蛋白的分子结构由三个多肽α-链扭曲在一起形成的一个三股螺旋体。在所有胶原蛋白的“胶原域”都发现了(Gly-X-Y)n重复。X和Y的位置往往分别被脯氨酸和羟脯氨酸占用（Gelse, Poschl, & Aigener, 2003）。目前，至少已有27中胶原蛋白类型已确定，其氨基酸序列、分子结构和功能明显不同（Canty & Kadler, 2005; Cheng, Hsu, Chang, Lin, & Sakata, 2009）。胶原蛋白已被广泛用作医药、化妆品、生物医学和食品行业的材料（Cheng et al.,2009）。一般来说，工业应用的胶原蛋白的主要来源是牛与猪的皮肤和骨头。然而，阮病毒疾病的爆发，如海绵脑病（BSE），传染性海绵脑病（TSE）和口蹄疫（FMD），以及禽流感，导致一些消费者对从这些动物体提取的胶原蛋白和胶原蛋白产品的担忧。此外，以猪为原料提取胶原蛋白不能被犹太人和穆斯林接收（Liu, Liang, Regenstein, & Zhou, 2012; Regenstein & Zhou, 2007）。因此，全球对胶原蛋白的代替原料的需求增加了，如水生动物。但是，关于胶原蛋白提取的其他来源的信息是有限的。
蛋壳作为副产品大约占了一个鸡蛋总重量（60g）的10%（Nys, Bain, & Immerseel, 2011）。据估计每年在伊朗蛋制品工业都产生100000吨的蛋壳。蛋壳膜存在于白色液体和固体蛋壳内表面之间。胶原蛋白占蛋壳膜总蛋白含量的10%（MacNeil, 2006）。在蛋
壳膜中已经确定含有Ⅰ型、Ⅴ型和Ⅹ型胶原蛋白（Arias et al., 1992）。经生化、细胞毒性与基因毒性检测，在自身免疫性风险和消费的过敏反应中蛋壳膜胶原蛋白是安全的（Ruff, Endres, Clewell, Szabo, & Schauss, 2012）。因此，蛋壳膜加工的副产品，是胶原蛋白的重要来源，有可能取代哺乳动物来源。
通过优化提取工艺获得高收益的蛋壳膜胶原蛋白是很重要的。乙酸和蛋白酶浓度、反应时间、PH值包括NaOH浓度、碱处理时间和提取温度都是影响胶原蛋白提取率以及提取的胶原蛋白功能性质的重要变量。响应面法（RSM）可以用来进行提取方法的优化。RSM是一种集数学和统计技术于一身并广泛应用于食品行业评估预测独立变量和相关变量之间关系的方法（Box & Wilson, 1951）。RSM的主要优势是在需要评估多个变量及其交互作用时减少实验的数量，因此RSM比其他方法更省时省力（Wu, Cui, Tang, & Gu, 2007）。关于从水生动物中提取胶原蛋白优化的研究早有报道（Wang, Yang, Du, Yang, & Liu, 2008; Woo, Yua, Cho, Lee, & Kim, 2008）。这些研究表明，RSM在提取胶原蛋白的最佳条件的研究上是有效的。至今还没有关于蛋壳膜胶原蛋白提取优化的报道。因此，本工作的目的就是用RSM对蛋壳膜中酶溶性胶原蛋白（PSC）提取条件的优化。本研究调查的是关键处理变量（NaOH浓度、碱处理时间、酶浓度和水解时间）对PSC提取率的影响，并确定从蛋壳膜中提取PSC的最佳条件。
2.材料与方法
2.1.材料和化学试剂
未加工的蛋壳膜来源于商业。仔细的手动去除外膜并用蒸馏水洗净。酶活为750U/mg的胃蛋白酶是从Sigma Aldrich Co.（St. Louis, US）购买的。NaCl、乙酸、NaOH 和三（羟甲基）氨基甲烷是从Merck (Darmstadt, Germany)购买的。本研究中所使用的所有试剂均为分析级。
2.2.蛋壳膜中酶溶性胶原蛋白的提取
PSC是从蛋壳膜中用Kittiphattanabawon, Benjiakul, Visessanguan, Nagai, and Tanaka (2005) and Liu et al. (2012)提出的方法并稍加改进之后提取出来的。准确称取5g的新鲜蛋壳膜。蛋壳膜用10倍质量体积比（V/W）的碱性溶液（0.2-1.2mol/L NaOH）搅拌处理6-36h，每2h更换一次碱液，除去杂蛋白。然后弃上清，碱处理过的样品用蒸馏水清洗直至PH成中性。提取PSC时，将预处理的蛋壳膜浸泡在0.5mol/L的乙酸与胃蛋白酶（15-90U/mg）抽提液中搅拌处理12-72h。胃蛋白酶的量以酶活计。混合物用两层纱布
过滤以除去未溶解的碎片。该溶液用0.05mol/L 的Tris(PH=7.0)以及终浓度2mol/L 的NaCl 盐析。在30000g 的离心力下5℃左右离心40min 得到沉淀；然后用10倍质量体积比的0.5mol/L 的醋酸溶解沉淀。最终的溶液用分子量12KDa 的透析膜在4℃的冷水中透析12h ，每4h 换一次透析液。然后将溶液用冻干机冷冻干燥（ALPHA 2-4; Christ, Harz, Germany ）。从这个角度讲提取物为胃蛋白酶溶性胶原蛋白（PSC ）。PSC 的得率是在蛋壳膜清洗后的重量基础上的百分比。PSC 的得率计算式如下：
100%g g (%)?=）
干粉重量（）提取重量（提取率PSC PSC （1） 2.3.实验设计与统计分析
首先，通过改变单一因素影响PSC 的总收率来确定提取的初步范围变量：NaOH 浓度、碱处理时间、酶浓度和水解时间。然后，用RSM 对提取参数进行优化。为确定独立变量对反应的交互影响，做四因素五水平的中心复合设计（CCD ）。自变量的范围以及水平已由Table 1给出。自变量及其水平的选择以初步实验的结果为基础。提取率为因变量。对于统计计算，变量进行编码之后根据方程：
X
X X X i i ?-=0 （2） i X 是变量的编码值；i X 是变量的实际值；0X 是i X 在中心水平的实际值；X ?是阶跃变量。如表2所示，实验设计的CCD 的30个实验点是随机组成的（16个因子点、8个轴向点和6个中心点）。设计中心的六次重复（处理时间25-30h ）是被用来估计纯误差的平方和的。以CCD 数据进行多元线性回归分析符合下列二次多项式：
∑∑∑∑=+===+++=344
1412
41i 0i i j j i ij i i ii i i X X X X Y ββββ （3） Y 代表因变量（胶原蛋白产量，%）；0β是一个常数；i β、ii β和ij β是回归系数；i X 和j
X 是自变量水平。实验数据经线性回归可得到响应面图和等高线图的回归模型。这些响应面和等高线图能够直观的反应每一个实验因素水平与反应之间的关系，并确定最优条件（Lu, Engelmann, Lila, & Erdman, 2008）。Design-Expert 8.1.3 (trial version, State-Ease Inc., Minneapolis, USA)是一款用于计算二次多项式模型和优化的系数的软件。当P 值小于0.05时认为具有统计学意义。每个数据都要测定三次取平均值。
3.结果与讨论
3.1.单因素实验结果
3.1.1.NaOH浓度对胶原蛋白提取率的影响
NaOH浓度对PSC提取率的影响如Fig.1a所示。提取时其他条件一定：酶浓度45U/mg、水解时间36h、碱处理时间18h，而以NaOH浓度（0.2，0.4，0.6，0.8，1和1.2mol/L）为变量进行。随着NaOH浓度的增加，提取率迅速增加，在0.7-0.8mol/L时达到高峰。然后提取率显著下降（在0.8mol/l以上），可能是由于结构的破坏和PSC的分解。因此，本文取0.8mol/L的NaOH浓度进行下一步实验。
3.1.2.碱处理时间对胶原蛋白提取率的影响
碱处理时间对PSC的提取率的影响如Fig.1b所示。碱处理时间分别被设定为6，12，18，24，30和36h；其他实验条件固定如下：NaOH浓度为0.8mol/L，酶浓度45U/mg，水解时间36h。从Fig.1b中可以看出在6~18h内产量随碱处理时间增加而增加，紧接着随碱处理时间的增加而减少。因此，18h时获得PSC的最大提取率。
3.1.3.酶浓度对胶原蛋白提取率的影响
为了研究酶浓度对PSC提取率的影响，提取使用不同的酶浓度进行：15，30，45，60，75和90U/mg。其他三个提取参数固定：NaOH浓度0.8mol/L，水解时间36h，碱处理时间18h（Fig.1c）。当酶浓度从15到45U/mg增加时PSC的提取率从22.5%显著增加到30.9%，然后当酶浓度超过45U/mg后提取率智慧稍微增加。在酶浓度为45U/mg 时PSC提取率依然很高，但是增加没弄都会导致工业提取工艺成本提高（Ye & Jiang，2011）。所以，45-60U/mg被认为是PSC提取的最佳条件。
3.1.
4.水解时间对胶原蛋白提取率的影响
水解时间对胶原蛋白提取率的影响可能是当胃蛋白酶打开专门的蛋壳膜胶原蛋白肽区时时间有利于PSC暴露于抽提介质。这一作用可以溶解胶原蛋白，并使其从材料中扩散出来。Fig.2d显示水解时间对PSC提取率的影响。其他提取参数设定如下：NaOH 浓度0.8mol/L，酶浓度45U/mg，碱处理时间为18h。在水解时间从12增加到48h时，提取率的方差相对快速而且PSC产量高达29.6%；提取过程将在这个水平进行。因此，36-48h的范围被认为是提取的最佳水解时间。基质中的质量传递速率是决定提取率的关键因素。换句话说，胶原蛋白从蛋壳膜基质中到大量抽提介质中的释放率是与时间有关的。因此，预计PSC的产率将继续随着时间的延长而升高。这就解释了水解时间从36到48h对胶原蛋白产量的正效应。换句话说，PSC饱和溶剂导致了酶活性的降低进而导致了水解时间48h以后提取率的降低。根据单因子实验，NaOH浓度选0.4-1.2mol/L,碱处理时间选6-30h，酶浓度选15-75U/mg，水解时间选12-60h进行RSM实验。
3.2.胶原蛋白提取参数的优化
3.2.1.模型拟合
四个独立变量的范围和中心点的值都是基于单因子实验结果的。在当前的符合设计中有四个过程变量（1X ，NaOH 浓度；2X ，碱处理时间；3X ，酶浓度；4X ，水解时间）总共30个运行命令，如Table 2所示。此外，实验结果证明，胶原蛋白的提取率从14.8%到30.1%不等。胶原蛋白最高产量（30.1%）的实验条件是：NaOH 浓度0.8mol/L ，碱处理时间18h ，酶浓度75U/mg ，水解时间36h 。通过对实验数据进行多元回归分析，响应产量和测试变量呈相关性，表示为二阶多项式方程：
44332
211434
232413
12143
213.25521-3.19444-0.02760-73.593757-1.38889- 2.95139-5.5556-0.093750.037500.85417-0.333330.438061.7666121.43750-51.85208X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X Y ++++++= （4）
其中Y 是酸溶性胶原蛋白的产量，而1X ，2X ，3X 和4X 分别是变量NaOH 浓度、碱处理时间、酶浓度和水解时间的编码。
所选择的二次预测模型的提取率（Y ）的拟合统计显示在Table 4。对二次回归模型进行方差分析（ANOV A ）得决定系数（0.99622=R ）表明，只有0.38%不能用模型来解释。然而，一个较大的2R 值并不总是意味着回归模型是好的。调整后的确定系数（Adj 0.99262=R ）也证实该模型是非常好的，这表明胶原蛋白产量的实验值与预测值高度契合。误差分析的结果表明，缺乏适合性检验（0.5821）是不重要的，95%的可信度完全可以证实模型的有效性。同时，一个相对低的变异系数（ 1.28=CV ）代表一个非常高的精度高度可靠的实验值（Song et al.，2011）。因此，该模型的P 值（F ob Table 3显示了方程（4）的回归系数。对于该模型中的每一项，一个小的P 值（P<0.05）和一个大的F 值意味着对提取率的影响更为显著（Quanhong & Caili, 2005）。该表显示有一个非常小的P 值（P<0.05），表明线性系数（1X ,2X ,3X 和4X ）、二次系数（11X X ,22X X ,33X X 和44X X ）和交互系数（21X X ,41X X ,42X X 和43X X ）是显著的。另一项系数对提取率无显著影响（P>0.05）。 3.2.2.胶原蛋白提取条件大优化 响应面法是用来说明NaOH 浓度、碱处理时间、酶浓度和水解时间对反应的影响的。回归模型可以预测四个参数对产量的影响。四个实验变量之间的交互作用和反应与每个变量实验水平之间的关系可用三围响应面和二维等高线图说明（Liu, Mei, Wang, Shao, & Tao, 2014）。一个圆形的等高线图表明相应的变量之间的交互作用是可以忽略不计的，而椭圆形的等高线图则恰恰相反（Muralidhar, Chirumamil, Marchant, & Nigam, 2001）。 在碱性介质中（NaOH ）毁容劫匪胶原蛋白，而且酶的作用会大打折扣（Sato et al., 2003）。Fig.2awei NaOH 浓度和碱处理时间对产量综合影响的三维响应面和等高线图。这些图中显示的是使其他变量保持在他们的中值（实验范围的中间值）时两个影响因素的响应值。弯曲的响应面和椭圆形的等高线图表示两个影响因素之间存在较强的交互作用。当NaOH 浓度在0.7和0.8mol/L 之间，碱处理时间在12和18h 之间时得到胶原蛋白的高收益。随着NaOH 浓度（0.8-1.2mol/L ）和碱处理时间（18-36h ）的继续增加提取率下降。这表明NaOH 浓度（1X ）和碱处理时间（2X ）对提取率的交互影响很显著，这一结果与Table 4相吻合。NaOH 浓度（1X ）和酶浓度（3X ）对提取率的交互影响显示在Fig.2b 。响应面实验的最大预测值被包含在等高线图中最小的椭圆里。等高线图中最小的椭圆环表明独立变量之间有一个显著的交互影响（Muralidhar et al., 2001）。如图所示，提取率随着胃蛋白酶浓度一直增加到50U/mg 而增加，之后在高浓度时略有增加。PSC 的产量随着NaOH 浓度一直增加到0.8mol/L 而增加。交互效果是通过NaOH 浓度 和酶浓度的同时作用观察到的。Fig.2c 显示的是在固定酶浓度和碱处理时间（0水平）而NaOH 浓度（1X ）和水解时间（4X ）不同的条件下得到的三位响应面和等高线图。Fig.2c 表明，当NaOH 浓度和水解时间处于阈值水平式，即分别为0.7-0.8mol/L 和36-48h 时，PSC 的提取率可以达到最大。 碱处理时间（2X ）和酶浓度（3X ）对胶原蛋白产量（Y ）的影响如Fig.2d 所示。如图所示，提取率随酶浓度从15到60U/mg 增加而迅速增加，但超过60U/mg 后提取率随着酶浓度的增加而缓慢增加。PSC 提取率随着碱处理时间从12到18h 增加而增加，之后岁碱处理时间增加而下降。Fig.2e 显示了酶浓度（3X ）和NaOH 浓度（1X ）分别固定在45U/mg 和0.8mol/L 前提下碱处理时间（2X ）和水解时间（4X ）的交互作用。PSC 提取率随水解时间从从12到48h 增加而上升，但之后不再随水解时间进一步增加而上升；它还还随碱处理时间从6到18h 增加而上升，之后随之从18到30h 增加而下降。Fig.2f 为不同酶浓度和水解时间而固定NaOH 浓度（0.8mol/L ）和碱处理时间（18h ）的条件下得到的三维响应面和等高线图。当酶浓度在50-75U/mg 的范围内时PSC 产量逐渐增加，并且在水解时间48h 时达到最大，之后将不再进一步变化。应该指出的是：酶溶发生在较高的酶水平（75U/mg 以上）和较长的水解时间（48h 以上）时并不总能达到一个理想的响应值，这可能表明高分子量的肽片段不能通过盐析得到。我们的结果与Wang, Yang, Wang, and Dua (2008)报道的通过增加胃蛋白酶量来提高草鱼中胶原蛋白产率的结果相符。结果表明：用0.5mol/L 乙酸提取蛋壳膜中的胶原蛋白分子并没有完全溶解（数据未显示）。该现象最有可能被胶原蛋白分子在胶原链肽区域极易共价交联或分子间交联从而导致胶原分子在乙酸溶液中的低溶解度这一事实解释（Ahmad & Benjakul, 2010; Jongjareonrak, Benjakul, Visessanguan, Nagai, & Tanaka, 2005; Zang et al., 2007）。胃蛋白酶处理能够在不损害胶原蛋白三螺旋结构完整性的前提下专门得打通蛋壳膜中胶原蛋白的非螺旋端肽。因此，部分裂解的胶原蛋白的产量会增加（Huang, Shiau, & Chen, 2011; Nalinanon, Benjakul, Visessanguan, & Kishimura, 2007）。分析表明,在四个独立变量中，NaOH 浓度（1X ）和酶浓度（3X ）是对胶原蛋白的产量（Y ，%）影响最大的两个变量。类似的趋势已在黄鳍金枪鱼背侧皮肤胶原蛋白提取一文中报道过（Woo et al., 2008）。 3.3.模型的验证 最有条件为：NaOH 浓度（1X ）0.76mol/L ，碱处理时间（2X ）18h ，酶浓度（3X ）50U/mg ，水解时间（4X ）43.42h 。在最优条件下，模型的预测收益率是30.054%。分子结果表明，实验值（30.049%）与预测值吻合良好（至少在5%的置信水平内），表明 RSM 模型是令人满意的和准确的。这些结果表明，在蛋壳膜中有丰富的胶原蛋白。不同来源的不同胶原蛋白提取率早已有报道，包括眼斑河豚鱼（44.7%）(Nagai & Suzuki, 2002),通道鲶鱼（38.4%）（Liu, Li, & Guo, 2007），黑鼓鱼（15.8%），青衣鲷（29.3%）（Ogawa et al., 2003），草鱼（29.3%）（Wang et al., 2008），大笛鲷（19.79%）（Nalinanon et al., 2007），黄鳍金枪鱼（27.1 %）（Woo et al.，2008），独角兽的蛆（8.48%）（Ahmad & Benjakul, 2010）和气球鱼（19.5%）（Huang et al., 2011）。不同的提取技术和来源可以解释各种来源明显不同的提取率。因此，胃蛋白酶提高胶原蛋白的提取率从而增加产量。 4.结论 目前的研究表明，RSM 是描述和预测PSC 从蛋壳膜提取过程的有效工具。RSM 的响应面和等高线图是 为了直观地展示四个独立变量（NaOH 浓度、碱处理时间、酶浓度和水解时间）的影响。PSC 产量的实验值从14.8%变化到30.1%。当NaOH 浓度为0.76mol/L ，碱处理时间18h ，酶浓度50U/mg ，水解时间为43.42h 时，蛋壳膜中PSC 产量是最多的达到30.049%。关于PSC 的化学结构和生物学性能的进一步研究需要新的资源。 附件2：外文原文（复印件） (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910257876.7 (22)申请日 2019.04.01 (71)申请人 武汉轻工大学 地址 430023 湖北省武汉市汉口常青花园 学府南路68号 (72)发明人 徐玉玲 汪海波 何浪 李盛 张军涛 未本美 (74)专利代理机构 北京思创大成知识产权代理 有限公司 11614 代理人 高爽 (51)Int.Cl. C07K 14/78(2006.01) C07K 1/30(2006.01) C07K 1/14(2006.01) (54)发明名称一种胶原蛋白及其提取方法(57)摘要本发明公开了一种胶原蛋白及其提取方法。该方法包括如下步骤：1)将含有胶原蛋白的动物组织在液氮中进行冷冻、研磨；2)将研磨后的动物组织以酸/酶法提取胶原蛋白，得到胶原蛋白溶液；3)将胶原蛋白溶液透析、冻干后，得到粉末状的所述胶原蛋白。本发明采用冷冻研磨预处理方法，在液氮中预先冷冻含有胶原蛋白的动物组织一段时间，利用研磨仪在一定频率下研磨成粉末，该方法处理后，三螺旋结构及热变性温度并未受影响，能在保持天然胶原纤维化性能的基础上，比原有不冷冻研磨的酸提法的提取率提高18％-82％，这对于胶原应用及胶原基生物材料 的应用具有重要意义。权利要求书1页 说明书5页 附图2页CN 109796529 A 2019.05.24 C N 109796529 A 权 利 要 求 书1/1页CN 109796529 A 1.一种胶原蛋白提取方法，其特征在于，该方法包括如下步骤： 1)将含有胶原蛋白的动物组织在液氮中进行冷冻、研磨； 2)将研磨后的动物组织以酸/酶法提取胶原蛋白，得到胶原蛋白溶液； 3)将胶原蛋白溶液盐析、透析、冻干后，得到粉末状的所述胶原蛋白。 2.根据权利要求1所述的胶原蛋白提取方法，其中，进行步骤1)之前，还包括预处理步骤： 将含有胶原蛋白的动物组织脱脂、除杂蛋白后，干燥。 3.根据权利要求1所述的胶原蛋白提取方法，其中， 所述含有胶原蛋白的动物组织为哺乳动物皮和/或鱼类皮； 所述胶原蛋白为哺乳动物皮胶原蛋白和/或鱼皮胶原蛋白。 4.根据权利要求1所述的胶原蛋白提取方法，其中，步骤1)中，冷冻的时间为16～32h。 5.根据权利要求1所述的胶原蛋白提取方法，其中，步骤1)中，所述研磨的时间为3-25min。 6.根据权利要求5所述的胶原蛋白提取方法，其中，步骤1)中，所述研磨的时间为10-20min。 7.根据权利要求1所述的胶原蛋白提取方法，其中，步骤1)中，所述研磨的频率为10～25HZ。 8.根据权利要求1所述的胶原蛋白提取方法，其中，步骤2)中，酸/酶法提取胶原蛋白的步骤包括： 将研磨后的样品使用0.4～0.6mol/L乙酸浸泡并搅拌3～5d，再加入胃蛋白酶使混合溶液中胃蛋白酶的浓度为1.5～2.5％，搅拌16～32h后得到胶原蛋白溶液。 9.根据权利要求1所述的胶原蛋白提取方法，其中，步骤3)中，所述透析的时间≥3d。 10.由权利要求1-9中任意一项所述的胶原蛋白提取方法得到的胶原蛋白。 2 胶原蛋白的提取方法 胶原蛋白的提取与纯化的目标是尽量使胶原提取的产率、纯度更高，并且使所提取的胶原能满足不同领域的要求。迄今为止，胶原的提取方法主要有以下4种：酸法、碱法、盐法、酶法。在实际提取过程中，不同提取方法之间往往相互结合，以取得较好的提取效果。 1、酸法提取 酸法提取主要采用低离子浓度酸性条件浸渍处理原料，从而破坏分子间的盐键和希夫碱，而引起纤维膨胀、溶解。作为溶剂使用的酸，主要有盐酸或亚硫酸、磷酸、硫酸、醋酸、柠檬酸和甲酸等。酸法是提取胶原蛋白比较常用和有效的方法，用酸法提取的胶原最大程度地保持了其三股螺旋结构。此法处理快速，所得产品的分子量是连续的，适用于医用生物材 料及原料的制备，但产品得率低，设备腐蚀严重，污染重。赵苍碧等采用0.3 %的醋酸溶液在 4 ℃下从牛腱中提取胶原蛋白，得到高纯度的胶原蛋白溶液。余海等采用0.5 mol/L的醋酸溶液在4 ℃下从鼠尾肌腱胶成功提取出I型胶原蛋白。Takeshi等胶原蛋白课题组 采用0.5 mol/L的醋酸溶液从海妒鱼、鳍鱼、金枪鱼、水母等的皮中提取、分离出纯度较高的胶原蛋白，并对所提取的胶原蛋白的理化性质作了系统的研究。2、碱法提取 碱法提取胶原蛋白常用的处理剂为石灰、氢氧化钠、碳酸钠等。如Holzer等采用1 %～1.5 %石灰水浸泡的方法提取胶原蛋白。由于它容易造成肽键水解，因此得到的水解产物分子量比较低。所以，若想保留胶原的三股螺旋结构，此法不可取。 3、盐法提取 盐法提取胶原蛋白所用的中性盐有盐酸-三羟甲基胺基甲烷(Tris-HCl)、氯化钠、柠檬酸盐等。在中性条件下，当盐的浓度达到一定量时，胶原溶解。并且可采用不同浓度的氯化钠对提取的胶原蛋白进行盐析处理，可以沉淀出不同类型的胶原蛋白。 4、酶法提取 胶原蛋白的提取 实验原料：猪皮，氯仿，乙醇，乙酸，0.05mol/L Tris-HCl缓冲液，NaCl，NaOH，胃蛋白酶，蒸馏水。 实验器材：搅拌机，低温离心机，控温磁力搅拌器，电子天平，透析设备，PH试纸，烧杯，玻璃棒，小刀，研钵。 实验需配药品：A:氯仿/乙醇（2:1）约需400ml， B:0.5mol/L乙酸约3000ml， C:6mol/L NaOH溶液约40ml, D:质量分数0.1％、0.01％的乙酸（透析用）， E:含4.5mol/LNaCl的0.05mol/LTris-HCl缓冲液约需200ml。 实验步骤： 1,猪皮的前处理： （1）称取猪皮50g，用氯仿/乙醇（2:1，A）溶液对其进行脱脂后切除皮下脂肪，去毛并细切； （2）将组织小块用乙醇和蒸馏水洗涤多次； （3）将洗涤后的组织放入搅拌机中搅拌成糊状，用含4.5mol/L NaCl的0.05mol/L Tris-HCl 缓冲液（pH 7.5，E）充分洗涤（2h）以去除脂质及血清等成分，低温离心（8000r/min，30min，4℃）取沉淀。 2,提取胶原蛋白： （1）进行前处理后，在沉淀中加入500ml含胃蛋白酶250mg的0.5mol/L冰醋酸（B），搅拌并维持在4℃，提取48h； （2）高速冷冻离心机离心（4000r/min）吸取上清液。在上清液中加入NaCl至4.4mol/L （NaCl2.2mol）搅拌过夜； （3）低温离心，将沉淀溶于0.5mol/L冰醋酸中，再逐级用2.4mol/L（NaCl1.2mol，以500ml 冰醋酸计），1.7mol/L（NaCl0.85mol）及1.0mol/L（NaCl0.5mol）的NaCl反复盐析、酸溶。最后得到的上清液即为胶原粗提液。 3,胶原蛋白提纯: （1）在粗提胶原蛋白溶液缓慢加入6 mol/L NaOH溶液（C）调节pH值到7，冷冻离心除掉沉淀物，在剩余的溶液中加入氯化钠固体研细粉末，缓慢搅拌，4 ℃静置过夜保存；（2）离心取沉淀，用稀醋酸再次溶解，将溶解液装入透析袋中，用质量分数分别为0.1%、0.01%的乙酸溶液（D）透析1 d，再用蒸馏水透析3d，每天换透析液两次，最后得到的是纯度较高的胶原蛋白水溶液； （3）将纯化的胶原蛋白水溶液采用低温冷冻干燥法制备成纯胶原蛋白样品，备用。 毕业论文声明 本人郑重声明： 1．此毕业论文是本人在指导教师指导下独立进行研究取得的成果。除了特别加以标注地方外，本文不包含他人或其它机构已经发表或撰写过的研究成果。对本文研究做出重要贡献的个人与集体均已在文中作了明确标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 2．本人完全了解学校、学院有关保留、使用学位论文的规定，同意学校与学院保留并向国家有关部门或机构送交此论文的复印件和电子版，允许此文被查阅和借阅。本人授权大学学院可以将此文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本文。 3．若在大学学院毕业论文审查小组复审中，发现本文有抄袭，一切后果均由本人承担，与毕业论文指导老师无关。 4.本人所呈交的毕业论文，是在指导老师的指导下独立进行研究所取得的成果。论文中凡引用他人已经发布或未发表的成果、数据、观点等，均已明确注明出处。论文中已经注明引用的内容外，不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究成果做出重要贡献的个人和集体，均已在论文中已明确的方式标明。 学位论文作者（签名）： 年月 关于毕业论文使用授权的声明 本人在指导老师的指导下所完成的论文及相关的资料（包括图纸、实验记录、原始数据、实物照片、图片、录音带、设计手稿等），知识产权归属华北电力大学。本人完全了解大学有关保存，使用毕业论文的规定。同意学校保存或向国家有关部门或机构送交论文的纸质版或电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权大学可以将本毕业论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用任何复制手段保存或编汇本毕业论文。如果发表相关成果，一定征得指导教师同意，且第一署名单位为大学。本人毕业后使用毕业论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为大学。本人完全了解大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，同意如下各项内容： 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进行pH调节要求），添加按料液固形物含量0.5%--1%的白土进入板框过滤间进行一次过滤，过滤后的料渣运至冷库保存。 8、精滤：进行一次过滤后的料液，并添加按料液固形物含量0.5%--1%的白土， 0.2—0.3%的活性碳，在60℃以上搅拌1h，同样调节pH6.0—6.5（调节前取 样检测pH，并询问技术部进行pH调节要求），进行二次板框过滤操作。9、浓缩：过滤后的澄清料液，在高真空、低温度条件（一效温度80℃以下）， 浓缩至30%即停止浓缩。 10、喷粉：进入喷粉操作，喷粉时出风口的温度要低，控制在80℃以下。 11、包装：按蛋白粉包装形式包装，如果喷出来的粉比重很轻，可以使用万 能搅碎机粉碎一下，提高比重。 胶原蛋白的提取、结构以及分子量测量综述 一、前言 胶原蛋白(collagen)是与各组织、器官机能有关的功能性蛋白 约占人体总蛋白的三分之一,存在于细胞外间质 是具有三股螺旋结构的蛋白质家族[1]。胶原是人体重要的细胞外基质成分,在细胞生物学中有重要应用价值。胶原是一个大的蛋白家族 至少有15个型别，各型胶原都具有一定的分子构型和组织分布特点，其中以Ⅰ型胶原分布最广含量最多 [2]。胶原蛋白 或称胶原 是按是否形成有周期性横纹的胶原原纤维collagenous fibril可将其分为原纤维胶原蛋白fibrillar or fibril-forming collagen和非原纤维收原蛋白nonfibrillar or non fibril forming collagen两大类。目前己发现的胶原蛋白类型己不下19种 原纤维胶原蛋白包括I、II、III、V、XI型胶原 在体内以胶原纤维的形式存在。胶原纤维是骨骼、肌腱、骨间膜、皮肤、软骨、韧带等器官的基本结构物质 使这些器官具有很高的抗张强度。胶原纤维与组织器官的生物力学特性密切相夫原纤维胶原蛋白包括I、II、III、V、和XI型胶原 其余均属于非原纤维胶原蛋白。非原纤维胶原蛋白具有胶原蛋白的基本特征 即三股螺旋结构 但其结构、分布和功能更具有多样性、非原纤维胶原蛋白按其超分了结构可进一步分类。 1.结合于胶原原纤维表面的胶原蛋白（fibril associated collagens with interrupted triple helice FACIT）包括IX XII XIV XVI X XI型胶原。 2.形成网状结构的胶原蛋白，包括IV VIII X型胶原。 3.形成串珠状纤维beaded filament的胶原蛋白有VI型胶原。 4.形成固着原纤维anchoring fibril 的胶原蛋白有VII型胶原。 5.有跨膜区的胶原蛋白有XIII和XVII型胶原。 6.结构尚未明确的胶原蛋白包括XV和XVIII型胶原等。胶原不仅作为组织的支持物,而且对细胞、组织乃至器官行使正常功能及伤口愈合都有重大影响。胶原作为医用生物材料比以往应用的金属、陶瓷或化学材料具有更大的优越，因此近20年来已被广泛用于临床 近年来 世界各国已将胶原制品广泛应用于临床修复软组织缺损覆盖烧伤创面、整形、牙周引导组织再生、口腔种植体、牙槽嵴再建及颌骨空腔修复。 二、胶原蛋白的提取 胶原多从牛皮、肌腱、鼠尾等部位提取，由于胶原是一个大的蛋白家族是细胞外间质的四大组分之一，几乎分布于所有的组织中。到目前为止已发现脊椎动物的胶原类型达十多种之多各型作用不一。胶原的异常改变涉及许多纤维化疾病。在肿瘤的发生与转移中胶原的分布和类型也发生改受。因此在提取时常将各型分别提取。目前从组织提取胶原多采用分级盐析的方法。在酸性条件下，I型和Ill型胶原沉淀的盐浓度临界点相近 在中性条件下III型和IV型胶原沉淀的盐浓度临界点又很接近。因此提取时难度较大，程序复杂，需过柱纯化，而且花费时间长，易发生胶原变性。主要的提取方法分述如下：I型和II型胶原主要分布于细胞，组织之间及结缔组织间质中，属于间质胶原，在脏器纤维化病理过程中I型和II型胶原起着重要作用。I型胶原是结缔组织间质中最主要的成分。一般制品多以I型胶原为材料文献上I型胶原的提取一般采用多次超速高心的办法。李成章、樊明文[3]。从人胚骨中提取了I型胶原，用于胶原制品的制作。采用胚胎骨组织来提取胶原，一般认为骨组织仅含有I 型胶原，选用骨组织作为提取原料可省去分型、过柱纯化等烦杂工序，简便经济，易获得纯度较高的I型胶原，他们的方法为将脱钙骨粉浸入0.5mol/LHAc24，48h，取上清缓慢加入研磨精细的NaCl，终浓度为4mol/L，搅拌过夜离心35 000×g，20min，下同，去上清，其沉淀物加入0.5 mol/L HAc透析溶解，离心，取上清依次加入0.lmol/LTris-HCI终浓度为0.01mol/L，5mol/LNaOH调pH至7.4，NaCl终浓度为4mol/L，搅拌过夜，离心，去上清，沉淀以4 mol/L NaCI，0.05 mol/L Tris-HCI洗一次，再加0.5mol/LHAC透析溶解，离心去沉淀，上清装入透析袋内，对NaCl溶府透析，平衡后NaCl浓度为1O离心去上清，沉淀物用0.5mol/LHAC透析去盐溶解，离心去沉淀，上清浓缩冻干以上所有液体及操作温度均为4℃。为提高抽提纯度骨粉应越细越好，脱钙必须完全，采用EDTA脱钙，可使一些非胶原蛋白，如骨连接蛋白 羊软骨Ⅱ型胶原蛋白的提取纯化与鉴定 作者：肖旭，石文达，姚青，陈虎，王基云，李晓兵，高岭 【摘要】目的从羊肋软骨中提取纯化Ⅱ型胶原蛋白，并对其进行鉴定。方法选择羊肋软骨为原料经脱脂、脱钙后，用盐酸胍去除蛋白多糖，经胃蛋白酶消化、氯化钠盐析等步骤，提取纯化蛋白，然后进行鉴定。结果 4mol/L盐酸胍能有效去除蛋白多糖，用胃蛋白酶的限制性酶解结果满意；氯化钠盐析浓度为3mol/L时最佳。SDS-PAGE 电泳结果显示提取纯化的蛋白与Sigma公司的Ⅱ型胶原蛋白一致。Ⅱ型胶原蛋白最大吸收峰为212 nm。结论从羊肋软骨提取的Ⅱ型胶原蛋白纯度高，且符合II型胶原蛋白的特征。 【关键词】Ⅱ型胶原蛋白；软骨；蛋白多糖 Abstract: Objective To isolate and purify collagen type Ⅱ(CⅡ) from Sheep cartilage and to identify its purity. Methods The Sheep cartilages were collected as raw materials. After degreasing and decalcification, Guanidine hydrochloride was used to remove the proteoglycans. The digestion of pepsin, salting of sodium chloride were performed for extracting CⅡand identification. Results The proteoglycans could be efficiently removed by 4mol?L 1 guanidine hydrochloride. The results were obtained by limited enzyme digestion of pepsin added. The optimizing concentration of sodium chloride for salting CⅡwas 3mol?L 1. It was found that the protein and Sigma 开题报告 食品质量与安全 酶解法提取牛皮胶原蛋白的条件优化 一、选题的背景与意义 胶原蛋白，主要存在于动物的皮、骨、软骨、牙齿、肌腱、韧带和血管中，是结缔组织极重要的结构蛋白。由于胶原蛋白具有良好的物理性能和生物学特性，因而其被广泛的应用于化工、食品、医学、生物材料以及农业等诸多领域。因此，胶原蛋白的提取一直是研究的热点。 目前国际上已开发出许多胶原保健品和功能性胶原生物材料。相对于我国，其在胶原蛋白的基础研究上已经具有一些优势并拥有一定的国际专利，而且部分已经投入市场，形成一定的市场规模。而我国的高质量胶原蛋白基础研究还有差距，有关这方面的核心专利技术不多。 但就目前的消费趋势来看，我国胶原蛋白的需求量逐渐增加，特别是随着人们对饮食和健康的不断重视，因此市场前景较为关阔。另一方面在肉制品和制革加工过程中含有丰富胶原物质的副产物（皮、内脏、肉骨头）利用的附加值很低。这样既浪费资源又污染环境，利用这些废弃物生成胶原蛋白实现资源的合理和有价值的利用，实现经济和社会效益的双赢。 本实验的以牛肉制品的下脚料——牛皮为原料，利用酶解法提取胶原蛋白，同时通过试验条件的优化，得到较优的提取条件，为今后的进一步研究提供参考。 二、研究的基本内容与拟解决的主要问题： 基本内容： 1、对牛皮成分的测定：主要测其水分、脂肪、粗蛋白、胶原蛋白等。 2、酶制剂的选择和复合：选择两种胶原蛋白提取率比较高的酶，然后按一定比例进行 复合试验。 3、研究不同实验条件对胶原蛋白提取率的影响：通过对加酶量、水解pH、水解温度、 水解时间、固液比等因素进行单因素试验，并在此基础上进行正交试验得出优化的 工艺条件。 拟解决的问题： 1、如何选择合适的比例对两种单酶进行复合。 2、如何提高胶原蛋白的提取率。 毕业论文外文资料翻译 学院：生物科学与工程学院 专业：生物工程 姓名：李秀莉 学号：120302214 外文出处：Food Chemistry 190(2016) 186-193 附件： 1.外文资料翻译译文；2.外文原文。 附件1：外文资料翻译译文 响应面优化蛋壳膜中胃蛋白酶溶性胶原蛋白提取工艺关键词： 蛋壳膜、响应面优化法、胃蛋白酶溶性胶原蛋白 摘要： 本文利用响应面优化法（RSM）确定了自变量对蛋壳膜中胃蛋白酶溶性胶原蛋白（PSC）提取产率的影响。采用中心复合设计（CCD）的实验设计和结果分析方法，选取最有可能的条件范围进行了优化实验：NaOH浓度（X1：0.4-1.2mol/L）,碱处理时间（X2：6-30h），酶浓度（X3：15-75U/mg）以及水解时间（X4：12-60h）。实验数据用适当的统计学方法通过多元线性回归分析得到一个二阶多项式方程，分析表明最佳提取条件为：NaOH浓度为0.76mol/L，碱处理时间为18h，酶浓度为50U/mg，水解时间为43.42h。在最佳提取条件下的提取率实验值是30.049%，这与预测值30.054%高度一致。 1.前言 胶原蛋白是脊椎动物的主要结构蛋白，大约占一个动物总蛋白的30%（Muyonga, Cole, & Duodo, 2004)。胶原蛋白的分子结构由三个多肽α-链扭曲在一起形成的一个三股螺旋体。在所有胶原蛋白的“胶原域”都发现了(Gly-X-Y)n重复。X和Y的位置往往分别被脯氨酸和羟脯氨酸占用（Gelse, Poschl, & Aigener, 2003）。目前，至少已有27中胶原蛋白类型已确定，其氨基酸序列、分子结构和功能明显不同（Canty & Kadler, 2005; Cheng, Hsu, Chang, Lin, & Sakata, 2009）。胶原蛋白已被广泛用作医药、化妆品、生物医学和食品行业的材料（Cheng et al.,2009）。一般来说，工业应用的胶原蛋白的主要来源是牛与猪的皮肤和骨头。然而，阮病毒疾病的爆发，如海绵脑病（BSE），传染性海绵脑病（TSE）和口蹄疫（FMD），以及禽流感，导致一些消费者对从这些动物体提取的胶原蛋白和胶原蛋白产品的担忧。此外，以猪为原料提取胶原蛋白不能被犹太人和穆斯林接收（Liu, Liang, Regenstein, & Zhou, 2012; Regenstein & Zhou, 2007）。因此，全球对胶原蛋白的代替原料的需求增加了，如水生动物。但是，关于胶原蛋白提取的其他来源的信息是有限的。 蛋壳作为副产品大约占了一个鸡蛋总重量（60g）的10%（Nys, Bain, & Immerseel, 2011）。据估计每年在伊朗蛋制品工业都产生100000吨的蛋壳。蛋壳膜存在于白色液体和固体蛋壳内表面之间。胶原蛋白占蛋壳膜总蛋白含量的10%（MacNeil, 2006）。在蛋 鱼鳞胶原蛋白的提取方法 摘要：人口、资源和环境是当前全球性的重大问题，加强对水产品的废弃物鱼鳞的加工利用和实现渔业生产的可持续发展已成为当今热门研究课题。文章简述了鱼鳞的结构特点，介绍了目前对鱼鳞胶原蛋白的提取方法，旨在使人们了解鱼鳞的真正价值所在，为其开发利用作参考。 关键词：鱼鳞胶原蛋白提取方法 近年来，淡水鱼加工业随着我国淡水鱼产量的增长而得到了较快的发展，鱼品加工也越来越广泛。但是，许多淡水鱼加工过程仅局限于对鱼体肌肉的利用，而对鱼鳞等废弃物的加工利用甚少。每年淡水鱼加工业的废弃物总量达到200万吨以上，其中鱼鳞约占15%，即30万吨。若能合理利用，可有效减少环境污染，又可提高企业效益，因此加大对鱼鳞含有物质的利用，可应用多个行业，其利用价值巨大，发展前景广阔。 1 鱼鳞的结构与组成 鱼鳞是鱼体与外界接触的组织，是鱼类真皮层的变形物，通常占鱼体重量的1%~5%，起保护鱼体免受伤害的作用。通常鱼鳞可分为三种：(1)板鳃鱼所特有的木盾鳞；(2)斜方型、边缘相联的硬鳞；(3)最常见的骨鳞，在硬骨鱼中最多。鱼鳞主要由蛋白质，卵磷脂，羟基磷灰石和鸟嘌呤组成，其中有机物占41％一55％，钙盐38％～46％。蛋白质占总重的70％，主要为胶原蛋白和鱼鳞角蛋白。鱼鳞胶原蛋白主要为I型胶原。I型胶原蛋白为三股超螺旋结构，即三条多肽链每条都向左旋转形成左手螺旋结构，这三条肽链再以氢键相互结合形成右手超螺旋结构。这种结构非常稳定，胶原一般不溶于水和中性盐溶液、稀酸、稀碱及一般有机溶剂，溶于强酸和强碱。 2 鱼鳞胶原蛋白的提取方法 2.1鱼鳞提取胶原蛋白的前处理 在鱼鳞的前处理中主要做的是脱钙，方法主要有酸脱钙和EDTA脱钙。酸脱 收稿日期：２００６－０９－０２ ＊通讯作者基金项目：上海市科委科研项目（０３ＪＧ０５００１） 作者简介：王川（１９８１－），男，学士，研究方向为功能食品和食品生化技术。 几种酶法从猪皮中提取胶原蛋白的对比研究 王 川１，李 燕２，马志英１，＊，蓝蔚青２ （１．上海市食品研究所，上海 ２００２３５；２．上海水产大学食品学院，上海 ２０００９０） 摘 要：研究了用胰酶、木瓜蛋白酶和胃蛋白酶从猪皮中提取胶原蛋白。研究发现，猪皮的蛋白质含量约为２４．５９％，羟脯氨酸含量为２．３％。猪皮经酶解处理后，即得到胶原蛋白粗提取液，粗提液再经过透析、浓缩，最后进行冷冻干燥，可得到纯度较高的胶原蛋白制品。研究结果显示：三种酶处理猪皮，其中以胰酶提取物得率最高，但结构破坏较严重，用胃蛋白酶提取的胶原蛋白制品的结构最完整，色泽最为洁白，但得率最低。关键词：胶原蛋白；酶解；羟脯氨酸；提取 Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ Ｓｔｕｄｙ ｏｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｏｌｌａｇｅｎ ｆｒｏｍ Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｓｋｉｎ ｂｙ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｅｎｚｙｍｅｓ ＷＡＮＧ Ｃｈｕａｎ１，ＬＩ Ｙａｎ２，ＭＡ Ｚｈｉ－ｙｉｎｇ１，＊，ＬＡＮ Ｗｅｉ－ｑｉｎｇ２（１．Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｆｏｏｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， Ｓｈａｎｇｈａｉ ２００２３５， Ｃｈｉｎａ； ２．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｓｈａｎｇｈａｉ ２０００９０， Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ ：Ｔｈｉｓ ｐａｐｅｒ ｈａｓ ｓｔｕｄｉｅｄ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｆｒｏｍ ｐｏｒｃｉｎｅ ｓｋｉｎ ｂｙ ｔｒｙｐｓｉｎ， ｐａｐａｉｎ ａｎｄ ｐｅｐｓｉｎ． Ｔｈｅｒｅ ｈａｖｅ ｂｅｅｎｆｏｕｎｄ ｔｏ ｃｏｎｔａｉｎ ２４．５９％ ｐｒｏｔｅｉｎ， ａｎｄ ２．３％ ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｌｉｎｅ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ｓｋｉｎ． Ｃｏｌｌａｇｅｎ ｆｒｏｍ ｐｏｒｃｉｎｅ ｓｋｉｎ ｗａｓｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｂｙ ｔｈｒｅｅ ｋｉｎｄｓ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅｓ． Ａｆｔｅｒ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｉｔ ｗａｓ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｆｕｒｔｈｅｒ ｂｙ ｄｉａｌｙｚｉｎｇ， ｃｏｎｄｅｎｓｉｎｇ ａｎｄ ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｉｎｇ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄ： Ａｍｏｎｇ ｔｈｅ ｃｏｌｌａｇｅｎｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｂｙ ｔｈｒｅｅ ｋｉｎｄｓ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅｓ， ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ ｔｒｙｐｓｉｎ ｉｓ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ， ｂｕｔ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｉｓ ｓｅｖｅｒｅｌｙ ｄｅｓｔｒｏｙｅｄ， ｗｈｉｌｅ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｂｙ ｐａｐａｉｎ ｉｓ ｔｈｅ ｂｅｓｔ， ａｎｄ ａｌｓｏ ｔｈｅ ｗｈｉｔｅｎｅｓｓ ｗａｓ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ａｍｏｎｇｔｈｅ ｃｏｌｌａｇｅｎｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ， ｂｕｔ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｉｓ ｔｈｅ ｌｏｗｅｓｔ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｃｏｌｌａｇｅｎ；ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ；ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｌｉｎｅ；ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ 中图分类号：Ｑ８１４．９ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００２－６６３０（２００７）０１－０２０１－０４ 胶原蛋白是构成动物支持组织的结构蛋白质，能有 效地增加皮肤组织细胞的储水功能［１］，增加肌肤弹性，保持皮肤柔软、细嫩，也能使人体内的血管和神经保持韧性和弹性，头发光亮，对人体抗衰老及美容具有特殊功效［２］。 从动物组织中提取胶原蛋白，常用的方法有：碱法、酸法、酶法和热处理等［３－６］。利用酶法提取胶原蛋白，具有较高的回收率，水解反应速度快，时间短，无环境污染等优点。酶法提取的水解胶原蛋白纯度高，水溶性好，理化性质稳定。 目前国际上已开发出许多胶原保健品和功能性胶原生物材料。其在胶原蛋白的基础研究上具有一些优势，拥有一定的国际专利，并形成部分的市场规模。目前我国的高质量胶原蛋白基础研究还有差距，有关这方面的核心专利技术不多。就目前的消费趋势来看，我国胶原蛋白的需求量逐渐增加，因此市场前景较为广阔。另一方面在肉制品加工过程中含有丰富胶原物质的副产 物（皮、内脏、肉骨头）利用的附加值很低，既浪费资 源又污染环境。利用这些废弃物生产胶原蛋白，可以实现资源的合理和有价值的利用，实现经济和社会效益的双赢。 本文分别用胰酶、木瓜蛋白酶和胃蛋白酶对猪皮进行胶原蛋白的提取，并对酶解提取物进行分子量、特性粘度、羟脯氨酸含量测定，对比其结果，对酶法提取胶原蛋白进行对比研究，为进一步对不同用途和性能的胶原蛋白研究提供技术基础。１材料与方法 １．１ 原料 选用经检疫合格的生猪，屠宰后生剥皮。初步处理后，－１８℃冻藏备用，实验时４℃解冻。１．２ 仪器 分光光度计（Ｕｎｉｃｏ ＵＶ－２０００）；Ｃｈｒｉｓｔ冻干机 （Ａｌｐｈ Ａ１－２）；Ｂｅｃｋｍａｎ高速离心机（ＬＧ１０－２．４Ａ）；凯 开题报告 食品科学与工程 鱼鳞胶原蛋白的提取工艺研究 一、综述本课题国内外研究动态，说明选题的依据和意义 胶原蛋白是细胞外基质的结构蛋白质，其分子在细胞外基质中聚集为超分子结构。其分子量为30万道尔顿，它是由3条左手螺旋构型α肽链结合而成的三螺旋结构，互相盘绕成螺旋结构。在胶原蛋白中甘氨酸（Gly）几乎占总含量的1/3，脯氨酸（Pro）和羟脯氨酸（Hyp）的含量是都高于其他蛋白质中的含量，且羟基赖氨酸（Hyl）仅在胶原蛋白中存在。胶原蛋白是结缔组织中极其重要的一种结构蛋白占全身总蛋白质的30%以，它广泛存在于动物的骨、腱、肌鞘、韧带肌膜、软骨和皮肤中。由于其分子结构稳定并具有良好的生物相容性，在医药、保健、食品加工、化妆品等领域有良好的应用前景。 近年来，我国水产品产量一直保持着高速增长的势头，其中，2005年产量高达4900万吨，约占世界水产品产量的35%，位居世界第一位。伴随着我国渔业生产的快速发展，水产品加工也越来越广泛，但是在加工过程中会不可避免地产生大量的下脚料，其中的鱼鳞通常被人们视为下脚料，这类下脚料往往被随意丢弃，不但造成了资源浪费，还会污染环境。据统计，我国每年废弃的鱼鳞达到30万吨以上。 鱼鳞约占鱼体重的2%~5%，研究表明，鱼鳞中含有丰富的蛋白质、卵鳞脂和各种矿物质，有机物占41%~55%，钙盐为38%~46%，主要由蛋白质和羟基磷灰石组成，其中蛋白质占鱼鳞总重的70%，主要为胶原蛋白和鱼鳞角蛋白。水产胶原蛋白具有陆生动物胶原蛋白没有的一些特点以及更高的安全性，由此以鱼鳞作为原料提取胶原蛋白是一种很好的途径。 胶原蛋白质结构和功能特点的多样性和复杂性，决定了它在许多领域的重要地位以及广阔的应用前景。当今科学技术已将胶原蛋白广泛应用于医药工业、食品工业、日用化学品工业、生物合成及胶原修饰等领域中，鱼鳞胶原蛋白作为极有发展潜力与应用价值的高附加值产品而倍受人们的关注与青睐。 鱼鳞中含有大量的胶原蛋白，采用传统工艺进行水产品加工的过程中，一般将其作为废弃物丢弃，这是一种巨大的浪费。本文总结了鱼鳞胶原三个产品的制备技术与应用，其中鱼鳞明胶和鱼鳞胶原蛋白粉的加工技术已相对成熟，而作为生物医用材料的胶原蛋白的开发尚处于起步阶段。以鱼鳞胶原制备的一系列产品具有广阔的应用领域，横跨化工业、食品行业、化妆品 龙源期刊网 https://www.wendangku.net/doc/6b7397499.html, 胶原蛋白肽粉的提取工艺 作者：蔡比泰 来源：《现代食品·下》2017年第03期 摘要：作为一种新兴的功能型蛋白配料，胶原蛋白肽近年来在国内外受到广泛关注，取 得了快速发展。本文主要分析胶原蛋白肽的功能特性以及提取工艺，并提出未来胶原蛋白肽产品的发展趋势，以供相关企业参考。 关键词：胶原蛋白肽；胶原蛋白；提取工艺 Abstract：As a new type of functional protein ingredient， collagen peptide has been paid more and more attention in recent years. In this paper， the functional properties and extraction technology of collagen peptide were analyzed， and the future development trend of collagen peptide was put forward， for reference to relevant enterprises. Key words：Collagen peptide； Collagen； Extraction technology 中图分类号：TS254.4 在国家经济水平不断提升的今天，人们更加关注生活质量和个人身体质量。而胶原蛋白肽产品以其良好的补水、锁水、抗氧化、抗肿瘤和起泡性等功能，被越来越多的应用于各种护肤、药物以及食品中。 1 胶原蛋白肽概述 胶原蛋白是一种纤维性蛋白质，广泛存在于动物的骨骼、皮肤、毛发和血管中，主要起到支持、维护和修复机体的作用。胶原蛋白的主要构成物质是氨基酸，经过水解之后会生成胶原蛋白肽以及副产品氨基酸。下面将从两个方面阐述胶原蛋白肽。 1.1 胶原蛋白肽的理化性质 由于胶原蛋白肽的分子量比较小，比胶原蛋白更容易溶解。在浓度达到50%的情况下，胶原蛋白肽依然不会出现浑浊现象，且黏稠度非常低。此外，在一般的pH下，其溶解度会增强。正是由于这些特性，胶原蛋白肽在饮料等产品中的应用非常广泛。 1.2 胶原蛋白肽的功能特性 胶原蛋白肽是胶原蛋白水解后制成的，大量的亲水基团暴露在外面，胶原蛋白肽的吸水性能和锁水性要比胶原蛋白强很多。所以，胶原蛋白肽被大量应用于护肤品中，主要起到锁住皮肤的水分以及补水的功效。胶原蛋白肽还经常作为食品添加剂被广泛应用到食物烹饪中，主要 实验21 胶原蛋白的提取工艺研究 一、实验目的 1．掌握胶原提取与分离的工艺方法。 2．掌握冷冻离心机的使用。 3．了解胶原提取的实验原理。 二、实验原理 胶原是生物体内一种纤维蛋白，主要存在于皮肤、骨、软骨及肌腱等组织中，占人体或其他动物体总蛋白含量的25～33%。胶原分为可溶性胶原和不溶性胶原。随着年龄的增长，胶原分子间出现共价键架桥。这些架桥大多位于胶原分子N及c端的非胶原性肽(端肽)部分，因而易被蛋白酶切断。在酸性条件下，以胃蛋白酶处理(底物﹕酶＝20～100﹕1)或中性条件下经木瓜蛋白酶处理，被切除部分端肽的胶原分子便变为可溶性。本实验采用胃蛋白酶消化法从猪皮或肌腱中提取胶原蛋白。 三、主要仪器与试剂 1．主要仪器 控温磁力搅拌器，高速组织捣碎机，酸度计（或pH试纸），高速冷冻离心机。 2．试剂 猪皮或肌腱，胃蛋白酶，醋酸，硫酸铜，硫酸钾，氢氧化钠，硫酸，硼酸，盐酸。 四、实验步骤 安全预防：醋酸具有刺激性气味，需要在通风橱中进行。 1．原料前处理 将新鲜猪皮或肌腱去脂肪、筋膜后，切成5 mm以下的薄片，越少越有利于提取胶原蛋白。然后除血，脱脂，再用蒸馏水漂洗干净，晾干备用。前处理时必须充分去除脂肪组织，胶原中一旦有脂质混入，无论是进行中性，还是酸性沉淀溶解都是不能去除的，最后只能得到乳浊状的胶原溶液。 2．胶原蛋白的提取 将上述预处理好的猪皮或肌腱称重后放入三角烧瓶中，分别加入一定量的酶和一定浓度的乙酸溶液进行水解，控制温度4 ℃左右缓慢搅拌3 d，然后用高速冷冻离心机以4000 r·min －1离心，取上清溶液，即可得粗提胶原蛋白溶液。 3．胶原蛋白提纯 在粗提胶原蛋白溶液缓慢加入6mol·L－1氢氧化钠溶液调节pH值到7，冷冻离心除掉沉淀物，在剩余的溶液中加入氯化钠固体研细粉末，缓慢搅拌，4 ℃静置过夜保存。离心取沉淀，用稀醋酸再次溶解，将溶解液装入透析袋中，用质量分数分别为0.1%的乙酸溶液透析1 d，再用蒸馏水透析，最后得到的是纯度较高的胶原蛋白水溶液。 4．蛋白质含量的测定 凯氏定氮法。 五、思考题 1．原料前处理时，为什么必须充分去除脂肪组织？ 2．胶原蛋白提纯过程中，在剩余溶液中加入氯化钠的作用是什么？ 3．酶解时，对提取温度和pH值有何要求？ 参考文献 胶原蛋白项目投资计划书 一、项目概况 国务院发布的“国家中长期科学和技术发展规划纲要（2006-2020年）”中，“重点领域及其优先主题”第51项是“先进医疗设备与生物医用材料”。而胶原蛋白则是新型生物医用材料、组织工程技术以及生物药物缓释体系的的重要组成部分，其高速发展完全符合国家的政策导向。 高附加值农业也是十二五重点支持的领域之一，鱼胶原蛋白系列产品的开发符合新兴农产品深开发的发展方向。2005年我国水产品总量已达到5100万吨，占世界总产量的35.7%。据我国农业部渔业局委托上海水产系统有关单位进行的《中国水产废弃物利用产业调查报告》指出：2002年水产品加工业处理水产原料达到了1589.2万吨，总产值达761.1亿元。除此之外，大约还有40%的国外水产品在中国加工，每年大约有800万吨废弃物（包括鱼皮、鳞、骨、内脏等）产生。因此，每年由如此巨大量的鱼类加工原料被废弃，如能全面综合利用，其产能和效能则不可限量。所以，开发海洋生物资源综合加工利用技术，具有重大的经济、生态和社会意义。 胶原基生物材料及制品的临床应用已有几十年，2010年全球市场销量已达86亿美金,国内仅有不到10亿人民币的销量。目前市售的胶原基医疗产品是以陆地动物组织如牛/猪皮肤或跟腱为主要来源，涉及病毒传播等问题,已被列入我国重点监控的高风险产品名录。寻找更为安全的胶原来源以保证其临床医用的安全性，已成为亟待解 决的关键难题。迄今未见水产品人畜共患疾病的报道，因此，水产品废弃物来源的鱼胶原比陆地动物源胶原的生物安全性高。从鱼鳞/鱼皮等水产品加工废弃物中提取的胶原产品用于食品、化妆品领域已有10多年历史并证明安全有效。世界上迄今只有欧盟批准的鱼胶原基医用止血材料1项，因此鱼胶原医用产品的研发、转化和标准化基本属于空白。 二. 领军人物及团队 本项目负责人顾其胜教授是生物材料行业的行业带头人，曾开发出多项具有自主知识产权的产品，是国家生物医用材料领域的知名专家，尤其擅长于天然多糖、蛋白质和其他生物制品等生物材料的开发和转化，作为多家高校的客座教授，参与过“十一五”中的863项目及重点支撑项目，并带教研究生多名。 项目开发团队的人员配置合理，有生物学、材料学、临床医学等专业背景并配置有高学历（硕士、博士）的人才作为项目的主要负责小组。顾其胜教授作为总负责人具有丰富的开发、管理、产业化经验，其他参与人员均有相应的产品开发、生产、质控、保障、临床验证、产品申报等方面的经验，可保证项目实施各阶段接口之间的有效衔接。 本项目的研发团队有天然多糖及其衍生化制品开发和转化的相关专业经历，曾参与国家863、十一五专项、国家自然科学基金等支持的相关项目的研发工作，对天然多糖及其衍生化产物的制备、纯化有丰富的经验积累和实践技能积累。项目组在胶原蛋白开发领域有丰 研究简报文章编号:1000-2790(2002)19-1820-02 I型胶原蛋白的提取纯化和鉴定 王彦宏朱平冷南解慧 (第四军医大学西京医院临床免疫科陕西西安710033) 关键词:I型胶原蛋白;胃蛋白酶;关节炎 中图号:R593.22文献标识码:B 1材料和方法 1.1材料胃蛋白酶及I型胶原蛋白(C I)标准品购自美国Sigma公司.M r14.4~97.4>103低分子标准蛋白购自上海丽珠东风生化技术有限公司.CS-9000薄层扫描仪购自日本岛津公司. 1:Protein marker;2:C I(Sigma)2g L-1;3:C I(Sigma)1g L-1;4:C I1g L-1;5:C I0.5g L-1;6:C I0.25g L-1; 7:0.125g L-1. 图1SDS-PAGE分析经DEAE-52纤维素柱层析纯化的C I 1.2方法新鲜牛软骨剥去骨膜在液氮冷冻下磨成粉称质量用10倍体积的4mol L-1盐酸胍-0.05mmol L-1 Tris-~Cl(p~7.5)混悬后于4 下搅拌24h12000g离心20min弃上清用0.5mmol L-1乙酸充分洗涤.沉淀用4倍的0.5mmol L-1乙酸(内含1g L-1胃蛋白酶)混悬 4 下搅拌48h20000g离心20min取上清然后用3mmol L-1的NaCl沉淀过夜离心沉淀用0.1mmol L-1乙酸溶解此即为粗制之I型胶原蛋白(C I).DE52离子交换柱经 0.05mmol L-1Tris-~Cl-0.2mmol L-1NaCl(p~7.4)平衡后装入高度为20cm体积为120mL的交换柱内.缓缓加入经平衡液透析后之粗制C I在核酸蛋白检测仪检测下(7=280nm)调节流速约5mL min-1收集第1峰(C I)然后用3mmol L-1 收稿日期:2001-12-04;修回日期:2002-03-24 基金项目:国家新药基金资助项目(96-901-05-262) 通讯作者:朱平.Tel.(029)3375355Email.Zhuping https://www.wendangku.net/doc/6b7397499.html, 作者简介:王彦宏(1963-)男(汉族)陕西省扶风县人.主管技师. Tel.(029)3375360Email.cxyhfk https://www.wendangku.net/doc/6b7397499.html, NaCl4 下沉淀过夜离心取沉淀用0.5mmol L-1乙酸重溶解.透析此即为纯化后之C I.C I的鉴定:D采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电永(PAGE).选用50g L-1浓缩胶和120 g L-1分离胶样品分别为低分子标准蛋白(M r为97.4 66. 2 43.0 31.0 20.1和14.4>103)标准C I及不同批次的自产纯化C I.按常规电泳;@凝胶采用CS-9000薄层扫描仪扫描7=580nm. 2结果C I的SDS-PAGE的条带经与C I对照品(Sigma 公司产品)和标准分子蛋白的条带对照均一致(图1).SDS- PAGE薄层扫描结果如图2. 图2薄层扫描分析SDS-PAGE凝胶 3讨论I型胶原是RA的一种自身抗原抗胶原抗体和胶原特异性T细胞在关节炎的发生和发展中起重要作用[1-3]口服同种属或异种属I型胶原均有抑制减轻动物模型关节炎和人类RA的作用[4 5]国外多采用鸡I型胶原鉴于牛软骨来源更丰富我们采用胃蛋白酶消化法从牛软骨提取C I 并经DEAE-52离子交换柱层析纯化SDS-PAGE和薄层扫描鉴定均表明获得与Sigma公司产品分子质量一致的C I 为临床应用提供了实验方法和便利条件. 参考文献: [1]Snomden N Reynlds I Morgan K~olLt.T cell responses to ~uman type I collagen in patients with rheumatoid arthritis and healthy controls[J].1997;40(7):1210-1218. [2]Myers LK~iggins GC Finkel T~Reed AM Thompson JW Walton RC~endrickson J Kerr NC Pandya-Lipman RK Shlopov BV Stastny P Postlethwaite AE Kang A~.Juvenile arthritis and autoimmunity to type I collagen[J]. 2001;44(8):1775-1781. [3]Garnero P Gineyts E Christgau S Finck B Delmas PD. Association of baseline levels of urinary glucosyl-galactosyl-【CN109796529A】一种胶原蛋白及其提取方法【专利】
胶原蛋白的提取方法
胶原蛋白的提取
鲫鱼鱼皮胶原蛋白提取工艺的研究毕业论文
鱼皮胶原蛋白工艺20130413
胶原蛋白的提取、结构以及分子量测量综述
羊软骨Ⅱ型胶原蛋白的提取纯化与鉴定
酶解法提取牛皮胶原蛋白的条件优化[设计+开题+综述]
胶原蛋白提取
鱼鳞胶原蛋白的提取方法
几种酶法从猪皮中提取胶原蛋白的对比研究
鱼鳞胶原蛋白的提取工艺研究【开题报告】
胶原蛋白肽粉的提取工艺
胶原蛋白的提取工艺研究
(新)胶原蛋白项目计划书1128
Ⅱ型胶原蛋白的提取纯化和鉴定