双光子荧光显微镜的原理特点

双光子荧光显微镜的原理特点

双光子荧光显微镜是结合了激光扫描共聚焦显微镜和双光子激发技术的一种新技术。

双光子激发的基本原理是：

在高光子密度的情况下，荧光分子可以同时吸收2个长波长的光子，在经过一个很短的所谓激发态寿命的时间后，发射出一个波长较短的光子;其效果和使用一个波长为长波长一半的光子去激发荧光分子是相同的。

双光子激发需要很高的光子密度，为了不损伤细胞，双光子显微镜使用高能量锁模脉冲激光器。

这种激光器发出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脉冲宽度只有100飞秒，而其周期可以达到80至100兆赫。

在使用高数值孔径的物镜将脉冲激光的光子聚焦时，物镜的焦点处的光子密度是的，双光子激发只发生在物镜的焦点上，所以双光子显微镜不需要共聚焦针孔，提高了荧光检测效率。

为形态学、分子细胞生物学、神经科学、和药理学等研究领域中重要的研究手段。

1.双光子显微镜出现的背景----传统激光共聚焦显微镜的两大局限:

1)一是光毒性现象：

因为共聚焦的针孔必须足够小以获得高分辨率的图像，而孔径小又会挡掉很大部分从样品发出的荧光，包括从焦平面发出的荧光，相应的，激发光必须足够强以获得

足够的信噪比;

而高强度的激光会使荧光染料在连续扫描过程中迅速褪色，荧光信号会随着扫描进程度进行变得越来越弱。

2)光毒作用是另外一个问题，在激光照射下，许多荧光染料分子会产生诸如单态氧或自由基等细胞毒素，所以实验中要限制扫描时间和激发光的光功率密度以保持样品的活性。

在针对活性样品的研究中，尤其是活性样品生长、发育过程的各个阶段，光漂白和光毒现象使这些研究受到很大的限制。

2.为什么说双光子显微镜一般不需要配备紫外激发激光器?

双光子显微镜技术是建立在双光子激发效应的基础上的一种荧光激发技术：荧光染料分子可以同时吸收低能量的两个光子而被激发(两个光子到达荧光分子的时间间隔小于1飞秒)，其激发效果可以等同于吸收一个1/2波长的高能量光子。

例如，吸收两个红色波长的光子，相当于一个吸收紫外的分子。长波长的光子不易被细胞吸收，因此对活细胞的光毒性减少，也降低了光漂白。这样即起到紫外激发的功能，又避免了紫外光线对样品的伤害。

3.双光子显微镜的激光器有何特别之处?

双光子吸收几率依赖于两个入射光子在空间和时间上的重合程度(两个光子必须在10-18秒内到达)。双光子吸收截面很小，只有在具有很大光子流量的区域的荧光团才会被激发。

因此所用激光器多为钛宝石激光器，可以达到皮秒或者飞秒级的扫描速度，且具有非常高的峰值功率和较低的平均功率，从而可以减小或者消除光漂白和光毒作用。

主要的是在一个很小的范围提供非常高密度的光子，可以保证双光子的同时激发。

4.双光子激发的优点是什么?

1)增加了染料的选择性：共聚焦系统的激光器(Ar,Ar/Kr,HeNe)的激发光范围在488nm-647nm

这就意味着想用紫外激发荧光染料的实验进行，例如使用DAPI,Hoescht

而双光子的激发波长是单光子的两倍，所以紫外激发的染料能被近红外光激发。

2)减少光漂白：因为光漂白减少的减少使得用CFP/YFP做荧光共振能量转移(FRET)的实验的成功率提高。

3)无需特殊的物镜：从硬件的角度出发，用近红外光的波长激发紫外激发染料不需要特殊的紫外光学组件。

4)提高信噪比：激发光波长和发射光波长具有很大的差别，提高了信噪比。

5)漂白局限于焦点处：

因为荧光激发只发生在物镜的焦点上，所以就不需要共聚焦针孔了。这样提高了光的检测，而且光漂白只发生在焦点上。

6)更容易穿透标本：红外波长的光不易被细胞散射，能穿透更深的标本。

5.相对于激光扫描共聚焦显微镜，双光子显微镜做的改进是什么?

1)减少了光漂白。

2)减少了光毒性。

双光子探针原理

我今天讲解的文献题目是对生物组织中过氧化氢进行比率成像的一种双光子荧光探针。 背景知识：过氧化氢是活性氧族中的重要一员，活性氧族包括（超氧阴离子自由基、过氧氢自由基、羟基自由基、过氧自由基、单线态氧、次氯酸等）在生物组织的生理衰老及病理方面有着重要的作用。但是超过细胞正常水平的过氧化氢会引起DNA损伤、突变以及遗传的不稳定性。 1.与其他探针作比较：主要讲了采用硼酸盐机理保护的探针对过氧化氢具有较高的选择性，并在细胞中稳定成像，但是这些探针大多用于单光子显微镜并要求短波长激发，以上这些都限制了它在深入组织中的成像的应用。 与单光子探针比较。双光子显微镜比单光子显微镜具有穿透力强、定位激发以及延长观察时间等大量优点而在检测活细胞组织中的过氧化氢方面具有很好的应用前景。 2.探针设计要求：对过氧化氢高效的双光子探针应具有以下特点：在水溶液缓冲剂中具有足够大的溶解性、对过氧化氢具有较高的选择性、有较高的双光子活性横截面和在生物PH范围内有较稳定的光谱性质。 探针的合成：通过过氧萘引入含有硼酸基的氨基甲酸酯合成了AN1。与过氧化氢相连的硼酸盐与缺电子的氨基甲酸酯分离会得到富电的AN1，引起更多红移荧光散射。并在模拟生理环境下表征它的光学特性以及AN1的光学特性，而且PN1相对AN1发生了50nm的蓝移。AN1相对PN1有较大的位移是因为更稳定的电荷转移激发前荧光团的形态包括给电子基和吸电子基。 荧光性能测定：PN1与过氧化氢的反应主要通过发射荧光和液相色谱-质谱仪检测，产物AN1是主要的荧光物。 其他性能测定：1然后我们估测PN1在双光子模式下对过氧化氢的探测能力。 2PN1要比其他活性氧类对过氧化氢有更高的选择性。 2接下来力图利用PN1做双光子探针来检测细胞环境里过氧化氢含量的变化。 为了进一步建立PN1在生物成像领域的应用，我们也做了这个新探针在检测活的组织中过氧化氢含量变化的能力。 结论：最后我们得出结论，我们研究的这种新型双光子探针PN1具有大的荧光活性面、对过氧化氢有一个很明显的有蓝变绿的一个颜色变化过程、对活性氧类具有较好的选择性、低细胞毒性、对生物活性体内PH的变化不敏感等优点。这个新的探针可以对活细胞以及活组织中的过氧化氢深度范围成像而不受其他生物活性氧类的干扰。当前的努力主要是利用PN1以及对过氧化氢在复杂生物样本内的荧光成像化学过程的研究。

荧光显微镜原理

各位老师、同学： 按照上次组会的安排，今天下午我将结合荧光分析仪向大家简单的介绍一下荧光的原理和具体的实际操作过程，时间安排在下午3:30（京时），地点在510（荧光室，我会提前约好拿到钥匙），相关内容大概如下： 1.荧光的基本原理 2.实际的操作过程 3.几个常见的问题： a.如何选择合适的激发波长？ b.狭缝宽度是如何确定的？ c.荧光量子产率测试的一般流程 请有兴趣的师生按时参加。 荧光显微镜原理及应用 (一)荧光显微镜的原理和结构特点：荧光显微镜是利用一个高发光效率的点光源，经过滤色系统发出一定波长的光(如紫外光3650入或紫蓝光4200入)作为激发光、激发标本内的荧光物质发射出各种不同颜色的荧光后，再通过物镜和目镜的放大进行观察。这样在强烈的对衬背景下，即使荧光很微弱也易辨认，敏感性高，主要用于细胞结构和功能以及化学成分等的研究。荧光显微镜的基本构造是由普通光学显微镜加上一些附件(如荧光光源、激发滤片、双色束分离器和阻断滤片等)的基础上组成的。荧光光源——般采用超高压汞灯(50一

200W)，它可发出各种波长的光，但每种荧光物质都有一个产生最强荧光的激发光波长，所以需加用激发滤片（一般有紫外、紫色、蓝色和绿色激发滤片），仅使一定波长的激发光透过照射到标本上，而将其他光都吸收掉。每种物质被激发光照射后，在极短时间内发射出较照射波长更长的可见荧光。荧光具有专一性，一般都比激发光弱，为能观察到专一的荧光，在物镜后面需加阻断(或压制)滤光片。它的作用有二：一是吸收和阻挡激发光进入目镜、以免于扰荧光和损伤眼睛，二是选择并让特异的荧光透过，表现出专一的荧光色彩。两种滤光片必须选择配合使用。 荧光显微镜就其光路来分有两种： 1．透射式荧光显微镜: 激发光源是通过聚光镜穿过标本材料来激发荧光的。常用暗视野集光器，也可用普通集光器，调节反光镜使激发光转射和旁射到标本上．这是比较旧式的荧光显微镜。其优点是低倍镜时荧光强，而缺点是随放大倍数增加其荧光减弱．所以对观察较大的标本材料较好。 2．落射式荧光显微镜这是近代发展起来的新式荧光显微镜，与上不同处是激发光从物镜向下落射到标本表面，即用同一物镜作为照明聚光器和收集荧光的物镜。光路中需加上一个双色束分离器，它与光铀呈45。角，激发光被反射到物镜中，并聚集在样品上，样品所产生的荧光以及由物镜透镜表面、盖玻片表面反射的激发光同时进入物镜，反回到双色束分离器，使激发光和荧光分开，残余激发光再被阻断滤片吸收。如换用不同的激发滤片／双色束分离器／阻断滤片的组

双光子显微成像

创新助手报告——主题分析报告 创新助手平台提供 北京万方软件股份有限公司 2014-07-10

报告目录 报告核心要素......................................................................................................... I 一、主题简介 (1) 二、主题相关科研产出总体分析 (1) 2.1 文献总体产出统计 (1) 2.2 学术关注趋势分析 (2) 三、主题相关科技论文产出分析 (2) 3.1 中文期刊论文 (2) 3.1.1 近十年中文期刊论文分布列表 (2) 3.1.2 中文期刊论文增长趋势 (3) 3.1.3 发文较多期刊 (4) 3.1.4 发文较多的机构 (4) 3.1.5 发文较多的人物 (4) 3.1.6 核心期刊分布数量对比 (4) 3.1.7最近相关中文期刊论文 (5) 3.1.8被引较多的相关期刊论文 (6) 3.2 学位论文 (7) 3.2.1 近十年学位论文年代分布列表 (7) 3.2.2 学位论文增长趋势 (8) 3.2.3 硕博学位论文数量对比 (8) 3.2.4 发文较多的机构 (9) 3.2.5 发文较多的人物 (9) 3.2.6 最近相关学位论文 (9) 3.3 中文会议论文 (10) 3.3.1 近十年中文会议论文年代分布列表 (10) 3.3.2 中文会议论文增长趋势 (10) 3.3.3 中文会议论文主办单位分布 (11) 3.3.4 发文较多的机构 (11) 3.3.5发文较多的人物 (11) 3.3.6最近相关中文会议论文 (12) 3.4 外文期刊论文 (12) 3.4.1 近十年外文期刊论文年代分布列表 (12) 3.4.2 外文期刊论文增长趋势 (13) 3.4.3 最近相关外文期刊论文 (13) 3.5 外文会议论文 (13) I

浅析光学显微镜机械结构设计

浅析光学显微镜机械结构设计 发表时间：2019-04-28T09:29:27.077Z 来源：《基层建设》2019年第6期作者：朱濛1 陈振波2 孔欢3 王鹏程4 姚新科5 [导读] 摘要：光学显微镜（Optical Microscope，简写OM）是利用光学原理，把人眼所不能分辨的微小物体放大成像，以供人们提取微细结构信息的光学仪器。 1、南京工程学院电力工程学院 21167； 2、南京工程学院机械工程学院 21167； 3、南京工程学院电力工程学院 21167； 4、南京工程学院建筑工程学院 21167； 5、南京工程学院自动化学院 21167 摘要：光学显微镜（Optical Microscope，简写OM）是利用光学原理，把人眼所不能分辨的微小物体放大成像，以供人们提取微细结构信息的光学仪器。光学显微镜的使用范围非常的广泛，发展至今，也衍生出了非常多的类型，本文结合光学显微镜的结构组成，从人体工程视角探索光学显微镜的机械结构设计，从使用的安全性、科学性、可靠性的角度分析了光学显微镜的机械结构设计的规范和标准。 关键词：光学显微镜；机械结构；人体工程学 光学显微镜的结构主要有光学结构和机械结构组成，机械结构的部分不仅能对光学结构有很好的固定作用，还起着关键性的调节作用，机械结构能够发挥光学系统的最大功效，辅助光学系统完成相关的显微镜观察工作。光学显微镜的机械结构的部分主要在载物台、物镜转换器以及调焦装置等，这些机械结构的设计不仅要遵循基本的机械结构设计原则，还要保证在光学显微镜中的具体的光学操作，除此之外，设计的原则还要迎合人体操作的需求，使得光学显微镜的机械结构更加的吻合人体工程学的设计要求，使得光学显微镜使用更加的舒适方便。 一、光学显微镜的基本构造 对于光学显微镜的机械设计，我们首先要了解光学显微镜的构造组成部分，而且还要知道这些零部件的作用，只有熟知了这些零部件的作用和使用规范，我们才能更加合理的设计光学显微镜的机械结构部分，光学显微镜一般是由载物台、聚光照明系统、物镜，目镜和调焦机构组成。载物台的作用是放置被观察的物体，使用调焦旋钮来驱动调焦机构能完成对载物台的调节工作。聚光灯照明系统由聚光灯和光源组成，聚光灯的作用能够让光更多的聚集到被观察的部位。物镜距离载物台比较近，是第一级的放大装置。目镜则是于人眼靠近的第二级放大镜头。 这三部分是光学显微镜的重要组成部分，构成了光学显微镜的主要工作原理。 那么机械装置有哪些呢？一般光学显微镜的机械装置有镜座、镜臂、载物台、镜筒、物镜转换器、与调焦装置。这些机械装置的主要作用是固定和调节光学镜头，调节标本的位置等。其中镜座是支撑整个显微镜的装置，而镜臂则用来支撑精通和载物台。 二、基于人体工程学的光学显微镜的机械结构设计 人体工程学的设计原理主要是考虑到人体结构和机械结构尺寸，并且综合考虑到人们劳动、工作效果、工作效能等方面，利用系统工程、控制理论、统计学的原理设计出一系列的设计方法。具体到光学显微镜的机械结构设计中，我们就要考虑到人们的身体尺寸和应用习惯，首先我们从有关部分获得了我国成年人的人体部分尺寸的表格（表-1），以此为根据设计光学显微镜结构部分。 1、载物台的设计 从上面的介绍中我们知道，载物台的作用是用来放置被观察物体的，并且式样能够在载物台上自由的移动，以获取最佳的观察效果。一般的移动范围是30mm*70mm和50mm*70mm，主要的设计标准就是，载物台距离工作底面的距离于载物台和人体的水平距离，分别设为B1和B2，考虑到人在调节使用载物台的过程中的行为习惯，得出计算式。 其中y1和y2分别衣着修正指数和身体活动余量修正。同理得出B2的表达式。经过计算得出： B1=307～357mm B2=301～348mm 2、调焦机构设计 调焦机构用于调节光学结构以便于观察人员获取最佳的成像效果，调焦的动作主要包括了上下移动和粗微调节机构，如何合理的设计能够使得人在调焦的过程中更加的舒适和便捷。首先是调焦旋钮的位置，在具体的使用过程中，显微镜是放在工作台上的，我们无法获取具体的使用高度和姿势，所以我们只能将人体的上身活动分为三个维度的多个不同程度的拆解动作，分别为手肘在X、Y、Z轴上的旋转方向，并在matlab的环境下运行得出，人体的手臂舒适度域： 为了适应大多数人的使用习惯，我们从95百分位这一阶段的数据为设计的参考点，确定出调焦按钮的最佳设计尺寸，从而确定调焦按钮在光学显微镜中的位置。其次是调焦按钮的外形和尺寸，旋钮的截面形状对于人手的握持方式有着一定的影响，当旋钮和手掌的接触面积越大的时候，人手的贴合的程度越好，那么使用的手感就越好，但是太大了会让人手在长期的握持中增加疲劳感，所以对于旋钮的直径设计要求为。旋钮的直径设计保持在35mm-75mm之间，厚度的大小在20mm-50mm范围内波动。最后是旋钮的扭矩M，扭矩的大小设计也非常的重要，太大了会使握持不舒服，太小的话又不利于调焦的准确，由于人类的手部关节的操作力范围为12N-18N，根据人体工程学的计算方法得出M的大小为： 除了基本的形态和尺寸设计，我们还要考虑到载物台移动过程中的摩擦力设计，太小的摩擦力会让调节过程难以掌握精确度，阻力太大的话会增加人使用的机体劳累，所以适当的摩擦力设计也是机械结构设计中需要考虑的内容。 3、物镜转换器的设计 物镜转换器是迅速切换物镜的机械装置，有内定位和外定位两种，转换器的设计直接影响了成像的质量，根据人体工程学的原理，内定位型的转换器比较能够减轻操作的负担，同时还能节省操作台的空间，所以很多光学显微镜的采用内定位转换器，其设计也非常的满足心理学和生理学的设计要求。 结语 本文通过对光学显微镜的主要结构做了介绍，并对光学显微镜的机械部分的功能做了相应的阐述，利用人体工程学的设计理论，对光学显微镜的机械结构部分作出了具体的设计标准的研究，是符合我国当前光学显微镜制造标准的。 参考文献： [1]史红伟，石要武，杨爽等.光学显微镜自动调焦指导函数的评价与选择[J].计算机辅助设计与图形学学报，2013，25（2）：235-24

【CN209946009U】光学相干层析和双光子荧光同步成像系统【专利】

(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)实用新型专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201920375721.9 (22)申请日 2019.03.22 (73)专利权人 中国科学院苏州生物医学工程技 术研究所 地址 215163 江苏省苏州市高新区科技城 科灵路88号 (72)发明人 徐欣　高峰　张欣　金幸杰　 (74)专利代理机构 北京远大卓悦知识产权代理 事务所(普通合伙) 11369 代理人 韩飞 (51)Int.Cl. G01N 21/64(2006.01) (ESM)同样的发明创造已同日申请发明专利 (54)实用新型名称 光学相干层析和双光子荧光同步成像系统 (57)摘要 本实用新型公开了一种光学相干层析和双 光子荧光同步成像系统，包括双光子光源、快轴 扫描模块、慢轴扫描模块、第一二向色镜、共用扫 描模块、光学相干层析模块、第二二向色镜、双光 子荧光成像模块以及成像显微物镜。本实用新型 的光学相干层析和双光子荧光同步成像系统，通 过将双光子扫描成像技术和光学相干层析成像 技术相结合，采用共光路共振镜同步扫描成像方 法有效减少了系统硬件，实现了光学相干层析技 术和双光子荧光扫描成像扫描速度的有效利用， 达到了样品荧光快速面成像和断层成像的目的。权利要求书2页 说明书6页 附图2页CN 209946009 U 2020.01.14 C N 209946009 U

权　利　要　求　书1/2页CN 209946009 U 1.一种光学相干层析和双光子荧光同步成像系统，其特征在于，包括双光子光源、快轴扫描模块、慢轴扫描模块、第一二向色镜、共用扫描模块、光学相干层析模块、第二二向色镜、双光子荧光成像模块以及成像显微物镜； 所述光学相干层析模块中发出的样品光经过所述慢轴扫描模块后透射所述第一二向色镜，所述双光子光源发出的飞秒激光经过所述快轴扫描模块后被所述第一二向色镜反射，与透射所述第一二向色镜的样品光相结合，共同经过所述共用扫描模块后透射所述二向色镜，再经过所述成像显微物镜后照射到样品上；飞秒激光激发样品产生的荧光经所述成像显微物镜后被所述第二二向色镜反射至所述双光子荧光成像模块进行荧光成像，样品光照射到样品上被反射形成的成像光沿原路返回，依次经所述成像显微物镜、透射第二二向色镜、共用扫描模块、透射第一二向色镜、慢轴扫描模块后进入所述光学相干层析模块进行层析成像。 2.根据权利要求1所述的光学相干层析和双光子荧光同步成像系统，其特征在于，所述双光子荧光成像模块包括沿光路依次设置的成像聚焦透镜、滤光片和探测器，样品被激发后发出的荧光经所述第二二向色镜反射后，依次经所述成像聚焦透镜、滤光片后由所述探测器接收，进行荧光成像。 3.根据权利要求2所述的光学相干层析和双光子荧光同步成像系统，其特征在于，所述快轴扫描模块包括快轴扫描振镜和快轴聚焦透镜，所述慢轴扫描模块包括慢轴扫描振镜和慢轴聚焦透镜。 4.根据权利要求3所述的光学相干层析和双光子荧光同步成像系统，其特征在于，所述共用扫描模块包括依次设置的共用扫描振镜、共用聚焦透镜和中继透镜组。 5.根据权利要求4所述的光学相干层析和双光子荧光同步成像系统，其特征在于，所述快轴扫描振镜的扫描轴方向与共用扫描振镜的扫描方向相互垂直，且所述快轴扫描振镜的扫描轴分别与所述双光子光源发出光的光轴以及快轴聚焦透镜的光轴垂直； 所述慢轴扫描振镜的扫描轴方向与快轴扫描振镜的扫描方向相互平行，且所述慢轴扫描振镜的扫描轴分别与所述光学相干层析模块发出光的光轴方向以及慢轴聚焦透镜的光轴垂直； 所述共用扫描振镜与所述快轴扫描振镜的扫描方向相互垂直，且所述共用扫描振镜的扫描轴分别与所述共用聚焦透镜、中继透镜组的光轴垂直。 6.根据权利要求5所述的光学相干层析和双光子荧光同步成像系统，其特征在于，所述慢轴聚焦透镜和共用聚焦透镜构成4f系统，所述慢轴扫描振镜和共用扫描振镜位于4f系统的透镜焦点位置；所述快轴聚焦透镜和共用聚焦透镜构成4f系统，所述快轴扫描振镜和共用扫描振镜位于4f系统的透镜焦点位置。 7.根据权利要求1所述的光学相干层析和双光子荧光同步成像系统，其特征在于，所述光学相干层析模块包括谱域光学相干层析系统或者扫频源光学相干层析系统。 8.根据权利要求1所述的光学相干层析和双光子荧光同步成像系统，其特征在于，所述第一二向色镜截止波长为900nm，长波反，短波通，其透射所述光学相干层析模块发出的样品光以及样品反射的成像光均，且反射所述双光子光源发出的飞秒激光。 9.根据权利要求1所述的光学相干层析和双光子荧光同步成像系统，其特征在于，所述第二二向色镜截止波长为650nm，长波通，短波反，其透射所述双光子光源发出的飞秒激光、 2

光学显微镜的发展历史

光学显微镜的发展历史、现状与趋势 杨拓拓 (苏州大学现代光学技术研究所，江苏苏州215000) 1基本原理 显微镜成像原理及视角放大率 显微镜由物镜和目镜组成。物体AB 在物镜前焦面稍前处，经物镜成放大、倒立的实像A'B'，它位于目镜前焦面或稍后处，经目镜成放大的虚像，该像位于无穷远或明视距离处。 图1-1显微镜系统光路图 牛顿放大率公式： f f x x ''= 'x 是像点到像方焦点的距离，x 是物点到物方焦点的距离。 根据牛顿放大率公式可得物镜的垂轴放大率为 '1'1'11--f f x ?== β 目镜的视觉放大率为： '22250 f =Γ 组合系统的放大率为 '1f

'2'121250f f ? -=Γ=Γβ 显微镜系统的像方焦距 ?-=/'2'1'f f f '250 f = Γ 显微镜系统成倒像轴向放大率 '2'1'2'1/f f x x =β 若物点A 沿光轴移动很小的距离，则通过显微镜系统的像点'2A 将移动很大的距离，且移动 方向相同。 显微系统的角放大率 '2'1'2'1/x x f f =γ 即入射于物镜为大孔径光束，而由目镜射出为小孔径光束。 显微镜的孔径光阑 单组低倍显微物镜，镜框是孔径光阑。 复杂物镜一般以最后一组透镜的镜框作为孔径光阑。 对于测量显微镜，孔阑在物镜的象方焦面上，构成物方远心光路。 显微镜的视场光阑和视场 在显微物镜的象平面上设置了视场光阑来限制视场。由于显微物镜的视场很小，而且要求象面上有均匀的照度，故不设渐晕光阑。 显微镜是小视场大孔径成像，为获得大孔径并保证轴上点成像质量，显微镜线视场不超过物镜的1/20,线视场要求： 1'120202β?=≤f y

激光共聚焦显微镜技术1讲解

激光共聚焦显微镜技术 The techniques and applications of Confocal Laser Scanning Microscopy 激光共聚焦显微镜(LSCM)的发展简史 1957年，Marvin Minsky提出了共聚焦显微镜技术的某些基本原理，获得了美国的专利。1978年，阿姆斯特丹大学的G.J.Brakenhoff首次展示了改善了分辨率的共焦显微镜。 1985年，Wijnaendtsvan Resandt推出了第一台对荧光标记的材料进行光切的共焦显微镜 激光共聚焦显微镜(LSCM)的发展简史 ?80年代末，各家公司都推出了商品化的共焦显微镜,英国的Bio-Rad公司的MRC系列，德国Leica公司的TCS系列，Zeiss公司的LSM系列等。 ?近二十年来，从滤片型到光谱型，人们对共焦高分辨率，采集图像快速，技术的改进及应用开发不断进行，出现了很多新的技术。如双光子，FCS,FLIM ,STED等。 共焦显微镜的优点 人眼分辨率：0.2mm 光学显微镜分辨率：0.25μm 电子显微镜分辨率：0.2nm 共焦显微镜分辨率：μm 共焦显微镜的优点 ?电子显微镜的缺陷： 1.只能观察固定样品 2.样品制备过程（固定、包埋、切片）造成的假象 ?荧光显微镜的缺陷: 1.可以观察活细胞或组织，但细胞或组织内结构高度重叠。 2.荧光具有强散射性，造成图像实际清晰度的大大下降。 3.荧光漂白很快，使荧光图像的拍照有困难。 4.如果荧光滤片选配不当，多荧光标记样品图像的采集很困难，且很难抑制光谱交叉。 共焦显微镜的优点 ?共焦显微镜与传统显微镜的区别 1.抑制图像的模糊，获得清晰的图像 激光扫描共焦显微镜技术 ?共焦显微镜与传统显微镜的区别

光学显微镜的原理及构造

光学显微镜的原理及构造显微镜是人类认识物质微观世界的重要工具，是现代科学研究工作不可缺少的仪器之一。显微镜自1666年问世以来已有300多年的历史了，其间随着科学技术不断发展，显微镜的品种不断增加，结构和性能逐步得到完善和提高。 根据不同的使用用途，光学显微镜可分为普通光学显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜、荧光显微镜、倒置显微镜、体视显微镜、偏光显微镜等10多种。目前，世界上许多国家都可以生产光学显微镜，牌名、种类繁杂，其中德国、日本等国制造的显微镜品质、数量占优势，但价格昂贵。 对于现代的光学显微镜，包括各种简单的常规检验用显微镜、万能研究以及万能照相显微镜等，首先要认识其构造及各部件的功能，同时要掌握正确的调试、使用和保养方法，才能在实际应用中面对各种要求时以不同的显微镜检方法，充分发挥显微镜应有的功能，提高常规检验工作效率. 光学显微镜的原理和构造 随着科学技术的发展，显微镜检方法由最传统的明视野、暗视野发展出了相差法、偏光方法；荧光方法也由透射光激发进展为落射光激发，使荧光效率大为提高；微分干涉相衬方法基于偏光方法，而巧妙地利用了微分干涉棱镜，使之能应用于医学与生物学的样品，又能应用于金相样品的分析与检验。 下面以德国ZEISS公司生产的Axioplan万能研究用显微镜，简单介绍万能显微镜的基本组成部件。 1. 显微镜主机体（stand）　显微镜的主机体设计成金字塔形，而底座的截面呈T字形，使显微镜的整体相当稳固。显微镜的光学部件和机构调节部件、光源的灯室、显微照相装置、电源变压稳压器等，都可安装在主机体上或主机体内。 2. 显微镜的底座（base）　底座和主机体通常组成一个稳固的整体。底座内通常装有透射光照明光路系统（聚光、集光和反光）部件，光源的滤光片组，粗/微调焦机构，光源的视场光阑也安装在底座上。 3. 透射光光源（tranilluminator）　透射光光源由灯室（lamp housing）、灯座（lamp socket）、卤素灯（halogen lamp）、集光与聚光系统（lamp collector and lamp condenser）及其调整装置组成。 4. 透射光光源与反射光光源的转换开关（toggle switch）　这是新一代AXIO系列显微镜特有的装置，透射光和反射光可通用。当具有透/反两用的配置时，利用这一转换开关能方便而又迅速的使透射光 和反射光互相转换。在纯透射光的配置中，这一开关就改为电源开关。

双光子显微镜的独特优势.

相关技术指标与进口必要性 双光子显微镜的独特优势有以下几点： 1）双光子显微镜采用长波长激发，长波长的光比短波长的光受散射影响较小，容易穿透标本，双光子显微镜的穿透深度通常是共聚焦显微镜的2到3倍。对于皮层较深处神经元的活动观察更加全面。 2）焦平面外的荧光分子不被激发，成像的亮度和信噪比高。更加适合活体 下微弱荧光信号的观察。 3）长波长的近红外光比短波长的光对细胞毒性小，比较适合活细胞长时间的动态观察。 4）使用双光子显微镜观察标本的时候，只有在焦平面上才有光漂白和光毒性。 所以，双光子显微镜比单光子显微镜更适合用来观察厚标本、更适合用来观察活细胞、或用来进行定点光漂白实验。 利用活体双光子显微镜，我们可以对脑科学的几个前沿领域进行更加深入的研究。利用活体双光子显微镜的光遗传学操作能力，我们可以对某类神经元的激活和失活进行高精度的操作，对这些神经元的特殊功能的进行研究。在活体水平下，我们可以对皮层在清醒、静息状态下就存在有组织的脑功能活动进行观察，从而加深我们对大脑在内外环境的监测、情节记忆及自我意识方面的理解。利用活体双光子显微镜的多点光激活能力，我们可以研究多个神经细胞之间的连接和控制，来更好的了解神经信号之间复杂动态的编码过程。目前国内没有同类产品，其他设备在各个技术层面都无法满足我单位要求，为更好的开展神经学研究，故申请购置此套设备。 主要技术指标： 1 显微镜 1.1 适用于活体动物操作的正置显微镜，物镜下自由空间高度≥23 cm； 1.2 显微镜镜体置于XY电动载物台之上，可通过移动显微镜镜体的方式 对样品进行定位和观察； 1.3 显微镜镜体移动通过软件控制，XY方向行程≥35 mm，步进≤100 nm； 1.4 配备长寿命落射荧光光源； 1.5 配备可观察FITC和DsRed的滤色块； 1.6 配备全角度物镜转盘，物镜可旋转、可倾斜，能够以任何角度垂直

典型光学仪器的基本原理

1、光学仪器在国民生产和生活中各个领域广泛应用，绝大多数光学仪器可归纳为望远镜系统、显微镜系统和照明系统三类。 2、人眼构造：人眼本身就相当于一个摄影系统，外表大体呈球形，直径约为25mm，由角膜、瞳孔、房水、睫状体、晶状体和玻璃体等组成的屈光系统相当于成像系统的镜头，起聚焦成像作用。眼睛内的视网膜和大脑的使神经中枢等相当于成像系统的感光底片和控制系统，能够接收外界信号并成像。 3、视度调节：眼睛通过睫状肌的伸缩本能地改变水晶体光焦度的大小以实现对任意距离的物体自动调焦的过程称作眼睛的视度调节。 4、视觉调节：人眼除了随着物体距离的改变而调节晶状体曲率外，还可以在不同的明暗条件下工作，人眼能感受非常大范围的光亮度变化，即眼睛对不同的亮度条件下具有适应的调节能力，这种能力称为眼睛的视觉调节。 5、放大镜定义：放大镜(英文名称：magnifier)：用来观察物体细节的简单目视光学器件，是焦距比眼的明视距离小得多的会聚透镜。物体在人眼视网膜上所成像的大小正比于物对眼所张的角（视角）。 6、视角愈大，像也愈大，愈能分辨物的细节。移近物体可增大视角，但受到眼睛调焦能力的限制。使用放大镜，令其紧靠眼睛，并把物放在它的焦点以内，成一正立虚像。放大镜的作用是放大视角。 7、显微镜：显微镜是由一个透镜或几个透镜的组合构成的一种光学仪器，是人类进入原子时代的标志。主要用于放大微小物体成为人的肉眼所能看到的仪器。显微镜分光学显微镜和电子显微镜：光学显微

镜是在1590年由荷兰的詹森父子所首创。现在的光学显微镜可把物体放大1600倍，分辨的最小极限达0.1微米，国内显微镜机械筒长度一般是160mm。 8、光学显微镜由目镜，物镜，粗准焦螺旋，细准焦螺旋，压片夹，通光孔，遮光器，转换器，反光镜，载物台，镜臂，镜筒，镜座，聚光器，光阑组成。 9、显微镜以显微原理进行分类可分为光学显微镜与电子显微镜。 10、光学显微镜：通常皆由光学部分、照明部分和机械部分组成。无

双光子显微镜

双光子显微镜 https://www.wendangku.net/doc/718073402.html,/view/1428311.htm?fr=ala0_1 双光子荧光显微镜是结合了激光扫描共聚焦显微镜和双光子激发技术的一种新 技术。双光子激发的基本原理是：在高光子密度的情况下，荧光分子可以同时吸收 2 个长波长的光子，在经过一个很短的所谓激发态寿命的时间后，发射出一个波长较短的光子；其效果和使用一个波长为长波长一半的光子去激发荧光分子是相同的。双光子激发需要很高的光子密度，为了不损伤细胞，双光子显微镜使用高能量锁模脉冲激光器。这种激光器发出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脉冲宽度只有100 飞秒，而其周期可以达到80 至100 兆赫。在使用高数值孔径的物镜将脉冲激光的光子聚焦时，物镜的焦点处的光子密度是最高的，双光子激发只发生在物镜的焦点上，所以双光子显微镜不需要共聚焦针孔，提高了荧光检测效率。双光子荧光显微镜有很多优点：1）长波长的光比短波长的光受散射影响较小容易穿透标本；2）焦平面外的荧光分子不被激发使较多的激发光可以到达焦平面，使激发光可以穿透更深的标本；3）长波长的近红外光比短波长的光对细胞毒性小；4）使用双光子显微镜观察标本的时候，只有在焦平面上才有光漂白和光毒性。所以，双光子显微镜比单光子显微镜更适合用来观察厚标本、更适合用来观察活细胞、或用来进行定点光漂白实验。 激光共聚焦显微镜在进行生物样品研究工作中还存在很多局限和问题： 一是标记染料的光漂白现象。因为共焦孔径光阑必须足够小以获得高分辨率的图像，而孔径小又会挡掉很大部分从样品发出的荧光，包括从焦平面发出的荧光，相应的，激发光必须足够强以获得足够的信噪比；而高强度的激光会使荧光染料在连续扫描过程中迅速褪色，荧光信号会随着扫描进程度进行变得越来越弱。 光毒作用是另外一个问题，在激光照射下，许多荧光染料分子会产生诸如单态氧或自由基等细胞毒素，所以实验中要限制扫描时间和激发光的光功率密度以保持样品的活性。在针对活性样品的研究中，尤其是活性样品生长、发育过程的各个阶段，光漂白和光毒现象使这些研究受到很大的限制。 在传统荧光显微镜中，一个荧光团吸收一个光子，该光子能量对应于荧光团基态和激发态能量之差。通过一个较短寿命的虚态，也可以通过同时吸收两个较低能量（即更高的波长）的光子激发荧光。例如，吸收两个红色波长的光子，可以激发一个吸收紫外的分子。双光子激发是一个非线性过程，对激发光强度有平方依赖关系。

荧光显微镜原理

荧光显微镜原理 一、荧光显微镜 荧光显微镜是免疫荧光细胞化学的基本工具。它是由光源、滤板系统和光学系统等主要 部件组成。是利用一定波长的光激发标本发射荧光，通过物镜和目镜系统放大以观察标本的 荧光图像。 （一）光源 现在多采用200W的超高压汞灯作光源，它是用石英玻璃制作，中间呈球形，内充一定 数量的汞，工作时由两个电极间放电，引起水银蒸发，球内气压迅速升高，当水银完全蒸发 时，可达50～70个标准大气压力，这一过程一般约需5～15min。超高压汞灯的发光是电极间放电使水银分子不断解离和还原过程中发射光量子的结果。它发射很强的紫外和蓝紫光， 足以激发各类荧光物质，因此，为荧光显微镜普遍采用。 超高压汞灯也散发大量热能。因此，灯室必须有良好的散热条件，工作环境温度不宜太 高。 新型超高压汞灯在使用初期不需高电压即可引燃，使用一些时间后，则需要高压启动（约

为15000V），启动后，维持工作电压一般为50～60V，工作电流约4A左右。200W超高压汞灯的平均寿命，在每次使用2h的情况下约为200h，开动一次工作时间愈短，则寿命愈短， 如开一次只工作20min，则寿命降低50%。因此，使用时尽量减少启动次数。灯泡在使用过 程中，其光效是逐渐降低的。灯熄灭后要等待冷却才能重新启动。点燃灯泡后不可立即关闭， 以免水银蒸发不完全而损坏电极，一般需要等15min。由于超高压汞灯压力很高，紫外线强 烈，因此灯泡必须置灯室中方可点燃，以免伤害眼睛和发生爆炸时造成操作者受伤。 超高压汞灯（100W或200W）光源的电路和包括变压、镇流、启动几个部分。在灯室上 有调节灯泡发光中心的系统，灯泡球部后面安装有镀铝的凹面反射镜，前面安装有集光透镜。 国产超高压汞灯GCQ-200型性能良好，可以代替HBO-200等型的进口灯泡，平均寿命在200h以上，价格也比较低。 我国研制的一种简易轻便型高色温溴钨荧光光源装置，体积小，重量轻，功率小，交、 直流两用（自带直流电源），易于携带，使用方便，已推广应用。 （二）滤色系统 滤色系统是荧光显微镜的重要部位，由激发滤板和压制滤板组成。滤板型号，各厂家名

双光子显微镜技术指标 - 中山大学招投标网

中山大学竞争性谈判采购公告附件 项目编号:中大招（货）[2010]015号 项目名称：中山大学附属第一医院双光子显微镜采购项目 一．激光器 1．常规单光子激光器配置，激发谱线≧6（不包括多光子激光器）, 激发谱线越多越好。 1.1红激光（HeNe 633或635nm，≧10mW） 1.2 蓝激光（Ar 457或458nm,473nm或476nm，488nm,514或515≤nm，≧65mW激发谱线）。 1.3绿光（HeNe 543nm，≧1mW） 1.4紫外激光器UV（固态激光器405 nm，≧50mW） 1.5自动扩束装置，保证更换各个波长和物镜时，光束直径能自动适应物镜后出瞳面，保证各 个波长和物镜条件下实现最佳的分辨率和激发效率。 2.多光子脉冲激光照射系统：Chameleon Ultr II 或Mai Tai Deepsee，飞秒级或皮秒脉冲激光波 长不低于此范围680-1080nm。 二．扫描头 1．点扫描，扫描频率2800线/秒或以上，每个通道的扫描图像均可同时达到6144 x6144或以上的扫描分辨率。 2．扫描振镜：独立的检流扫描振镜≥3个，保证每个激光扫描斑点一样，视场更均匀。用于放大、旋转、分支。 3．扫描放大范围最小≤1倍放大，最大≥60倍放大，步进0.1倍。 4．扫描范围：扫描视场对角线≥22mm，均匀照明, 保证每个扫描点都是圆形的，并且激发光光程 长度一致。 5．检测器采用制冷技术提供灵敏度，独立的共聚焦扫描成像荧光光谱检测通道≥3个，或32+2阵 列式检测器，还要加光电倍增管的DIC和Dodt Contrast透射光检测通道1个。 6．必须配激光追踪自动Z轴防漂移补偿系统，激光自动跟踪焦平面，激光定时校准，消除焦平面 漂移。 7．必须配置自动对齐的同步刺激双向扫描功能或SIM或DUOSCAN或相同功能FLY model， FRET,FRAP,FLIP及解龙锁，光活化等实验室必须要有的特性。 8．配置NDD直接检测器4个，TLD透射光检测器和RLD反射光检测器各两个。 9. 配置在体活鼠脑固定夹具 三．显微镜 1．配置全自动高级研究型正置固定载物台电生理专业显微镜,显微镜控制方式：软件、触摸屏、手 动，可通过三种方式控制功能切换，透/反射光路切换，物镜转换，载物台升降，荧光滤片组转换， 透射光光阑及聚光器功能转换。 2. 观察方法: 明场,荧光,微分干涉（DIC）, 渐层照明Dodt Contrast。 3．电动控制转换的6孔物镜转盘、微分干涉电动转盘。 4．目镜视场≥25mm，电动XY载物台。 5．荧光系统：120瓦金属卤化物光源，灯泡平均寿命2000小时。

LSM780双光子激光共聚焦显微镜技术参数

1.设备名称 双光子荧光寿命成像激光共聚焦扫描显微镜 2.数量 1套 3.设备用途说明 4.工作条件 电源220V±10%，50HZ 室温：20~25℃ 其他：防尘，除湿，抗震动 工作台：牢固，稳定，防震 5.规格、技术要求及参数 5.1 双光子飞秒激光器部分 5.1.1Ar激光：458nm、488nm、514nm，25mW 5.1.2HeNe激光：543nm，1mW 5.1.3HeNe激光：633nm，5mW 5.1.4405激光：405nm，30mW 5.1.5*红外飞秒脉冲激光器，波长范围:680-1080nm, 包含负色散补偿功能 5.1.6根据标本的情况利用飞秒激光器的双光子可观看800微米深度样品数据。 5.1.7*稳定的可见光AOTF，同时控制激光各波长的激光强度，8通道，切换时间<5 微秒。AOTF对激光强度的控制连续可调（0~100%），步进0.1%）。 5.1.8每支激光器通过独立的光纤连接到扫描器部分，光纤即插即用，无需校准。 5.1.9光纤末端具有可对激光进行聚焦的集光镜，电动调节。 5.1.10具有8个激光光路接口和红外飞秒激光器直接耦合端口。 5.2扫描器 1

5.2.1扫描器（含检测器）与显微镜直接连接于显微镜端口（非光纤连接），一体化设 计，一体化像差及色差校正。 5.2.2*整个光路的光学设计适用波长范围为360nm～1000nm全光谱范围。 5.2.3每个荧光检测器具有独立的10级可调数码增益。 5.2.4有可调大小的针孔，调节范围为连续调节，免维护。 5.2.5*光栅分光方式，并且具有减少信号损失的循环光路设计。 5.2.6各荧光检测通道均不采用发射光滤光片，荧光信号经光栅分光后可直接到达检 测器。 5.2.7*共聚焦成像通道：具备34个荧光检测通道，可以同时采集10个荧光通道和 1个透射光通道图像，10种荧光染料可同时分离成像，1个透射光通道（明场DIC效果） 5.2.8*扫描器（含检测器）必须内置高灵敏度GaAsP spectral 检测器，而且该仪 器能够整合FCS技术，使影像品質(S/N ratio)信噪比有2X提升，具有检测微弱的单分子荧光的功能。 5.2.9一个可用于明场和DIC观察的透射光检测通道。 5.2.10*两个独立的电动的10位滤光片转轮，通过滤光片导入激发光、透过荧光并阻 断从样品反射回的激光，可提供多至50种激发光波长组合。其中一个转轮可由用户自由更换滤光片，满足系统升级扩展的需要。 5.2.11可对荧光光谱进行分析，拆分光谱重叠的不同标记的信号，可以解决同时使用 多种荧光标记时，如GFP/YFP双标记，激发光或发射光波长重叠造成的串色问题。 5.2.12具有实时计算机系统（Real time computer ）监控扫描过程、同步及数据采 集，可选择使用16位、12位和8位A/D转换的动态范围。 5.2.13采用X、Y轴独立的双镜扫描，扫描为线性扫描。 5.2.14*扫描分辨率：可以在4 x 1至6144 x 6144之间自由选择。所有通道同时使 1

荧光显微镜的原理和荧光显微镜结构特点

荧光显微镜的原理和荧光显微镜结构特点发布时间:2011-06-14 荧光显微镜的原理和荧光显微镜结构特点 荧光显微镜的原理是什么, 荧光显微镜是利用一个高发光效率的点光源，经过滤色系统发出一定波长的光(如紫外光365nm或紫蓝光420nm)作为激发光，激发检测标本内的荧光物质发射出各种不同颜色的荧光后，通过物镜和目镜系统的放大以观察标本的荧光图像的光学显微镜，是医学检验中的重要仪器之一。 在强烈的对衬背景下，即使荧光很微弱也易辨认，敏感性高，主要用于细胞结构和功能以及化学成分等的研究。荧光显微镜的基本构造是由普通光学显微镜加上一些附件(如荧光光源、激发滤片、双色束分离器和阻断滤片等)的基础上组成的。荧光光源——般采用超高压汞灯(50一200W)，它可发出各种波长的光，但每种荧光物质都有一个产生最强荧光的激发光波长，所以需加用激发滤片(一般有紫外、紫色、蓝色和绿色激发滤片)，仅使一定波长的激发光透过照射到标本上，而将其他光都吸收掉。每种物质被激发光照射后，在极短时间内发射出较照射波长更长的可见荧光。荧光具有专一性，一般都比激发光弱，为能观察到专一的荧光，在物镜后面需加阻断(或压制)滤光片。它的作用有二:一是吸收和阻挡激发光进入目镜、以免于扰荧光和损伤眼睛，二是选择并让特异的荧光透过，表现出专一的荧光色彩。两种滤光片必须选择配合使用。 萤光显微镜原理: (1) 光源幅射出各种波长的光(以紫外至红外)。 (2) 激励滤光源:透过能使标本产生萤光的特定波长的光，同时阻挡对激发萤光无用的光。

(3) 荧光标本:一般用萤光色素染色。 (4) 阻挡滤光镜:阻挡掉没有被标本吸收的激发光有选择地透射萤光，在萤光中也有部分波长被选择透过。以紫外线为光源，使被照射的物体发出荧光的显微镜。

光学显微镜的工作原理

光学显微镜的工作原理 显微镜就是一种精密的光学仪器,已有300多年的发展史。自从有了显微镜,人们瞧到了过去瞧不到的许多微小生物与构成生物的基本单元——细胞。目前,不仅有能放大千余倍的光学显微镜,而且有放大几十万倍的电子显微镜,使我们对生物体的生命活动规律有了更进一步的认识。在普通中学生物教学大纲中规定的实验中,大部分要通过显微镜来完成,因此,显微镜性能的好坏就是做好观察实验的关键。 一、显微镜的光学系统 显微镜的光学系统主要包括物镜、目镜、反光镜与聚光器四个部件。广义的说也包括照明光源、滤光器、盖玻片与载玻片等。 (一)、物镜 物镜就是决定显微镜性能的最重要部件,安装在物镜转换器上,接近被观察的物体,故叫做物镜或接物镜。 1、物镜的分类 物镜根据使用条件的不同可分为干燥物镜与浸液物镜;其中浸液物镜又可分为水浸物镜与油浸物镜(常用放大倍数为90—100倍)。 根据放大倍数的不同可分为低倍物镜(10倍以下)、中倍物镜(20倍左右)高倍物镜(40—65倍)。 根据像差矫正情况,分为消色差物镜(常用,能矫正光谱中两种色光的色差的物镜)与复色差物镜(能矫正光谱中三种色光的色差的物镜,价格贵,使用少)。 2、物镜的主要参数: 物镜主要参数包括:放大倍数、数值孔径与工作距离。 ①、放大倍数就是指眼睛瞧到像的大小与对应标本大小的比值。它指的就是长度的比值而不就是面积的比值。例:放大倍数为100×,指的就是长度就是1μm的标本,放大后像的长度就是100μm,要就是以面积计算,则放大了10,000倍。 显微镜的总放大倍数等于物镜与目镜放大倍数的乘积。 ②、数值孔径也叫镜口率,简写NA 或A,就是物镜与聚光器的主要参数,与显微镜的分辨力成正比。干燥物镜的数值孔径为0、05-0、95,油浸物镜(香柏油)的数值孔径为1、25。 ③、工作距离就是指当所观察的标本最清楚时物镜的前端透镜下面到标本的盖玻片上面的距离。物

双光子荧光显微镜的原理特点

双光子荧光显微镜的原理特点 双光子荧光显微镜是结合了激光扫描共聚焦显微镜和双光子激发技术的一种新技术。 双光子激发的基本原理是： 在高光子密度的情况下，荧光分子可以同时吸收2个长波长的光子，在经过一个很短的所谓激发态寿命的时间后，发射出一个波长较短的光子;其效果和使用一个波长为长波长一半的光子去激发荧光分子是相同的。 双光子激发需要很高的光子密度，为了不损伤细胞，双光子显微镜使用高能量锁模脉冲激光器。 这种激光器发出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脉冲宽度只有100飞秒，而其周期可以达到80至100兆赫。 在使用高数值孔径的物镜将脉冲激光的光子聚焦时，物镜的焦点处的光子密度是的，双光子激发只发生在物镜的焦点上，所以双光子显微镜不需要共聚焦针孔，提高了荧光检测效率。 为形态学、分子细胞生物学、神经科学、和药理学等研究领域中重要的研究手段。 1.双光子显微镜出现的背景----传统激光共聚焦显微镜的两大局限: 1)一是光毒性现象： 因为共聚焦的针孔必须足够小以获得高分辨率的图像，而孔径小又会挡掉很大部分从样品发出的荧光，包括从焦平面发出的荧光，相应的，激发光必须足够强以获得

足够的信噪比; 而高强度的激光会使荧光染料在连续扫描过程中迅速褪色，荧光信号会随着扫描进程度进行变得越来越弱。 2)光毒作用是另外一个问题，在激光照射下，许多荧光染料分子会产生诸如单态氧或自由基等细胞毒素，所以实验中要限制扫描时间和激发光的光功率密度以保持样品的活性。 在针对活性样品的研究中，尤其是活性样品生长、发育过程的各个阶段，光漂白和光毒现象使这些研究受到很大的限制。 2.为什么说双光子显微镜一般不需要配备紫外激发激光器? 双光子显微镜技术是建立在双光子激发效应的基础上的一种荧光激发技术：荧光染料分子可以同时吸收低能量的两个光子而被激发(两个光子到达荧光分子的时间间隔小于1飞秒)，其激发效果可以等同于吸收一个1/2波长的高能量光子。 例如，吸收两个红色波长的光子，相当于一个吸收紫外的分子。长波长的光子不易被细胞吸收，因此对活细胞的光毒性减少，也降低了光漂白。这样即起到紫外激发的功能，又避免了紫外光线对样品的伤害。 3.双光子显微镜的激光器有何特别之处? 双光子吸收几率依赖于两个入射光子在空间和时间上的重合程度(两个光子必须在10-18秒内到达)。双光子吸收截面很小，只有在具有很大光子流量的区域的荧光团才会被激发。 因此所用激光器多为钛宝石激光器，可以达到皮秒或者飞秒级的扫描速度，且具有非常高的峰值功率和较低的平均功率，从而可以减小或者消除光漂白和光毒作用。