乳酸菌菌株鉴定

分子生物学实验作业

——用分子生物学方法鉴定菌株

专业：生物化工

姓名：王晓娜

学号：1043111039

鉴定一株乳酸菌菌株

一、实验目的和方法

采用RAPD指纹图谱方法鉴定一株乳酸菌菌株

二、实验材料

2.1 菌株

实验给定的菌株

2.2 试剂

Taq DNA聚合酶、DNA电泳buffer、引物、dNTP、模板DNA

2.3 仪器

台式离心机，PCR仪，稳压稳流电泳仪，紫外检测仪，凝胶成像系统

三、实验步骤

3.1 制备细菌DNA样品

收集菌悬液于1.5mlepp管中，5 000r/min离心5min。去上清，在沉淀中加入567微升 TE缓冲液、30微升10％的SDS、5微升10mg/ml 的溶菌酶后，37℃水浴3h。再加入3微升20mg/ml的蛋白酶K，37℃水浴lh。加入100微升5mol/l NaCl，80微升CTAB/NaCl溶液，65℃水浴10min。加入等体积的氯仿／异戊醇，12 000r/min离心5min。取上清，加入等体积酚／氯仿／异戊醇，12 000r／min离心5min。取上清，加入2倍体积的冰乙醇，12 000r/min离心10rnin，沉降DNA。去上清，将沉淀吹干，用100微升TE缓冲液(pH8．0)溶解。取l微升 DNA样品，稀释200倍后，紫外测定0D260和0D280。选取浓度1．8≤0D26l／0D280≤2．0的样品。然后，将DNA浓度稀释至48ng/μl作为模板备用。

3.2 PCR反应

扩增体积为25μl (含TapDNA聚合酶2u，10×PCR reaction buffer 2μl，dNTP 2μl，引物lμl，模板DNA 1μl)。扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性1min，38℃复性lmin，72℃延伸2min，进行40个循环后72℃延伸10min。取12μl扩增产物进行电泳，电压为100V，琼脂糖凝胶为l％(0．5×TBE)电泳30—40min，用凝胶成像系统观察

电泳结果并拍照。

四、结果分析

通过与DNA Marker比较进行菌株鉴定。

腐乳中乳酸菌的分离与鉴定_王夫杰

腐乳中乳酸菌的分离与鉴定 王夫杰1,鲁绯1*,渠岩2,张建1,黄持都1 (1.北京市食品酿造研究所,北京 100050;2.中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京 100083) 摘要:文章主要对青方、白方和红方腐乳中的乳酸菌进行了分离鉴定。从青方和白方腐乳中分别分离到乳酸菌7株和5株,红方中没有分离到乳酸菌。鉴定结果表明,白方中4株为鼠李糖乳杆菌,1株清酒乳杆菌;青方中有1株为植物乳杆菌,1株干酪乳杆菌,3株鼠李糖乳杆菌,2株清酒乳杆菌。最后,对不同菌株的耐盐性和耐酒精性进行了测试。 关键词:腐乳;乳酸菌;分离;鉴定 中图分类号:T S264.25 文献标识码:B 文章编号:1000-9973(2010)07-0098-04 Separation an d identification of lactic acid bacteria isolated from Su fu WANG Fu jie1,LU Fei1*,QU Yan2,ZH ANG Jian1,H UANG Chi du1 (1.Beijing Foo d Brew ing Institute,Beijing100050,China; 2.Fo od Science and Nutr itional Engineering Co lleg e of China A gricultural U niv ersity,Beijing100083,China) Abstract:The lactic acid bacteria in gr ey Sufu、w hite Sufu and red Sufu w er e separated and identify. Seven str ains w ere isolated from gr ey Sufu,five strains w ere iso lated fr om w hite Sufu,no o ne w as i solated fr om red Sufu.The identification show ed that four str ains w ere Lactobacillus rhamnose and one w as Lactobacillus sake in white Sufu.In grey Sufu,three str ains w ere Lacto bacillus rham nose, tw o strains were Lactobacillus sake,the tw o other w ere Lactobacillus plantar um and Lactobacillus ca sei respectiv ely.At last,the salt and alco ho l tolerance of different strains w er e tested. Key words:Sufu;lactic acid bacteria;separ ation;identificatio n 乳酸菌的应用历史非常悠久,4000年前古人已有酸奶饮用的历史。随着现代微生物学的发展,食品级乳酸菌的优良特性已引起食品微生物界的关注,乳酸菌已广泛应用于乳制品、肉制品、果蔬制品、软饮料等食品。乳酸菌在酿造工业中的应用受到越来越多的关注。 腐乳是中国独创的调味品,在世界发酵食品中独树一帜,它既可单独食用,也可用来烹调风味独特的菜肴,被称为 中国奶酪 。商品腐乳中含有高水平的适度耐盐菌,其主导耐盐微生物是耐盐乳酸菌,它在腐乳的腌制和后酵过程中起着非常重要的作用,一定数量的乳酸菌在后酵过程中对腐乳风味物质的形成具有积极意义[1-5]。 乳酸菌是潜在地加快腐乳成熟和改进风味的协同菌株。研究表明,从特定食品中分离出的乳酸菌是该食品进行乳酸发酵的最佳出发菌株,因为它们比其它来源的乳酸菌具有更强的竞争力[6-8]。本文对青方、白方和红方腐乳中的乳酸菌进行了分离纯化和鉴定,旨在揭示腐乳中乳酸菌的群系分布特征,对腐乳发酵中风味乳酸菌的研究和开发提供依据,对乳酸菌应用于腐乳生产、改善腐乳风味的研究提供基础。 1 材料与方法 1.1 样品 收稿日期:2010-03-27 *通讯作者 基金项目:北京市优秀人才培养资助(20081D010*******);北京市自然科学基金(6093022)作者简介:王夫杰(1980-),女,硕士,研究方向为生物技术与发酵工程; 鲁绯,女,副教授,食品科学与工程博士。 98

乳酸菌菌种分离筛选方法

乳酸菌菌种的分离筛选方法 乳酸细菌是一类能利用发酵糖产生大量乳酸的细菌通称。为兼性厌氧菌，杆状或球状，革兰氏阳性菌，无芽孢，不运动。营养要求高，需要提供丰富的肽类氨基酸维生素。在琼脂表面或内层形成较小的白色或淡黄色的菌落。 通常用作为有益微生物的菌种有乳酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、乳酸片球菌、双歧杆菌、屎肠球菌、戊糖片球菌等。 乳杆菌常用MRS琼脂作半选择培养基。当乳杆菌仅是复杂区系中的部分菌类 时，SL培养基常用作为选择性培养基。对于芽孢乳杆菌常用GYP培养基，链球菌有TYC培养基、MS培养基。M17培养基被用作乳球菌的分离培养基。 嗜酸乳杆菌属于乳杆菌属的一个种。其特性为：杆菌，两端圆，不运动，无 鞭毛。粪肠球菌为革兰氏阳性，圆形或椭圆形。 乳酸片球菌细胞呈球状，直径0.6~1.0μm，在直角两个平面交替形成四联状， 一般细胞成对生，单生者罕见，不成链状排列。革兰氏阳性，不运动，兼性厌氧。在MRS培养基上菌落小，呈白色。沿洋菜穿刺线的生长物呈丝状。 乳酸菌在一般琼脂培养基上形成微小菌落，不易观察，所以分离时先富集培养并选择合适的培养基。分离培养基一般添加西红柿、酵母膏、吐温-80等物质，也常常加入醋酸盐，因醋酸盐能抑制部分细菌生长，对乳酸菌无害。 培养基中添加碳酸钙，乳酸溶解培养基中的碳酸钙形成透明圈，作为分离鉴别的依据，通过对生成的乳酸量进行性能鉴定。 乳酸菌生长繁殖时需要多种氨基酸，维生素及微氧，一般菌落比较小。分离培养基一般可添加西红柿酵母膏油酸吐温等物质，均具有促进生长作用。也常常 添加醋酸盐抑制有些细菌的生长，对乳酸菌无害。 一.筛选方法： 1.溶钙圈法： 利用一些产酸类细菌在含CaCO3的培养基上产生CaCO3溶解圈，从而筛选出这些产酸类细菌，可用于乳酸菌的筛选。 其中培养基中加入CaCO3的作用是：①鉴别能产生酸的细菌；②中和产生的酸， 以维持培养基的PH。 筛选过程：样品预处理→梯度稀释至10-6→选择合适的稀释度涂布→37℃培养

乳杆菌属(Lactobacillus)内13个新种的分类

乳杆菌属（Lactobacillus）内13个新种的分类东北酸菜是我国传统的发酵制品,主要分布在我国东北地区,酿造和食用历史悠久,以自酿酸菜为采集菌种的来源。西藏地区的自然发酵酸奶已经有几千年的历史,具有独特的营养价值,它们中都蕴藏着丰富的乳酸菌资源。 本研究的目的是通过多相分类手段对从东北酸菜中分离得到的12个潜在乳酸菌新种和从西藏酸奶中分离得到的1个潜在乳酸菌新种进行鉴定,确定它们的分类学地位。采用多相方法进行鉴定,包括16S rRNA基因序列分析,phe S基因序列分析,rpo A基因序列分析,DNA G+C mol%测定,平均核苷酸一致性分析(ANI),脂肪酸甲酯(FAME)分析和表型特征分析。 菌株54-2~T与Lactobacillus composti、Lactobacillus floricola、Lactobacillus selangorensis、Lactobacillus perolens、Lactobacillus harbinensis和Lactobacillus shenzhenensis处于一个系统发育分支,16S rRNA 基因序列相似性在90.4-96.5%之间;phe S基因序列相似性在56.7-74.6%之间;rpo A基因序列相似性在57.2-81.6%之间;ANI计算结果分别在66.26-72.50%之间。菌株54-5~T、143-6~T、247-4~T、17-4~T和143-1~T与Lactobacillus dextrinicus和Lactobacillus concavus处于一个系统发育分支,16S rRNA基因序列相似性为94.9-99.9%;phe S基因序列相似性在70.1-83.1%之间;rpo A基因序列相似性在81.0-98.3%之间;ANI计算结果在70.34-81.73%之间。 菌株33-7~T、116-2~T、184-8~T、204-8~T、8-1(1)~T,256-3~T和M1575~T 与Lactobacillus tucceti、Lactobacillus nodensis、Lactobacillus insicii、Lactobacillus allii、Lactobacillus metriopterae、Lactobacillus terrae、Lactobacillus versmoldensis和Lactobacillus furfuricola处于一个系统发

乳酸菌的分离与初步鉴定

学院：漓江学院年级专业：09生物技术 组员：吴汉川200913007005 杨隆荷200913007006 李翠200913007007 王志远200913007008 乳酸菌的分离及初步鉴定 一、实验目的 1了解和掌握放线菌的菌种特性和分离方法 2初步掌握军中筛选方法设计 3掌握平菌种的选育 二、实验原理 乳酸菌是指以糖为原料，属于真细菌纲真细菌目中的乳酸细菌科。乳酸细菌科根据细胞呈球状或呈杆状，又分成乳酸杆菌族和链球菌族。 在BCG 牛乳培养基琼脂平板上，乳酸菌菌落大约1-3 mm，圆形隆起，表面光 的溶滑或稍粗糙，呈乳白色、灰白色或暗黄色；在产酸菌落周围还能产生CaCO 3 解圈。乳酸菌革兰氏染色呈阳性，涂片镜检细胞杆状或链球状。 乳酸杆菌呈杆状，成单杆、双杆或长丝状；乳酸杆菌，呈球状，成对或短链或长链状。乳酸菌革兰氏染色后呈蓝紫色。 平板涂布法平板涂布法是将样品经稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释液接种到平板上，经过培养，由每个单个细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个但菌落代表原样品中的一个单细胞。 生理盐水：称取9g氯化钠，溶解在少量蒸馏水中，稀释到1000毫升。 四、实验器材与试剂 含乳酸菌的酸奶、结晶紫、卢哥氏碘液、95%乙醇、蕃红溶液、灭菌CaCO3粉末、NaCl； BCG牛乳培养基：(A)溶液：脱脂乳粉100g，水500mL，加入1.6%溴甲酚绿(B.C.G)乙醇溶液1mL，80℃灭菌20min。(B)溶液：酵母膏10g，水500mL，琼脂20g, pH6.8, 121℃湿热灭菌20min。以无菌操作趁热将(A)、(B)溶液混合均匀后倒平板。 1000ml烧瓶一个, 无菌培养皿9个, 500ml容量三角瓶2个，25ml无菌移液管1只，20ml无菌试管7只，1ml无菌移液管6只，培养基分装器一个，玻棒2根, 无菌涂布器3只，酒精灯一盏，接种环一个，天平，牛角匙，漏斗，漏斗架，载玻片，盖玻片，pH试纸若干，液体石蜡，棉塞，吸管，牛皮纸，线绳、标签等。 五、实验步骤 1.菌悬液的配制 取1洁净三角瓶，盛以225ml生理盐水；7只洁净试管，各盛9ml的生理盐水；加塞包扎于在103kPa 121℃高压蒸汽灭菌20Min，得到无菌生理盐水。

营养缺陷型菌株的筛选和鉴定

营养缺陷型菌株的筛选和鉴定 mutugenesis and isolation of auxotroph 细菌革兰氏染色法 gram stain 酵母菌的形态结构观察 yeast morphology 培养基的配制和灭菌 types of mddia and sterlization 菌种保藏 preservation of cultures 细胞计数法 conting of cell 凝集反应 agglutination reactions 相差显微镜 phase contrast microscope 细胞融合 cell fusion 质粒DNA的提取 isolation of plasmid DNA 植物DNA的提取 isolation of plant DNA 多肽的末端分析 analysis of terminal of polypeptide PCR扩增DNA PCR amplify DNA fragment SDS-聚丙烯凝胶电泳 SDS-polyacrylamide gel electrophoresis 蛋白质的性质 properties of protein 植物组织培养 plant tissue culture BL-410生物机能实验系统简介 the introduction of BL-410 biofunctional experiment system 青蛙坐骨神经-腓肠肌标本的制备 preparation methods for nerve-muscle specimen of frog 人ABO血型的鉴定 Identification of humankind ABO blood group

乳酸菌及其乳酸菌发酵食品

乳酸菌及其乳酸菌发酵食品 发酵是一种古老、传统的食品储存与加工的方法，凡利用微生物的作用而制得的食品都可以称为发酵食品。发酵食品是人类巧妙地利用有益微生物加工制造的一类食品，具有独特的风味和营养价值，丰富了我们的饮食生活。发酵食品因在食品加工过程中有微生物参与作用，进而可以形成一些特异性风味物质和营养因子，如乳酸菌参与牛乳发酵，产生乙醛、丁二酮、丙酮、3-羟基丁酮、挥发性酸等芳香物质，以及胞外多糖、乳酸菌素、γ-氨基丁酸等营养因子。 乳酸菌是发酵食品最主要的有益微生物之一，人类对于乳酸菌的应用历史非常久远，在远古人类就在酿造食品方面不自觉地利用了乳酸菌。但是，人类能主动地去研究和掌握乳酸菌的生活规律，并加以应用，还是近百年的事。 1 乳酸菌 1.1 乳酸菌的分类 乳酸菌是一类以糖为原料产乳酸为主的细菌的总称，乳酸菌不是分类学上的名词，属于真细菌纲(Eubacteriac)真细菌目(Eabacteriales)中的乳酸细菌科(lactobacillaceae)。在伯杰氏系统细菌分类学上，目前已发现的乳酸菌，至少分布于乳杆菌属(Lactobacillus)、链球菌属(Strptococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)，乳球菌属(Lactococcus)等19个属的微生物中。其中，在食品、医药等领域应用较多的乳酸菌主要分布在乳杆菌属、双歧杆菌属、链球菌属、肠球菌属、乳球菌属、片球菌属和明串珠菌属等七个属种。 1.2 乳酸菌的基本特性 乳酸菌是革兰氏阳性，不形成芽孢(个别属除外)，不运动或少运动，不耐高温，但耐酸的球菌或杆菌，乳酸菌是一种兼性厌氧菌，适合于在氧含量低或无氧的环境中生长。与其它细菌相比，乳酸菌对营养的要求比较严格，除了要供给适量的水分、充足的碳源、氮源和无机盐类外，还需要加入维生素、氨基酸等生长因子。乳酸菌都能发酵一定的糖类产生乳酸，但分解蛋白质和脂肪能力微弱，过氧化氢酶反应呈阴性，适宜在偏酸的环境中生长，可使培养基pH 值降到5.0以下，产酸及耐酸能力都较强。 1.3 乳酸菌的发酵类型 乳酸菌的发酵根据产物的不同，分为三种类型：同型乳酸发酵、异型乳酸发酵和双歧发酵。同型乳酸发酵是指发酵终产物中90%以上为乳酸的乳酸发酵过程，以乳酸链球菌和多数乳酸杆菌为主。异型乳酸发酵是指发酵终产物中除乳酸外,还有乙醇、二氧化碳等成分的乳酸发酵过程，以明串珠菌属的乳酸菌以及某些乳酸杆菌,如肠膜明串珠菌、短乳杆菌、甘露醇乳杆菌等。双歧发酵是双歧杆菌的产能模式，双歧杆菌是一类特殊的严格厌氧菌,对营养要求较高,它们对葡萄糖的代谢也可归入异型乳酸发酵,但与其他乳酸菌的异型发酵不同。 1.4 乳酸菌的代谢产物 乳酸菌发酵的代谢产物主要有有机酸类、细菌素类、乙醛等芳香物质、胞外多糖、γ-氨基丁酸等。有机酸类主要有乳酸、乙酸，及少量的甲酸、丙酸等，具有抗菌防腐的作用，并带给食品酸性的口感；细菌素又称乳酸菌素，具有固定抗菌谱，对病原菌和腐败菌具有很强的抑制能力；乙醛等芳香物质给乳酸菌发酵食品带来独特的发酵风味；胞外多糖作为生命物质的重要组成部分，广泛参与细胞的各种生命现象及生理过程的调节；γ-氨基丁酸是神经系统中重要的抑制性神经递质，具有改善脑机能，调节情绪抗焦虑，降低血压等方面具有重要作用。

乳酸菌的提取和鉴定

酸奶中乳酸菌的筛选试验 一、实验目的：熟悉从酸奶中分离和纯化乳酸菌的一般方法 二、实验原理： 市场销售的酸奶主要含乳酸菌，乳酸菌的主要作用是把牛奶中乳糖发酵成乳酸，此外酸奶中还含有其他球菌，利用它产酸等性质可以分离乳酸菌，分离培养基一般添加蛋白胨、酵母膏提供氮源、维生素、生长因子；葡萄糖为可发酵糖类；磷酸氢二钾为酸碱缓冲剂；柠檬酸铵、硫酸镁、硫酸锰、亚硫酸铁、吐温-80和乙酸钠为培养各种乳酸菌提供生长因子，其成分还能抑制某些杂菌；琼脂是培养基的凝固剂。、也常常加入醋酸盐，因醋酸盐能抑制部分细菌生长，对乳酸菌无害。培养基中添加碳酸钙，乳酸溶解培养基中的碳酸钙形成透明圈，作为分离鉴别的依据。 .筛选方法：.溶钙圈法：利用一些产酸类细菌在含CaCO3 的培养基上产生CaCO3 溶解圈，从而筛选出这些产酸类细菌，可用于乳酸菌的筛选。其中培养基中加入CaCO3 的作用是：①鉴别能产生酸的细菌；②中和产生的酸，以维持培养基的PH、更利于乳酸菌的生长和分离 三、实验药品及仪器 牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、葡萄糖、乳糖、吐温-80、柠檬酸二铵、CaCO3 、K2HPO4 NaAc·3H2O、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O、琼脂、结晶紫染色液、碘液、95%乙醇、石蜡、蒸馏水。 仪器：超净工作台、电子显微镜、接种环、恒温培养箱、接

种环、培养皿、涂布环、高压锅、试管、微波炉、电子天平、离心机 四培养基类型 ①改良MRS 培养基（乳酸菌分离培养基）：牛肉膏10g，蛋白胨10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，吐温-80 1.0ml（它是一种很好的乳化剂和分散剂也就是说它的作用就是是培养基的营养成分更加的均匀就是对营养成分的再一次优化），K 2HPO4 2g，NaAc·3H2O 5g，柠檬酸二铵2g，MgSO4·7H2O 0.58g，MnSO4·H2O 0.25g，补蒸馏水至1000ml（固体培养基中加琼脂 1.5%-2%），调pH 至6.4±0.2，121℃高压灭菌15min ②改良MC 培养基（乳酸菌选择培养基）：牛肉膏5g，蛋白胨5g，酵母膏5g，葡萄糖20g，乳糖20g，CaCO3 10g，琼脂20g，中性红0.05g（指示剂），最终pH6.5±0.2，补蒸馏水至1000ml，121℃高压灭菌15min。 配制方法：1把除CaCO3以外的成分称量溶解后.调PH至6.2～6.4； 2.称取20g CaCO3加入到100mL蒸馏水中，制成CaCO3乳浊液； 3.将培养基和CaCO3乳浊液分开灭菌； 4.倒平板前，待培养基融化冷却后，平板上加入一定量的CaCO3乳浊液，晾干了以后再接种。 五、实验流程 1、吸取酸奶1ml 2、10 倍梯度稀释平板涂布（改良MC Medium） 3、厌氧培养（28℃培养48h）待形成菌落 4、挑取溶钙圈较大的单菌落→ 观察、记录菌落形态与特征 5、Improved MC Medium 划线分离纯化 6、选取溶钙圈较大的单菌落进行G+染色 7、革兰氏阳性菌（G+菌）→ 记录菌株细胞形态

乳酸菌得分离、纯化与鉴定

乳酸菌得分离、纯化与鉴定 第一部分:乳酸菌得分离、纯化 一、实验器材: 1、实验药品新鲜乳酸饮料(市售)、脱脂奶粉、蔗糖、1、6%溴甲酚绿乙醇溶液(溴甲酚绿、无水乙醇)、酵母膏、琼脂、革兰氏染液(结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、沙黄)、75%乙醇、香柏油、1mol/L NaOH、1mol/L HCl、碳酸钙; 0、4gNaOH固体、4、2ml浓HCL(分析纯) 、20gCaCO3固体、酵母膏20g 、琼脂30g 香柏油、脱脂奶粉100g 、蔗糖10g; 2、仪器与设备高压蒸汽灭菌锅、光学显微镜、培养箱、pH试纸、酸乳瓶、培养皿(φ9或φ12)、试管、300ml三角瓶(带玻珠)、移液管、天平、500ml锥形瓶、250ml锥形瓶、250ml烧杯。 二、实验步骤: 1、培养基配制(BCG牛乳培养基): (A)溶液:取脱脂乳粉100g,水500ml,加入1、6%溴甲酚氯乙醇溶液1ml,混合均匀后分装入三角瓶于高压蒸汽灭菌锅80℃灭菌20 min;(1、6%溴甲苯酚绿(BCG)乙醇溶液用1、6g溴甲酚绿加入20ml无水乙醇中,再加水至100ml制成) (B)溶液:酵母膏10g,水500ml,CaCO3 10g,琼脂20g,加热溶解,用精密pH试纸调节pH到6、8,分装入三角瓶后在103kPa 121℃高压蒸汽灭菌20Min。 以无菌操作趁热将(A)(B)溶液均匀混合。 2、药品配制 2、1 结晶紫:结晶紫乙醇饱与液(结晶紫2g溶于20ml 95%乙醇中)20ml,1%草酸氨水溶液80ml。将两液混匀,放置24小时后过滤即可。 2、2 卢哥氏碘液:碘1g,碘化钾2g,蒸馏水300ml。先将碘化钾溶于少量蒸馏水中,然后加入碘使之完全溶解,再加入蒸馏水300ml即成。 2、3 蕃红溶液:番红2、5g,95%乙醇100ml,溶解后存于密闭得棕色瓶中。用时取20ml与80ml蒸馏水混匀即可。 2、4 0、1%得吕氏美蓝染液:A液:美蓝0、3g,95%乙醇300ml;B液:0、01% KOH 100ml。混合A与B液即成,按1:100稀释即可。 2、4 生理盐水:称取9g氯化钠,溶解在少量蒸馏水中,稀释到1000毫升。 3、菌悬液得配制

乳酸菌菌种的分离筛选方法

乳酸菌菌种的分离筛选方法乳酸细菌是一类能利用发酵糖产生大量乳酸的细菌通称。为兼性厌氧菌，杆状或球状，革兰氏阳性菌，无芽孢，不运动。营养要求高，需要提供丰富的肽类氨基酸维生素。在琼脂表面或内层形成较小的白色或淡黄色的菌落。 通常用作为有益微生物的菌种有乳酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、乳酸片球菌、双歧杆菌、屎肠球菌、戊糖片球菌等。 乳杆菌常用MRS琼脂作半选择培养基。当乳杆菌仅是复杂区系中的部分菌类 时，SL培养基常用作为选择性培养基。对于芽孢乳杆菌常用GYP培养基，链球菌有TYC培养基、MS培养基。M17培养基被用作乳球菌的分离培养基。 嗜酸乳杆菌属于乳杆菌属的一个种。其特性为：杆菌，两端圆，不运动，无 鞭毛。粪肠球菌为革兰氏阳性，圆形或椭圆形。 乳酸片球菌细胞呈球状，直径0.6~1.0μm，在直角两个平面交替形成四联状，一般细胞成对生，单生者罕见，不成链状排列。革兰氏阳性，不运动，兼性厌氧。在MRS培养基上菌落小，呈白色。沿洋菜穿刺线的生长物呈丝状。 乳酸菌在一般琼脂培养基上形成微小菌落，不易观察，所以分离时先富集培养并选择合适的培养基。分离培养基一般添加西红柿、酵母膏、吐温-80等物质，也常常加入醋酸盐，因醋酸盐能抑制部分细菌生长，对乳酸菌无害。 培养基中添加碳酸钙，乳酸溶解培养基中的碳酸钙形成透明圈，作为分离鉴别的依据，通过对生成的乳酸量进行性能鉴定。 乳酸菌生长繁殖时需要多种氨基酸，维生素及微氧，一般菌落比较小。分离培养基一般可添加西红柿酵母膏油酸吐温等物质，均具有促进生长作用。也常常添加醋酸盐抑制有些细菌的生长，对乳酸菌无害。 一.筛选方法： 1.溶钙圈法： 利用一些产酸类细菌在含CaCO3的培养基上产生CaCO3溶解圈，从而筛选出这些产酸类细菌，可用于乳酸菌的筛选。 其中培养基中加入CaCO3的作用是：①鉴别能产生酸的细菌；②中和产生的酸，以维持培养基的PH。 筛选过程：样品预处理→梯度稀释至10-6→选择合适的稀释度涂布→37℃培养

乳酸菌的分类

乳酸菌的分類 1.乳酸菌的分類: (1)是一類可發酵利用碳水化合物而產生大量乳酸的細菌。 (2)大多數細菌都能產生或多或少的乳酸 →不能認為凡是產乳酸的細菌都是乳酸菌。 2.乳酸菌的分類体系→(1)生化狀態分類法(2)化學分類法。 3.按照Bersy細菌學手冊中的生化分類法: 乳桿菌屬(Lactobacillus) 鏈球菌屬(Streptococeus) 乳酸菌有5個屬明串珠菌屬(Leuconostoc) 雙歧桿菌屬(Bifidobacterium) 片球菌屬(Pediococcus) 每個屬中又有很多菌種，一些菌種還包括數個亞種。 4.乳桿菌屬: (1)一般呈細長的桿狀，大小為0.5～1 μm x 2～10 μm，常呈 鏈狀排列。G(+)，無芽孢菌，微需氧。 (2)目前已實際應用的，主要有： 德氏乳桿菌(L. delbrueckii)、保加利亞乳桿茵(L. bulgaricus)瑞士乳桿菌(L. helviticus)、嗜酸乳桿菌(L. acido phlus)和乾 酪乳桿菌(L. casei)及其亞种等；短乳桿茵(L. brevis)和發酵 乳桿菌(L. fementi)。 5.鏈球菌屬乳酸菌: (1)一般呈短鏈或長鏈狀排列，為無芽孢G(+)，兼性厭氧。

(2)有些屬於人或動物的病原菌: 如能引起牛乳房炎的無乳鏈球菌(S. agalactiae)和人咽喉炎的溶血鏈球菌(S.haemolytlcus)。 (3)有些能引起食物變質而常用于特種乾酪(羅馬諾乾酪)製造上 ，如糞鏈球菌(S. faecalis)和液化鏈球菌(S. liquefaciens)。 (4)有些則是發酵乳製品生產上常用的菌種，如乳酸鏈球菌(S. lactis)、丁二酮乳酸鏈球菌(S. diacetilactis)、乳酪鏈球菌 (S.creamoris)和嗜熱乳鏈球菌(S. thermophilus)等。 6.明串珠菌屬: (1)呈圓形或卵圓形，菌体排列成鏈狀。經常存在于水果、蔬菜 中，能在高濃度的含糖食品中生長。 (2)該屬乳酸菌可發酵利用葡萄糖產生CO2、乙酸和乳酸。依据 此特性可將明串珠菌從鏈球菌中區別開(鏈球菌不產生CO2，而且生成L-乳酸)。 (3)常見的菌种有腸膜明串珠菌(Leuc. Mesenteroides)及其乳脂亞 种(Leuc. Cremoris)和葡聚糖亞種(Leuc. Dextranicun)、蝕橙明串珠菌(Lcuc. Citrovorum)、乳酸明串珠茵(Leuc. Lactis)和酒明串珠菌(Leuc. Oenos)等。它們均可用在發酵乳製品生產上。 (4)腸膜明串珠菌乳脂亞种（又稱乳脂明串珠菌）最為常見，它 能發酵檸檬酸產生特殊風味物質，故又稱風味菌、香氣菌或產香菌。 7.雙歧桿菌: (1)因菌体尖端呈分支枝狀（如Y或V字形）而得名，是無芽孢

PCR技术在乳酸菌分类鉴定中的应用

PCR技术在乳酸菌分类鉴定中的应用 王庭柱，高学军，杨振宇 东北农业大学教育部乳品科学重点实验室（150030） E-mail：wangtingzhu1980@https://www.wendangku.net/doc/6f9176580.html, 摘要：近年来，随着分子生物学和生物信息学的迅速发展，特别是作为生物技术里程碑的PCR技术以及核酸测序和电泳技术的不断改进与完善，产生了许多新的分类学方法，如RAPD、PCR-RFLP、T-RFLP、ARDRA、PCR-SSCP、PCR-DGGE、PCR-TGGE、AFLP、REP-PCR、S-PCR、LCR、LH-PCR、SBCS以及小卫星序列多态性和序列同源性分析等。本文即论述了这些技术在乳酸菌分类鉴定中的应用及其优势和局限性。 关键词：乳酸菌，PCR，分类，鉴定，分子生物学 1. 引言 乳酸菌（lactic acid bacteria, LAB）是一大类缺乏细胞色素、糖代谢主要以乳酸为终产物的革兰氏阳性非芽孢细菌，其过氧化氢酶反应为阴性、耐氧耐酸、营养要求复杂并且严格发酵。LAB这个名称就细菌分类学而言实属一个非正式、非规范的名称。目前从自然界中已发现的这类细菌在分类学上至少可划分为23个属，涉及到的有关菌种则更多，其代表性的菌属有乳杆菌属、乳球菌属、链球菌属、双歧杆菌属、肠球菌属、明串珠菌属、气球菌属、肉杆菌属、酒球菌属、足球菌属、四体球菌属和漫游球菌属等[1,2]。 传统的LAB鉴定方法主要依赖于表型分析，包括形态学观察、生长需要及特性、发酵图谱、细胞壁蛋白分析、血清学以及脂肪酸甲基酯分析等，其中有些技术已被证明适用于某些LAB的鉴定，但是也普遍意识到表型分析的一些缺点，如重现率及辨识能力低、相似的表型特性并不等同于相似的或者关系密切的基因型[3]。表型试验可能的固有问题是，不是每一给定种内的所有菌株都有一个共同的性状，而且即使是同一菌株也可能呈现出一定的生化变异性。此外，实验操作的一点改变也可能产生错误的结果。因此基于表型试验的常规技术并不能对菌株做出明确的鉴定[4]。一般来讲，准确地鉴定一株乳酸菌至菌种的水平，至少需要17种表型实验[5]，但是微生态系统的分离株需要更为简单快速的鉴定方法。因此，需要进行表型特性的分子水平研究和遗传特性的研究。 只有分子生物学技术才能解决LAB鉴定的复杂性。近年来发展起来的核酸技术如DNA 杂交和特定靶序列的扩增技术，对LAB的鉴定是一种改进和补充。在LAB分类学方面，代表性的遗传学方法是限制酶分析（restriction enzyme analysis, REA）的多态性（如PFGE、RFLP 和核糖分型）和PCR技术[3]。REA是进行基因组DNA的限制性内切酶消化。脉冲场凝胶电泳（pulsed-field gel electrophoresis, PFGE）是经酶切后，分离出大量的基因组片段；限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism, RFLP）指的是酶切后含同源序列的酶切片段在长度大小或数目上的差异；而核糖分型（Ribotyping）是以rDNA和/或其间隔区域作为探针，与基因组限制片段进行杂交。PFGE是菌株分类中最有识别力的方法，但是基因组DNA的所有限制片段的完全分离是个困难；迄今，最佳辨识力的遗传探针是种特异性的[6]；而PCR技术以及以PCR为基础的遗传指纹技术和群落分析技术甚至可以进行高度菌株特异性的LAB鉴定。 PCR技术的创立打开了LAB快速鉴定的大门，其不仅操作简便、快速可靠并且灵敏高效，而且还克服了对培养的依赖性（自然界中有85～99.9%的微生物至今还不能进行纯培

乳酸菌的分离、纯化与鉴定

乳酸菌的分离、纯化与鉴定 第一部分：乳酸菌的分离、纯化 一、实验器材： 1. 实验药品新鲜乳酸饮料（市售）、脱脂奶粉、蔗糖、1.6%溴甲酚绿乙醇溶液（溴甲酚绿、无水乙醇）、酵母膏、琼脂、革兰氏染液（结晶紫染液、卢戈氏碘液、 95%L 醇、沙黄）、15/乙醇、香柏油、1mol/L NaOH、1mol/L HCI、碳酸钙；0.4gNaOH固体、4.2ml浓HCL（分析纯）、20gCaCO3固体、酵母膏20g、琼脂30g 香柏油、脱脂奶粉100g、蔗糖10g ； 2. 仪器与设备高压蒸汽灭菌锅、光学显微镜、培养箱、 pH试纸、酸乳瓶、培养皿（?9或? 12）、试管、300ml三角瓶（带玻珠）、移液管、天平、500ml 锥形瓶、250ml 锥形瓶、250ml烧杯。 二、实验步骤： 1. 培养基配制（BCG牛乳培养基）： （A）溶液：取脱脂乳粉100g,水500ml,加入1.6%溴甲酚氯乙醇溶液1ml, 混合均匀后分装入三角瓶于高压蒸汽灭菌锅 80C灭菌20 min ; （1.6%溴甲苯酚绿（BCG 乙醇溶液用1.6g溴甲酚绿加入20ml无水乙醇中，再加水至100ml制成）（B）溶液：酵母膏10g，水500ml, CaCO3 10g琼脂20g,加热溶解，用精密pH 试纸调节pH到6.8，分装入三角瓶后在103kPa 121 T高压蒸汽灭菌 20Mi n。 以无菌操作趁热将（A）（B）溶液均匀混合。 2. 药品配制 2.1结晶紫：结晶紫乙醇饱和液（结晶紫 2g溶于20ml 95%^醇中）20ml, 1%莊酸氨水溶液80ml。将两液混匀，放置24小时后过滤即可。 2.2卢哥氏碘液：碘1g,碘化钾2g,蒸馏水300ml。先将碘化钾溶于少量蒸馏水中，然后加入碘使之完全溶解，再加入蒸馏水300ml即成。 2.3蕃红溶液：番红2.5g , 95%^醇100ml，溶解后存于密闭的棕色瓶中。用时取20ml 与80ml蒸馏水混匀即可。 2.4 0.1%的吕氏美蓝染液：A液：美蓝0.3g ,95%^醇300ml; B液：0.01% K0H100ml。混合A和B液即成，按1： 100稀释即可。 2.4生理盐水：称取9g氯化钠，溶解在少量蒸馏水中，稀释到 1000毫升。

乳酸菌的简介

乳酸菌的简介 一、乳酸菌的起源 根据圣经旧的书上记载，公元前4000多年，人类已经开始发酵乳酸肉制品及蔬菜腌渍物。直到公元1857年，巴斯德(Pasteur)发现酸乳(sour milk)中有微小生物体存在，将其定名为”levue lactique”，发酵乃微生物作用所致的秘密才首次得以揭露；这是发现乳酸菌的开端。1873年李斯特(Lister)利用稀释法，由酸乳中纯化分离出Bacterium lactis，也就是目前的Lactococcus lactis，这是乳酸菌最早被分离出来的纪录(廖,1998；李,2000)。 二、乳酸菌的定义 乳酸菌一般是指能将碳水化合物发酵分解为乳酸的细菌群(佐佐木隆,1998)。乳酸菌群具有以下几点特性： 1.为革兰氏阳性(gram positive)球菌或杆菌。 2.不产生孢子(nonsporting)且无运动性(nonmotile) 3.不具分泌催化酶(catalase negative)之能力。 4.可在有氧环境生长，但以无氧状态下生存较佳，亦有绝对厌氧者。 5.需有碳水化合物、胺基酸、维生素等多种生长因子方能生长之复合营养需求 性(complex nutritional requirements)。 6.依代谢途径与最终产物的不同，可分为同质发酵(homofermentative)及异质发 酵(heterofermentative)两种乳酸菌。同质发酵性乳酸菌含有aldolase，最终产物90％-100％为乳酸；异质发酵性乳酸菌具有phosphoketolase，其最终产物除了40％-50％的乳酸外，还包括乙醇、二氧化碳及醋酸等多项产物(Ingledew,1995)。 乳酸菌普遍存在动物体消化道中，因耐酸性佳且可分泌乳酸及抗菌物质等有利于生存的条件，故消化道三大菌群当中最占优势(Nemcova et al. 1997) 三、乳酸菌的分类 乳酸菌一般包括Lactobacillus (L)、Leuconostoc (Leuc.)、Streptococcus (S)及Pediococcus (Ped.)四属；广义的乳酸菌尚包括Bifidobacterium与Sporolactobacillus 两个属(Jay, 2000)。近年来依据DNA和RNA序列相似性比对，将传统特上归类不明的菌属，一一明确独立成群，并赋与分类上之位置；至1999年底为止，乳酸菌共被分成18个属，分别为Abiotrophia、Atopobium、Bifidobacterium、Carnobacterium、Enterococcus、Lactobacillus、Lactococcus、Lactospaera、Leuconosto、Oenococcus、Pediococcus、Sporolactobacillus、Streptococcus、Tetragenococcus、Vagococcus、Weissella、Granulicatella、Paralactobacillus(李, 2000)。其中Streptococcus属及Enterococcus属中的部份菌株对人类及动物具有病原性，Bifidobacterium属、Pediococcus属及Leuconostone属中的少数菌种，曾有报告指出在人类感染病例中被分离到(Gasser, 1994；Donohue & Salminen, 1996)。而Lactobacillus属及Lactococcus属两者则普遍被认为对人类及动物体无害

乳酸菌菌株鉴定

分子生物学实验作业 ——用分子生物学方法鉴定菌株 专业：生物化工 姓名：王晓娜 学号：1043111039

鉴定一株乳酸菌菌株 一、实验目的和方法 采用RAPD指纹图谱方法鉴定一株乳酸菌菌株 二、实验材料 2.1 菌株 实验给定的菌株 2.2 试剂 Taq DNA聚合酶、DNA电泳buffer、引物、dNTP、模板DNA

2.3 仪器 台式离心机，PCR仪，稳压稳流电泳仪，紫外检测仪，凝胶成像系统 三、实验步骤 3.1 制备细菌DNA样品 收集菌悬液于1.5mlepp管中，5 000r/min离心5min。去上清，在沉淀中加入567微升 TE缓冲液、30微升10％的SDS、5微升10mg/ml 的溶菌酶后，37℃水浴3h。再加入3微升20mg/ml的蛋白酶K，37℃水浴lh。加入100微升5mol/l NaCl，80微升CTAB/NaCl溶液，65℃水浴10min。加入等体积的氯仿／异戊醇，12 000r/min离心5min。取上清，加入等体积酚／氯仿／异戊醇，12 000r／min离心5min。取上清，加入2倍体积的冰乙醇，12 000r/min离心10rnin，沉降DNA。去上清，将沉淀吹干，用100微升TE缓冲液(pH8．0)溶解。取l微升 DNA样品，稀释200倍后，紫外测定0D260和0D280。选取浓度1．8≤0D26l／0D280≤2．0的样品。然后，将DNA浓度稀释至48ng/μl作为模板备用。 3.2 PCR反应 扩增体积为25μl (含TapDNA聚合酶2u，10×PCR reaction buffer 2μl，dNTP 2μl，引物lμl，模板DNA 1μl)。扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性1min，38℃复性lmin，72℃延伸2min，进行40个循环后72℃延伸10min。取12μl扩增产物进行电泳，电压为100V，琼脂糖凝胶为l％(0．5×TBE)电泳30—40min，用凝胶成像系统观察

乳酸菌的分离纯化与鉴定

乳酸菌的分离、纯化与鉴定 第一部分:乳酸菌的分离、纯化 一、实验器材: 1、实验药品新鲜乳酸饮料(市售)、脱脂奶粉、蔗糖、1、6%溴甲酚绿乙醇溶液(溴甲酚绿、无水乙醇)、酵母膏、琼脂、革兰氏染液(结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、沙黄)、75%乙醇、香柏油、1mol/L NaOH、1mol/L HCl、碳酸钙; 0、4gNaOH固体、4、2ml浓HCL(分析纯) 、20gCaCO3固体、酵母膏20g 、琼脂30g 香柏油、脱脂奶粉100g 、蔗糖10g; 2、仪器与设备高压蒸汽灭菌锅、光学显微镜、培养箱、pH试纸、酸乳瓶、培养皿(φ9或φ12)、试管、300ml三角瓶(带玻珠)、移液管、天平、500ml锥形瓶、250ml锥形瓶、250ml烧杯。 二、实验步骤: 1、培养基配制(BCG牛乳培养基): (A)溶液:取脱脂乳粉100g,水500ml,加入1、6%溴甲酚氯乙醇溶液1ml,混合均匀后分装入三角瓶于高压蒸汽灭菌锅80℃灭菌20 min;(1、6%溴甲苯酚绿(BCG)乙醇溶液用1、6g溴甲酚绿加入20ml无水乙醇中,再加水至100ml制成) (B)溶液:酵母膏10g,水500ml,CaCO3 10g,琼脂20g,加热溶解,用精密pH试纸调节pH到6、8,分装入三角瓶后在103kPa 121℃高压蒸汽灭菌20Min。 以无菌操作趁热将(A)(B)溶液均匀混合。 2、药品配制 2、1 结晶紫:结晶紫乙醇饱与液(结晶紫2g溶于20ml 95%乙醇中)20ml,1%草酸氨水溶液80ml。将两液混匀,放置24小时后过滤即可。 2、2 卢哥氏碘液:碘1g,碘化钾2g,蒸馏水300ml。先将碘化钾溶于少量蒸馏水中,然后加入碘使之完全溶解,再加入蒸馏水300ml即成。 2、3 蕃红溶液:番红2、5g,95%乙醇100ml,溶解后存于密闭的棕色瓶中。用时取20ml与80ml蒸馏水混匀即可。 2、4 0、1%的吕氏美蓝染液:A液:美蓝0、3g,95%乙醇300ml;B液:0、01% KOH 100ml。混合A与B液即成,按1:100稀释即可。

乳酸菌的种类

乳酸菌的种类 微生物可依据革兰氏染色（阴性还是阳性）、菌的状态（球形还是杆形）、生存条件（需氧还是厌氧）、排列形态、碳水化合物的利用特性、代谢物等来进行分类。最近，通过对遗传基因序列的调查，发现它也同样适用于微生物的体系分类。 但是，如果新的分类基准被订立的话，这种较方便的区分法也可能会被随时改变。作为实例来讲，双歧杆菌属过去被称为杆状双歧杆菌，后来又变更为乳酸菌双歧杆菌。1986年，又变成为了双歧杆菌属。 现在，以人体大肠内繁殖的乳酸菌和其他微生物来举例说明：在人体肠内有数十亿的微生物，从这里采集到的食物里，我们会发现很多种类的微生物。为了分离这些微生物需要并用多种培养方法。 参考促进微生物生长的营养素、色素等特性，并对其进行分离分类是科研人员的主要工作。因为乳酸菌属于微生物的一种，所以同样可以按照革兰氏染色、菌的形态、生存条件和排列状态来进行分类。 一般来说，我们正在使用的乳酸菌从大的方面可分为6个属：棍状的乳酸杆菌属、球状的链球菌属、双歧杆菌属、嗜酸乳杆菌属、小球菌属、乳球菌属。

是由lacto(意为牛奶乳糖)和bacillus(意为杆状菌)合并起来产生的名称，是指能分解牛奶里乳糖的棍棒模样的菌。 与其他的乳酸菌相比，对乳酸杆菌科学效能的研究是最多的。从学术和产业的角度来讲，乳酸菌是被最广泛应用的一种菌。乳酸杆菌包括：保加利亚乳杆菌、干酪乳酸菌、嗜酸乳杆菌等。 保加利亚乳杆菌 这种菌含有起源于保加利亚的意思。是从保加利亚 地区人们喜欢饮用的发酵乳产品里发现的一种乳酸菌。 干酪乳杆菌 (Lactobacillus casei shirota) casei 意为奶酪。 这种棍棒模样的乳酸菌，主要在小肠内活动。在人 体内不会被消化液、胆汁杀死，具有使小肠内菌群正常化和 净化大肠的效果。 作为耐酸性较强的特殊乳酸菌，在净肠和促进消化 方面，对人体起着非常有益的作用。 嗜酸乳杆菌 (Lactobacillus asidophilus) 作为乳酸菌的一种，这种棍棒型的乳酸菌作为较强 的耐酸性菌，能阻止肠内腐败性微生物的滋生，并且有抗癌、 降低胆固醇和促进维生素B 群形成的作用。 SNUL 菌 作为嗜酸乳杆菌的代表，对降低胆固醇有非常明显

乳酸菌的分离和初步鉴定

乳酸菌的分离和初步鉴定 刘海音张超 (长春师范学院生物系，长春，130032) 摘要：本文采用BCG牛乳培养基琼脂平板筛选乳酸菌，经过连续6次以上的传代，以达到分离提纯，镜检时观察到链球状和杆状两种形状。为了鉴定分离出的菌种，做了一系列的生理生化反应实验，如吲哚试验的反应结果为阴性，糖发酵试验的反应结果为阳性。此外还进一步做了小型发酵实验，检测出了乳酸的存在⑴。以上实验结果符合乳酸菌的特征，从而证实该分离出的菌种为乳酸菌，杆状的叫做短乳杆菌，链球状的叫做乳链球菌。 关键词：乳酸菌分离鉴定 乳酸菌为一群可发酵碳水化合物以获取能量，并生成大量乳酸的一类细菌的总称。利用发酵技术保藏食品，最典型的是通过乳酸菌的发酵。这在发酵乳工业中已经得到广泛的应用。利用天然的或经筛选的乳酸菌发酵，已经生产出多种不同类型的发酵乳。因而分离和鉴定乳酸菌对人类的生产和生活都具有非常重要的意义。本报告采用BCG牛乳培养基琼脂平板筛选和分离乳酸菌，利用镜检观察到了链球状和杆状两种形状。通过吲哚试验和糖发酵试验以及小型发酵实验证明该菌种为乳酸菌，杆状的叫做短乳杆菌，链球状的叫做乳链球菌 1.材料和方法 1.1材料 1.1.1选用沈阳乳业有限责任公司乳品一厂生产的辉山纯酸奶 1.1.2 培养基 BCG牛乳培养基 A(溶液)：脱脂奶粉100g, 水500 ml, 加入1.6%溴甲酚绿（B.C.G）乙醇溶液1 ml, 80 摄氏度灭菌20 min. B(溶液)：酵母膏10 g, 水500 ml, 琼脂20 g, PH : 6.8 121摄氏度灭菌20 min 以无菌操作趁热将A ,B 溶液混合均匀后倒平板。 乳酸菌培养基 牛肉膏5 g , 酵母膏5 g , 蛋白胨10 g ,葡萄糖10 g , 乳糖5 g , 氯化钠5 g , 水1000 ml , PH : 6.8 121摄氏度湿热灭菌20 min 蛋白胨水培养基