大黄颗粒对大鼠的长期毒性试验研究
【CN109938870A】一种大鼠重症脑出血合并脓毒症复合模型的建立方法及其应用【专利】
(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910214737.6 (22)申请日 2019.03.20 (71)申请人 复旦大学附属华山医院 地址 200040 上海市静安区乌鲁木齐中路 12号 (72)发明人 宫晔 邓水香 朱宏达 冯圣捷 田觅 金朋 (74)专利代理机构 上海申新律师事务所 31272 代理人 俞涤炯 (51)Int.Cl. A61D 1/00(2006.01) A61D 7/00(2006.01) (54)发明名称 一种大鼠重症脑出血合并脓毒症复合模型 的建立方法及其应用 (57)摘要 本发明涉及一种大鼠重症脑出血合并脓毒 症复合模型的建立方法，其包括：大鼠注射麻醉 后，断尾取血匀速注入右侧尾状核，获得脑出血 大鼠模型；脑出血大鼠模型制备成功后，采用盲 肠结扎穿孔法获得重症脑出血合并脓毒症复合 模型。本发明还涉及上述复合模型在制备预防/ 治疗重症脑出血合并脓毒症的药物中的应用。本 发明成功构建了重症脑出血合并脓毒症复合模 型，更好的模拟临床重症脑出血并发感染以及脓 毒症的临床表现，为进一步探索重症脑出血合并 感染和脓毒症的发病机制和干预措施提供理论 基础；并将其具体应用于治疗重症脑出血+脓毒 症的药物的筛选，对防治重症脑出血合并感染和 脓毒症的发生及后期的康复治疗及预后具有重 要的意义。权利要求书1页 说明书5页 附图2页CN 109938870 A 2019.06.28 C N 109938870 A
权 利 要 求 书1/1页CN 109938870 A 1.一种大鼠重症脑出血合并脓毒症复合模型的建立方法，其特征在于，包括如下步骤： 步骤一、脑出血大鼠模型的制备； 大鼠注射麻醉后，断尾取血匀速注入右侧尾状核，留置预定时间，缓慢拔针，防止反流，获得脑出血大鼠模型； 步骤二、重症脑出血合并脓毒症模型的制备； 步骤一的脑出血大鼠模型制备成功后，大鼠注射麻醉后仰卧固定，腹部手术区域皮肤杀菌后铺无菌孔巾，沿正中线剪开皮肤、肌肉、腹膜后牵出盲肠，以无菌丝线测量盲肠全长后取该段丝线对折处所对应的盲肠部位以无菌丝线结扎，扎紧前将盲肠内容物向降部挤压，扎紧后用无菌不锈钢针沿结扎远端肠管外侧缘穿刺两孔并将穿刺针来回抽动后退出穿刺针；轻轻挤压结扎盲肠降部，挤出少量粪质后将肠管还纳腹腔，确认腹腔内无活动性出血后以无菌丝线逐层缝合腹壁，获得重症脑出血合并脓毒症复合模型。 2.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述步骤一中，大鼠采用10％水合氯醛320～380mg/kg腹腔注射麻醉，其断尾取血量为50～180ul，其血液注入方法为：2次注入法，先注入一半，留置8～12min后，再注射另一半血量；注入完成后，留置12～18min后拔针。 3.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述步骤一中，所述右侧尾状核的注入位置为：前囟中线旁开2.8～3.2mm，冠状缝前0.8～1.2mm，深度5～7mm。 4.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述步骤一中，在拔针后，采用骨蜡封闭颅骨创口，缝合头皮，局部皮肤用复合碘消毒液消毒，防止局部感染。 5.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，在脑出血模型制备成功20～28h后制备重症脑出血合并脓毒症复合模型。 6.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述步骤二中，大鼠采用10％水合氯醛腹腔注射麻醉；皮肤杀菌采用安尔碘涂搽；无菌不锈钢针的尺寸为外径2～4mm，其来回抽动的次数为2～5次。 7.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述步骤二中，腹壁缝合完毕后，即刻注射生理盐水15～25毫升/千克体重于大鼠后腿根部皮下。 8.根据权利要求1～7中任一项制备的大鼠重症脑出血合并脓毒症复合模型在制备预防和治疗重症脑出血合并脓毒症的药物中的应用。 2
长期毒性试验
长期毒性试验 药物毒性是否产生，取决于： a药物本身的理化特性b给药情况c如何被机体代谢 对一特定药物而言，最重要的影响毒性的因素： a给药途径b体内停留时间c给药频率 （影响靶组织的药物浓度） 1.半数有效量（ED50）：能引起50%的动物或实验标本产生反应的浓度或剂量。 2.半数致死量（LD50 ）：能引起50%的动物死亡的浓度或剂量。 3.治疗指数：TI= LD50/ ED50 药物实验动物的LD50和ED50的比值称为治疗指数（TI），用以表示药物的安全性。 4.安全范围：ED99~LD1（或ED95~LD5）之间的距离。值越大越安全。 ?有效量曲线和致死量曲线的斜率不一样时，以TI评价药物的安全性并不可靠。（原因？）六、药物毒性作用类别 药物不良反应（adverse reaction)：凡是不符合用药目的并为病人带来不适或痛苦的有害反应统称为药物不良反应。 包括：副反应、后遗效应、停药反应、毒性反应、变态反应、特异质反应、致癌性、致畸性、致突变性； （三)药物毒性临床前评价程序（三水平） 第一水平，急性毒性试验： 第二水平，长期毒性试验（第一阶段） 第三水平，长期毒性试验（第二阶段） （四）药物毒理学研究在新药临床试验各阶段的任务 第一期临床研究→探索安全的人用剂量 第二期临床研究→安全性{疗效（有效性）不良反应（安全性） 第三期临床研究→大范围的社会考察 不良反应监测→提高疗效，降低不良反应 多数毒物发挥其毒性作用至少经历四个过程： a毒物吸收后经过多种屏障转运到一个或多个靶部位； b进入靶部位的终毒物与内源靶分子发生交互作用； c毒物引起机体分子、细胞和组织水平功能和结构紊乱； d机体启动不同水平的修复机制。当此机制低下或功能和结构紊乱超过机体修复能力时，机体即出现组织坏死、癌症、纤维化等毒性损害。 长期毒性试验的意义 a判断受试药物能否进行临床试验； b预测人类临床用药时可能毒性和安全范围； c制定临床试验中的防治措施； d确定应该着重评价的生理生化指标； e选择I期临床试验时的初试剂量，等。 一、一般原则 1动物选择： a.敏感动物，年轻动物，雌雄各半 b.2种（啮齿—大鼠6w、非啮齿—比格犬4-6m） c.体重差异不大于平均体重的20% d..单笼饲养、定量喂食
急性、慢性和亚慢性毒性实验(20201111083305)
急性毒性试验 (-)经典的急性致死性毒性试验 通过试验得到化合物引起动物死亡的剂量一反应关系并求得LD50 ( LC50) 1、实验动物 常用的实验动物是小鼠或大鼠。一般受试动物应是雌、雄各半；若雌、雄动物对待测化学物毒性的敏感程度有明差异，则应分别求出各自的LD50；如果试验是为畸形试验做剂量准备，也可仅做雌性动物的LD50试验。小动物每组10只，狗等大动物可每组6只。 2、染毒剂量设计 首先要了解化学毒物的结构式、分子量、常温常压下的状态、纯度、杂质成分与含量、溶解度、挥发度、PH等理化性质。对于新的受试化学物，找出与受试化学毒物结构与理化性质近似的化学物的毒性资料，并以文献资料中相同的动物种系和相同接触途径所测得的LD50(LC50)值作为受试化学物的预期毒性中值，先用少量动物，以较大的剂量间隔(一般按几何级数)染毒，找出找出10%、90% (或0%~100%)的致死剂量范围，然后在这个剂量范围内设几个剂量组。改良寇氏法最好设5个剂量组，每组10只动物，雌雄各半，剂量组要求以等比级数设置。根据以下公式计算出剂量分组： i=(lgLD90-lgLD10) / (n-1)或：i=(lgLD100-lgLD0)/ (n-1) 式中i为组距(相邻的两个剂量组对数剂量之差)； n为设计的剂量组数。 有的毒性较小，此时可不再求其LD50,而应进行限量试验。在用大鼠或小鼠进行试验时，一般用20只动物，雌雄各半。单次染毒剂量一般限定为5g/kg (体重)，对于食品毒理学试验，限量要求为15g/kg (体重)。如果实验动物无死亡或仅有个别动物死亡(死亡率低于50%), 则可得出LD50大于限量的结论。 3、观察 染毒后一般要求观察14天，依据14天内动物的总死亡情况计算LD50o在实际工作中，依据受试物有关测试规程要求确定观察期的长短。 观察内容包括： (1)动物死亡情况：包括动物死亡数及各自的死亡时间。 (2)动物体重：于染毒前、染毒后每周和死亡时测定体重。 (3)中毒反应症状：临床观察每天至少一次，观察皮肤、被毛、眼睛和粘膜改变，呼吸、 循环、自主和中枢神经系统以及四肢活动和行为方式的变化等，特别要注意有无震颤、 惊厥、腹泻、嗜睡等现象。神经毒性：惊厥、共济失调和死亡。植物神经兴奋：腹泻或 竖毛。 (4)病理学检查：解剖进行尸检，观察各器官有无改变，对肉眼观察有变化的脏器需进 行组织病理学检查。 4、LD50计算 (1)霍恩氏法 (2)简化寇氏法 M=X - i (S p - 0. 5) 式中:m―logLD50, X—最高剂量组剂量对数值，
脓毒症大鼠肝组织基因表达变化的研究
脓毒症大鼠肝组织基因表达变化的研究 摘要】目的应用基因芯片技术初步分析脓毒症大鼠肝脏组织细胞基因表达谱的 变化。方法健康Wistar 大鼠40 只，随机分为模型组和假手术组，每组各20 只。通过盲肠结扎穿孔术（CLP）制备大鼠脓毒症模型，应用含有22523 个大鼠基因cDNA 克隆的表达谱基因芯片进行检测，筛选差异表达基因，用计算机软件分析 脓毒症大鼠肝脏组织术后24 小时的基因表达变化。结果与假手术组比较，共筛 选出差异表达基因共285 条，占基因芯片总点数的1.26%，其中已知基因180 条，93 条基因表达上调，87 条基因表达下调。涉及到一系列与细胞生长调节相关基因，物质能量代谢相关基因，信号转导、炎症、应激反应相关基因，转录调控及 蛋白质翻译、修饰、加工、降解相关基因等相关的基因异常表达。结论脓毒症导 致的多脏器功能不全（MODS）是多种基因作用的结果，采用基因芯片技术全面 揭示脓毒症肝脏基因表达的模式，有利于发现新的研究目标和治疗途径。 【关键词】脓毒症肝基因表达基因芯片 【中图分类号】R394 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2012）08-0053-03 脓毒症(Sepsis) 及其所导致的多脏器功能不全（MODS），在临床上发病率高，病死率高，临床救治棘手，源于其发病机制非常复杂。目前多数认为是过度的炎 症反应与代偿性抗炎反应失衡，出现免疫系统功能紊乱的病理生理过程，并与机 体多系统、多器官病理生理改变密切相关，涉及感染、炎症、免疫、凝血及组织 损害等一系列基本问题[1]。国内外已有学者运用基因芯片技术对经C L P 或腹腔 注射脂多糖制备小鼠脓毒症模型的多个脏器组织的基因差异表达分别进行研究， 其结果初步显示了这些组织中部分基因表达的特异性改变，但并未对脓毒症机制 和治疗的研究提出新的看法。本实验再次运用基因芯片技术研究分析脓毒症时肝 脏相对应的基因表达谱变化，旨在进一步探讨脓毒症的研究治疗新途径。 1 材料和方法 1.1 实验动物及模型制备 雄性健康Wi s t a r 大鼠40 只，体重180 － 220g，购自上海斯莱克实验动物 有限公司。实验前在清洁级环境下饲养2 周，常规饲料喂食、正常饮水。按随机 数字表法分组：假手术组（n ＝ 20 只）、模型组（n ＝ 20 只）。模型组：采用 盲肠结扎穿孔术（CLP）方法建立大鼠肠源性脓毒症模型。实验前大鼠禁食过夜，自由饮水，称体重后以氯胺酮（100mg/ kg）腹腔麻醉固定，消毒铺巾，沿中下腹正中线切开2cm 开腹提出盲肠，7 号丝线距盲肠根部1c m 处血管弓内结扎盲肠；用9 号无菌针头刺穿盲肠3次，使肠内容物流出，避免伤及肠系膜血管，然后将 盲肠放回腹腔，缝合腹部切口。假手术组：不结扎和穿刺盲肠外，其余操作同CLP组。两组术毕皮下注射平衡液5ml/kg以补充术中丢失的体液并抗休克治疗， 术后正常饮食、自由饮水。 1.2 肝组织的留取和处理 两组大鼠（n＝40只）24h断颈活杀迅速开腹摘取肝脏，置入液氮罐中骤冷保存，温度－70℃，备用。 1.3 基因芯片杂交及检测分析 用一步法总RNA提取试剂（Trizol）抽提液氮中肝组织总RNA。反转录并标记探针，与RatRef-12大鼠表达谱基因芯片(由联合基因技术有限公司制作，每个芯 片含有22523个大鼠基因cDNA克隆)杂交过夜，洗片、晾干后扫描，采用Scan
炎调方干预脓毒症大鼠模型的效果研究
炎调方干预脓毒症大鼠模型的效果研究 发表时间：2019-09-23T16:25:49.893Z 来源：《医师在线》2019年5月9期作者：张燕婷1 朱佳琳1 李淑芳2 熊旭东2 [导读] 目的探讨炎调方对脓毒症大鼠的作用机制。张燕婷1 朱佳琳1 李淑芳2 熊旭东2通讯作者（1上海三林康德社区卫生服务中心，中医科；2上海中医药大学附属曙光医院，感染科；上海200000）摘要：目的探讨炎调方对脓毒症大鼠的作用机制。方法将SD雄性88只大鼠随机分为正常组、假手术组、模型组、炎调方组、对照组(炎调方减去大黄、芒硝)，采用盲肠结扎穿孔术制备脓毒症大鼠模型。术后分别于12h、24h、36h致死大鼠，测定血清IL-1β水平及观察各组肺病理切片的变化。结果血清方面：假手术组与正常组相比，血清IL-1β水平无统计学意义(P>0.05)；与正常组相比，12h模型组的血清IL-1β水平与24h的血清IL-1β水平比较升高 (P<0.05)；造模后12h炎调方组血清IL-1β水平和模型组对比，有显著降低(P<0.01)，差异在24h 无统计学意义(P>0.05)；对照组(炎调方去掉大黄和芒硝)与模型组对比，12h和24 h均无统计学意义(P>0．05)；炎调方组血清IL-1β水平和对照组对比在12 h水平显著降低(P<0.01)，24 h但是未见明显差异(P>0.05)；肺病理切片方面：正常对照组及假手术组肺组织未见明显病理 学损伤性变化。CLP术后12h,模型组的肺组织轻微充血，CLP手术后24h，与12h对比，模型组肺组织损害更甚，充血更明显，减方对照组肺组织病变情况较模型组无明显改变。炎调方组和模型组相比，病变范围略小。结论炎调方能明显下调脓毒症大鼠血清IL-1β水平，并且能减轻脓毒症大鼠肺组织损伤。 关键词:炎调方脓毒症肺病理切片脓毒症（sepsis）是指由感染导致的全身炎症反应综合征（systemic inflammatory response syndrome,SIRS），进一步发展可以成急性呼吸窘迫综合征（ARDS）和脓毒症休克（septic shock），甚至可导致多脏器功能障碍综合征（MODS）[1]。严重的脓毒症患者和脓毒性休克目前仍然是作为ICU内患者死亡的主要原因，其病死率达2８％~５０％。脓毒症一直以来都作为危重病、急救医学领域临床和基础科研的难点和热点 [2]。本研究是通过经典的盲肠结扎穿孔(CLP)术制作脓毒症大鼠模型，以通腑活血法治疗脓毒症，通过检测大鼠部分炎症介质变化和肺组织的变化及观察大鼠的死亡情况，进一步探讨并丰富炎调方对脓毒症干预的效果研究，为诊疗脓毒症疾病的发展提供研究证据。 1 实验材料 1.1动物来源与分组 88只雄性SD大鼠，购自上海中医药大学的实验动物中心，购回后所有大鼠均作适应性饲养一周后随机分为正常组、假手术组、模型组、炎调方组、对照组（炎调方减去大黄和芒硝）。 1.2 药物炎调方组：玄参l5g，当归15g，生大黄10g(后下)，芒硝10g(冲)，桃仁10g，赤芍15g。对照组：玄参l5g，当归15g，桃仁10g，赤芍15g。中药均由上海曙光西院中药房提供。按常规的煎煮方法来煎煮，最后将芒硝充分溶解于药液中，将药液浓缩为含生药1.0 g ／ml，放入4℃冰箱备用。对照组（炎调方减去大黄和芒硝）煎煮方法同前，药液被浓缩为含生药1.0g／mL，保存备用于4℃冰箱。 1.3 仪器 Multiskan MK3 酶标仪（赛默尔上海世飞仪器厂）；501C超级恒温水域槽（上海精宏实验设备公司）；台式离心机(microfuge lite)(Beckman 公司)；OLYMPLUS BH2 显微镜（PHILIP）；石蜡全自动切片机(德国CUT6062切片机)；低温冰箱（-70℃）(Forma scientific公司)。 2 方法 2.1 脓毒症模型的制备 参照相关文献[3-5]，采用盲肠结扎穿孔(cecal ligationand puncture，CLP) 法制造脓毒症大鼠模型，实验鼠术前禁食12小时，腹腔注射2﹪的戊巴比妥钠（40mg/kg）麻醉，安尔碘消毒皮肤，沿中下腹做大约1.5cm的切口，提出盲肠，用4号线把盲肠根部结扎，将18号针把盲肠穿通3次后将肠还纳于腹腔，并逐层缝合皮肤。术后注射生理盐水（30mg/kg）于皮下抗休克。待麻醉清醒后可自由活动、喝水、进食。假手术组仅仅切开腹腔并翻动肠道，不去结扎穿刺，剩下的操作同模型组。 2.2 分组按随机方法将实验大鼠分成5个组，正常组8只，麻醉并腹主动脉取血和肺部组织后处死；假手术组8只，麻醉后开腹翻动肠道，关闭腹腔，12h后麻醉并腹主动脉取血和肺部组织后处死；模型组24只，CLP术后12h、24h、36h分别麻醉然后腹主动脉取血和肺部组织后处死，每个组各8只；炎调方组，将炎调方于术前灌胃（9.9g/kg），每天一次，连续3天，灌胃3次后2h予以造模，CLP术后各时间点分别麻醉并腹主动脉取血和取肺部组织后处死，每个组各8只；对照组（炎调方减去大黄和芒硝）24只，该方造模前灌胃（9.9g/kg），每天一次，连续3天，灌胃三次后2h予以CLP造模，术后各时间点分别麻醉和腹主动脉取血致死，每组各8只。 2.3 标本采集与检测 腹腔注射2％戊巴比妥钠(40mg／kg)麻醉大鼠，安尔碘消毒皮肤后逐层开腹，予以腹主动脉抽血．取血后静置30min于室温下，离心（3000转／rain15min）后血清存于4℃冰箱，备测白细胞介素1β（IL-1β），然后快速打开大鼠左右胸腔，取出左右两边肺叶。切取左肺和右肺的病理组织，左肺固定于福尔马林10％液体，酒精极度脱水，石蜡包埋并切片，常规HE染色，在光镜下对比肺组织的变化。右肺迅速置于液氮中备用，然后转入-70℃冰箱冻存。 3 统计学方法统计软件用于SPSS 19.0，计量资料的数据以Mean±SD（x±S)来表示，采用单因素方差分析方法。（P<0.05是差异具有统计学意义） 4 实验结果 4.1 多组大鼠死亡情况观察实验中,实验鼠共死亡19只（其中模型组8只，炎调方组4只，减方炎调方组7只），进入后续实验共69只。正常组、假手术组大鼠活动无异常。模型组的手术之后都有脓毒症严重现象，如手术结束后清醒推迟，呼吸变快明显，腹部向下膨隆，精神不振，少动等现象，剖开腹腔发现脓血和浑浊性恶臭液体，肠管可见肿胀，肺部明显淤血，CLP+减方对照组大鼠与模型组相比未见明显变化。CLP+炎调方组大鼠精神明显好于CLP组，术后表现较轻。取材前，各组大鼠的死亡情况（只）(见表1)。正常组和假手术组全部存活，模型组12h,24h分别死亡2，5只（死亡率8.3％,3 5.7％），炎调方组12h,24h分别死亡1,2只（4.17％,13.3％），减方炎调方组12h, 24h分别死亡1,4只（4.17％,2 6.67％）。 4.2各组大鼠血清IL-1β的比较
制剂长期毒性研究技术指导原则
制剂长期毒性研究技术 指导原则 公司内部编号：（GOOD-TMMT-MMUT-UUPTY-UUYY-DTTI-
北京市医疗机构制剂长期毒性研究 技术指导原则 一、概述 长期毒性研究可为医疗机构制剂（以下简称“制剂”）的研发提供重要的安全性参考信息，是非临床安全性评价的重要内容。通过长期毒性研究，可预测受试物可能引起的临床不良反应，包括不良反应的性质、程度、量毒关系和时毒关系、可逆性等；判断受试物长期给药的毒性靶器官或靶组织；推测临床试验的起始剂量和重复用药的安全剂量范围；提示临床试验中需重点监测的指标；提供临床试验中解毒或解救措施的参考。 本指导原则适用于中药制剂、化学制剂的长期毒性试验研究。 二、一般要求 长期毒性研究应遵守《药物非临床研究质量管理规范》，遵循毒理学研究中随机、对照、重复的基本原则进行试验设计和开展研究工作。 研究机构必须具有法人资格，具备从事药物安全性评价的相关设备、设施及资质，必须取得相应实验动物使用许可证，具有与所使用的实验动物级别相符的实验环境。 试验项目负责人必须获得相关专业领域副高级以上职称（含副高），所有参加研究的人员必须经过相关专业的业务培训。 三、基本内容 制剂的开发背景和研究基础各不相同，在长期毒性研究立题之前应进行文献查阅，根据申报品种的立题依据、临床意义、处方来源、使用历史、有效性与安全性等背景资料进行综合考虑。 （一）试验项目的选择 1.制剂注册申请
（1）中药制剂若满足以下全部条件，可免于进行长期毒性试验： ①根据中医药理论组方； ②处方中的药味用量不超过法定药品标准规定； ③处方组成中不含有法定标准中标识有毒性及现代毒理学证明有毒性的药材（毒性药材是指历版中国药典，部颁标准，进口药材标准，省、自治区、直辖市的中药材标准中标注为大毒/剧毒和有毒的药材，如制附子、制川乌、制草乌等）； ④处方组成不含有十八反、十九畏配伍禁忌； ⑤利用传统工艺配制（即制剂配制过程没有使原组方中治疗疾病的物质基础发生变化的）； ⑥急性毒性试验（采用最大给药容量、最大给药浓度）未见明显毒性反应； ⑦临床实际用药周期为1周以内。 实际用药周期超过1周者，如符合上述条件，且该处方在本医疗机构具有5年以上（含5年）使用历史、能提供可靠的临床安全性资料，亦可免于进行长期毒性试验。 （2）申请配制的化学制剂属已有同品种获得制剂批准文号的，可免于进行长期毒性试验。 （3）本医疗机构已有品种的改剂型品种，如果配制工艺无质的改变且临床用量、给药途径相同，可以免报长期毒性研究资料（缓释、控释制剂除外）。否则，应按临床拟用途径比较改变前后的长期毒性反应。 （4）化学制剂注射剂品种，参照新药的注射剂相关研究技术要求进行试验研究，提供申报资料及文献资料。 2.制剂补充申请
脓毒血症动物模型具体步骤及说明
脓毒血症动物模型具体步骤及说明 原型物种人 来源盲肠结扎穿孔术（CLP）致脓毒症 模式动物品系SPF级SD大鼠，健康，雄性，体重为180g~200g 实验分组实验分六组：正常对照组、模型组、阳性药组、受试药组三个剂量组，每组15只动物。 实验周期2d 建模方法1. 称量大鼠，腹腔注射水合氯醛（350mg/kg）麻醉，腹部正中剃毛后用碘酒及酒精擦拭手术区域。 2. 沿腹白线切开腹腔约2cm，找出盲肠，用5-0 缝线结扎约1/3盲肠，以21G针头贯通穿刺结扎的盲肠2次。轻轻挤压使少量肠内容物从穿刺孔溢出确保通畅；将处理好的盲肠回纳入腹腔，用5-0 缝线缝合内层，3-0缝线缝合外层，将大鼠置于加热垫维持肛温在37±0.5℃。 3. 待大鼠苏醒后自由饮水，正常饲养。 4. 2d后大鼠水合氯醛钠麻醉后，于腹主动脉取血5ml，室温静止2h，4℃离心机3000r/min离心10min，分离出上层血清，置-80℃冰箱保存备用。处死大鼠，取出心脏、肝脏、肾脏、肺、小肠，4％多聚甲醛固定，石蜡包埋切片(厚4um)，HE染色，观察病理改变，其余组织置于-80℃冰箱备用。 应用疾病模型
1.一般情况观察脓毒症组术后苏醒延迟，醒后精神萎靡，身体蜷缩，基本不活动，进食进水减少，对外界反应迟钝，呼吸频率加快，被毛蓬松少光泽，大便稀软，不再扎堆取暖。12h出现死亡大鼠，随着时间的延长大部分大鼠出现皮温低，肌力减弱，眼周血性分泌物，停止进食进水，排泄稀水样便，色黄，腥臭味。进一步发展出现呼吸急促，对被动仰卧无反抗，排泄物呈黏液状，量多，最终死亡。剖腹可见恶臭味血性渗液，肠管水肿黏连，盲肠坏死变黑。 心脏：光镜下结果比较，对照组大鼠心肌肌纤维结构排列紧密、无水肿、充血及渗出。模型组心肌肌纤维结构排列疏松，带状空泡化，细胞核肿胀，间质水肿、充血。 肝脏：肝有大量空泡脂肪样变性，肝细胞肿胀并有炎性细胞浸润。 肺：模型组肺间隔增厚，部分肺泡组织结构被破坏，炎症细胞浸润。 肾：可见肾皮质及间质水肿伴大量炎性细胞浸润，肾小管上皮细胞均有肿胀。空泡变性，坏死脱落。肾小管囊腔扩张、管型形成。皮髓质境界欠清晰，肾小球收缩、毛细血管微血栓形成 小肠：模型组小肠粘膜水肿、白细胞浸润、出血和上皮细胞坏死脱落。 血浆中炎症因子增加是脓毒症的典型特征之一,IL－1β、TNF－α及IL－6 是主要的促炎症细胞因子，在脓毒症模型后显著升高。
大鼠脓毒症模型
大鼠盲肠结扎穿孔术（CLP）致脓毒症模型脓毒症(sepsis)是指由感染引起的全身炎症反应综合征(Systemic inflammatoy response syndrome，SIRS)，临床上证实有致病菌侵袭存在或有高度可疑的感染性病灶，临床中多以常见并发症出现在重度感染、大面积烧伤、严重创伤或大手术术后的危重患者当中。脓毒症一旦发生，进展迅速，短时间可由全身炎性反应综合征(Systemic inflammatory response syndrome，SIRS)、脓毒症进展为重度脓毒症(severe sepsis)(合并器官功能不全)、脓毒症休克(septic shock)(并发充分液体复苏亦无法纠正的低血压)及多器官功能障碍综合征(Multiple organ dysfunction syndrome，MODS)，以上三者可贯序发生，亦可同时发生，严重危及患者生命，产生极高的致死风险。虽然目前已经有许多动物模型用来复制脓毒症，但盲肠结扎穿孔术（CLP）致脓毒症的啮齿动物模型仍然是目前应用最广泛的脓毒症动物模型。 1.实验动物 SPF级Wistar大鼠，健康，雄性，体重为180g~200g 2.实验分组 实验分六组：正常对照组、模型组、阳性药组、受试药组三个剂量组，每组15只动物。 3.实验周期 2d 4.建模方法 1.称量大鼠，腹腔注射水合氯醛（350mg/kg）麻醉，腹部正中剃毛后用碘酒及酒精擦拭手术区域。 2.沿腹白线切开腹腔约2cm，找出盲肠，用5-0缝线结扎约1/3盲肠，以21G针头贯通穿刺结扎的盲肠2次。轻轻挤压使少量肠内容物从穿刺孔溢出确保通畅；将处理好的盲肠回纳入腹腔，用5-0缝线缝合内层，3-0缝线缝合外层，将大鼠置于加热垫维持肛温在37±0.5℃。 3.待大鼠苏醒后自由饮水，正常饲养。 4.2d后大鼠水合氯醛钠麻醉后，于腹主动脉取血5ml，室温静止2h，4℃离心机3000r/min离心10min，分离出上层血清，置-80℃冰箱保存备用。处死大
2020脓毒症致心肌损伤模型的研究进展
2020脓毒症致心肌损伤模型的研究进展 摘要 脓毒症致心功能不全是一种危及生命的并发症，也被称为脓毒症心肌病，可以表现为心肌损伤、心功能障碍等，其发病机制尚不明确。目前，脓毒症致心肌损伤的动物模型已经相对成熟，而随着多种心肌细胞株的建立，研究者也构建出多种细胞模型用于该疾病的研究。本文将对脓毒症致心肌损伤的机制，动物及细胞模型的研究进展予以综述，为优化和选择实验模型提供参考依据。 脓毒症是机体对感染的反应失调而引起器官功能障碍的一种致命综合征。脓毒症所致心功能不全是脓毒症患者死亡率上升的主要原因之一，脓毒症导致心肌损伤(sepsis-induced myocardial injury，SIMI)是脓毒症主要表现之一，其发病机制复杂且不明确，临床上亦无统一的诊断标准和特异性疗法。因此，建立SIMI模型来研究发病机制并开发治疗药物显得格外重要。目前，已经建立了多种SIMI的模型，在体动物模型研究已经相对成熟；近年来，离体细胞模型，如原代剥离心肌、心肌细胞系、人多潜能干细胞来源的心肌细胞(cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells，hPSC-CMs)，也逐渐受到大家的关注。本文将对SIMI的机制、模型及其特点进行综述，为优化和选择SIMI模型提供参考依据。 1 SIMI的发病机制
1.1 炎性损伤 脓毒症时，机体通过内源性与外源性的炎症反应造成心肌损伤。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)可以与心肌细胞表达的Toll样受体4(Toll-like receptor 4，TLR 4)结合，导致心肌细胞产生多种促炎因子，如肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)等。同时，机体免疫系统产生的大量炎性细胞因子，通过血液系统到达心脏，内源与外源两方面造成心肌过度炎性损伤[1](图1)。 图1 SIMI的主要机制 1.2 线粒体损伤 线粒体稳态对于心肌细胞功能维持尤为重要，而脓毒症发生时心肌细胞中线粒体分裂、融合失衡及线粒体氧化磷酸化受损，ATP合成减少[2]。
生殖毒性试验流程及意义
啮齿类动物生殖毒性I、II、III段实验流程及意义 1.概述 生殖毒性试验（Reproductive toxicity study）是通过动物试验反映受试物对哺乳动物生殖功能和发育过程的影响，预测其可能产生的对生殖细胞、受孕、妊娠、分娩、哺乳等亲代生殖机能的不良影响，以及对子代胚胎-胎儿发育、出生后发育的不良影响。包括：生育力与早期胚胎发育毒性实验（I段）、胚胎—胎仔发育毒性试验（II段）、围产期毒性试验（III段）。 生殖毒性试验中，为方便实验一般可将一个完整生命周期过程分成以下几个阶段如下图所示： 图1. 动物生命周期划分 A. 从交配前到受孕（成年雄性和雌性生殖功能、配子的发育和成熟、交配行为、受精）。 B. 从受孕到着床（成年雌性生殖功能、着床前发育、着床）。 C. 从着床到硬腭闭合（成年雌性生殖功能、胚胎发育、主要器官形成）。 D. 从硬腭闭合到妊娠终止（成年雌性生殖功能、胎仔发育和生长、器官发育和生长）。 E. 从出生到离乳（成年雌性生殖功能、幼仔对宫外生活的适应性、离乳前发育和生长）。 F. 从离乳到性成熟（离乳后发育和生长、独立生活的适应能力、达到性成熟的情况）。 各段试验研究阶段如下： 生育力与早期胚胎发育毒性实验（I段）：A-B 胚胎—胎仔发育毒性试验（II段）：C-D 围产期毒性试验（III段）：C-F 1一般试验设计简介 1.1受试物 生殖毒性试验的受试物应能充分代表临床研究受试物或上市药品。 1.2实验动物 首选啮齿类动物为大鼠。在胚胎-胎仔发育毒性研究中，一般还需要采用第二种哺乳动物，家兔为优先选用的非啮齿类动物。 1.3给药 1. 3.1计量选择：至少应设三个剂量组，必要时可增加剂量组。
SD 大鼠脓毒血症
大鼠脓毒血症建立方法 SD 大鼠, 体重190～270 g ,雌雄均有, 禁食24 h 后进行实验。用2.5 %戊巴比妥钠按1 ml/ kg 体重, 腹腔注射麻醉大鼠, 随机分为实验组和对照组(假手术组) 。常规消毒腹部, 在下腹部正中央切口, 长约2 cm , 打开腹腔寻找盲肠, 小心分离其远端与大肠的系膜, 盲肠内如有粪便, 则把粪便小心挤向相连的大肠, 实验组在盲肠远端1/ 2 处用无菌4 号丝线紧紧结扎, 并用无菌7 号针头在已结扎盲肠远段中央处贯通穿刺。然后把盲肠推回腹腔, 关闭腹腔, 逐层缝合。对照组仅做开腹分离盲肠远端与大肠的系膜及关腹手术。术后按50 ml/ kg 体重皮下注射生理盐水, 补充手术中丢失的体液, 连续观察24h , 整个实验过程中在室温22～25 ℃环境进行并让大鼠自由饮水。在盲肠结扎前、结扎后8 h、16h、和24h 在无菌条件下取大鼠尾血1 滴进行细胞培养, 实验组还在无菌条件下取腹腔渗出液少许进行细菌培养。 用结扎整个盲肠加穿刺的方法可复制出动物的理想败血症模型, 因为动物模型血液细菌培养阳性, 培养出来的细菌与感染灶细菌完全或部分相同, 动物表现与临床败血症类似, 重复性好, 模型复制后有一定的存活时间供研究之用。有人把结扎整个盲肠改为结扎盲肠1/ 2 , 把穿刺盲肠2 次改为贯通穿刺盲肠, 操作更为简便, 效果也令人满意。 造成盲肠缺血坏死, 自身肠道的细菌进入腹腔造成感染。血液培养显示, 在CL P 后16 h , 血液已有大肠杆菌及绿脓杆菌生成, 与腹腔渗出液细菌培养结果相同; 培养出的菌种与报道略有不同, 这可能是由于大鼠来源及实验室的条件不同造成的。 实验组动物术后24 h 活杀, 见盲肠结扎的远端已发生坏死, 穿刺的针孔明显, 腹腔感染, 有臭味的渗出液,但腹腔未见粪便, 这与人类阑尾穿刺并发腹膜炎等疾病过程相似。大鼠盲肠结扎加穿刺引起的败血症存活情况与结扎盲肠部分的多少, 穿刺针孔的多少和大小有关。针孔多, 针孔大, 死亡率高。上述结扎整个盲肠并用9号针头刺孔2 个, 24 h 有75 %大鼠死亡。有人结扎1/2 盲肠并用7 号贯通穿刺, 24 h 无大鼠死亡。另外,饲养动物环境也是影响动物存活率的重要因素。有人曾在室温30 ℃时, 饲养CL P 大鼠5 只, 结果在24 h内全部死亡。
(完整版)急性毒性试验
试验目的：急性毒性试验是在24小时内给药1次或2次（间隔6-8小时），观察动物接受过量的受试药物所产生的急性中毒反应，为多次反复给药的毒性试验设计剂量、分析毒性作用的主要靶器官、分析人体过量时可能出现的毒性反应、I期临床的剂量选择和观察指标的设计提供参考信息等。 一、啮齿类动物单次给药的毒性试验 （一）试验条件 1.动物品系：常用健康的小鼠、大鼠。选用其他动物应说明原因。年龄一般为7-9周龄。同批试验中，小鼠或大鼠的初始体重不应超过或低于所用动物平均体重的20%.实验前至少驯养观察1周，记录动物的行为活动、饮食、体重及精神状况。 2.饲养管理：动物饲料应符合动物的营养标准。若用自己配制的饲料，应提供配方及营养成分含量的检测报告；若是购买的饲料，应注明生产单位。应写明动物饲养室内环境因素的控制情况。 3.受试药物：应注明受试药物的名称、批号、来源、纯度、保存条件及配制方法。 （二）试验方法： 由于受试药物的化学结构、活性成分的含量、药理、毒理学特点各异，毒性也不同，有的很难观察到毒性反应，实验者可根据受试药物的特点，由下列几种实验方法中选择一种进行急性毒性试验。 1.伴随测定半数致死量（LD50）的急性毒性试验方法。 2.最大耐受剂量（MTD）试验方法：最大耐受剂量，是引起动物出现明显的中毒反应而不产生死亡的剂量。 3.最大受试药物量试验方法：在合理的浓度及合理的容量条件下，用最大的剂量给予实验动物，观察动物的反应。 4.单次口服固定剂量方法（Fixed-dose procedure）。选择5、50、500和2000mg/kg四个固定剂量。 实验动物首选大鼠，给药前禁食6-12小时，给受试药物后再禁食3-4小时。如无资料证明雄性动物对受药试物更敏感，首先用雌性动物进行预试。根据受试药物的有关资料，由上述四个剂量中选择一个作初始剂量，若无有关资料作参考，可用500mg/kg作初始剂量进行预试，如无毒性反应，则用2000mg/kg 进行预试，此剂量如无死亡发生即可结束预试。如初始剂量出现严重的毒性反应，那就用下一个挡次的剂量进行预试，如该动物存活，就在此两个固定剂量之间选择一个中间剂量试验。每个剂量给一只动物，预试一般不超过5只动物。每个剂量试验之间至少应间隔24小时。给受试药物后的观察期至少7天，如动物的毒性反应到第7天仍然存在，尚应继续再观察7天。 在上述预试的基础上进行正式试验。每个剂量最少用10只动物，雌雄各半。根据预试的结果，由前面所述的四种剂量中选择出可能产生明显毒性但又不引起死亡的剂量；如预试结果表明，50mg/kg引起死亡，则降低一个剂量档次试验。
生殖毒性及其评定
第二节生殖毒性及其评定 一、生殖毒性表现 外来化合物对生殖过程的损害作用可以表现为性淡漠、性无能或各种形式的性功能减退。雌性可出现排卵规律改变、月经失调或闭经、卵巢萎缩、受孕减少、胚胎死亡、生殖力降低、不孕或不育等。雄性可表现为睾丸萎缩或坏死、精子数目减少等。 二、生殖毒性作用的评定 外来化合物对生殖过程作用的评定主要通过生殖毒性试验来进行，过去也称为繁殖试验。生殖毒性试验可以全面反映外来化合物对性腺功能、发情周期、交配行为、受孕、妊娠过程、分娩、授乳以及幼仔断奶后生长发育可能发生的影响。评定的主要依据是交配后母体受孕情况（受孕率）、妊娠过程情况（正常妊娠率）、子代动物分娩出生情况（出生存活率）、授乳哺育情况（哺育成活率）以及断奶后发育情况等。此外还可同时观察出生幼仔是否有畸形出现，但畸形观察主要在发育毒性评定中进行。 （一）试验方法原则 生殖毒性试验多用性成熟大鼠，也可用小鼠或家兔。大鼠自然受孕率较小鼠为高，较为理想。 一般设三个剂量组，另设对照组。最高剂量组剂量应该超过预期人类实际接触水平，希望能使亲代动物出现轻度中毒，但不出现死亡或死亡率不超过10%，也不能完全丧失生育能力。低剂量组的亲代动物不应观察到任何中毒症状。另设中间剂量组应仅能出现极为轻微的中毒症状。中间剂量与高剂量和低剂量应呈等比级数。 最高剂量组轻度中毒的概念是进食量显著减少，体重明显下降。要求最高剂量组出现轻度中毒的目的是表明在已能引起中毒剂量下，如仍不致影响正常生殖过程，则表示该受试物确实不具有生殖毒性作用。反之，如剂量过低，则难于确定受试物是否确实不具有生殖毒性，有可能因剂量不足，未达到最小有作用剂量。 剂量的确定可用少数动物进行预试，如已进行过亚慢性和急性毒性试验，则最高剂量也可略高于亚慢性毒性试验中最大无作用剂量，或相当于LD50的1/10左右。最低剂量可相当于最高剂量的1/30。如经多次试验确实证实1 000mg／kg体重剂量对生育力无损害作用，或最高剂量可引起亲代动物表现一般毒性作用，但对生育力无不利影响，则可不进行其它剂量试验。
脓毒症动物模型的选择与评价
脓毒症（Ｓｅｐｓｉｓ）作为急危重症领域的棘手难题，日益引起临床医师及科研工作者的关注。近十年来，现代生物科技的飞速发展极大地促进了人们对脓毒症发病机制的认识，并推动了脓毒症治疗措施的改进和更新。其中，脓毒症动物模型的应用对此起到了十分重要的作用。脓毒症动物模型的不断发展也反映了人们对脓毒症本质的认识正在逐渐深入，总结和分析现有动物模型，对于如何建立更贴近临床实际的脓毒症动物模型、合理设计实验以及准确解释动物实验数据都具有重要意义。 １ 应用脓毒症动物模型的意义 在过去的几年中，人们对感染后炎症反应分子机制的研究已取得显著进展，其中很大部分是利用体外观察的方法对细胞生理学研究的成果。应明确的是，尽管体外实验的手段先进而且方便，但要更好地了解脓毒症时体内炎症反应的发生、发展过程和其他病理生理变化，还需采用临床相关的脓毒症或脓毒性休克动物模型进行深入的探讨。 一般认为，利用动物模型进行脓毒症研究具有以下优点。 １．１ 在进行具有高度创伤性的操作或进行器官离体实验时只能使用动物模型。特别是在研究脓毒症的病理生理变化时通常需要采集组织标本（如肝、肺、肾等），而这些标本很难从临床获得。只有利用动物模型才可能方便地采取脓毒症各个阶段的组织标本。 １．２ 临床脓毒症病因较复杂，难以判断其确切的发病时间。很多患者还伴有其他严重的非相关疾病。并且，临床的脓毒症患者通常接受多种支持治疗，这些治疗不可避免地会影响对脓毒症自然病程的观察。因此，直接探讨人类脓毒症的病理生理机制相当困难，而采用动物模型进行实验则可免受上述因素的干扰。 １．３ 由于临床脓毒症患者的遗传学背景非常复杂，加之患者年龄、性别、同时存在的其他疾病以及支持治疗等因素均可导致临床资料的高度变异性。而要控制这种变异只能靠加大样本量，这无疑将会耗费更多的时间并给临床脓毒症试验带来很大的经济压力。由于动物模型的生物学差异较人类要小，因此所需的样本量也明显少于临床观察。 １．４ 在探讨脓毒症的发病机制时经常要使用一些药物或试剂（如某种细胞因子的抗体或拮抗剂等），这些制剂可能具有毒性或未经过临床的安全性检验不能用于人体。因此，只有采用动物模型才能方便地利用这些制剂来了解脓毒症发病的分子机制。除此之外，应用脓毒症的动物实验模型还可对药物进行临床试验前的筛选。 由此可见，在探索脓毒症发生、发展机制的过程中，选择适宜的脓毒症或脓毒性休克动物模型进行体内研究仍具有不可替代的地位。 ２ 脓毒症动物模型的选择及其局限性 大量的临床及实验研究资料表明，尽管在过去十几年中有关脓毒症发病机制的认识已取得较大进展，但对于脓毒症治疗和新药开发方面的研究却不容乐观。许多新的干预脓毒症制剂虽然在动物实验中表现出很好的应用前景，但其在临床ＩＩ期和ＩＩＩ期试验中均未取得显著的临床疗效，甚至反而加重疾病的程度。迄今为止，严重脓毒症或脓毒性休克的死亡率仍高达５０％左右。造成这一现象的重要原因之一即是在药物应用于临床前的动物实验观察中所 脓毒症动物模型的选择与评价 姚咏明（解放军总医院野战外科研究所 解放军总医院第一附属医院全军烧伤研究所，北京，１０００３７） ＹＡＯ Ｙｏｎｇ－ｍｉｎｇ 作者简介 姚咏明（１９６５－），男，湖 北人，医学博士后，教 授，博士生导师。主要从 事创伤休克、脓毒症和 多器官功能障碍综合征 发病机制及防治的研究。 现任解放军总医院野战 外科研究所副所长、中 国微生物学会微生物毒 素分会副主任委员、中 国中西医结合急救医学 分会常委、中国灾害防 御协会救援医学会常务 理事等职。
长期毒性实验
长期毒性试验操作规程 1.目的： 观察连续重复给予受试物对动物所产生的毒性反应，首先出现的症状和严重程度，毒副反应的靶器官及其恢复和发展情况。确定无毒反应剂量，为拟定人用安全剂量提供参考。 2. 动物和材料： 2.1动物 一类新药首选Beagle犬和猴类，应写明供应单位。根据试验周期的长短，一般选择性成熟青年动物为受试动物。二、三、四类新药要求放松一些，但要根据实际情况选择合适的实验动物。 实验前大动物应检测心电，并做血液学和血液生化学分析，指标在正常范围内的动物，方可作为受试动物。 小动物分组方式通常采用随机分组，雌雄各半。大动物通常每组动物4-6只，雌（无孕）雄各半，随机分组。 2.2 受试物和实验室 3.试验方法 3.1 剂量和分组 3.1.1 一般设2-3个剂量组，一类新药应设三个剂量组和一个对照组。剂量一般用g（或mg）/kg或单位/kg表示。低剂量组略高于临床试验人用日最高剂量或按体表面积折算的动物药效学有效剂量。低剂量组不应出现毒性反应。高剂量组原则上应产生明显或严重的毒性反应或个别动物死亡。在高、低两个剂量之间按等比关系再设置一个中剂量。 3.1.2 对照组不给受试物仅给等容量的溶媒或赋形剂。如这些成分可能有毒性时，应另设一组对照组。 限度试验：如果经小鼠急性毒性口服给药剂量大于5g/kg或注射给药剂量大于2g/kg仍不出现毒性反应和死亡或仅个别动物有毒性反应时，可考虑只作一个高于临床拟用剂量50倍的剂量。 3.2 给药途径与方法 3.2.1 给药应与临床用药途径一致。 3.2.2 口服药途径每天于喂食前定时给予。若将受试物混在饲料、水中给予，每动物应分笼饲养，并采取严格有效措施，以保证每只动物按量在一定时限内服完。 3.2.3 经静脉、肌肉或皮下途径，其注射部位可于四肢或臀部等处交替进行。 3.2.4 受试物最好是每周7天连续给予，如试验周期在90天以上，可考虑每周给药6天，每天定时给药。每周可根据体重情况调整给药量，按等容量不等浓度配制药物。 4 试验周期 4.1 长毒试验的给药时间为临床试验用药期的二-三倍，最长半年。 4.2 三、四类新药均符合法定标准；可先做大鼠长期毒性试验。如无明显毒性反应可免做大动物如Beagle犬与猴类等的长期毒性试验。 5. 检查项目 5.1 一般观察：如行为活动、恶心呕吐、流涎、粪便及体重变化情况等。 5.2 检测项目： 5.2.1 心电检查（必要时做）： 5.2.2血液学指标：红细胞或网织红细胞计数、血红蛋白、白细胞计数及其分类、血小板计数、凝血时间。 5.2.3 血液生化学：天门冬氨酸氨基转换酶（AST）、丙氨酸氨基转换酶（ALT）、碱性磷酸酶（ALP）、肌酐（Crea）、尿素氮（BUN）、总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、血糖（GLU）、