细胞凋亡实验步骤及注意事项

细胞凋亡实验步骤及注意事项

一、实验目的

1、掌屋凋亡细胞的形态特征

2、学会用荧光探针对细胞进行双标记来检测正常活细胞、凋亡细胞和坏死细胞的方法

二、实验原理

细胞死亡根据其性质、起源及生物学意义区分为凋亡和坏死两种不同类型。凋亡普遍存在于生命界，在生物个体和生存中起着非常重要的作用。它是细胞在一定生理条件下一系列顺序发生事件的组合，是细胞遵循一定规律自己结束生命的自主控制过程。细胞凋亡具有可鉴别的形态学和生物化学特征。

在形态上可见凋亡细胞与周围细胞脱离接触，细胞变园，细胞膜向内皱缩、胞浆浓缩、内质网扩张、细胞核固缩破裂呈团块状或新月状分布、内质网和细胞膜进一步融合将细胞分成多个完整包裹的凋亡小体，凋亡小体最后被吞噬细胞吞噬消化。在凋亡过程中细胞内容物并不释放到细胞外，不会影响其它细胞，因而不引起炎症反应。

在生物化学上，多数细胞凋亡的过程中，内源性核酸内切酶活化，活性增加。核DNA随机地在核小体的连接部位被酶切断，降解为180-200bp或它的整倍数的各种片断。如果对核DNA进行琼脂糖电泳，可显示以180-200bp为基数的DNA ladder（梯状带纹）的特征。

相比之下，坏死是细胞处于剧烈损伤条件下发生的细胞死亡。细胞在坏死早期即丧失质膜完整性，各种细胞器膨胀，进而质膜崩解释放出其中的内容物，引起炎症反应，坏死过程中细胞核DNA虽也降解，但由于存在各种长度不等的DNA

片断，不能形成梯状带纹，而呈弥散状。

一些温和的损伤刺激及一些抗肿瘤药物可诱导细胞凋亡，通常这些因素在诱导凋亡的同时，也可产生细胞坏死，这取决于损伤的剧烈程度和细胞本身对刺激的敏感程度。

三尖杉酯碱（HT）是我国自行研制的一种对急性粒细胞白血病，急性单核白血病等有良好疗效的抗肿瘤药物。研究表明HT在0.02~5μg/ml范围内作用2小时，即可诱导HL-60细胞凋亡，并表现出典型的凋亡特征。本实验用1μg/ml HT在体外诱导培养的HL-60细胞发生凋亡，同时也有少数细胞发生坏死。用Hoechst33342和碘化丙啶（propidium iodide，PI）对细胞进行双重染色，可以区别凋亡、坏死及正常细胞。

细胞膜是一选择性的生物膜，一般的生物染料如PI等不能穿过质膜。当细胞坏死时，质膜不完整，PI就进入细胞内部，它可嵌入到DNA或RNA中，使坏死

细胞着色，凋亡细胞和活细胞不着色。而一些活细胞染料由于为亲脂性物质，可跨膜进入活细胞，因而可进行活细胞染色。Hoechst33342是一种活性荧光染料且毒性较弱，它是双苯并咪唑的一种衍生物。与DNA特异结合（主要结合于A-T）碱基区），显示凋亡细胞和活细胞。凡是看到有凋亡小体的细胞都是凋亡细胞。

三、实验用品

1、试剂：三尖杉酯碱（HT），300μg/ml，100mmol/L Tris-HCl（pH7.5），5mol/L EDTA缓冲液、碱性裂解液：0.2mol/L NaOH, 1%SDS、醋酸钠：3mol/L KAc （pH4.8）；异丙醇；70%乙醇；溴酚蓝，蔗糖指示剂。TBE电泳缓冲液，1%琼脂糖，溴乙锭。PI母液：500μg/ml；Ho33342母液：2mmol/L。

2、仪器设备：荧光显微镜，电泳仪，电泳槽，微量加样器（1ml，100μl）0.5、1.5ml离心管，载玻片，盖玻片。

四、实验材料

人早幼粒白血病HL-60细胞，用含10%小牛血清的RPMI1640培养基在37℃，5%CO2条件下培养。

五、方法步骤

1、三尖杉酯碱诱发HL-60细胞凋亡

（1）实验前约24小时，接种两瓶HL-60细胞，标记①、②，每瓶含约6ml 培养液，置37℃，5%CO2培养箱培养。

（2）实验前约2.5小时，当细胞密度达到70%，①号瓶加入三尖杉酯碱200μl，使终浓度为1μg/ml，②号瓶中加入同等量PBS（pH7.4）作对照。共同放入培养箱中继续培养2.5小时。

2、Ho33342和PI双重染色鉴别三种细胞

（1）染色：将瓶中的细胞摇匀取200μl于1.5ml的离心管中，加入Ho33342母液2μl，PI 20μl，染色15分钟。

（2）滴片：取一载玻片用双面胶围成一小室，从离心管中各取以上染色后的细胞悬液10μl，加入小室内盖上盖玻片，荧光镜下用紫外激发光，高倍镜下观察，区别三种细胞，并注意三者比例。

注

意事项1. 诱导培养HL-60细胞时间要准确；

2. 荧光显微镜下观察细胞时，由于荧光易碎灭，观察时要尽量快。

其他细胞死亡根据其性质、起源及生物学意义区分为凋亡和坏死两种不同类型。凋亡普遍存在于生命界，在生物个体和生存中起着非常重要的作用。它是细胞在一定生理条件下一系列顺序发生事件的组合，是细胞遵循一定规律自己结束生命的自主控制过程。细胞凋亡具有可鉴别的形态学和生物化学特征。在形态上可见凋亡细胞与周围细胞脱离接触，细胞变园，细胞膜向内皱缩、胞浆浓缩、内质网扩张、细胞核固缩破裂呈团块状或新月状分布、内质网和

细胞膜进一步融合将细胞分成多个完整包裹的凋亡小体，凋亡小体最后被吞噬细胞吞噬消化。在凋亡过程中细胞内容物并不释放到细胞外，不会影响其它细胞，因而不引起炎症反应。

在生物化学上，多数细胞凋亡的过程中，内源性核酸内切酶活化，活性增加。核DNA随机地在核小体的连接部位被酶切断，降解为180-200bp或它的整倍数的各种片断。如果对核DNA进行琼脂糖电泳，可显示以180-200bp为基数的DNA ladder（梯状带纹）的特征。

相比之下，坏死是细胞处于剧烈损伤条件下发生的细胞死亡。细胞在坏死早期即丧失质膜完整性，各种细胞器膨胀，进而质膜崩解释放出其中的内容物，引起炎症反应，坏死过程中细胞核DNA虽也降解，但由于存在各种长度不等的DNA片断，不能形成梯状带纹，而呈弥散状。

一些温和的损伤刺激及一些抗肿瘤药物可诱导细胞凋亡，通常这些因素在诱导凋亡的同时，也可产生细胞坏死，这取决于损伤的剧烈程度和细胞本身对刺激的敏感程度。

细胞凋亡实验步骤及注意事项

细胞凋亡实验步骤及注意事项 一、实验目的 1、掌屋凋亡细胞的形态特征 2、学会用荧光探针对细胞进行双标记来检测正常活细胞、凋亡细胞与坏死 细胞的方法 二、实验原理 细胞死亡根据其性质、起源及生物学意义区分为凋亡与坏死两种不同类型。凋亡普遍存在于生命界,在生物个体与生存中起着非常重要的作用。它就是细胞在一 定生理条件下一系列顺序发生事件的组合,就是细胞遵循一定规律自己结束生命 的自主控制过程。细胞凋亡具有可鉴别的形态学与生物化学特征。 在形态上可见凋亡细胞与周围细胞脱离接触,细胞变园,细胞膜向内皱缩、胞浆浓缩、内质网扩张、细胞核固缩破裂呈团块状或新月状分布、内质网与细胞膜进一步融合将细胞分成多个完整包裹的凋亡小体,凋亡小体最后被吞噬细胞吞噬消化。在凋亡过程中细胞内容物并不释放到细胞外,不会影响其它细胞,因而不引起炎症反应。 在生物化学上,多数细胞凋亡的过程中,内源性核酸内切酶活化,活性增加。核DNA 随机地在核小体的连接部位被酶切断,降解为180-200bp或它的整倍数的各种片断。如果对核DNA进行琼脂糖电泳,可显示以180-200bp为基数的DNA ladder(梯状带纹)的特征。 相比之下,坏死就是细胞处于剧烈损伤条件下发生的细胞死亡。细胞在坏死早期 即丧失质膜完整性,各种细胞器膨胀,进而质膜崩解释放出其中的内容物,引起炎症反应,坏死过程中细胞核DNA虽也降解,但由于存在各种长度不等的DNA片断,不能形成梯状带纹,而呈弥散状。 一些温与的损伤刺激及一些抗肿瘤药物可诱导细胞凋亡,通常这些因素在诱导凋亡的同时,也可产生细胞坏死,这取决于损伤的剧烈程度与细胞本身对刺激的敏感 程度。 三尖杉酯碱(HT)就是我国自行研制的一种对急性粒细胞白血病,急性单核白血病等有良好疗效的抗肿瘤药物。研究表明HT在0、02~5μg/ml范围内作用2小时,即可诱导HL-60细胞凋亡,并表现出典型的凋亡特征。本实验用1μg/ml HT在体外诱导培养的HL-60细胞发生凋亡,同时也有少数细胞发生坏死。用 Hoechst33342与碘化丙啶(propidium iodide,PI)对细胞进行双重染色,可以区别凋亡、坏死及正常细胞。 细胞膜就是一选择性的生物膜,一般的生物染料如PI等不能穿过质膜。当细胞坏死时,质膜不完整,PI就进入细胞内部,它可嵌入到DNA或RNA中,使坏死细胞着

细胞凋亡实验报告

实验七、Hela细胞凋亡诱导及检测 一、实验目的 学习细胞凋亡诱导及检测。 二、实验原理 1.细胞凋亡是多细胞有机体为调控机体发育，维护内环境稳定，由基因控制的细 胞主动死亡过程，是细胞衰老自然死亡的主要方式之一，是一种自然的生理学 过程。与细胞坏死不同，不会引起炎症反应，不释放细胞内容物。 2.DAPI是一种荧光染料，它可以与DNA双螺旋的凹槽部分发生相互作用，从而与 DNA紧密结合，可在紫外下激发蓝光。 三、实验材料 8.8mol/L的H2O2溶液，甲醇，PBS溶液，10μg/mL的DAPI染液 四、实验步骤 1.细胞传代（上一次实验完成） 2.凋亡诱导 1)取做H.E染色的小皿，加H2O2溶液150μL使终浓度为0.8mol/L 2)24小时后收集细胞进行染色和形态学观察。 3. 染色 1）收集细胞，观察，贴壁细胞较多，直接用PBS溶液洗 2）吸出洗液，加入500μL甲醇，室温固定10min 3）倒掉甲醇，PBS洗净，加500μLPBS溶液和50μLDAPI母液，于37℃染色10min 4）倒掉染液，用PBS洗净（注意避光），加入500μLPBS溶液，倒置荧光显微镜 下观察并拍照。 五、实验结果与分析 1.观察： 实验开始前镜检： 细胞贴壁较多，细胞有的仍呈不规则状，有的细胞已皱缩，还有一些细胞呈圆形浮在培养基中，核质分界不明显。可以看到有的细胞处于裂解状态。 染色后： 由于DAPI染料只对核进行染色，所以在紫外下只可见核的结构。 视野里最多的是正常细胞，其特点是染色质均一且核表面光滑，说明凋亡是不同步的。 凋亡各时期的细胞也都可见，其主要特点是染色不均一。凋亡前期和中期的细胞较多。很少看到凋亡末期的细胞，除了这个时期细胞较少外，还可能因 为在前期操作中很多凋亡小体被洗掉了。而且有的细胞在正常光下观察是明显 的裂解状态，但是到紫外光路下就变得很不明显了。 另外，可以看到很多分裂期的细胞，其特点为染色深，细胞核染色质浓缩，但是看起来较均一，往往有对称性，特别是分裂末期的细胞两个子细胞会靠在 一起。 2.照片及分析：

实验室安全防护知识注意事项(正式)

编订：__________________ 单位：__________________ 时间：__________________ 实验室安全防护知识注意 事项(正式) Standardize The Management Mechanism To Make The Personnel In The Organization Operate According To The Established Standards And Reach The Expected Level. Word格式 / 完整 / 可编辑

文件编号：KG-AO-4600-41 实验室安全防护知识注意事项(正 式) 使用备注：本文档可用在日常工作场景，通过对管理机制、管理原则、管理方法以及管 理机构进行设置固定的规范，从而使得组织内人员按照既定标准、规范的要求进行操作，使日常工作或活动达到预期的水平。下载后就可自由编辑。 近日，合肥工业大学化学楼发生硫化氢泄漏事件。化学试剂在实验中随时充满了危险，因此需要特别注意！发点实验室安全防护方面的知识，一起学习。 化学实验中会经常使用各种化学药品和仪器设备，以及水、电、煤气，还会经常遇到高温、低温、高压、真空、高电压、高频和带有辐射源的实验条件和仪器。若缺乏必要的安全防护知识，会造成生命和财产的巨大损失。因此，对从事化学实验室工作人员的安全防护教育是非常重要的，必须引起本中心全体人员的重视。 危险化学品 易燃试剂 在处理易燃试剂时，都应严格检查在附近有无明

火。下列常用的有机溶剂都具有很大的易燃性：碳氢化合物如己烷、轻石油（即石油醚）、苯、甲苯；醇类如甲醇、乙醇；酯类如乙酸乙酯；酮类如丙酮；醚类化合物因其暴露在空气或见光会产生易爆炸的过氧化物，因此，使用时要特别注意。常用的乙醚和四氢呋喃就属于醚类，处理时要特别小心。 此外，乙醚还具有相当低的沸点和一定程度的麻醉作用，二硫化碳具有很高的易燃性，甚至用水浴加热都会导致它着火，因此在实验中应尽量避免使用。 氧化剂 硫酸、硝酸既有很强的腐蚀性，也有很强的氧化性。像漂白粉、过氧化氢、过酸、二氧化钴和高锰酸钾等都是很强的氧化剂。 腐蚀性药品 处理或使用腐蚀性试剂时一定要戴上防护手套。一旦溅到皮肤上，应立即用大量的水冲洗干净。无机酸当中的硫酸、盐酸、氢溴酸、磷酸和硝酸，有机酸中的羧酸、磺酸都是具有腐蚀性的。苯酚也是相当危

高中生物细胞凋亡的知识点(一)

高中生物细胞凋亡的知识点(一) ［背景知识互动］ 1.人的自然寿命是多少岁？人的寿命的长短与什么有关？ 2.人体每天都有哪些细胞死亡？举例说明。 答案: 1.人的自然寿命是120岁。人的寿命与细胞衰老有直接关系。 2.人体每天死亡的细胞有小肠上皮细胞、皮肤细胞、血红细胞等。知识链接 人体的衰老与细胞的衰老有关。 人体内每天都有大量的细胞死亡。 ［典型例题探究］ 【例1】什么是细胞凋亡？ 解析：高等真核生物的大多数细胞，在丧失生理功能或严重受损时，激活固有的细胞自杀程序而自灭。这一过程称为细胞程序化死亡。细胞凋亡这个词指细胞程序化死亡所表现的生理变化和形态变化，其中包括细胞收缩、膜泡化、染色质浓缩和降解成小片段。 答案：细胞凋亡是指生物体生长发育过程中，由基因控制的，按照一定的程序发生的'细胞死亡，因而细胞凋亡又称为程序性死亡。规律发现 细胞凋亡中的细胞经常降解成为膜包裹的凋亡体，被巨噬细胞或邻近的细胞吞噬或消化，但不产生炎症反应。 【例2】细胞凋亡的大致过程可分为三个阶段，它们是：________、________、 ________。 解析：.细胞凋亡的过程的三个阶段为： 凋亡的起始：细胞皱缩，细胞连接消失，内质网膨胀，染色体固缩并沿着核膜分布，但细胞膜依然完整。 凋亡小体的形成：核膜破裂，染色体断裂为大小不等的片段，与一些细胞器聚集后被内折的细胞膜包围，在细胞表面形成了许多泡状和芽状的突起，这些突起叫做凋亡小体。 细胞的解体：凋亡小体逐渐与细胞分离，脱落至细胞间质，最终被周围的细胞吞噬并消化。 答案：凋亡的起始凋亡小体的形成细胞的解体注意对细胞凋亡过程的掌握。 1

流式细胞仪检测细胞凋亡——Annexin VPI双染色法

流式细胞仪检测细胞凋亡——Annexin V/PI 双染色法 基本原理 细胞凋亡早期改变发生在细胞膜表面，目早期识别仍有困难些细胞膜表面的改变之是磷脂酰丝氨酸（PS）从细胞膜内转移到细胞膜外，使PS暴露在细胞膜外表面。PS是一带负电荷的磷脂，正常主要存在于细胞膜的内面，在细胞发生凋亡时细胞膜上的这种磷脂分布的不对称性被破坏而使PS暴露在细胞膜外。Annexin V是一种Ca+依赖的磷脂结合蛋白，最初发现是一种具有很强的抗凝血特性的血管蛋白，Annexin V具有易于结合到磷脂类如PS的特性。对PS有高度的亲和性。因此，该蛋白可充当一敏感的探针检测暴露在细胞膜表面的PS。PS转移到细胞膜外不是凋亡所独特的，也可发生在细胞坏死中。两种细胞死亡方式间的差别是在凋亡的初始阶段细胞膜是完好的，而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就破坏了。因此，可以建立一种用Annexin V结合在细胞膜表面作凋亡的指示并结合一种染料排除试验以检测细胞膜的完整性的检测方法。 试剂与仪器 l孵育缓冲液：10mmol/L HEPES/NaOH，PH 7.4，140mmol/L NaCl，5mmol/L CaCl2 l标记液：将FITC- Annexin V（宝灵曼公司产品）和PI加入到孵育缓冲液中，终浓度均为1ug/ml l流式细胞仪 实验步骤 1. 细胞收集：悬浮细胞直接收集到10ml的离心管中，每样本细胞为（1~5）×106，/mL　500~1000r/min离心5min，弃去培养液。 2. 用孵育缓冲液洗涤1次，500~1000r/min离心5min。 3. 用100ul的标记溶液重悬细胞，室温下避光孵育10~15min。 4. 500~1000r/min离心5min沉淀细胞孵育缓冲液洗1次。 5. 加入荧光（SA-FLOUS）溶液4℃下孵育20min，避光并不时振动。 6. 流式细胞仪分析：流式细胞仪激发光波长用488nm，用一波长为515nm的通带滤器检测FITC荧光，另一波长于560nm的滤器检测PI。 7. 结果判断：凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料如PI有抗染性，坏死细胞则不能。细胞膜有损伤的细胞的DNA可被PI着染产生红色荧光，而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。因此，在细胞凋亡的早期PI不会着染而没有红色荧光信号。正常活细胞与此相似。在

细胞生物学实验

细胞生物学实验： 《细胞生物学实验》是高等教育出版社出版的一本书籍，作者是王崇英、高清祥。 内容简介： 《细胞生物学实验(第3版)》在保留第2版简明、可操作性强等特点的基础上，删除了相对陈旧和不适用的实验，增加了反映目前细胞生物学研究现状和发展趋势的实验，并对每个实验的结构体系进行了调整，强化了要点提示及注意事项，增加了预期实验结果。全书共3篇7章42个实验和11个附录。第一篇7个实验介绍了“普通光学显微镜”、“特殊光学显微镜”、“激光扫描共聚焦荧光显微镜”、“双光子激光扫描荧光显微镜”和“电子显微镜”的原理及使用方法；第二和第三篇从基础性、综合性和设计性实验层面安排了35个实验，涵盖了“细胞形态结构和生理活动”、“细胞分裂与染色体标本制备”、“细胞培养、遗传转化及基因表达”、“染色体分析技术”以及“细胞周期与细胞凋亡”等内容，旨在培养学生的基本实验技能和综合创新能力；附录部分提供了“实验室注意事项”、“实验报告的书写要求”、“离心机转数与离心力换算表及公式”、“常用缓冲液的配制”和“常用细胞生物学词汇”等资料。书后附有部分实验的彩色图片和照片。《细胞生物学实验(第3版)》配有数字课程（基础版）网站。网站内容包括部分实验内容的录像片段、彩色图片和照片，供学有余力的学生学习和教师教学参考。《细胞生物学实验(第3版)》适合作为综合性大学、师范、农林、医学等院校相关专业本科生的细

胞生物学实验教材使用，也可供研究生、相关科研及实验技术人员参考。 目录： 第一篇显微镜技术 光学显微镜及其使用 普通光学显微镜及其使用 特殊光学显微镜及其使用 暗视野显微镜 相差显微镜 偏振光显微镜 微分干涉相差显微镜 荧光显微镜 激光扫描共聚焦荧光显微镜和双光子激光扫描荧光显微镜 激光扫描共聚焦荧光显微镜 双光子激光扫描荧光显微镜 电子显微镜及其使用 透射电子显微镜技术 透射电子显微镜的原理、用途与使用方法 透射电子显微镜样品制备(超薄切片) 扫描电子显微镜技术 扫描电子显微镜的原理、用途与使用方法 扫描电子显微镜样品制备

实验室安全防护知识注意事项

实验室安全防护知识注意事项 姓名：XXX 部门：XXX 日期：XXX

实验室安全防护知识注意事项 近日，合肥工业大学化学楼发生硫化氢泄漏事件。化学试剂在实验中随时充满了危险，因此需要特别注意！发点实验室安全防护方面的知识，一起学习。 化学实验中会经常使用各种化学药品和仪器设备，以及水、电、煤气，还会经常遇到高温、低温、高压、真空、高电压、高频和带有辐射源的实验条件和仪器。若缺乏必要的安全防护知识，会造成生命和财产的巨大损失。因此，对从事化学实验室工作人员的安全防护教育是非常重要的，必须引起本中心全体人员的重视。 危险化学品 易燃试剂 在处理易燃试剂时，都应严格检查在附近有无明火。下列常用的有机溶剂都具有很大的易燃性： 碳氢化合物如己烷、轻石油（即石油醚）、苯、甲苯；醇类如甲醇、乙醇；酯类如乙酸乙酯；酮类如丙酮；醚类化合物因其暴露在空气或见光会产生易爆炸的过氧化物，因此，使用时要特别注意。常用的乙醚和四氢呋喃就属于醚类，处理时要特别小心。 此外，乙醚还具有相当低的沸点和一定程度的麻醉作用，二硫化碳具有很高的易燃性，甚至用水浴加热都会导致它着火，因此在实验中应尽量避免使用。 氧化剂 硫酸、硝酸既有很强的腐蚀性，也有很强的氧化性。像漂白粉、过氧化氢、过酸、二氧化钴和高锰酸钾等都是很强的氧化剂。 第 2 页共 5 页

腐蚀性药品 处理或使用腐蚀性试剂时一定要戴上防护手套。一旦溅到皮肤上，应立即用大量的水冲洗干净。无机酸当中的硫酸、盐酸、氢溴酸、磷酸和硝酸，有机酸中的羧酸、磺酸都是具有腐蚀性的。苯酚也是相当危险的，能导致皮肤灼伤，它的有毒蒸气能够被皮肤吸收。无机碱中的氢氧化钠、氢氧化钾这样的强碱，硫酸钠、硫酸钾这样的弱碱都具有腐蚀性，有机碱中的胺、羟胺、三乙胺、吡啶等都具有腐蚀性。 液溴是非常危险的药品，它能导致皮肤、眼睛的灼伤，因此一定要在通风橱里使用。此外，由于它的密度较大，当用滴管转移时，即使不挤乳胶头，都可能因其重力而滴下来，因此，使用时要特别小心。 氯化亚砜、酰氯、无水三氯化铝以及其他的一些试剂，因能与水反应放出氯化氢气体，也具有腐蚀性，并会对呼吸系统产生严重的刺激。 安全防护知识 眼睛的保护 在普通的眼镜外面再戴上护眼罩或护目镜，在实验室里禁止戴隐形眼镜。如果眼睛里溅上药品，一定要采取紧急处理。 防护眼镜 穿着、服装 在实验室里应穿上防化服。另外，也不要穿拖鞋、凉鞋。 仪器和设备 一般情况下，若不知道某个仪器或设备的功能，不要试图使用它们。象真空吸收泵、旋转蒸发仪、压缩气体钢瓶等，一旦错用都可能导致这些昂贵的仪器的损坏，或者使实验失败，更严重的是导致一些事故的发生。在安装实验仪器之前，要检查玻璃磨口是否沾有碎片或碎渣。在加 第 3 页共 5 页

细胞凋亡检测,细胞凋亡实验步骤,检测方法

细胞凋亡检测，细胞凋亡实验步骤，检测方法 一、定性和定量研究 只定性的研究方法：常规琼脂糖凝胶电泳、脉冲场倒转琼脂糖凝胶电泳、形态学观察（普通光学显微镜、透射电镜、荧光显微镜） 进行定量或半定量的研究方法：各种流式细胞仪方法、原位末端标记法、ELISA 定量琼脂糖凝胶电泳。 二、区分凋亡和坏死 可将二者区分开的方法：琼脂糖凝胶电泳，形态学观察（透射电镜是是区分凋亡和坏死最可靠的方法），Hoechst33342/PI双染色法流式细胞仪检测，AnnexinV/PI双染色法流式细胞仪检测等。 不能将二者区分开的方法：原位末端标记法、PI单染色法流式细胞仪检测等。 三、样品来源不同选择 组织：主要用形态学方法(HE染色，透射电镜、石蜡包埋组织切片进行原位末端标记，ELISA或将组织碾碎消化做琼脂糖凝胶电泳)。 四、细胞凋亡检测 1、早期检测: 1) PS(磷脂酰丝氨酸)在细胞外膜上的检测 2)细胞内氧化还原状态改变的检测 3)细胞色素C的定位检测 4) 线粒体膜电位变化的检测 2、晚期检测： 细胞凋亡晚期中，核酸内切酶在核小体之间剪切核DNA，产生大量长度在 180-200 bp 的DNA片段。 对于晚期检测通常有以下方法： 1) TUNEL(末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记) 2) LM-PCR Ladder (连接介导的PCR检测) 3) T elemerase Detection (端粒酶检测) 3、生化检测： 1）典型的生化特征：DNA 片段化 2）检测方法主要有：琼脂糖凝胶电泳、原位末端标记（TUNEL）等 3）TUNEL（末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记） 4）通过DNA末端转移酶将带标记的dNTP （多为dUTP）间接或直接接到DNA 片段的3’-OH端，再通过酶联显色或荧光检测定量分析结果。可做细胞悬液、福尔马林固定或石蜡处理的组织、细胞培养物等多种样本的检测。 4、LM-PCR Ladder (连接介导的PCR检测) 当凋亡细胞比例较小以及检测样品量很少（如活体组织切片）时，直接琼脂糖电泳可能观察不到核DNA的变化。通过LM-PCR,连上特异性接头，专一性地扩增梯度片段，从而灵敏地检测凋亡时产生梯度片段。此外，LM-PCR 检测是半定量的，因此相同凋亡程度的不同样品可进行比较。如果细胞量很少，还可在分离提纯DNA后，用32P-ATP和脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）使DNA标记，

流式细胞仪检测细胞凋亡操作流程 Annexin V 检测细胞凋亡

A n n e x i n V检测细胞凋亡 实验原理 Annexin V 是检测细胞凋亡的灵敏指标之一。它是一种磷脂结合蛋白，可以与早期凋亡细胞的胞膜结合，而细胞质膜的改变是细胞发生凋亡时最早的改变之一。在细胞发生凋亡时，膜磷脂酰丝氨酸(PS) 由质膜内侧翻向外侧。Annexin V 与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，因而与细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸结合。由于在发生凋亡时，磷脂酰丝氨酸外翻的发生早于细胞核的改变，因此，与DNA 碎片检测比较，使用Annexin V 可以更早地检测到凋亡细胞。因为细胞坏死时也会发生磷脂酰丝氨酸外翻，所以Annexin V 常与鉴定细胞死活的核酸染料(如PI 或7-AAD)合并使用，来区分凋亡细胞(Annexin V+/核酸染料-) 与死亡细胞(Annexin V+/核酸染料+)。 实验用品 1. 一次性12?75mm Falcon试管。 2. PBS缓冲液：含0.1%NaN3，过滤后2-8?C保存。 3. 微量加样器和加样头。

4. Annexin V Binding Buffer缓冲液（Cat. No. 66121E）：浓度为 10?，使用时，用稀释为1?浓度的应用液。 5. Annexin V试剂与核酸染料： Annexin V 核酸染料 Annexin V-Biotin（Cat. No. 65872X）Streptavidin-FITC（Cat. No. 13024D） PI（Cat. No. 66211E）或7-AAD（Cat. No. 34321X） Annexin V-FITC（Cat. No. 65874X）PI（Cat. No. 66211E）Annexin V-PE（Cat. No. 65875X）7-AAD（Cat. No. 34321X） 6. FACS流式细胞仪：上样检测。 7. CELLQuest软件：获取和分析试验数据。 8. Annexin V检测对照管： Annexin V A-阴性对照B-补偿1 C-补偿2 Biotin SAv-FITC Annexin V-Biotin 和SAv-FITC PI 和SAv-FITC PE 未染色细胞Annexin V-PE 7-AAD FITC 未染色细胞Annexin V-FITC PI 操作步骤 1.取Falcon 试管，按标本顺序编好阴性对照管和标本管号。 2.使用冷的PBS缓冲液洗细胞两次，再用1?Binding Buffer缓冲液制成1?106 细胞/ml的悬液。 3.Falcon试管中加入100 μl细胞悬液。 4.按以下体积加入Annexin V与核酸染料： 1阴性对照-- 2单阳1 AV-FITC - 4样本AV-FITC PI 5.轻轻混匀，室温（20?C ~25?C）避光处放置15分钟。

抗肿瘤药物阿霉素对细胞增殖及凋亡的影响

抗肿瘤药物阿霉素对细胞增殖及凋亡的影响 冯景（201111201028）张书（201111201036） 指导老师：张伟 摘要：为了探究抗肿瘤药物阿霉素对细胞增殖及凋亡的影响，使用了MTT比色法测定了细胞给不同浓度后的相对数量，研究其对细胞增殖的影响；使用荧光染色法研究其对细胞形态的影响，并观察细胞凋亡形态。关键字：阿霉素细胞凋亡 MTT Abstract：To explore the anticancer drug doxorubicin effect on cell proliferation and apoptosis, studying its effects on cell proliferation by the MTT that analyzes the relative number of cells after different concentrations; learning its affect on cells morphology using fluorescence staining and apoptotic morphology was observed. Keywords: Apoptosis doxorubicin MTT 近50年的抗肿瘤药物研究开发工作使肿瘤化疗取得相当的进步，特别是使血液系统恶性肿瘤患者生存时间明显延长，但严重威胁人类生命健康的占恶性肿瘤90%以上的实体瘤的治疗尚未达到满意的疗效。抗肿瘤药物正从传统的非选择性单一的细胞毒性药物向针对机制的多环节作用的新型抗肿瘤药物发展。 目前发现许多天然药物具有抗肿瘤作用，部分常用的抗肿瘤药物及其作用机制如表1所示，其中很多抗肿瘤药物可以明显抑制肿瘤细胞的增殖，而对正常细胞的毒副作用较小。

实验室安全操作注意事项

. 实验室安全操作注意事项 每次做完实验，都要及时的分析实验数据，以便总结上次实验的经验与体会，为下一次实验方法的进一步完善提供理论依据。切勿等全部实验做完再来分析，此时才发现这样或那样的不足，造成人力与财力、时间的浪费，盲目地做实验是不足取的。 1 实验安全常识 在化学实验室里，安全是非常重要的，它常常潜藏着诸如发生爆炸、着火、中毒、灼伤、割伤、触电等事故的危险性，如何来防止这些事故的发生以及万一发生又如何来急救。 1.1 安全用电常识 违章用电常常可能造成人身伤亡，火灾，损坏仪器设备等严重事故。物理化学实验室使用电器较多，特别要注意安全用电。为了保障人身安全，一定要遵守实验室安全规则。 (1)防止触电 ①不用潮湿的手接触电器。 ②电源裸露部分应有绝缘装置(例如电线接头处应裹上绝缘胶布)。 ③所有电器的金属外壳都应保护接地。 ④实验时，应先连接好电路后才接通电源。实验结束时，先切断电源再拆线路。 ⑤修理或安装电器时，应先切断电源。 ⑥不能用试电笔去试高压电。使用高压电源应有专门的防护措施。 ⑦如有人触电，应迅速切断电源，然后进行抢救。 (2)防止引起火灾 ①使用的保险丝要与实验室允许的用电量相符。 ②电线的安全通电量应大于用电功率。 ③室内若有氢气、煤气等易燃易爆气体，应避免产生电火花。继电器工作和开关电闸时，易产生电火花，要特别小心。电器接触点(如电插头)接触不良时，应及时修理或更换。 ④如遇电线起火，立即切断电源，用沙或二氧化碳、四氯化碳灭火器灭火，禁止用水或泡沫灭火器等导电液体灭火。 (3)防止短路 ①线路中各接点应牢固，电路元件两端接头不要互相结触，以防短路。 ②电线、电器不要被水淋湿或浸在导电液体中，例如实验室加热用的灯泡接口不要浸在水中。 (4)电器仪表的安全使用 ①在使用前，先了解电器仪表要求使用的电源是交流电还是直流电;是三相电还是单相电以及电压的大小(380V、220V、110V或6V)。须弄清电器功率是否符合要求及直流电器仪表的正、负极。 ②仪表量程应大于待测量。若待测量大小不明时，应从最大量程开始测量。

秀丽线虫生殖细胞凋亡检测

题目：秀丽线虫生殖细胞凋亡检测 实验目的: 1. 掌握检测凋亡细胞的方法 2. 学习使用荧光染料活体染色的方法和步骤 ．实验原理 1. 秀丽隐杆线虫( Caenorhabditis elegans )：是一种无毒无害、可以独立生存的 线虫。其个体小，成体仅 1.5mm 长，为雌雄同体 ( hermaphrodites )，雄性个体仅占群体的 0.2%，可自体受精或双性生殖；在20℃下平均生活史为 3.5 天，平均繁殖力为 300-350 个；但若与雄虫交配，可产生多达 1400 个以上的后代。 1976 年， Sulston 和 Horvitz 利用秀丽隐杆线虫 ( Caenorhabditis elegans ) 研究发现，其约 13%的体细胞在胚胎发育中注定死亡，使得人们认识到细胞凋亡的遗传基础。 2. 荧光染料活体染色：本实验使用吖啶橙( Acridine orange )作为染色剂，该染 料对细胞具有慢性毒性，致癌性强，由于凋亡细胞因 DNA片段化可结合更多染料，荧光显微镜下呈亮绿色，可在荧光显微镜下快速方便的检测出，适用于多数品系。

实验材料及设备 1. 实验材料： a) 各品系秀丽隐杆线虫：N2(实验组) , ced-1::gfp (方法对照组)，ced- 3(阴性对照) b) OP50 c) M9培养基 d) NGM培养基 2. 实验设备： a) 普通光学显微镜 b) 载玻片若干，盖玻片若干，铂金丝 c) 暗箱 d) 吸水纸、滴管等 e) 荧光显微镜 四．实验方法及步骤 1. 线虫接种、同步化 2. 取样：在 12 孔板培养板上，每孔吸取 900μL 预先接入少量 OP50 的 M9 培养基，每孔用铂金丝挑取培养 20~30 条成体线虫 3. 染色：向 N2与 ced-3 品系中每孔加入 250μg/mL 吖啶橙 100μL, 混匀后 置于培养箱(避光)染色 45~60min。 4. 方法对照组观察：向 ced-1::GFP 品系中加入 1 滴盐酸左旋咪唑，麻痹线

实验室安全操作注意事项正式样本

文件编号：TP-AR-L5503 There Are Certain Management Mechanisms And Methods In The Management Of Organizations, And The Provisions Are Binding On The Personnel Within The Jurisdiction, Which Should Be Observed By Each Party. （示范文本） 编制：_______________ 审核：_______________ 单位：_______________ 实验室安全操作注意事 项正式样本

实验室安全操作注意事项正式样本 使用注意：该管理制度资料可用在组织/机构/单位管理上，形成一定的管理机制和管理原则、管理方法以及管理机构设置的规范，条款对管辖范围内人员具有约束力需各自遵守。材料内容可根据实际情况作相应修改，请在使用时认真阅读。 每次做完实验，都要及时的分析实验数据，以便总结上次实验的经验与体会，为下一次实验方法的进一步完善提供理论依据。切勿等全部实验做完再来分析，此时才发现这样或那样的不足，造成人力与财力、时间的浪费，盲目地做实验是不足取的。 1 实验安全常识 在化学实验室里，安全是非常重要的，它常常潜藏着诸如发生爆炸、着火、中毒、灼伤、割伤、触电等事故的危险性，如何来防止这些事故的发生以及万一发生又如何来急救。 1.1 安全用电常识

违章用电常常可能造成人身伤亡，火灾，损坏仪器设备等严重事故。物理化学实验室使用电器较多，特别要注意安全用电。为了保障人身安全，一定要遵守实验室安全规则。 (1)防止触电 ①不用潮湿的手接触电器。 ②电源裸露部分应有绝缘装置(例如电线接头处应裹上绝缘胶布)。 ③所有电器的金属外壳都应保护接地。 ④实验时，应先连接好电路后才接通电源。实验结束时，先切断电源再拆线路。 ⑤修理或安装电器时，应先切断电源。 ⑥不能用试电笔去试高压电。使用高压电源应有专门的防护措施。 ⑦如有人触电，应迅速切断电源，然后进行抢

关于细胞凋亡与疾病

细胞凋亡与疾病 细胞凋亡指机体细胞在发育过程中或在某些因素作用下，通过细胞内基因及其产物的调控而发生的一种程序性细胞死亡。细胞凋亡对胚胎发育及形态发生组织内正常细胞群的稳定、机体的防御和免疫反应、疾病或中毒时引起的细胞损伤、老化、肿瘤的发生进展起着重要作用[1]。自1972年Kerr提出细胞凋亡这一概念后，从20世纪80年代末期开始成为肿瘤病因学、病理学研究热点，近几年的研究在凋亡信号转导途径、细胞凋亡的生化反应机制及细胞凋亡的调控基因，细胞凋亡与疾病的关系等方面都取得了显著的进展[2]。文章就细胞凋亡与疾病的关系进行综述。 1、概述 早在1972年，Kerr等已发现从细胞形态、超微结构和生化变化等方面来分析，细胞有两种死亡形式：一种是早被熟知的细胞坏死(Necrosis)，另一种是细胞凋亡(Apoptosis)[3]。 1.1概念 凋亡(apoptosis)一般是指机体细胞在发育过程中或在某些因素作用下，通过细胞内基因及其产物的调控而发生的一种程序性细胞死亡(programmed cell death)。一般表现为单个细胞的死亡，且不伴有炎症反应。细胞凋亡又称程序性细胞死亡(PCD)，指的是细胞将自身裂解为许多膜小泡的一种精

确调节的细胞死亡过程，是有机体为保持自身组织稳定、调控自身细胞的增殖和死亡之间的平衡、由基因控制的细胞主动性死亡，一种正常的生理过程[4]。细胞凋亡参与调节机体细胞生长与更新间的平衡稳定，在机体发育过程中和成年机体新陈代谢中都起着重要作用。但近年来的研究表明，细胞凋亡还与多种疾病(如发育畸形、神经退化症、自身免疫性疾病、肿瘤、艾滋病等)的发生发展有关，从而使细胞凋亡研究成为生命科学研究的热点之一[5]。 2、细胞凋亡的形态学和生化特征 2.1 形态学特征 细胞凋亡时伴随着细胞膜表面、细胞质和核的一系列形态学改变，首先出现细胞体缩小、胞核固缩、胞浆密度增高，继而胞膜内陷将细胞自行分割为多个有膜包绕的凋亡小体(apoptotis bodies)。凋亡小体几乎立即被邻近的吞噬细胞所吞噬。吞噬细胞内的凋亡小体能停留数小时，可借助组织切片染色用光学显微镜观察[6]。在凋亡发生的全过程中，细胞膜一直保持完整。胞内容物不释放出来，所以不引起周围的炎症反应。同一组织中，不同细胞发生凋亡的过程并不同步[7]。 2.2生化特征 细胞凋亡时，早期Ca2+内流引起胞质中Ca2+浓度持续升高，激活了Ca2+依赖性核酸内切酶，于180碱基对处将DNA 切断，胞质内蛋白质发生交联，产生单个核小体和穴聚核小

细胞凋亡的检测(含图片) 陈英玉

细胞凋亡的检测 细胞凋亡与坏死是两种完全不同的细胞凋亡形式，根据死亡细胞在形态学、生物化学和分子生物学上的差别，可以将二者区别开来。细胞凋亡的检测方法有很多，下面介绍几种常用的测定方法。 一、细胞凋亡的形态学检测 根据凋亡细胞固有的形态特征，人们已经设计了许多不同的细胞凋亡形态学检测方法。 1 光学显微镜和倒置显微镜 （1）未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。 贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。 （2）染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割 成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。 2 荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜 一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。 常用的DNA特异性染料有：HO 33342 (Hoechst 33342)，HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI。三种染料与DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。 Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用时用PBS稀释成终浓度为2~5mg/ml。 DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用终浓度一般为0.5 ~1mg/ml。 结果评判：细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样（creased），部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体(图1)。

巨噬细胞吞噬作用的观察 细胞学实验报告

生命科学学院专业生物技术 2016级生技班612组姓名同实验者 2018年 3 月 26日 题目：巨噬细胞吞噬作用的观察 一．实验目的 1.通过小鼠腹腔巨噬细胞对异物吞噬作用的观察，了解巨噬 细胞在非特异性免疫中的功能。 2.掌握小鼠等实验动物腹腔巨噬细胞采集和制片的方法。 3.学习小鼠腹腔注射的操作方法和步骤。 二．实验原理 1.向小鼠腹腔内注射无菌淀粉肉汤，排异反应使小鼠产生大量 巨噬细胞，且巨噬细胞吞噬淀粉肉汤后不会对细胞造成伤害，反而被“喂养”。连续多天注射使小鼠腹腔内聚集大量巨噬细 胞。 2.台盼蓝是一种生物染料，专一染色死细胞。活细胞的细胞质膜 对台盼蓝有不透过性。巨噬细胞吞噬含有台盼蓝的淀粉肉汤 后，可以消化其中的淀粉和蛋白质，但是不能消化其中的台盼 蓝，因此台盼蓝会聚集在溶酶体中。是一种溶酶体染色的方法。

生命科学学院专业生物技术 2016级生技班612组姓名同实验者 2018年 3 月 26日3.当向小鼠腹腔中注射鸡红细胞时，鸡红细胞作为外源物质，会 被小鼠细胞识别并吞噬，在适当的的时机，我们就有可以在显微镜下观察到巨噬细胞吞噬鸡红细胞的过程 三．实验材料及设备 1.实验材料： a)连续2~3天向腹腔中注射含台盼蓝的淀粉肉汤的小鼠一只 b)鸡红细胞悬液 c)生理盐水 2.实验设备： a)普通光学显微镜 b)载玻片、盖玻片若干 c)注射器 d)染色皿若干、吸水纸、滴管、剪刀、白瓷板等

生命科学学院专业生物技术 2016级生技班612组姓名同实验者 2018年 3 月 26日四．实验方法及步骤 1.小鼠处理与巨噬细胞采集 a)连续2-3天（每天一次）向小鼠腹腔中注射含台盼蓝的淀 粉肉汤。 b)选择已注射淀粉肉汤3小时以上的小鼠一只。 c)一人控制住小鼠，露出腹部，另一人用注射器向小鼠腹腔 中注射1ml鸡红细胞悬液。按摩小鼠腹部。 d)20-30分钟后，再注射1-1.5ml生理盐水（0.9%NaCl）按 摩小鼠腹部。 e)3分钟后，引颈法处死小鼠 f)迅速在腹腔剪开一个不大的开口（注意要剪开腹部的肌肉 层），用无针头的注射器吸取腹腔液。 g)在载玻片上滴2-3滴腹腔液，加上盖玻片，在显微镜下观 察。 2.观察 在不同倍数下观察样本，找到正在消化或者吞噬鸡红细胞 的巨噬细胞。注意避免玻片液体干涸。

实验室安全及防护知识及其常识

实验室安全及防护知识及其常识 (一)实验室安全知识 在生物化学实验室中，经常与毒性很强、有腐蚀性、易燃烧和具有爆炸性的化学药品直接接触，常常使用易碎的玻璃和瓷质器皿以及在煤气、水、电等高温电热设备的环境下进行着紧张而细致的工作，因此，必须十分重视安全工作。 1.进入实验室开始工作前应了解煤气总阀门、水阀门及电闸所在处。离开实验室时，一定要将室内检查一遍，应将水、电、煤气的开关关好，门窗锁好。 2、使用煤气灯时，应先将火柴点燃，一手执火柴紧靠近灯口，一手慢开煤气门。不能先开煤气门，后燃火柴。灯焰大小和火力强弱，应根据实验的需要来调节。用火时，应做到火着人在，人走火灭。 3.使用电器设备(如烘箱、恒温水浴、离心机、电炉等)时，严防触电;绝不可用湿手或在眼睛旁视时开关电闸和电器开关。应该用试电笔检查电器设备是否漏电，凡是漏电的，一律不能使用。 4.使用浓酸、浓碱，必须极为小心地操作，防止溅出。用移液管量取这些试剂时，必须使用橡皮球，绝对不能用口吸取。若不慎溅在实验台上或地面，必须及时用湿抹布擦洗干净。如果触及皮肤应立即治疗。 5.使用可燃物，特别是易燃物(如乙醚、丙酮、乙醇、苯、金属钠等)时，应特别小心。不要大量放在桌上，更不要在靠近火焰处。只有在远离火源时，或将火焰熄灭后，才可大量倾倒易燃液体。低沸点的有机溶剂不准在火上直接加热，只能在水浴上利用回流冷凝管加热或蒸馏。 6.如果不慎倾出了相当量的易燃液体，则应按下法处理: (1)立即关闭室内所有的火源和电加热器。 (2)关门，开启小窗及窗户。 (3)用毛巾或抹布擦拭洒出的液体，并将液体拧到大的容器中，然后再倒入带塞的玻璃瓶中。 7.用油浴操作时，应小心加热，不断用温度计测量，不要使温度超过油的燃烧温度。

《细胞实验》13 流式细胞仪检测细胞凋亡操作流程

流式检测细胞凋亡 Annexin V 检测细胞凋亡 (2) 实验原理 (2) 实验用品 (2) 操作步骤 (3) Annexin V Blocking (5) 凋亡细胞的DNA 断裂片段分析 (7) 实验原理 (7) 实验用品 (8) 操作步骤 (9) BrdU Flow Kits 检测细胞增殖 (12) 实验原理 (12) BrdU Flow Kits 试剂盒 (12) 结果分析 (17) 流式仪器设置指南 (18) 线粒体膜电位变化检测细胞凋亡 (22) 实验原理 (22) 实验用品 (22) 样本制备 (23) 结果分析 (24) 注意事项 (24) Active Caspase-3 检测细胞凋亡 (26) 实验原理 (26) 实验步骤 (27) 结果分析 (28)

Annexin V 检测细胞凋亡 实验原理 Annexin V 是检测细胞凋亡的灵敏指标之一。它是一种磷脂结合蛋白，可以与早期凋亡细胞的胞膜结合，而细胞质膜的改变是细胞发生凋亡时最早的改变之一。在细胞发生凋亡时，膜磷脂酰丝氨酸(PS) 由质膜内侧翻向外侧。Annexin V 与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，因而与细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸结合。由于在发生凋亡时，磷脂酰丝氨酸外翻的发生早于细胞核的改变，因此，与DNA 碎片检测比较，使用Annexin V 可以更早地检测到凋亡细胞。因为细胞坏死时也会发生磷脂酰丝氨酸外翻，所以Annexin V 常与鉴定细胞死活的核酸染料(如PI 或7-AAD)合并使用，来区分凋亡细胞(Annexin V+/核酸染料-) 与死亡细胞(Annexin V+/核酸染料+)。 实验用品 1. 一次性12×75mm Falcon试管。 2. PBS缓冲液：含0.1%NaN ，过滤后2-8°C保存。 3 3. 微量加样器和加样头。

细胞凋亡的几种检测方法

细胞凋亡的几种检测方 法 Company number：【WTUT-WT88Y-W8BBGB-BWYTT-19998】

细胞凋亡的几种检测方法 1、形态学观察方法 （1）HE（苏木精—伊红染色法）染色、光镜观察：凋亡细胞呈圆形，胞核深染，胞质浓缩，染色质成团块状，细胞表面有“出芽”现象。 （2）丫啶橙（AO)染色，荧光显微镜观察：活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光。凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。 （3）台盼蓝染色：如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。此方法对反映细胞膜的完整性，区别坏死细胞有一定的帮助。 （4）透射电镜观察：可见凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集，常呈新月形，核膜皱褶，胞质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。 2、 DNA凝胶电泳 细胞发生凋亡或坏死，其细胞DNA均发生断裂，细胞内小分子量DNA片断增加，高分子DNA减少，胞质内出现DNA片断。但凋亡细胞DNA断裂点均有规

律的发生在核小体之间，出现180－200bpDNA片断，而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片断，利用此特征可以确定群体细胞的死亡，并可与坏死细胞区别。 正常活细胞DNA 电泳出现阶梯状（LADDER)条带；坏死细胞DNA电泳类似血抹片时的连续性条带 3、酶联免疫吸附法（ELISA)核小体测定 凋亡细胞的DNA断裂使细胞质内出现核小体。核小体由组蛋白及其伴随的DNA片断组成，可由ELISA法检测。 检测步骤 1、将凋亡细胞裂解后高速离心，其上清液中含有核小体； 2、在微定量板上吸附组蛋白体’ 3、加上清夜使抗组蛋白抗体与核小体上的组蛋白结合‘ 4、加辣过氧化物酶标记的抗DNA抗体使之与核小体上的DNA结合’ 4、加酶的底物，测光吸收制。 用途 该法敏感性高，可检测5*100/ml个凋亡细胞。可用于人、大鼠、小鼠的凋亡检测。该法不需要特殊仪器，

实验14-细胞凋亡的诱导和检测

实验14 细胞凋亡的诱导和检测 20世纪60年代人们注意到细胞存在着两种不同形式的死亡方式：凋亡（apoptosis）和坏死（necrosis）。细胞坏死指病理情况下细胞的意外死亡，坏死过程细胞膜通透性增高，细胞肿胀，核碎裂，继而溶酶体、细胞膜破坏，细胞容物溢出，细胞坏死常引起炎症反应。 细胞凋亡apoptosis一词来源于古希腊语，意思是花瓣或树叶凋落，意味着生命走到了尽头，细胞到了一定时期会像树叶那样自然死亡。凋亡是细胞在一定生理或病理条件下遵守自身程序的主动死亡过程。凋亡时细胞皱缩，表面微绒毛消失，染色质凝集并呈新月形或块状靠近核膜边缘，继而核裂解，由细胞膜包裹着核碎片或其他细胞器形成小球状凋亡小体凸出于细胞表面，最后凋亡小体脱落被吞噬细胞或邻周细胞吞噬。凋亡过程中溶酶体及细胞膜保持完整，不引起炎症反应。细胞凋亡时的生化变化特征是核酸切酶被激活，染色体DNA被降解，断裂为50～300 kb长的DNA片段，再进一步断裂成180～200bp整倍数的寡核苷酸片断，在琼脂糖凝胶电泳上呈现“梯状”电泳图谱(DNA Ladder)。细胞凋亡在个体正常发育、紫稳态维持、免疫耐受形成、肿瘤监控和抵御各种外界因素干扰等方面都起着关键性的作用。 1．细胞凋亡的检测方法 凋亡细胞具有一些列不同于坏死细胞的形态特征和生化特征，据此可以鉴别细胞的死亡形式。细胞凋亡的机制十分复杂，一般采用多种方法综合加以判断，同时不同类型细胞的凋亡分析方法有所不同，方法选择依赖于具体的研究体系和研究目的（表？）。

形态学观察方法：利用各种染色法可观察到凋亡细胞的各种形态学特征： （1）DAPI时常用的一种与DNA结合的荧光染料。借助于DAPI染色，可以观察细胞核的形态变化。 （2）Giemsa染色法可以观察到染色质固缩、趋边、凋亡小体形成等形态。 （3）吖啶橙(AO)染色，荧光显微镜观察，活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光。凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。 （4）吖啶橙(A())／溴化乙啶(EB)复染可以更可靠地确定凋亡细胞的变化，AO只进入活细胞，正常细胞及处于凋亡早期的细胞核呈现绿色；EB只进入死细胞，将死细胞及凋亡晚期的细胞的核染成橙红色。 （5）台盼蓝染色对反映细胞膜的完整性，区别坏死细胞有一定的帮助，如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。使用透射电镜观察，可见凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集，常呈新月形，核膜皱褶，胞质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。 （6）木精-伊红（HE）染色是经典的显示细胞核、细胞质的染色方法，染色结果清晰。发生凋亡的细胞经HE染色后，其细胞大小的变化及特征性细胞核的变化：染色质凝集、呈新月形或块状靠近核膜边缘，晚期核裂解、细胞膜包裹着核碎片“出芽”凸出于细胞表面形成凋亡小体等均可明显显示出来。 DNA凝胶电泳：细胞发生凋亡或坏死，其细胞DNA均发生断裂，细胞小分子 质量DNA片段增加，高分子DNA减少，胞质出现DNA片段。但凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发生在核小体之间，出现180～200 bp DNA片段，而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片段，利用此特征可以确定群体细胞的死亡，并可与坏死细胞区别。