原生质体制备方法
原生质体制备方法
培养基：
①PDA：200g土豆、20g葡萄糖、20g琼脂、1L水
②MYG液体培养基：5g麦芽糖、5g酵母提取物、10g葡萄糖、1L水、
③MYG液体再生培养基：5g麦芽糖、5g酵母提取物、10g葡萄糖、蔗糖、1L水、
④MYG软再生培养基：5g麦芽糖、5g酵母提取物、10g葡糖糖、8g琼脂粉、蔗糖、试剂：
①1mol/L MgSO4
②L MgSO4
③STC：山梨醇、50mM Tris-Hcl（）、50mM CaCl2
④肝素
⑤SPTC：山梨醇、40% PEG、50mM Tris-Hcl（）、50mM CaCl2
⑥无菌水
操作步骤：
①倒若干PDA平板，将GF-WT接入PDA平板，23℃，活化5-7days
②用无菌黄枪头在GF-WT平板上打孔，用长牙签挑出4个菌饼接入50ml/瓶的MYG
液体培养基中，120rmp，28℃，12h
③以10%的接种量接5瓶以上50ml/瓶的MYG液体培养基中，60rpm，28℃，16h
④混有大量悬浮菌丝的培养基用无菌的带有三层擦镜纸的漏斗过滤下来，用无菌
水和1mol/L MgSO4各冲洗三次，菌丝发白即可，冰上备用
⑤酶解体系的配制：取Dryslase 45mg+Yartlase105mg至无菌量管中，用10ml
1mol/L MgSO4溶解彻底，用无菌滤头和针筒过滤除菌，滤液保存于冰上
⑥1g菌丝加入到10ml酶解体系中，于无菌三角瓶中进行酶解反应，30℃，60rpm，
3h
⑦用带有无菌滤布的漏斗过滤酶解液，滤液用无菌50ml大管收集，用20ml L MgSO4
冲洗三角瓶和漏斗，3500rpm，10min，取上清
⑧沉淀用20ml STC溶解悬浮，3500rpm，10min，取上清
⑨沉淀下来的原生质体用800μL STC溶液悬浮，并加入200μL的SPTC溶液，加
入SPTC时一滴一滴加，混匀后镜检计数，大于107可用，冰上备用
微生物原生质体融合技术研究进展_王春平
动物医学进展,2008,29(5):64267 Progress in Veterinary Medicine 微生物原生质体融合技术研究进展3 王春平1,2,韦 强1,鲍国连13,刘 燕1,邵泽香1,2,季权安1 (1.浙江省农业科学院畜牧兽医研究所,浙江杭州310021;2.山东农业大学动物科技学院,山东泰安271018) 摘 要:原生质体融合技术在遗传学、动植物远缘杂交育种、生物学、免疫学、兽医学以及医药、食品、农业等方面都有广泛的应用价值,文章就原生质体制备、再生及其融合过程中的影响因素做了综述,另外还对原生质体融合方法和融合子的筛选方法进行了比较,为选择适宜有效的诱导融合方法和筛选方法提供依据。 关键词:原生质体融合;影响因素;融合方法;筛选方法 中图分类号:Q813.2文献标识码:A文章编号:100725038(2008)0520064204 原生质体融合也称细胞杂交、细胞融合或体细胞杂交,是指细胞通过介导和培养,在离体条件下用人工方法将不同种的细胞通过无性方式融合成一个核或多核的杂合细胞的过程[1]。原生质体融合技术起源于20世纪60年代。1960年法国的Karski研究小组在两种不同类型的动物细胞混合培养中发现了自发融合现象。1974年匈牙利的Ferenczy L 等[2]采用离心力诱导的方法,报道了白地霉营养缺陷型突变株的原生质体融合,从而使原生质体融合技术成为微生物育种的一项新技术,并从微生物种内融合扩展到界间的融合。路玲玲等[3]采用融合技术成功构建耐高温高产酒精酵母,至此,原生质体融合技术成为工业菌株改良的重要手段之一。原生质体融合技术已在农业、医药、环保等领域取得了开创性的研究成果,而且应用领域不断扩大[4]。 1 原生质体融合技术 微生物原生质体融合技术的整个过程包括:原生质体的制备,原生质体融合,原生质体再生[5]。1.1 原生质体制备与再生过程中的影响因素 制备原生质体的最大障碍就是细胞壁,现在去除细胞壁的主要方法是使用酶法,使用的酶主要为蜗牛酶或溶菌酶,具体根据所用微生物的种类而定。影响原生质体制备的因素很多,不同的微生物有其较为适当的形成条件。在菌龄选择上,多采用对数生长中后期的细菌,这主要是由于对数生长期细菌的细胞壁中肽聚糖含量最低,细胞壁对酶的作用最敏感。王燕[6]对双亲灭活米曲霉进行原生质体制备的过程中,用纤维素酶、溶壁酶、蜗牛酶混合浓度比为5∶3∶1的酶液混合使用能提高去壁效果。使用微生物产生的酶复合物或商品酶的混合液比单独使用一种酶的效果好,在一定范围内,酶作用的时间和酶作用的浓度都与原生质体的形成率成正相关,而与再生率成反相关。另外,ED TA作为螯合剂,可以避免金属离子对酶的抑制作用而提高酶脱壁效果,从而提高原生质体的形成率。据报道,对大肠埃希菌来说,用ED TA洗涤后,可以除去对酶解不利的金属离子[7]。另一方面,在原生质体制备前,用适量的青霉素对菌体进行预处理,可以抑制肽聚糖合成过程中的转肽作用,有利于原生质体的形成。根据酶反应动力学原理,酶解温度直接影响酶促反应的速度,如放线菌的最适酶解温度为28℃～37℃,真菌的最适酶解温度为30℃～35℃[8]。在高渗Tris 溶液中添加15mL/L聚乙烯吡咯烷酮(PV P)等原生质体扩张剂,有利于溶液中细菌的分散,有助于制备原生质体,添加0.02mol/L镁离子,有利于原生质体的稳定。关于原生质体的再生,吴孔兴等[9]报道在原生质体高渗再生培养基中加入0.3mol/L的蔗糖和0.2mol/L的丁二酸钠是合适的,王玉华等[10]报道在高渗再生培养基中加入0.5mol/L的蔗糖是适宜的,这可能要根据不同的微生物种类而定。 1.2 原生质体融合过程中的影响因素 1974年,匈牙利的Ferenczy报道了离心力诱导法对白地霉营养缺陷型突变株的原生质体融合。随后人们相继用NaCl、KCl和Ca(NO3)2等作为诱变剂进行融合,但融合频率都很低。聚乙二醇在适量 3收稿日期:2008202203 基金项目:浙江省重点科技攻关项目(2005C12021,2005E60014) 作者简介:王春平(1982-),男,山东淄博人,硕士研究生,主要从事动物传染病研究。3通讯作者
原生质体融合技术文献综述
XXXX学校XXXXXX学院毕业设计（论文）文献综述 学生姓名：学号： 专业：生物工程 班级： 设计（论文）题目： 指导教师： 二级学院： 2010年月日
题目 学生：学号：班级： 导师： 摘要：原生质体融合技术是细菌遗传育种的有效方法之一,发展迅速,应用广泛.文中综述了亲本菌株选择性遗传标记方法、影响原生质体制备与再生因素、原生质体融合方法和条件。介绍了原生质体融合技术在微生物遗传育种中的应用,并展望了原生质体融合技术的发展前景。 关键词： 引言：原生质体融合也称细胞杂交、细胞融合或体细胞杂交,是指细胞通过介导和培养,在离体条件下用人工方法将不同种的细胞通过无性方式融合成一个核或多核的杂合细胞的过程[1]。原生质体融合技术起源于20世纪60年代。1960年法国的Karski研究小组在两种不同类型的动物细胞混合培养中发现了自发融合现象。1974年匈牙利的Ferenczy L等[2]采用离心力诱导的方法,报道了白地霉营养缺陷型突变株的原生质体融合,从而使原生质体融合技术成为微生物育种的一项新技术,并从微生物种内融合扩展到界间的融合。路玲玲等[3]采用融合技术成功构建耐高温高产酒精酵母,至此,原生质体融合技术成为工业菌株改良的重要手段之一。原生质体融合技术已在农业、医药、环保等领域取得了开创性的研究成果,而且应用领域不断扩大[4]。 1 原生质体融合技术 微生物原生质体融合技术的整个过程包括:原生质体的制备、原生质体融合、原生质体再生[5]。 1.1 原生质体制备与再生过程中的影响因素 制备原生质体的最大障碍就是细胞壁,现在去除细胞壁的主要方法是使用酶法,使用的酶主要为蜗牛酶或溶菌酶,具体根据所用微生物的种类而定。影响原生质体制备的因素很多,不同的微生物有其较为适当的形成条件。在菌龄选择上,多采用对数生长中后期的细菌,这主要是由于对数生长期细菌的细胞壁中肽
植物原生质体培养方法
植物原生质体培养方法 1 植物原生质体培养的简史 植物细胞原生质体, 在植物学上指植物细胞通过质壁分离后, 可以和细胞壁分开的那部分细胞物质。原生质体分离纯化后, 须在适当的培养基上应用适当的培养方法, 才能再生细胞壁, 并启动细胞持续分裂, 直至形成细胞团、长成愈伤组织或胚状体、分化和发育成苗, 最终再生完整植株。其中, 选择合适的培养方法始终是原生质体培养中最基础也是最关键的一环。 植物原生质体培养方法起源于植物单细胞培养方法。早在1902 年,Haberlant 通过实验就预言: 体外培养单个细胞可通过其分裂得到培养组织。直到1954 年, 植物单细胞培养才获得成功。M uir 将培养的万寿菊及烟草悬浮细胞植入到长有愈伤组织的培养基上而得到了它们的单细胞克隆, 并建立了看护培养的方法。悬滴培养由De Ropp1954 年开创, 1960 年Jones 等完善了这一技术, 并建立了微室培养的方法。同年, Cock ing 应用酶法分离原生质获得了成功, 从而在实验条件下很容易获得大量的原生质体。随着多种适用于原生质体分离的商品酶的出现, 原生质体的培养方法也得到了不断的改进, 现在常用的液体浅层培养、双层培养法、琼脂糖包埋法、琼脂岛培养法以及使用条件培养基或饲喂培养等技术, 使原生质体培养获得了极大的成功。 2 原生质体培养方法 2. 1 液体培养法 2. 1. 1 液体浅层培养(L iquid th in culture) 这是目前较常用的原生质体培养方法, 一般适用于容易分裂的原生质体, 将含有原生质体的培养液在培养皿底部铺一薄层, 封口进行培养。这种方法操作简单, 对原生质体损伤较小, 且易于添加新鲜培养物。用这种方法, J.T rmeouillaax 等成功地培养长春花冠瘿组织的激素自养型的原生质体单细胞克隆; H isato Kunitake 等也在改良的M S 培养基上培育了Eustom a g rend if lorum (龙胆科, 原产美国) 原生质体再生植株。但这种方法也常使原生质体分布不均匀, 发育的原生质体之间产生粘连而影响其进一步的生长和发育, 尤其是难以定点观察单个原生质体的命运。王吉吉之等认为液体浅层培养在培养过程中, 应经常轻轻晃动培养基, 以增强通气, 促进愈伤组织形成。 2. 1. 2 微滴培养(D rop let culture) 微滴培养是由液体浅层培养发展起来的一种方法, 它克服了后者局部密度过高和原生质体粘聚的缺点。此方法是将0. 1m l 或更少的原生质体悬浮液用滴管滴于培养皿底部, 封口后进行培养。为避免微滴蒸发, 可将培养器皿置于湿润的环境中, 或在微滴上覆盖矿物油。此法适用于融合体及单个原生质体培养, 尤其适用于较多组合的实验。为了比较黄瓜两个品系在不同的植板密度以及在不同的激素水平下原生质体生长情况, Z. K. Punja 等选用了此方法获得很好的效果; 同样, S. V essabutr 等培养百脉根时也比较了不同预处理、不同酶液组合对原生质体培养的影响。 2. 2 固体培养—— 琼脂糖平板法(A grose beadmethed) 固体培养作为凝固剂的物质可以是琼脂、琼脂糖或Gellan gum , 近来很多实验证明, 琼脂糖尤其是低熔点的琼脂糖是一种良好的培养基凝固剂, 并且具有促进原生质体细胞分裂的作用。琼脂糖平板法是将原生质体纯化后悬浮在液体培养基中, 然后与热融并冷却到45℃的琼脂糖按一定比例混合, 轻轻摇动使原生质体均匀分布, 凝固后封口培养。由于原生质体彼此分开并固定了位置, 就避免了细胞间有害代谢产物的影响, 既便于定点观察, 又有利于追踪原生质体再生细胞的发育过程。Z. K. Punja 等证明琼脂平板法比微滴培养及液体浅层培养具有更高的植板率; 甘霖等也得出同样结论。但此种方法对操作技术要求比较严格, 尤其是温度一定要适宜; 添加低渗透压的培养基和转移再生愈伤组织也比较繁琐, 而且培养的原生质体极易褐变死亡。 2. 3 液体2固体结合培养 2. 3. 1 双层培养法(A grose2liquid doublelayer) 这种方法即在培养皿的底部先铺一薄层含或不含原生质体或细胞的固体培养基,
植物组织培养 第十章 原生质体培养
第十章原生质体培养 ?教学目的与要求： ?深入了解植物细胞结构功能与细胞全能性表达的关系，掌握原生质体的分离以 及培养过程中渗透压和激素的调控原理与技术。 第一节、原生质体研究概况 一、原生质体的概念 ?原生质体(p r o t o p l a s t)：指除去细胞壁的细胞或是说一个被质膜所包围的裸露 细胞。 二、原生质体研究进展 ?据统计，目前已有49个科，146个属的320多种植物经原生质体培养得到了再 生植株（1993）。其趋势仍以农作物和经济作物为主，但从一年生向多年生、草本向木本、高等植物向低等植物扩展。 三、原生质体研究的意义 ?1、除去了细胞壁为植物细胞之间的融合扫平了障碍，同时叶为制造新杂种开辟 了道路。2、原生质体可摄入外源D N A，细胞器、细菌或病毒颗粒，这些特性与植物全能性相结合为高等植物的遗传饰变打下基础。3、获得细胞无性系和选育突变体的优良起始材料。 第二节、原生质体的制备 1、用于分离原生质体的材料准备 ?无菌试管苗叶片 ?上胚轴和子叶 ?培养细胞 2、酶处理 ?原生质体分离常用的商品酶 ?纤维素酶类 ?果胶酶类 ?半纤维素酶 酶溶剂及其渗透压 ?酶溶剂：原生质体培养基或特殊配制。 ?渗透压调节剂：葡萄糖、甘露醇、山梨醇等。 ?酶浓度及酶解时间 ?酶解时间 ?酶浓度酶解温度 3、原生质体的收集和纯化 ?飘浮法：常用的飘浮剂有蔗糖、P e r c o l l、F i c o l l。 ?P e r c o l l是一种包有乙烯吡咯烷酮的硅胶颗粒。渗透压很低(<20m o s m／k g H2O), 粘度也很小，可形成高达1.3g／m l密度，采用预先形成的密度梯度时可在低离心力(200～1000g)于数分至数十分钟内达到满意的细胞分离结果。由于P e r c o l l 扩散常数低，所形成的梯度十分稳定。此外，P e r c o l l不穿透生物膜，对细胞无毒害，因此广泛用于分离细胞、亚细胞成分、细菌及病毒，还可将受损细胞及其碎片与完好的活细胞分离。
原生质体融合技术
原生质体融合技术的局限性 植物原生质体是指用特殊方法去细胞壁的、裸露的、有生活力的原生团。这种裸露细胞在适当的外界条件下，还可形成细胞壁，进行有丝分裂，形成愈伤组织和诱发再生植株，因而仍然具有细胞的全能性。 植物原生质体融合技术是借鉴于动物细胞融合的研究成果，在原生质体分离培养的基础上建立起来的，以植物的原生质体为材料，通过物理、化学等因素的诱导，使两个原生质体融合在一起以致形成融合细胞的技术。它不是雌雄孢子之间的结合，而是具有完整遗传物质的体细胞之间的融合，是2种原生质体间的杂交。通过原生质体融合可以把带有不同的基因组的两个细胞结合在一起，与有性杂交相比，无疑可以使“杂交”亲本组合的范围扩大，不但可以利用细胞核内基因资源，还可以利用包含在细胞质中的诸如叶绿体和线粒体DNA的遗传资源。 原生质体培养是细胞杂交的基础，但是直到目前为止，也只有360多个种的原生质体培养再生了完整的植株，大多数重要的植物尤其是木本植物如葡萄、棕榈、橡胶、茶、香蕉、椰子和芒果等的原生质体再生仍然很困难，或者还未进行深入研究。在原生质体再生的物种中，茄科占了将近1/4，并且用于育种目的的大多数体细胞杂种和细胞质杂种也比较集中于茄属、烟草属、苜蓿属、柑橘属、芸薹属和番茄属等6个属中。因此，为了有效地进行植物遗传改良，不但要使杂种细胞再生成完整植物，而且还必须提高植株再生的频率，以便有足够的群体进行有效的选择。但目前存在的一个普遍的问题使许多原生质体再生的程序似乎较低，重复性较差，并且还具有基因型的依赖性。为了将体细胞杂交技术应用于更多的植物中，还需要更加深入地研究植物细胞的分化、脱分化和再分化等发育机制。 1.技术局限性 植物细胞杂交的本质是将两种不同来源的原生质体，在人为的条件下进行诱导融合。由于植物细胞的全能性，因此融合之后的杂种细胞，可以再生出具有双亲性状的杂种植株。因此，细胞融合也叫原生质体融合或细胞杂交。其包括三个主要环节：诱导融合；选择融合体或杂种细胞；杂种植株的再生和鉴定。 1.1诱导原生质体融合 诱导原生质体融合是体细胞杂交的最基本的技术环节。融合方法的选择受到很多实验条件的限制。常用的化学方法有化学方法与电融合方法。化学方法中用的最多的是聚已二醇（PEG）融合技术。但是这种方法中PEG与高PH强加于原生质体的非常生理条件，PEG 的相对分子质量、纯度、浓度、处理时间、原生质体的状况和密度等都会影响PEG融合技术，而且其融合过程繁琐，PEG可能对细胞有毒害作用；而影响电融合的因素有电融合技术中交流电的强弱、处理时间的长短、电脉冲的大小电极的材料和间距、直流脉冲的强度、宽幅以及次数等。 而且对于不同的植物材料需要经过多次实验，才能找出这些参数的适当值。这就制约了原生质体融合技术成为常规育种方法。 1.2杂种细胞的选择 为了将杂种细胞与未融合的、同源融合的亲本细胞区分开，一般有以下选择方法： 1.2.1利用或诱导各种缺陷型或抗性细胞系，用选择培养基将互补的杂种细胞选择出来； 互补选择一般要求有相应的突变体。在体细胞杂交的研究中，虽然人们已经建立和利用了各种各样的突变体，但是在植物中要建立突变细胞系比较困难，如果要使突变细胞系保持再生能力就更难了，因此在实际应用中受到很大的限制。 1.2.2机械选择法 利用荧光素标记分离杂种细胞取得了一定的成效，但是显微镜操作费工费时，选择出异
植物原生质体培养
原生质体的培养 1. 原生质体的分离与纯化 原生质体培养的意义 (1)再生植株由原生质体再生生成植株，不论在进行有关细胞生物学或生物合成和代谢的实验研究上，还是在组织培养实践中，都有一定的优点：①可利用均一的分化细胞群体； ②因无细胞壁，试剂对细胞作用更为直接，其反应能直接测量，以使反应产物能较快的分离出来；③在理论和实践中，可极大节省空间，如在一个三角瓶就能培养210个细胞，但在大田种植需要4亩地；④可缩短实验周期，如悬浮培养时仅需1～2个小时。 原生质体培养可在遗传学方面进行基因互补，不亲和性，连锁群和基因鉴定，分析基因的激活和失活水平的研究。在研究分化问题时，用一个均一的原生质体群体可以筛选数以千计的不同。营养和激素条件，探索诱导单细胞的分化条件等。 (2)用于远缘体细胞融合，进行体细胞杂交。这是一种新的远缘杂交方法，为人们提供新的育种方法。两个亲缘关系较远的植株用一般杂交方法是不容易成功的，而用细胞融合的方法却成为可能。首先，两个原生质体融合形成异核体，异核体再再生细胞壁，进行有丝分裂，发生核融合，产生杂种细胞，由此可培养新的杂种。 一、原生质体(protoplast)的分离 （一）材料来源 原生质体是通过质壁分离与细胞壁分开的部分，是能存活的植物细胞的最小单位。自从1960年用酶法制备大量植物原生质体首次获得成功以来，原生质体培养成为生物技术最重要的进展之一。通过大量的试验表明，没有细胞壁的原生质体仍然具有"全能性"，可以经过离体培养得到再生植株。原生质体的分离研究较早，1892年Klereker首先用机械的方法分离得到了原生质体，但数量少且易受损伤。1960年，英国植物生理学家Cocking首先用酶解法从番茄幼苗的根分离原生质体获得成功。他使用一种由疣孢漆斑菌培养物制备的高浓度的纤维素酶溶液降解细胞壁。然而，直至1960年纤维素酶和离析酶成为商品酶投入市场以后，植物原生质体研究才成为一个热门的领域。至今从植物体的几乎每一部分都可分离得到原生质体。并且能从烟草、胡萝、矮牵牛、茄子、番茄等70种植物的原生质体再生成完整的植株。此外，原生质体融合，体细胞杂交的技术也得到广泛的应用。 （二）分离方法 1.机械分离法 1982年，Klercker第一次用机械方法从Stratiots aloides中获得原生质体.他们的做法是首先使细胞发生质壁分离,然后切开细胞壁释放出原生质体. 2.酶法分离 (1)酶的种类及特点 构成植物细胞壁的三个主要成分是： ①纤维素酶类：占细胞壁干重的25％至50％不等。 ②半纤维素酶类：平均约占细胞壁干重的53％左右。 ③果胶酶类：一般占细胞壁的5％。分离原生质体最常用的酶有纤维素酶、半纤维素 酶和果胶酶。
实验一植物原生质体的分离和培养一教学目标 了解植物原生质
实验一植物原生质体的分离和培养 一．教学目标：了解植物原生质体作为细胞工程研究的重要意义，了解原生质体活性鉴定的原理。掌握分离和培养原生质体的技术、方法和原理。掌握细胞活性的检测方法。掌握细胞计数的原理和方法。二．重点：掌握分离和培养原生质体的技术、方法和原理。掌握细胞活性的检测方法。掌握细胞计数的原理和方法。 三．难点：分离和培养原生质体的技术。 四．授课方式与教学方法：讲解原理、实验操作示范或具体指导。 五．教学内容: 实验原理 植物原生质体(protoplast)是除去细胞壁后为原生质所包围的“裸露细胞”,是开展基础研究的理想材料。其中,酶解法分离原生质体是一个常用的技术,其原理是植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成,因而使用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分,除去细胞壁,即可得到原生质体。由于原生质体内部与外界环境之间仅隔一层薄薄的细胞膜,必须保持在渗透压平衡的溶液中才能保持其完整性, 使原生质体分离后不致膨胀破裂，渗透剂常用甘露醇或蔗糖，酶液还应含一定Ca2+来稳定原生质膜。其次,还应当考虑取材、酶的种类和纯度、酶液的渗透压、酶解时间及温度等因素对分离原生质体的影响。将原生质体接种在培养基上进行培养，细胞壁再生，细胞分裂和再生植株。 测定原生质体的活性有多种方法。荧光素双醋酸酯(FDA)染色是常用的一种方法,FAD 本身无荧光,无极性,可透过完整的原生质膜。一旦进入原生质体后,由于受到酯酶分解而产生具有荧光的极性物质荧光素。它不能自由出入原生质膜,因此有活力的细胞能产生荧光,无活力的原生质体不能分解FAD无荧光产生。 细胞计数一般用血细胞计数极，按白细胞计数法进行计数。 从理论上讲，植物体的任何一部分都可以通过酶解作用去除细胞壁而得到原生质体。但在实际操作中，只有幼嫩的组织才能完成去壁的过程。所以，为了制备健康的原生质体，
原生质体细胞融合技术
食品生物技术课程论文原生质体细胞融合技术
原生质体细胞融合技术 摘要：细胞融合技术作为细胞工程的一项核心基础技术己在农业、医药、环保等领域得到了迅速发展和应用。综述了细胞融合技术中的常用方法:细胞融合仙台病毒诱导法、细胞融合PEG（聚乙二醇)诱导法、细胞融合电场诱导法、细胞融合激光诱导法;以及最新研究进展:基于微流控芯片的细胞融合技术、高通量细胞融合芯片、空间细胞融合技术、离子束细胞融合技术、非对称细胞融合技术等，并对它们的优缺进行简要的评述。 关键词：原生质体细胞融合技术影响因素融合方法发展 正文： 原生质体融合也称细胞杂交、细胞融合或体细胞杂交，是指细胞通过介导和培养，在离体条件下用人工方法将不同种的细胞通过无性方式融合成一个核或多核的杂合细胞的过程。利用现代科学技术，把来自于不同种生物的单个细胞融合成一个细胞，这个新细胞得到了来自两个细胞的遗传物质，具有新的遗传或生物特性。原生质体融合技术起源于20世纪60年代。1960年法国的Karski研究小组在两种不同类型的动物细胞混合培养中发现了自发融合现象。1974年匈牙利的Ferenczy 等采用离心力诱导的方法，报道了白地霉营养缺陷型突变株的原生质体融合，从而使原生质体融合技术成为微生物育种的一项新技术，并从微生物种内融合扩展到界间的融合。目前，通过原生质体融合进行体细胞杂交已成为细胞工程研究的重要内容之一。细胞融合核技术不仅为核质相互关系、基因调控、遗传互补、肿瘤发生、基因定位、衰老控制等理念领域的研究提供了有力的手段，而且在遗传学、动植物远缘杂交育种、发生生物学、免疫医学以及医药、食品、农业等方而都有广泛的应用价值。特别是在单克隆抗体的制备、哺乳动物的克隆以及抗癌疫苗的研发等技术中细胞融合技术已成为关键技术。 1 原生质体融合技术 微生物原生质体融合技术的整个过程包括:原生质体的制备，原生质体融合，原生质体再生。 1. 1 原生质体制备与再生过程中的影响因素 制备原生质体的最大障碍就是细胞壁，现在去除细胞壁的主要方法是使用酶法，使用的酶主要为蜗牛酶或溶菌酶，具体根据所用微生物的种类而定。影响原生质体制备的因素很多，不同的微生物有其较为适当的形成条件。在菌龄选择上，多采用对数生长中后期的细菌，这主要是由于对数生长期细菌的细胞壁中肤聚糖含量最低，细胞壁对酶的作用最敏感。对双亲灭活米曲霉进行原生质体制备的过程中，用纤维素酶、溶壁酶、蜗牛酶混合浓度比为5:3: 1的酶液混合使用能提高去壁效果。使用微生物产生的酶复合物或商品酶的混合液比单独使用
原生质体融合(实验报告)
酵母原生质体融合 ××××××××××酵母有发酵工业的灵魂之称，其发酵性能的好坏直接影响发酵产品的质量，同时也决定着发酵工艺流程和运转周期及运转费用[1]。因此，选育优良的酵母菌种在发酵工业中具有重要的意义[2]。对酿酒酵母的选育始终是酿酒工作者所要从事的重要工作之一。好的酿酒酵母能够提高酒的质量和产量，赋予酒良好的风味；能够简化工艺流程，减少设备投资；能够缩短发酵周期，降低运转费。 原生质体融合育种( protoplast fusion)是20世纪60年代发展起来的基因重组技术。通过两个遗传性状不同的亲株原生质体融合从而达到杂交目的。1960年法国的Barsi研究小组在培养两种不同动物细胞混合时发现了自发融合现象，同时日本的Dkada发现仙台病毒可诱发内艾氏腹水病细胞彼此融合，从而开始了细胞融合的探索。国内外对原生质体融合技术的研究都比较成熟, 一般认为酵母菌原生质体融合技术的关键点有原生质体的制备和再生、原生质体的融合以及融合子的筛选等。传统的对酿酒酵母的选育方法主要有自然分离、连续培养和诱变育种[3]。近年来重组技术，基因工程和原生质体融合技术迅速发展，得到了广泛应用。 两个或两个以上的细胞经过自然的或者人为的作用合并成为一个细胞叫融合细胞，这个过程就称为细胞融合过程。用微生物作材料进行细胞融合，必须消除细胞壁和细胞膜。通常采用酶解作用破除细胞壁，采用聚乙二醇促使细胞膜融合。细胞融合之后，还经过细胞质融合，细胞核重组，细胞壁再生等一系列过程才能形成具有生活能力的新菌株。融合后的细胞有两种可能：一是染色体DNA不发生重组，两种细胞的染色体共存于一个细胞内，形成异核体，这是不稳定的融合。另一类是两亲本细胞核染色体DNA真正发生重组。通过连续传代分离纯化可以区别这两类融合。应该指出，即便是真正的重组融合子，在传代中也有可能发生分离，产生回复或新的遗传重组体。因此，必须经过多次分离纯化才能够获得稳定的融合子。 本实验将通过酿酒酵母2.339与酿酒酵母2.70的融合，以期获得具有更高发酵效率的酿酒酵母新品种并应用于制酒工业，在节省酿酒粮食的投入量前提下提高发酵产量。以期获得更好的经济价值。 1.材料与方法 1.1 材料
微生物原生质体融合育种技术及其应用
微生物原生质体融合育种技术及其应用 摘要： 工业微生物菌种选育在发酵工业中占有重要地位。微生物原生质体融合(microbialprotoplast fusion)技术具有重组频率高、受结合型或致育型限制小以及遗传物质传递完整等优点,是微生物育种最常用的方法之一。结合相关研究进展,分析了原生质体融合技术的组成,包括制备、再生、融合的影响因素以及融合子的筛选方法,重点评述了原生质体融合技术应用在微生物育种中的最新进展,以及微生物原生质体融合技术的发展前景。 关键词：微生物原生质体融合遗传育种基因组重组 引言： 微生物菌种是发酵工业中的一个关键因素,它决定了发酵过程的成败及某一发酵产品是否具有工业化价值。自然界中的原始菌株大多不具有很高的工业化价值,因此需要对菌株进行选育和改良,以提高产品的质量,降低成本。原生质体融合技术是起源于20世纪60年代的一项重要的菌种改良技术,是将亲株细胞分别去除细胞壁后进行融合,经基因组间的交换重组,获得融合子的过程。与其他育种技术相比,原生质体融合技术具有重组频率高、受结合型或致育型限制小以及遗传物质传递完整且不需要完全了解作用机制等优点,因而被国内外微生物育种学者广泛应用。 1974年,匈牙利的Ferenczy成功将白地霉(Geotrichum candidum)营养缺陷型突变株的原生质体进行融合,使原生质体融合技术首次应用于微生物中。接下来的几十年,该技术的基本实验方法逐步完善,现已作为一项十分有用的技术广泛应用于工业微生物菌种选育中。本文就原生质体融合技术的过程及其应用于微生物育种方面的最新进展做了简要综述,并分析了目前存在的问题及未来的发展方向。 1 资料和方法： 1.1 资料来源 由第一作者在CNKI进行检索。网址：https://www.wendangku.net/doc/6f15244586.html,/。英文资料的检索时间范围为2007/2012；中文资料的检索时间范围为2007/2012。英文检索词为“protoplast fusion、research、progressions”；中文检索词为“原生质体融合、应用、研究进展”。 1.2 入选标准 纳入标准：①原生质体融合技术过程及其影响因素。②原生质体在微生物工程中的应用③原生质体技术应用的工业实例。
真菌原生质体融合技术
大型真菌原生质体融合技术研究进展 1 发展史 由于原生质体技术的形成，去除了细胞壁的障碍，使得种内、种间甚至属间杂交成为可能。原生质体融合起源于60年代，而真菌原生质体融合的第一篇报道是以白地霉(Geotrichum candidum Link)营养缺陷型突变株为材料，采用离心方法进行原生质体融合，其融合率低于10-6。之后，人们又利用一些化学试剂，如NaNO2，Ca(NO3)2，NaCl，KCl等进行融合，效果得到改进。1976年安(Ann)等把用聚乙二醇(PEG)诱导植物原生质体融合的方法引入到真菌原生质体的融 合中来，使融合率达到10-2量级。PEG诱导原生质体融合的成功，推动了真菌原生质体融合的发展。1979年匈牙利的佩斯蒂(Pesti)首先报道了融合育种提高青霉素产量，从而开创了原生质体融合在实际工作中的应用。 日本、英国、加拿大、中国等对双孢蘑菇、香菇、木耳、平菇等食用菌原生质体的分离、再生、融合做了大量卓有成效的工作。在过去的几十年中，人们已从54种食用菌中分离到原生质体；已进行了种内10种、种间19种，属间5种、目间3种的原生质体融合研究。然而PEG等化学方法诱导原生质体融合对细胞损伤大，有残留毒性。1979年森达(Senda)，1980年齐默尔曼(Zimmermann)等人报道了电场诱导细胞融合的新技术，电融合技术操作简单、无化学毒性，对细胞损伤小，融合率高。以后几年里，人们把这种新的融合手段从动、植物扩展到微生物的原生质体融合研究中，导致了原生质体融合技术的新突破。1988年张闻迪等又报道了激光诱导动物细胞融合。1998年又有报道螯合剂对原生质体融合具有促进作用。 2 原生质体融合中亲本的选择标记 原生质体融合前首先必须对亲本进行遗传标记，从而有利于挑选融合子。在融合中，可采用营养缺陷型、抗药性、灭活原生质体、荧光染色、形态差异和自然生态标记等方法。
细菌原生质体融合步骤
细菌原生质体融合实验步骤 一、实验目的 了解原生质体融合技术的原理。 学习并掌握以细菌为材料的原生质体融合技术。 二、实验原理 原核微生物基因重组主要可通过转化、转导、接合等途径，但有些微生物不适于采用这些途径，从而使育种工作受到一定的限制。1978 年第三届国际工业微生物遗传学讨论会上，有人提出微生物细胞原生质体融合这一新的基因重组手段。由于它具有许多特殊优点，所以，目前已为国内外微生物育种工作所广泛研究和应用。 (一)、原生质体融合的优点 (1)、克服种属间杂交的“不育性”，可以进行远缘杂交。由于用酶解除去细胞壁，因此，即使相同接合型的真菌或不同种属间的微生物，皆可发生原生质体融合，产生重组子。 (2)、基因重组频率高，重组类型多。原生质体融合时，由于聚乙二醇(PEG)起促融合的作用，使细胞相互聚集，可以提高基因重组率。原生质体融合后，两个亲株的整套基因组(包括细胞核、细胞质)相互接触，发生多位点的交换，从而产生各种各样的基因组合，获得多种类型的重组子。 (3) 可将由其他育种方法获得的优良性状，经原生质体融合而组合到一个菌株中。 (4) 存在着两个以上亲株同时参与融合，可形成多种性状的融合子。 (二)、原生质体融合步骤 (1)、选择亲本选择两个具有育种价值并带有选择性遗传标记的菌株作为亲本。 (2)、制备原生质体经溶菌酶除去细胞壁，释放出原生质体，并置高渗液中维持其稳定。 (3)、促融合聚乙二醇加入到原生质体以促进融合。聚乙二醇为一种表面活性剂，能强制性的促进原生质体融合。在有Ca2+ 、Mg2+离子存在时，更能促进融合。 (4)、原生质体再生原生质体已失去细胞壁，虽有生物活性，但在普通培养基上不生长，必须涂布在再生培养基上，使之再生。 (5)、检出融合子利用选择培养基上的遗传标记，确定是否为融合子。 (6)、融合子筛选产生的融合子中可能有杂合双倍体和单倍重组体不同的类型，前者性能不稳定，要选出性能稳定的单倍重组体，反复筛选出生产性能良好的融合子。 (三)、原生质体再生率和融合率计算 三、实验材料 (一)、菌种： 枯草芽孢杆菌T4412 ade- his-、枯草芽孢杆菌TT2 ade-pro- (二)、培养基(配制方法见下一页附录)： (1)、完全培养基(CM，液体)； (2)、完全培养基(CM，固体) 液体培养基中加入2.0%琼脂； (3)、基本培养基(MM)； (4)、补充基本培养基(SM) 在基本培养基中加入20 g/mL 的腺嘌呤及2％的纯化琼脂，75 Pa 灭菌20min； (5)、再生补充基本培养基(SMR) 在补充基本培养基中加入0.5 mol/L 蔗糖，1.0％纯化琼脂作上层平板，2.0％纯化琼脂作底层平板、75 Pa 灭菌20 min。 (6)、酪蛋白培养基(测蛋白酶活性用)。 (三)、缓冲液：
原生质体制备方法
原生质体制备方法 培养基： ①PDA：200g土豆、20g葡萄糖、20g琼脂、1L水 ②MYG液体培养基：5g麦芽糖、5g酵母提取物、10g葡萄糖、1L水、 ③MYG液体再生培养基：5g麦芽糖、5g酵母提取物、10g葡萄糖、蔗糖、1L水、 ④MYG软再生培养基：5g麦芽糖、5g酵母提取物、10g葡糖糖、8g琼脂粉、蔗糖、试剂： ①1mol/L MgSO4 ②L MgSO4 ③STC：山梨醇、50mM Tris-Hcl（）、50mM CaCl2 ④肝素 ⑤SPTC：山梨醇、40% PEG、50mM Tris-Hcl（）、50mM CaCl2 ⑥无菌水 操作步骤： ①倒若干PDA平板，将GF-WT接入PDA平板，23℃，活化5-7days ②用无菌黄枪头在GF-WT平板上打孔，用长牙签挑出4个菌饼接入50ml/瓶的MYG 液体培养基中，120rmp，28℃，12h ③以10%的接种量接5瓶以上50ml/瓶的MYG液体培养基中，60rpm，28℃，16h ④混有大量悬浮菌丝的培养基用无菌的带有三层擦镜纸的漏斗过滤下来，用无菌 水和1mol/L MgSO4各冲洗三次，菌丝发白即可，冰上备用 ⑤酶解体系的配制：取Dryslase 45mg+Yartlase105mg至无菌量管中，用10ml 1mol/L MgSO4溶解彻底，用无菌滤头和针筒过滤除菌，滤液保存于冰上 ⑥1g菌丝加入到10ml酶解体系中，于无菌三角瓶中进行酶解反应，30℃，60rpm， 3h ⑦用带有无菌滤布的漏斗过滤酶解液，滤液用无菌50ml大管收集，用20ml L MgSO4 冲洗三角瓶和漏斗，3500rpm，10min，取上清
第7章 原生质体的培养
第7章原生质体的培养和体细胞杂交（3学时） 目的要求： (1)了解原生质体培养的意义 (2)掌握原生质体分离的大致步骤 (3)掌握原生质体培养的方法 (4)掌握原生质体融合的方凑 第一节原生质体的分离与纯化 原生质体培养的意义 (1)再生植株由原生质体再生生成植株，不论在进行有关细胞生物学或生物合成和代谢的实验研究上，还是在组织培养实践中，都有一定的优点：①可利用均一的分化细胞群体； ②因无细胞壁，试剂对细胞作用更为直接，其反应能直接测量，以使反应产物能较快的分离出来；③在理论和实践中，可极大节省空间，如在一个三角瓶就能培养210个细胞，但在大田种植需要4亩地；④可缩短实验周期，如悬浮培养时仅需1～2个小时。 原生质体培养可在遗传学方面进行基因互补，不亲和性，连锁群和基因鉴定，分析基因的激活和失活水平的研究。在研究分化问题时，用一个均一的原生质体群体可以筛选数以千计的不同。营养和激素条件，探索诱导单细胞的分化条件等。 (2)用于远缘体细胞融合，进行体细胞杂交。这是一种新的远缘杂交方法，为人们提供新的育种方法。两个亲缘关系较远的植株用一般杂交方法是不容易成功的，而用细胞融合的方法却成为可能。首先，两个原生质体融合形成异核体，异核体再再生细胞壁，进行有丝分裂，发生核融合，产生杂种细胞，由此可培养新的杂种。 一、原生质体(protoplast)的分离 （一）材料来源 原生质体是通过质壁分离与细胞壁分开的部分，是能存活的植物细胞的最小单位。自从1960年用酶法制备大量植物原生质体首次获得成功以来，原生质体培养成为生物技术最重要的进展之一。通过大量的试验表明，没有细胞壁的原生质体仍然具有"全能性"，可以经过离体培养得到再生植株。原生质体的分离研究较早，1892年Klereker首先用机械的方法分离得到了原生质体，但数量少且易受损伤。1960年，英国植物生理学家Cocking首先用酶解法从番茄幼苗的根分离原生质体获得成功。他使用一种由疣孢漆斑菌培养物制备的高浓度的纤维素酶溶液降解细胞壁。然而，直至1960年纤维素酶和离析酶成为商品酶投入市场以后，植物原生质体研究才成为一个热门的领域。至今从植物体的几乎每一部分都可分离得到
原生质体
原生质体（Protoplast）:指采用机械或酶解法去掉细胞壁的裸露细胞。 一、原生质体的应用 由于没有细胞壁，原生质体为作物遗传改良和植物学研究提供了极为有利的试验材料。原生质体可以用于下面几种研究。 用作细胞杂交服务于作物改良用作遗传转化的对象 研究细胞壁的发生过程筛选突变体 膜的结构、运输、激素接受位点等的研究用于分离细胞器和大分子 种质资源保存 二、原生质体分离、纯化 原生质体分离的最基本原则是保证原生质体不受伤害及不损害它的再生能力。 （一）分离方法 机械法分离 缺点：产量极低；应用的材料受限制；操作极费力 酶法分离 Cocking最早开展这方面研究 克服了机械法分离的缺陷，可分为直接法和顺序法两种。 酶法可在短时间内获得大量原生质体，缺点是：不纯的酶制剂所含杂质对原生质体可能有不同程度的毒害作用。 （二）影响原生质体分离的因素（酶法） 从理论上讲，只要用适当的酶处理，就能从任何活组织中分离得到原生质体。但是对于原生质体培养来说，要得到活性高、能进行分裂、形成愈伤组织、最后再生完整植株的原生质体则受许多因素的影响。原生质体分离时主要应考虑取材、酶的种类、纯度、酶液的渗透压、酶解时间、温度等。 1. 外植体来源: 生长旺盛、生命力强的组织和细胞是获得高活力原生质体的关键，并影响着原生质体的复壁、分裂、愈伤组织形成乃至植株再生。用于原生质体分离的植物外植体有叶片、叶柄、茎尖、根、子叶、茎段、胚、愈伤组织、悬浮培养物（Suspension cultures）、原球茎、花瓣和叶表皮等。叶肉细胞是常用的材料,因为叶片很易获得而且能充分供应。取材时，一般用刚展开的幼嫩叶片。另一个分离原生质体的常用材料是愈伤组织或悬浮细胞，采用其作材料可以避免植株生长环境的不良影响，可以常年供应，易于控制新生细胞的年龄，处理时操作方便，无需消毒. 选用悬浮细胞作材料时，需每隔3-5天继代一次，培养一段时间使细胞处于旺盛生长状态。一般在继代后的第三天游离原生质体。 2. 酶液组成和浓度： 纤维素,占壁干重的25-50% 植物细胞壁由三个主要成分构成 半纤维素, 平均53% 果胶质, 5%
实验一植物原生质体的分离和培养一教学目标 了解植物原生质
实验一植物原生质体的分离和培养一教学目标了解 植物原生质 The following text is amended on 12 November 2020.
实验一植物原生质体的分离和培养 一．教学目标：了解植物原生质体作为细胞工程研究的重要意义，了解原生质体活性鉴定的原理。掌握分离和培养原生质体的技术、方法和原理。掌握细胞活性的检测方法。掌握细胞计数的原理和方法。二．重点：掌握分离和培养原生质体的技术、方法和原理。掌握细胞活性的检测方法。掌握细胞计数的原理和方法。 三．难点：分离和培养原生质体的技术。 四．授课方式与教学方法：讲解原理、实验操作示范或具体指导。 五．教学内容: 实验原理 植物原生质体(protoplast)是除去细胞壁后为原生质所包围的“裸露细胞”,是开展基础研究的理想材料。其中,酶解法分离原生质体是一个常用的技术,其原理是植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成,因而使用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分,除去细胞壁,即可得到原生质体。由于原生质体内部与外界环境之间仅隔一层薄薄的细胞膜,必须保持在渗透压平衡的溶液中才能保持其完整性, 使原生质体分离后不致膨胀破裂，渗透剂常用甘露醇或蔗糖，酶液还应含一定Ca2+来稳定原生质膜。其次,还应当考虑取材、酶的种类和纯度、酶液的渗透压、酶解时间及温度等因素对分离原生质体的影响。将原生质体接种在培养基上进行培养，细胞壁再生，细胞分裂和再生植株。 测定原生质体的活性有多种方法。荧光素双醋酸酯(FDA)染色是常用的一种方法,FAD 本身无荧光,无极性,可透过完整的原生质膜。一旦进入原生质体后,由于受到酯酶分解而产生具有荧光的极性物质荧光素。它不能自由出入原生质膜,因此有活力的细胞能产生荧光,无活力的原生质体不能分解FAD无荧光产生。 细胞计数一般用血细胞计数极，按白细胞计数法进行计数。 从理论上讲，植物体的任何一部分都可以通过酶解作用去除细胞壁而得到原生质体。但在实际操作中，只有幼嫩的组织才能完成去壁的过程。所以，为了制备健康的原生质体，一般选用根尖、茎尖、嫩叶及对数生长期的愈伤组织为材料，一旦细胞具有木质化或次生加厚的外壁，则不能被酶降解。因此，取材成为实验成功与否的首要问题。花期短的花瓣，由于其组织鲜嫩，又具有色素标记，是该实验中较好的材料。 实验方法 1．把叶片(或花期短的花瓣)洗净，把表面水吸干。（2人一组）
植物原生质体提取培养1
实验原理： 植物原生质体是除去细胞壁后为原生质所包围的“裸露细胞”，是开展基础研究的理想材料。其中酶解法分离原生质体是一个常用的技术，其原理是植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成，因而使用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分，除去细胞壁。 许多化学、物理学和生物学方法可诱导原主质体融合，现在被广泛采用并证明行之有效的融合方法是聚乙二醇(PEG)法。高Ca高pH法和电融合法： PEG作为一种高分子化合物，20～50％的浓度能对原生质体产生瞬间冲击效应，原生质体很快发生收缩与粘连，随后用高Ca高pH法进行清洗．使原生质体融合得以完成。 PEG诱导融合的机理：PEG由于含有醚键而具负极性，与水、蛋白质和碳水化合物等一些正极化基团能形成氢键，当PEG分子足够长时，可阼为邻近原生质表面之间的分子桥而使之粘连。PEG也能连接Ca2+等阳离子，Ca2+可在一些负极化基团和PEG之间形成桥，因而促进粘连。在洗涤过程中，连接在原生质体膜上的PEG分子可被洗脱．这样将引起电荷的紊乱和再分布．从而引起原生质体融合：高Ca高pH由于增加了质膜的流动性，因而也大大提高了融合频率，洗涤时的渗透压冲击对融合也可能起作用。原生质体分离纯化或融合后，在适当的培养基上应用合适的培养方法，能够再生细胞壁，并启动细胞持续分裂，直至形成细胞团，长成愈伤组织或胚状体，再分化发育成苗。其中，选择合适的培养基及培养方法是原生质体培养中最基础也是最关键的环节。 [实验内容] 1．原生质体分离2．原生质体融合3．原生质体及融合体的培养 材料用品： 三角瓶、离心管、烧杯、200目滤网、解剖刀、长、短镊子、培养皿、滤纸、0.2μm滤膜、滤器、培养瓶（注：以上用品要进行高压灭菌）、台式离心机、高压灭菌锅、倒置显微镜、超静工作台 温度25±2℃，光照度1000Lx,光照14～16h/d 的条件下培养。培养时间约1周。 实验步骤： 1．溶液及培养基的配制 (1)酶液(2)PEG融合液(3)13％CPW洗液 1％纤维素酶 1％果胶酶 0.7mol/L甘露醇 0.7mmol/LKH2PO4 10mmol/LCaCl2·2H2O pH6.8—7.040% PEG (MW 1500-6000) 0.3 mol/L葡萄糖 3.5mmol/L CaCl2·2H2O 0.7mm0l/L KH2PO4 27．2 mg／L KH2PO4 101.0 mg／L KNO3 1480．0 mg／L CaCl2·2H2O 246．0 mg／L MgSO4 0．16 mg／L KI 0．025 mg／L CuSO4 13％ W／V甘露醇 pH 6.0 (4)20％蔗糖溶液