细胞增殖实验word版

细胞增殖检测方法

细胞增殖检测通常是检测分裂中的细胞数量或者细胞群体发生的变化。目前细胞增殖检测主要分为五类：DNA合成检测、代谢活性检测、细胞数量检测、细胞增殖相关抗原检测和ATP 浓度检测。在这些方法中作何选择，主要取决于所研究的细胞类型和研究方案。

1.DNA合成检测

这是目前实验室中检测细胞增殖最准确可靠的方式。该法是将放射性标记的3H-胸腺嘧啶与细胞一同孵育，这样新增殖细胞的DNA中就会掺入放射性标记，经洗脱后可用闪烁计数器检测。该方法耗时长，而且有个明显的弊端就，即使用和处理放射性物质既麻烦又不安全。不过，可以使用5-溴-2-脱氧尿苷BrdU来进行类似实验，因为BrdU也同样可以掺入到新合成的DNA中。但这样就需要进行额外的实验步骤，先孵育特异性BrdU单抗和带标记的二抗，然后再进行比色法、化学发光检测或荧光信号检测等步骤。该方法的优点就是不再需要放射性物质。BrdU标记很适合免疫组化IHC、免疫细胞化学IC、细胞内ELISA、流式细胞分析和高通量筛选。

2.代谢活性检测

检测细胞群体的代谢活性也可以反映细胞增殖的情况。在细胞增殖过程中脱氢酶的活性会增加，因此其底物四唑盐或Alamar Blue在代谢活跃的细胞环境中会逐渐减少，形成能够改变培养基颜色的甲臜染料。可以通过低配置或高配置的分光光度计和酶标仪来读取含染料培养基的吸光度，从而衡量细胞的代谢活性，检测细胞增殖的情况。

四种最常见的四唑盐是：MTT、XTT、MTS和WST1。MTT在标准的细胞培养基中是不溶的，而且其生成的甲臜晶体需要溶解在DMSO或者异丙醇中。因此，MTT 主要作为终点检测方法。其他三种盐与Alamar Blue一样，都是可溶且无毒。它们可以作为连续监控手段来跟踪细胞增殖的动态改变。其中XTT的效率较低，需要添加额外的因子；WST1更灵敏有效，与其他盐相比能够更快显色；Alamar Blue 的灵敏度也很高，只要微孔板的孔中有100个细胞就能够检测到。四唑盐和Alamar Blue氧化还原染料能够用于多种仪器和高通量研究，非常方便。它们适用的检测仪器包括：标准分光光度计、

荧光分光光度计和酶标仪等。

3.活细胞数量

最直接的增殖指标是活细胞数量的变化。但细胞直接计数法操作繁琐费时，所需细胞量较多，不推荐使用。

4.增殖标志检测

有些抗原只存在于增殖细胞中，而非增殖细胞缺乏这些抗原，因此可以通过特异性的单抗来对细胞增殖进行检测。例如，在人体细胞中，Ki-67抗体识别同名蛋白，在细胞周期S期、G2期和M期（增殖期）表达，而在G0期和G1期(非增殖期)不表达。用针对Ki-67蛋白的单抗就可以检测细胞的增殖情况。由于需要组织切片，这种方法无法进行高通量分析。不过这一方法颇受肿瘤研究者们的青睐，因为它能够用来检测体内肿瘤细胞的增殖。其他普遍使用的细胞增殖或细胞周期调控标志还包括：增殖细胞核抗原PCNA、拓扑异构酶IIB，以及磷酸化组蛋白H3等。

5.ATP检测

细胞内的ATP含量受到了严格调控，检测ATP也可以得到细胞增殖的信息。死亡细胞或即将死亡的细胞几乎不含ATP，在细胞溶解物或提取物中测得的ATP 浓度与细胞数之间存在严格的线性关系。利用荧光素酶luciferase及其底物荧光素luciferin的ATP检测以生物发光为基础，能够提供非常灵敏的结果。如果有ATP存在荧光素酶就会发光，而且其发光强度与ATP浓度成正比，用能读取发光信号的光度计和酶标仪都可以方便的进行检测。这种方法非常适用于高通量细胞增殖检测和筛选。

选择策略

怎样选择最适合的检测方法，主要依赖于使用的细胞类型和具体研究方案，还取决于实验者在细胞增殖中期望得到的信息。假如希望了解细胞增殖中的代谢活性变化，可以使用四唑盐和比色法检测；如果关注重点在于对DNA合成的改变，可以选择用BrdU或EdU标记，再通过比色法、化学发光或荧光检测进行分析；若研究的是单个细胞，也可以用BrdU或EdU标记来检测DNA合成，将其与荧光标记的相应抗体结合，就可以通过流式细胞仪来进行流式分选。

应该注意，测定细胞增殖很多时候单一方法都是有缺陷的，四唑盐—MTT法不够精确；最直接的指标是活细胞数量的变化，结果比较准确，但细胞直接计数法所需细胞量较多，操作繁琐费时；而3H掺入法麻烦且不安全。所以，建议最好用两种以上的方法进行测定，这样做主要是可以有一个用于辅助修正的数据。

EdU实验流程

一、实验原理

EdU（5-Ethynyl-2’- deoxyuridine）是一种胸腺嘧啶核苷类似物，能够在细胞增殖时期代替胸腺嘧啶（T）渗入正在复制的DNA分子中，通过基于EdU与Apollo荧光染料的特异性反应快速检测细胞DNA复制活性，适用于细胞增殖、细胞分化、生长与发育、DNA修复、病毒复制、细胞标记示踪等方面的研究，尤其适合进行siRNA、miRNA、小分子化合物及其他药物的筛选实验。

二、材料及准备工作

试剂、耗材名称品牌货号

广州锐博C10327-1 Cell-Light? EdU Apollo?567

In Vitro Imaging Kit(500T)

细胞培养板或培养皿

☆试剂盒需4?C储存，荧光试剂请避光，勿冻存，可稳定储存一年

溶液配制

1.PBS (pH 7.2~7.6)

PBS缓冲液 10x

NaCl 80 g

KCl 2 g

Na2HPO4·12H2O 36.151 g

(Or Na2HPO4 14.4 g

K2HPO4 2.4 g

蒸馏水至 1000 mL 调pH值至7.4

2.渗透剂(含0.5% Triton X-100的PBS)

3.甘氨酸溶液(2 mg/mL)（去离子水配配制，现用现配）

4.细胞固定液(即含4%多聚甲醛的PBS)

多聚甲醛 4 g

1x PBS定容至100ml，磁力搅拌器加热搅拌，温度控制在60℃以下。

如仍不溶，滴加NaOH (1N或0.1N），调PH值至7.4。

5.1% BSA的PBS

6.甲醇

7.无水乙醇

三、操作步骤及注意事项

A流式检测

1.1 取对数生长期的细胞，105细胞接种于6孔板或培养皿中，培养箱中培养过夜；

1.2 可以根据实验需要进行各种药物处理。

2.1 用细胞培养液以1:1000的比例稀释EdU溶液(试剂A)，制备适量50 μM EdU 培养基；

2.2 每孔加入500 μL 50μM EdU培养基孵育2h。（☆此步务必在超净台内完成）

3.1 用0.25％胰酶进行消化，转至离心管，用1×PBS吸打后，1000rpm×5min，弃上清；

3.2 用含1%BSA的PBS吸打后，1000rpm×5min，弃上清；

3.3 4%多聚甲醛的PBS固定15min，1000rpm×5min，弃上清；

3.4 用含1%BSA的PBS吸打后，1000rpm×5min，弃上清；

3.5 300 μL PBS吹散细胞，加入700 μL 无水乙醇(制成70%乙醇PBS液)，边加边震荡混匀，4℃固定24h以上；

3.6 1000rpm×5min，弃上清。

4.1 按下列顺序配置适量1× Apollo?反应液（☆现用现配，30分钟用完，以免破坏正常的反应体系）：

4.2 加入500 μL的1×Apollo?染色反应液，重悬细胞，避光室温孵育30 min，1000rpm×5 min；

4.3 加入500 μL 0.5% TritonX-100的PBS吸打，1000rpm×5min，重复2次；

4.4 每孔每次加入100 μL 甲醇冲洗1次，每次5min；PBS 100μL脱色摇床5min。

5.1 用去离子水按100:1稀释试剂F，制备适量1×Hoechst33342反应液，避光保存；

5.2 弃上清，加入500 μL 1× Hoechst 33342反应液，避光室温孵育30min，1000rpm×5min；

5.3 加入500 μL PBS吸打，1000rpm×5min，重复2次，洗脱Hoechst 33342

反应液。

6.1 1000rpm×5min收集细胞，300 μL PBS吹散细胞，自备300目尼龙滤膜过滤（若吹打成单细胞悬液，可不过网）；转至流式管进行流式细胞仪分析，荧光通道依据实验仪器而设定。

B荧光显微镜检测

1.1 取对数生长期的细胞，4×103~1×105细胞接种于96孔板中（☆细胞接种密度，没有严格要求，只要不影响显微镜下观察即可），培养箱中培养过夜；

1.2 可以根据实验需要进行各种药物处理。

2.1 用细胞培养液以1:1000的比例稀释EdU溶液（试剂A），制备适量50μM EdU 培养基；

2.2 每孔加入100 μL 50μM EdU培养基孵育2h。（☆此步务必在超净台内完成）;

2.3弃培养液，100 μL PBS清洗细胞2次，脱色摇床上，每次5min。

3.1 每孔加入100 μL 4% 多聚甲醛的PBS，室温脱色摇床孵育30 min；

3.2 2 mg/mL 甘氨酸脱色摇床孵育5 min；（☆可在多聚甲醛固定时配置，现用现配。目的：中和多聚甲醛）

3.3 每孔加入100 μL PBS脱色摇床孵育每次5 min；

3.4 每孔加入100 μL 0.5% TritonX-100的PBS，脱色摇床孵育10 min；

3.5 每孔加入100 μL PBS脱色摇床孵育1次，10 min。

4.1 按下列顺序配置适量1×Apollo?反应液（☆现用现配，30分钟用完，以免破坏正常的反应体系）：

4.2 每孔加入100 μL的1×Apollo?染色反应液，避光，室温脱色摇床孵育30 min；

4.3 每孔每次加入100 μL渗透剂（0.5% TritonX-100的PBS）脱色摇床孵育2次，每次10min；

4.4 每孔每次加入100 μL 甲醇冲洗1次，每次5min；PBS 100 μL脱色摇床5min。

5.1 用去离子水按100：1稀释试剂F，制备适量1×Hoechst33342反应液，避

光保存；

5.2 每孔加入100 μL 1×Hoechst 33342反应液，避光，室温脱色摇床孵育30 min；

5.3 每孔每次加入100 μL PBS脱色摇床孵育2次，每次5min，洗脱Hoechst 33342反应液。

6.1建议染色完成后，立即进行观测，因易淬灭，曝光时间建议＜30ms；如果条件限制，请避光4℃湿润保存待测，但不要超过3天。

☆特别注意

1、Apollo染色反应液一定要现用现配，按顺序加样，小心称量试剂E，注意避

光。试剂E易氧化，用毕请立即盖紧瓶盖。若发现试剂E粉末变黄，极可能是发生了氧化失效。

2、EdU的使用浓度，用50μM的较多，可以在10-50μM间选择合适条件。

3、EdU荧光极易淬灭，请染色后立即送检或镜下观察。

附：EdU与BrdU实验步骤比较

EdU（5-Ethynyl-2’-deoxyuridine）是一种胸腺嘧啶核苷类似物，能够在细胞增殖时期代替胸腺嘧啶（T）渗入正在复制的DNA分子中，通过基于EdU与Apollo荧光染料的特异性反应快速统计处于S期的细胞百分数来检测细胞DNA 复制活性。适用于细胞增殖、细胞分化、生长与发育、DNA修复、病毒复制、细胞标记示踪等方面的研究，尤其适合进行siRNA、miRNA、小分子化合物及其他药物的筛选实验。

https://www.wendangku.net/doc/789873684.html,的荧光染料是小分子物质(0.6×103 )，相对于BrdU抗体这样的大分子

物质(150×103)来说能够轻松地透过膜结构，这种能够有效快速地扩散和穿透组织的能力使得大的组织和器官碎片标本的快速处理成为可能。

2.这种小分子化学反应检测方法反应快，效率高，反应时间仅需几分钟，相比

BrdU检测需要抗原抗体过夜孵育，EdU检测只需要2.5个小时。

https://www.wendangku.net/doc/789873684.html,在检测掺入DNA分子中的乙炔基与小分子荧光叠氮化合物反应时不需要

进行DNA变性处理（酸解、热解、酶解等），有效保证了DNA双链结构的完整性,避免样品损伤。不会像BrdU标记检测那样影响细胞核的复染，也不会破坏细胞的形态学特征以及细胞核抗原的识别位点。因此，EdU检测技术就可以与包括细胞周期分析在内的其他DNA染色相结合，并且很好地相容。这种简单化的处理方式同样有助于在组织器官的整体水平上观测细胞增殖的真实情况，使其具有更高的敏感度和更快的检测速度。

https://www.wendangku.net/doc/789873684.html,标记可以通过结合其他抗体标记等技术，对细胞表面或细胞内特异性标

志物进行多重检测和多参数分析，在细胞水平进行系统性定量检测，直接获取细胞多维信息，深入开展细胞增殖、细胞周期、细胞毒性、DNA复制及修复、信号通路等方面的研究。

5.不同于BrdU标记检测技术那样依赖于抗原抗体的结合，EdU检测中形成的这

种特殊的生物合成物(稳定的三唑环) 无需抗原抗体反应，有效地降低了背景的干扰，并显著提高了检测的灵敏度。

6.BrdU需要DNA变性后才能与抗体结合，导致BrdU、Hoechst染色弥散，边缘

模糊不清；而EdU边缘清晰完整，检测更灵敏、更准确；Apollo染料分子很小，能够轻松地透过膜结构，无需

DNA变性即可与EdU特异结合发光，而且不会影响其与其它染料的结合，能够准确进行DNA定量。

EU 是尿嘧啶的类似物，同样通过“click”化学反应能够标记上荧光。所不同的是EU是在细胞转录合成RNA的时候掺入到RNA里面。所以用这个技术能够染出目标细胞新合成的RNA，从而达到检测细胞活性、毒性、RNA转录定位、RNA 分布检测及RNA与蛋白的相互作用（此项需结合免疫荧光技术使用）等研究的目的，同样有高精度、高灵敏度、操作简单方便等诸多优点。EU是研究细胞活性、毒性及RNA转录情况和机制等的理想工具。

MTS 检测细胞增殖实验

一、 实验原理

本试剂盒是一种用比色法来检测细胞增殖和细胞毒实验中的活细胞数量的检测试剂。此试剂含有一个新型的四唑化合物

[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphe

nyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium, inner salt; MTS(a)]和一种电子偶联剂(phenazine ethosulfate ; PES)。PES 具有增强的化学稳定性，这使它可与MTS 混合形成稳定的溶液。MTS (Owen’s reagent) 被细胞生物还原成为一种有色的甲臜产物，可直接溶解于培养基中（图1）。这种转化很可能是在代谢活跃的细胞中的脱氢酶产生的NADPH 或NADH 的作用下完成的。检测时，将少量的CellTiter 96? AQueous One Solution Reagent 直接加入培养板孔的培养基中，孵育1–4小时，在490nm 处检测到的甲臜产物的量与培养中的活细胞数成正比。 二、

材料及准备工作

试剂、耗材名称 品牌 货号

CellTiter 96? AQueous One Solution Cell Proliferation

Assay

Promega

G3581(5000T) 96孔细胞培养板

☆特别注意

1. –20°C 避光长期储存；频繁使用时4°C 避光保存6周。注意：实验证明此试剂冻融10次后与新鲜的试剂使用效果相同；

2. 此物质的化学、物理和毒理学性质还未完全研究清楚，因此建议在使用此试剂时带手套，穿实验服并带护目镜；

3. CellTiter 96? AQueous One Solution Cell Proliferation Assay是

光敏感试剂，装在琥珀色的容器中。试剂暴露在光线下数小时后可能会发生褪色。这种褪色反应可能会导致490nm的背景吸光值轻微升高，但不会影响检测结果。

实验准备

1.多道加样器（排枪），或连续式加样器；

2.酶标仪。

三、操作步骤及注意事项

1．取对数生长期的细胞，以5×103细胞接种于96孔板中作为增殖研究的起始细胞数。或根据实验细胞的增殖曲线选择合适的接种密度；

☆由于最外缘培养孔中培养基的挥发较强，尽量避免在其中种入细胞，并且最好能够在其中加入一定量培养基保证中间孔不会产生过度挥发。

2．可以根据实验需要进行各种药物处理。

2.1 室温静止90分钟或37°C水浴10min，使CellTiter 96? AQueous One Solution Reagent融化。

3.1 在96孔板中，每孔100ul培养基加20μl CellTiter 96? AQueous One Solution Reagent；

☆推荐以排枪或连续式加样器及数字式加样器加试剂，以保证加样方便准确3.2 在37°C，5% CO

的环境下孵育1-4h，通常2h为；

2

☆如果立刻检测就直接进行后续步骤，如果需要以后检测，每孔加入25 μl 10% SDS终止反应，避光保存于室温的湿盒中，最多可保存18h，然后再继续。

3.3 酶标仪490nm读取吸光度值。

☆特别注意

1.读取波长选择：图2显示MTS还原后产生的甲臜产物的吸光度光谱。推

荐在吸收峰490nm读取数据。如果酶标仪没有490nm的滤片,可以在450–

540nm范围内读取数据。如果需要，可以在其它波长读取吸光度值，但检

测灵敏度会降低。在630–700nm范围的参考波长可以用来减去细胞碎片

图2. MTS四唑化合物还原后产生

的甲臜产物的吸光度光谱在

490nm显示最大吸光值。负吸光

值（382nm）对应的是MTS的消

失（转化成甲臜产物）。

过多造成的背景值，以及其它非特异性吸光度值。

2.490nm的背景吸光度值校正:在以MTS试剂孵育后，细胞培养基中会在

490nm有微量的自发产生的吸收光。使用的细胞培养基种类，血清种类，pH

和暴露在光线下的时间长度都可能会影响490nm的背景吸光度值。孵育4h

后，背景吸光度值通常在0.2–0.3。背景吸光度可能受某些带四唑还原反应

的化合物的影响。强还原物质，包括维生素C,或含巯基的化合物, 如谷胱甘

肽，辅酶A和二硫苏糖醇, 能够以非酶的方式还原四唑盐，从而导致背景吸

光值的增加。高pH的培养基或长时间暴露在直接光照下面也可能导致自发

的四唑盐还原反应的加速进而导致背景吸光值的增加。如果使用含酚红的培

养基，快速的颜色变化可能指示待测化合物引起的pH值变化。待测化合物

产生的特异的化学干扰可以通过检测对照孔（含有不同浓度待测化合物的培

养基，但是不含细胞）的吸光度来确定。490nm的背景吸光度值可用下述方

法校正：准备3个重复的无细胞对照孔，含有与实验孔同样体积的细胞培养

基和CellTiter 96? AQueous One Solution Reagent。从所有其它孔的吸

光值中减去“无细胞”对照孔在490nm的吸光度平均值，即可得到校正的吸

光度值。

细胞增殖及细胞活力检测方法

细胞增殖及细胞活力检测方法 目前主要有两种用于检测细胞增殖能力的方法。一种是直接的方法，通过直接测定进行分裂的细胞数来评价细胞的增殖能力。另一种是间接的方法，即细胞活力（cell viability）检测方法，通过检测样品中健康细胞的数目来评价细胞的增殖能力。显然，细胞活力检测法并不能最终证明检测样品中的细胞是否在增殖。如细胞在某一培养条件下会自发启动凋亡程序，但药物的干扰可抑制凋亡的发生；这时若采用细胞活力检测法，显然可以区分两种条件下的细胞数量，但我们并不能从药物干扰组细胞数大于对照组的事实说明药物可促进细胞增殖的结论。所以最直接的证据应该采用方法一。 用于检测细胞增殖能力最经典的方法是用氚标记的胸腺嘧啶核苷处理细胞，再检测DNA链中氚含量。若细胞具有增殖能力，DNA合成过程中将会采用氚标记的胸腺嘧啶核苷作为合成原料，因此检测细胞DNA链内标记核苷酸的量可判断细胞是否进行DNA 的合成。 但更为常用的方法是BrdU检测法。用BrdU预处理的细胞中，BrdU可代替胸腺嘧啶核苷插入复制的DNA双链中，而且这种置换可以稳定存在，并带到子代细胞中。细胞经过固定和变性处理后，可用免疫学方法检测DNA中BrdU的含量（如采用鼠抗BrdU单克隆抗体特异识别BrdU,再采用辣根过氧化酶标记的山羊抗鼠IgG二抗标记，最后用比色法或荧光的方法进行定量测定），从而判断细胞的增殖能力。Calbiochem/EMD公司提供一种BrdU检测试剂盒，以微孔板的形式，合并所有清洗、固定、变性的步骤以单一试剂当中。比色检测在一抗二抗标记后在450nm下读数，

所有操作在3小时内结束。而且该试剂盒的灵敏度与市场上其他同类产品相比是最强的。1000个细胞以上水平的检测只需用BrdU预孵育2小时，100个细胞则采用过夜预孵育，即可检测细胞的增殖能力。 BrdU法的一个缺点是需要固定和变性等破坏DNA的处理。有些情况下，研究者可能希望在测定细胞增殖能力的同时检测细胞的总DNA含量，然而，在变性条件下，DNA 的双链结构将被破坏，DAPI和Hoechest 33342等核酸标记探针就不再能识别DNA，因而也无法估计DNA总量。Molecular Probes公司的Click-iT EdU检测试剂盒可以解决这个问题。这种方法不需要变性步骤，因为荧光探针标记的叠氮化物小分子，而不是庞大的抗体分子，可以很轻易的识别并结合未变性DNA双链中的EdU分子。采用BrdU方法时，你必须非常小心的去对DNA进行变性，才能一方面使BrdU抗体进入细胞，另一方面又保留足够的双链DNA分子来进行细胞周期的分析。有了EdU 后则不同，由于你不再需要变性，这一切都很简单了；另外，常常用于DNA变性的HCl，可能破细胞内坏蛋白的抗原识别位点，因而限制了BrdU检测法中同时检测其他蛋白的应用，但这种情况在EdU法中不存在。 图1：EdU及BrdU原理示意图（摘至invitrogen说明书） 在一些情况下，细胞活力的检测相当于细胞增殖能力的测定。用于细胞活力检测的方法又很多，这些方法主要采用特殊的试剂来测定细胞的代谢活力，Alamar Blue，MTT及其他四唑盐。它们通过检测细胞的氧化还原活性来检测细胞增殖能力，所以这是一种间接的方法。 Calbiochem的快速细胞增殖试剂盒，或者，严格来说，叫细胞活力试剂盒，采用一

细胞增殖教学设计

《细胞的增殖》教学设计 巨鹿二中王耀华 一．教材分析： 细胞的增殖是必修一《分子与细胞》第六章第1节的内容。是学生在学习了细胞生命系统的物质组成、结构之后，来认识细胞这个系统的产生、发展和消亡的过程。细胞分裂的三种方式中，有丝分裂是最主要、同时也是最重要的方式。多细胞生物的生长发育过程中，体细胞的增多就是通过有丝分裂实现的。无论是单细胞真核生物还是多细胞生物他们各种形式的无性生殖也是通过有丝分裂完成的。有丝分裂还是学习减数分裂的基础，而减数分裂知识又是学习遗传变异规律的基础。由此可见有丝分裂是非常重要的基础知识。因此在教学过程中一定要讲透，要让学生真正掌握有关知识。 二、学情生分析： 高一的学生由于在初中基本上不学习生物学，对生物学中的一些基本概念不甚了解，而且缺乏一定的空间感，故对本节内容的学习比较困难。因此要借助多媒体或模型来帮助理解。三．教学方法： 本节课教学内容理论性强、抽象复杂，所以课前我指导学生做好预习，课堂上充分利用多媒体辅助教学，增强教学的直观性和形象性性通过上一节课的模拟探究使学生了解了细胞增殖的必要性，明白了生物体的生长还要靠细胞增殖增加细胞数量。可以通过不同方式，从不同的角度进行分析，要充分调动学生参与整个学习过程。通过学习使学生了解到认识和分析一个生命现象可以有多种不同的方法——除了一般的文字描述外，还可以用图形描述特点；用图解和表格突出重点；用曲线描述量的变化规律和趋势；通过实验观察、验证生物学知识等……。使学生在掌握知识的同时了解一些常用的生命科学研究的基本方法。在讲有丝分裂各时期的主要特点时，我采用了FLASH动画逐步演示有丝分裂各时期，很好地让学生感受细胞分裂过程的动态性和连续性。黑板粘贴模型克服了多媒体手段转瞬即逝的弊端，较好地化难为易，化抽象为形象。 四．教目学标： （一）知识目标： 1、了解真核细胞增殖的方式及意义。 2、理解细胞周期的概念。 3、准确描述细胞有丝分裂各阶段的重要特征。了解动、植物细胞有丝分裂过程的异同。 4、掌握有丝分裂的过程、特征和意义。尤其是DNA和染色体的规律性变化。 （二）能力目标： 1、学习用曲线图描述DNA和染色体数量的变化规律 2、通过学习有丝分裂过程培养学生分析图像、解读图像的能力。 3、通过实验培养学生制作临时装片的技能，培养学生的观察、分析能力以及识图和绘图能力。 （三）情感态度与价值观： 1、通过对细胞周期以及有丝分裂过程中DNA和染色体的规律性变化的学习，培养学生树立唯物主义的世界观。使学生对生命的运动性、对事物发展变化过程中由量变到质变的转化等哲学问题有正确的认识。 2、通过对实验思路的分析和对实验现象的观察培养学生实事求是的科学态度和严谨的科学工作作风。 五．教学重难点： 教学重点：1、细胞周期的概念。

Brdu细胞增殖检测实验

Brdu检测细胞增殖实验 实验操作: 孵箱中培养72h（细胞密1．铺细胞，每个3.5cm dish 10万个，在37℃、5%CO 2 度至50-60%左右）。 2．Brdu（5-溴-2′-脱氧尿苷）加入培养细胞中，1mg/ml，标记48h。(量：Brdu 以铺满整个dish底面为准。) 3．固定：PBS洗细胞爬片3次，每次5min，在摇床上晃动清洗，4%PFA固定30min。4．变性：将固定好的细胞爬片用PBS洗3次，每次5min，2mol/L的HCl在37℃条件下变性5min，可放置于37℃恒温孵箱，应用封口膜把培养皿封好。（120r/m）5．中和：0.1mol/L的硼酸钠（PH8.3）中和10min，PBS洗3次，每次5min。（50r/m）6．加入1ml的0.2%TritonX-100，10min。 7．吸出TritonX-100，用PBS洗3次，每次5min。 8．加入1ml 3%的BSA封闭，室温1h，可在摇床上晃动。 9．吸出BSA，用PBS洗3次，每次5min。 10．加一抗（尿嘧啶脱氧核苷Brdu（鼠单抗）1:200），用1%BSA稀释，4度过夜。11．将孵好一抗的细胞爬片用PBS洗3次，每次10min。 12．加二抗（羊抗鼠IgG/Alexa Fluor 594 1: 100），用1%BSA稀释，避光室温孵育1h。（60 r/min） 13．将孵好二抗的细胞爬片用PBS洗3次，每次10min。 14．加DAPI染细胞核，储存浓度为1mg/ml，应将DAPI完全混匀，可用手弹几下，一般稀释比例为1:1000（用PBS稀释），避光室温反应10min。 15．将DAPI染好的细胞爬片用PBS洗3次，每次10min。 16．中性树胶封片，荧光显微镜观察，200×镜下取5个视野，计数Brdu阳性细

CCK8法检测细胞增殖预实验

SRT-1720, EX527 —定要应用在白血病细胞株起作用的浓度方可比较对 293T细胞和白血病细胞株的不同影响，请重复实验。 实验日期：2015/08/22-2015/08/27 实验项目：CCK8法检测细胞增殖 实验地点：广西医科大学药基楼14楼生物靶向中心 实验人员：高宗燕、宁海萍、李登峰 实验目的：检测SRT-1720/EX527刺激293T细胞后对细胞增殖的影响 主要试剂：SRT-1720,EX527,CCK8试剂盒 主要仪器：酶标仪 实验步骤： 一、制作标准曲线（测定细胞具体数量时） 1、先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，然后接种细胞至96孔板。 2、设置4个细胞浓度梯度：0, 2000，4000，8000,每组4个复孔。 3、接种后培养24小时使细胞贴壁，然后加CCK试剂培养4小时后测定OD值，制作出一条以细胞数量为 横坐标（X轴），OD值为纵坐标（Y轴）的标准曲线。根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量（试用此标准曲线的前提是实验的条件要一致，便于确定细胞的接种数量以及加入CCK后的培养时间。） 图一、标准曲线 二、细胞增殖检测 1、在96孔板中配置100卩泊勺细胞悬液。将培养板在培养箱预培养24小时（在37C, 5% CO2的条件下）。 2、向培养板加入10 ^L SRT-1720（终浓度3um）, EX527 （终浓度100um）。 3、将培养板在培养箱孵育约24h 4、每孔加入10卩L CCK溶液（注意不要再孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数）。

5、将培养板在培养箱内孵育2小时。

6、用酶标仪测定在450nm处的吸光度。 图二、3um SRT1720刺激293T细胞后的细胞增殖曲线。该曲线呈S形，符合细胞正常生长情况。 图三、100um EX527刺激293T细胞后的细胞增殖曲线。该曲线前部分呈S形，符合细胞正常生长情况，但 在进入对数期之后曲线有下滑，之后进入平台期。 分析： SRT1720为SIRT1特异性活化剂，在前期实验中对白血病细胞株的生长表现出抑制作用，此次实验中SRT1720对正常细胞（293T）的生长无明显抑制作用。暗示SIRT1的活化对正常细胞的生长可能无明显影 响。 小剂量EX527为SIRT1特异性抑制剂，在前期实验中大剂量EX527对白血病细胞株的生长表现出抑制作用，而小剂量EX527无此效应，此次实验中大剂量EX527对正常细胞（293T）的生长可能有轻度抑制作用。但不能以一次实验结果做出肯定的结论，该实验还需重复。

高中生物知识点——细胞的增殖

高中生物知识点——细胞的增殖 知识点1细胞不能无限长大 1.细胞生长的原因 (1)细胞的生长 (2)细胞数目的增多 2.细胞不能无限长大的原因 (1)细胞体积越大，其相对表面积越小，细胞的物质运输效率越低。细胞表面积与体积的关系限制了细胞的生长。 (2)细胞核所控制的细胞质范围有一定的限度，细胞核中的DNA不会随细胞体积的扩大而增加。细胞的核质比限制了细胞的生长。 3.模拟实验 (1)琼脂块的表面积与体积之比：随琼脂块的增大而减小。 (2)NaOH的扩散速率(深度)：随琼脂块的体积增大保持不变。 (3)NaOH扩散的体积与整个琼脂块体积之比：随琼脂块体积的增大而减小。 知识点2细胞通过分裂进行增殖 1．细胞周期

1．细胞的增殖状态 (1)能持续分裂的细胞：红骨髓造血细胞、形成层细胞、根尖分生区细胞等； (2)暂时停止分裂的细胞：肝脏细胞、黄骨髓造血细胞等； (3)不能持续分裂的细胞：高度分化的细胞，如神经细胞、精子等。 3.细胞周期的判断方法 (1)细胞周期以分裂间期为起点，而不能以分裂期为起点。 (2)分裂间期的时间远远长于分裂期。 知识点3有丝分裂 1.真核细胞的分裂方式 真核细胞可进行有丝分裂、无丝分裂和减数分裂。 2.有丝分裂过程（以高等植物细胞为例） (1)分裂间期 完成DNA的复制和有关蛋白质的合成 (2)分裂期

3.有丝分裂中规律性变化规律 (1)有丝分裂相关结构的变化规律 (2)有丝分裂过程中染色体行为变化规律

(3)核DNA、染色体及染色单体数目变化规律(以二倍体为例) 数量变化： 曲线变化模型： (4)染色体、染色单体及DNA三者之间的数量关系 当有染色单体存在时，染色体∶染色单体∶DNA＝1∶2∶2。 当无染色单体存在时，染色体∶DNA＝1∶1。 4.动植物细胞有丝分裂的区别 5.有丝分裂的意义 亲代细胞的染色体经过复制后精确地平均分配到两个子细胞中，保持了细胞的亲子代之间遗传性状的稳定性。

CFSE细胞增殖实验

准备： 1.20ml预冷5%FBS(HI)-PBS 2.50ml 预冷MACS buffer 3.70um滤网 4.2.5ml RBC lysis 5.LS column 6.50ml 37度预热PBS 7.50ml 37度预热complete culture medium(RPMI 1640 +10% Heat Inactivated FBS+10 mM HEPES+1 mMpenicilline streptomycin+ 50 mM 2-mercaptoethanol) （一）CD3抗体包被 取96孔板每孔加入100ul 10ug/ml anti-CD3抗体（PBS）密封4度过夜。 （二）淋巴细胞获取 1.小鼠的脾脏结摘取于10ml 冷5%FBS-PBS中。 2.于70um滤网研磨滤过，500g 4度5min离心后弃上清。 3.2.5ml RBC lysis裂红5 min，10ml 冷5% PBS终止。

4.500g 4度5min 离心后弃上清，10ml MACS buffer重悬，计数。留取105 个细胞进行FACS。 （三）磁珠分选na?ve CD8a+ T细胞 1.Centrifuge cell suspension at 300×g for 10 minutes. Aspirate supernatant completely. 2.Resuspend cell pellet in 400 μL of MACS buffer per 108 total cells. 3.Add 100 μL of Naive CD8a+ T Cell Biotin-Antibody Cocktail per 108 total cells. 4.Mix well and incubate for 5 minutes in the refrigerator (2?8 °C). 5.Add 200 μL of MACS buffer per 108 total cells. 6.Add 200 μL of Anti-Biotin MicroBeads per 108total cells. Add 100 μL of CD44 MicroBeads per 108 total cells. 7.Mix well and incubate for an additional 10 minutes in the refrigerator (2?8 °C). 8.Wash cells by adding 10ml of MACS bufferper 108 cells and centrifuge at 300×g for 10 minutes. Aspirate supernatant completely. 9.Resuspend up to 108cells in 500 μL of MACS bu ffer. 10.Place LS column in the magnetic field of a suitable MACS Separator.

细胞增殖实验(MTT法)的步骤及方法

细胞增殖实验（MTT法）的步骤及方法 一、技术简介 细胞增殖是生物体的重要生命特征，细胞以分裂的方式进行增殖。单细胞生物，以细胞分裂的方式产生新的个体。多细胞生物，以细胞分裂的方式产生新的细胞，用来补充体内衰老和死亡的细胞；同时，多细胞生物可以由一个受精卵，经过细胞的分裂和分化，最终发育成一个新的多细胞个体。必须强调指出，通过细胞分裂，可以将复制的遗传物质，平均地分配到两个子细胞中去。可见，细胞增殖是生物体生长、发育、繁殖和遗传的基础。真核细胞的分裂方式有三种，即有丝分裂、无丝分裂和减数分裂。 MTT是3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide的简称。活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。然后采用二甲基亚砜（DMSO）溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在570 nm波长处测定其光吸收值，反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。 二、实验流程（以贴壁细胞为例） 1. 收集对数期细胞，调整浓度。 2. 将细胞种植于96孔板中，待细胞贴壁后（约4-12 h）加药。 3. 5% CO2，37 o C孵育一定时间。 4. 每孔中加入200 μL MTT溶液（配制成5 mg/ml），培养4 h。 5. 吸去孔内的培养液，加入150 μL DMSO，可继续孵育4 h，使结晶物充分溶 解。 6. 取出96孔板，将其置于酶联免疫检测仪上，震荡15 s，然后在570 nm下 测量吸光值。 7. 结果统计分析。

(完整版)高中生物《细胞的增殖》练习题

细胞的增殖练习 一．选择题 1．高等动物器官的大小主要决定于( ) A．细胞体积的大小，B．细胞数量的多少 C．细胞体积的大小和数量的多少D．细胞大小一般无明显差别 2．下列叙述正确的是( ) A．细胞只能适度增大，不能无限增大B．细胞越小越好 C．生物细胞的大小可以各种各样D．细胞越大越好 3．在一个细胞周期中( ) A、分裂间期占有的时间长 B、分裂间期占有的时间短 C、分裂期占有的时间长 D、分裂间期和分裂期占有的时间相当 4．关于植物细胞有丝分裂中期叙述不正确的是( ) A．染色体的形态较稳定，数目较清晰 B．每条染色体都有两条染色单体 C．每条染色体的着丝点都排列在细胞中央的赤道板位置上 D．每条染色体中只有一个ＤＮＡ分子 5．细胞核中每条染色体着丝点分裂为两个，一条染色体的两条染色单体彼此分开的时期是A．前期 B，中期 C，后期 D．末期( ) 6．植物有丝分裂期中，不具有姐妹染色体的是( ) A．前期 B．中期 C．后期 D．末期 7．动物细胞中心粒倍增的时期是( ) A．分裂间期 B．分裂前期 C．中期 D．后期 8．生物有丝分裂使细胞的亲代和子代保持遗传性状的稳定，这是因为 ( ) A．子代细胞和亲代细胞的染色体上的遗传物质DNA不变 B．分裂间期染色体和DNA自我复制一次 C．分裂后期染色体和DNA分子平均分配了一次 D．分裂期细胞平均分裂了一次 9．动物细胞的无丝分裂中( ) A．一般是细胞核先延长，中部凹陷缢裂为两个细胞核 B．一般是整个细胞先延长，中部凹陷缢裂为两个细胞 C．有纺锤丝的出现 D．也有染色体的出现 10．人体皮肤受伤后，伤口处细胞分裂促使伤口愈合，这种细胞分裂是( ) A．无丝分裂B．有丝分裂C．减数分裂D．分裂生殖11．在观察洋葱根尖细胞有丝分裂的过程中，你观察时，处于哪一个时期的细胞最多A．分裂中期B．分裂后期C．分裂前期或分裂末期D．分裂间期( ) 12．洋葱根尖细胞染色用龙胆紫溶液或醋酸洋红液，主要是因为 A．易使细胞染色 B．细胞质着色( ) C．细胞壁着色 D．染色体着色 13．有丝分裂中“丝”指的是( ) A．染色质丝 B．染色体 C．姐妹染色体 D．纺锤丝 14．细胞既不能无限长大，也不能无限小，细胞最小的限度是由什么决定的( ) A．生物的种类所决定 B．细胞的表面积与体积的比

细胞增殖MTT检测经验总结

细胞增殖检测：MTT实验经验总结 MTT分析法以活细胞代谢物还原剂3-（4，5）-dimethylthiahiazo （-z-y1）-3，5-di- phenytetrazoliumromide，MTT噻唑蓝为基础。MTT为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下tetrazolium环开裂，生成蓝色的formazan结晶，formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比（死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原）。还原生成的formazan结晶可在含50%的N，N-二甲基甲酰胺和20%的十二甲基磺酸钠（pH 4.7）的MTT溶解液中溶解，利用酶标仪测定490 nm处的光密度OD值，以反映出活细胞数目。也可以用DMSO来溶解。 MTT粉末和溶液保存时都需要避光，用铝箔纸包好就可以。实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光，觉得这样比较好。 一、步骤 1、接种细胞 用含10%胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000－10000个细胞接种到96孔板，每孔体积200ul。 2、培养细胞 同一般培养条件，培养3－5天（可根据试验目的和要求决定培养时间）。 3、呈色 培养3－5天后，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS 配）20ul.继续孵育4小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150ul DMSO，振荡10分钟，使结晶物充分融解。 4、比色 选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。 二、注意事项 1、选择适当得细胞接种浓度。 2、避免血清干扰：一般选小于10%的胎牛血清的培养液进行试验。在呈色后尽量吸尽孔内残余培养液。 3、设空白对照：与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照。其他试验步骤保持一致，最后比色以空白调零。 MTT实验吸光度最后要在0-0.7之间，超出这个范围就不是直线关系， IC50是半抑制率，意思是抑制率50％的时候药物的浓度。把药品稀释成不同的浓度，然后计算各自的抑制率，以药品的浓度为横坐标，抑制率为纵坐标作图，然后得到50％抑制率时候的药品浓度，就是IC50。要点：药品2倍稀释，多做梯度，做点线图即可！ 三、举例 各组浓度0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001，稀释倍数为10，最大浓度为0.1，抑制率为0.95、0.80、0.65、0.43、0.21，0.06。代入计算公式：

细胞增殖毒性实验步骤cck8知识讲解

如有侵权请联系网站删除 细胞增殖-毒性实验步骤 1、细胞传代、细胞计数、细胞增殖-毒性实验步骤： 实验准备：用75%酒精擦生物安全柜台面2遍，紫外线消毒30分钟（枪、枪头、 15ml及50ml离心管、剪刀、封口膜、记号笔、打火机、酒精灯、培养瓶），复温实验所需试剂［细胞培养液（DMEM、1640）、磷酸缓冲盐溶液（PBS、胰酶（0.25% Trypsin-EDT）胎牛血清（FBS、双抗］，所有的试剂、仪器放入生物安全柜前要用酒精喷洒消毒。显微镜下看细胞生长状态，有无污染。 1、倒去培养瓶内的培养液； 2）加入PBS 2ml洗涤培养瓶内细胞2次； 3）加入胰酶500ul/0.5ml 2?10min （具体时间因细胞而异，可在显微镜下看是否贴壁，必要时轻拍培养瓶促使细胞脱落）； 4）加入含10%FBS勺培养液1?1.5ml［培养液：胰酶=（2?3）:1］中和胰酶；5）轻轻吹打成单细胞悬液，吹打力度以不起气泡为宜； 6）将单细胞悬液吸入10?15ml离心管中，低速离心800rpm 3分钟，倒去上清 液； 7）加入含10%FBS ffl胞培养液1?2ml吹打悬浮细胞至单细胞悬液； 8）吸取20ul细胞悬液（10ul细胞悬液+10ul台盼兰液：给坏死细胞染色，判断细胞活力）至细胞计数板，进行细胞计数； CCK-8实验： 9）在96孔板中，给每孔加100卩L （约7000个）的细胞悬液，将培养板放在培养箱预培养 24-72 小时（37 C，5%CO2,使细胞贴壁； 10）向培养板中加入10卩L不同浓度（5、10、20、40、80、160ug/ml）的待测药物； 11）将培养板在培养箱孵育一段适当的时间24小时（例如：6、12、24或48小时）（药物起作用）； 注意：如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK之前更换新鲜培养基（除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基），去掉药物影响。 当然药物影响比较小的情况下，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。 12）向每孔加入10让（约10%）CCK-8溶液（注意不要再孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数）； 13）将培养板在培养箱内孵育1?4小时（半小时测一次OD值）； 14）用酶标仪测定在450nm处的吸光度。 精品资料

高中生物必修一细胞的增殖.docx

第 1节细胞的增殖 1.多细胞生物体体积的增大，即生物的生长，既靠增大细胞的体积，还要靠增加细胞的数量。 2.不同动植物同类器官或组织的细胞大小一般，器官大小主要决定于。 3.细胞体积越大，其相对表面积越，细胞的物质运输的效率就越。的关系限制了细胞的长大。 4.是重要的生命活动，是生物体生长、发育、繁殖、遗传的基础。 5.细胞在分裂之前，必须进行一定的。细胞增殖包括：和整个连续的过程。 6.细胞周期：。其包括两个阶段：。 7.分裂间期为分裂期进行活跃的物质准备，完成，同时细胞有。 8.分裂期的前期：期的染色质丝螺旋缠绕，缩短变粗，成为染色体。核仁逐渐，核膜逐渐。从细胞的发出，形成一个的纺锤体。染色体分布在纺锤体的中央。 9.分裂期的中期：每条染色体的排列在细胞中央的一个平面上，这个平面的位置成为。 10.分裂期的后期：每个分裂成两个，分开，成为两条子染色体，由纺 锤丝着分别向细胞的移动。这两套染色体的和完全相同。 11.分裂期的末期：纺锤丝逐渐，出现了新的。在赤道板的位置出现了一 个，细胞板有细胞的向，逐渐形成了新的。大多数子细 胞进入下一个细胞周期的状态。 12.动物细胞有丝分裂的过程，与植物细胞的基本相同。不同的特点是：第一，动物细胞有由一对构成的中心体，中心粒在倍增，成为两组。中心粒的，发出无数条放射状的， 两组中心粒之间的形成了。第二，动物细胞分裂的末期不形成细胞板，而是细 胞膜从细胞的，最后把细胞成两部分，每部分都含有一个。 13.有丝分裂的重要意义，是将亲代细胞的。 14.由于染色体上有遗传物质，因而在细胞的和之间保持了遗传性状的。 15.因为在分裂过程中没有出现的变化，所以叫做。 16.细胞无丝分裂的过程比较简单，一般是，，缢裂成为两个细胞核；接着，整个细胞从中部成两部分，形成两个子细胞。 17.在高等植物体内，有丝分裂常见于等细胞。由于各个细胞的分裂是进行的，因此在同一分生组织中可以看到处于的细胞。染色体容易被着色。 18.解离液是，目的是用药液使。 19.漂洗：待根尖后，用镊子取出，放入盛有的玻璃皿中漂洗。 20.染色：把根尖放入盛有质量浓度为的龙胆紫溶液或。 21.制片的目的是使，有利于观察。 22.把制成的装片先放在显微镜下观察，扫视整个装片，找到分生区细胞：。再换成显微镜仔细观察，首先，然后再观察。注意观察各时期细胞内的特点。最后观察的细胞。 23.有条件的学校，可以观察的有丝分裂装片。 24.装片的制作流程为：。 25.统计全班的结果，求每个时期细胞数目的。

细胞增殖实验(MTT assay)

MTT实验 一．实验原理 检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在490nm(可参比630nm)波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。根据测得的吸光度值（OD值），来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强（如果是测药物毒性，则表示药物毒性越小）二．溶液配制 将MTT粉末用PBS配制成5mg/ml的储液，0.22μm的小滤头过滤除菌后，分装到灭菌的EP管中1ml/管，-20℃避光保存；使用时，将其用DMEM+10%FBS的培养基稀释10倍至终浓度0.5mg/ml进行细胞活性试验测定。 三．实验步骤 1.细胞的准备：选择接近对数期生长的细胞，胰酶消化终止后，离心沉淀细胞去上清， 正常培养基重新悬浮细胞；细胞计数板计数，对MDA-MB-231细胞，利用培养基将细胞浓度调整至20000个/ml，然后利用八连排移液器，依次取100μL细胞悬液加入96孔板中，此时每孔的细胞数约为2000个，根据实验的组数及需要测定的天数接种适当的孔数和板数，通常每个实验组设置3-6个重复。 2.细胞的培养与处理：当进行加药处理时，通常选择接种12h后，进行首次细胞活性 测定，作为本底值；同时将相应的实验组加入对应的处理，根据药物作用时间选择合适的点进行选择时间进行细胞的活性测定。（在进行TGF-beta对细胞增殖的抑制试验时，选择5ng/ml的TGF-beta持续处理4d，并每天选择一块板进行测量，来绘制细胞的增值曲线；实验中注意根据细胞的生长状况选择两天换液一次。） 3.MTT的反应与结晶的生成：测定时，先将MTT原液用DMEM+10%FBS的培养基 稀释至工作浓度0.5mg/ml，然后用移液器吸出原来的培养基，每孔加入含 0.5mg/ml MTT的培养基；37℃，5%CO2条件下，继续对细胞培养3-5h，待结 晶的生成。 4.结晶的溶解及吸光值测定：结晶生成后，轻轻吸出原培养基，加150μLDMSO溶解， 室温轻轻震荡5min，以保证结晶完全溶解；迅速取出96孔板，在酶联免疫检测仪，选择波长490nm测定每孔的吸光值。 5.根据实验设置的需要，每隔一定时间重复测定细胞的活性，收集数据；同时进行重复 实验，以保证结果的准确性。

脾细胞增殖实验

淋巴细胞转化试验（Lymphocyte Transformation Test， LTT） [ 来源：点击数： 278 更新时间： 2009年08月26日 ][ 收藏本文 ] T细胞在体外培养时，受到非特异性有丝分裂原（如植物血凝素 Phytohemagglutimin，PHA）或特异性抗原刺激后，可出现细胞体积增大，代谢旺盛，蛋白和核酸合成增加并能进行分裂，成为淋巴母细胞，即为淋巴细胞转化现象。淋巴细胞转化率的高低可以反映机体细胞免疫水平。因此可作为测定机体免疫功能的指标之 一、形态学检测法 【原理】 淋巴细胞在有丝分裂原（PHA或ConA）或特异性抗原刺激下发生转化，产生一系列变化如细胞变大、细胞浆扩大、出现空泡、核仁明显、核染色质疏松等，由淋巴细胞转变成淋巴母细胞。通过母细胞转化率，了解机体的细胞免疫状态。 【材料】 Wright-Giemsa染液细胞培养液：多用RPMI1640。按说明书配制后抽滤除菌，临用前加入20%无菌NBS、PHA 50～200μg/ml、青霉素100U/ml、链霉素100U/ml）。 肝素（400单位/ml，用Hanks液配制），0.5 ml可抗凝血5 ml。 2.5%碘酒、75%酒精。 载玻片、无菌棉签、无菌注射器5 ml及7号针头、试管毛细滴管、培养瓶、高压灭菌器、CO2孵箱或恒温培养箱、水平离心机、无菌过滤器、各种吸管、超净台。 【方法】 1．灭菌器材将注射器及针头、吸管、培养瓶等高压灭菌，0.103 Mpa（15磅/吋2）20 min。2．分装培养液于各培养瓶中，每瓶2 ml。 孵箱培养72 h，期间3．抽取静脉血0.2 ml，无菌操作注入培养瓶内，立即摇匀，置37℃、5%CO 2 每天旋转摇匀1次，使细胞充分混匀。 4．培养后，摇匀细胞，倒入离心管内，1000 r/min离心10 min。 5．由于大的细胞离心后居上层者较多，只吸上层细胞推片计数，结果易偏高。所以准确计数方法是在倒净上清后，残留与管壁的少量液体回流至管底后，用毛细滴管吹打将管内细胞打散，置1滴于玻片上，用毛细滴管前端刮片，均匀分布于全片，染色，按头、体、尾三段各1～2纵列（计数走向似城墙形）进行计数，以减少分布不均带来的误差，每片计数100～200个淋巴细胞。记录转化和未转化的淋巴细胞数，求出转化率。 【结果】 1．用形态学方法判断转化率，掌握淋巴细胞的形态学至关重要，应根据细胞的大小、核与浆的比例、胞浆的染色性、核结构和核仁的有无等特征进行判别。 ⑴成熟的小淋巴细胞：与未培养的小淋巴细胞一样为6～8μm，核染色致密，无核仁，核与胞浆比例大，胞浆染色为轻度嗜碱性。 ⑵过度型淋巴细胞：比小淋巴细胞大，约10～20μm，核染色致密，但出现核仁，此为与成熟小淋巴细胞鉴别要点。 ⑶淋巴母细胞：细胞体积增大，约20～30μm，形态不整齐，常有小突起，核变大，核质染色疏散，有明显核仁1～2个，胞浆变宽，常出现胞浆空泡。 ⑷其它细胞：如中性粒细胞在培养72 h后，绝大部分衰变或死亡呈碎片。 2．计算转化的淋巴细胞包括淋巴母细胞和过度型淋巴细胞，未转化的淋巴细胞指的是成熟的小淋巴细胞，在正常情况下，PHA淋巴细胞转化率为60～80%，如为50～60%则偏低，50%以下则为降低。 问题： 1．T，B淋巴细胞在何种情况下能发生转化现象？何谓转化现象？

生物必修一细胞的增殖知识总结

生物必修一细胞的增殖 知识总结 Document serial number【KK89K-LLS98YT-SS8CB-SSUT-SST108】

第六章细胞的生命历程 第一节细胞的增殖 一、细胞通过分裂来增殖： ①单细胞生物通过细胞增殖来繁殖。 ②多细胞生物从受精卵开始，经细胞增殖和分化发育而来。 ③衰老、死亡的细胞需经细胞增殖加以补充。 1、意义：细胞增殖是重要的细胞生命活动，是生物体生长、发育、繁殖、遗传的基础。 2、过程：①物质的准备阶段；②细胞的分裂阶段。 3、方式：原核细胞：二分裂 真核生物：有丝分裂、减数分裂、无丝分裂 二、有丝分裂：是真核生物进行细胞分裂的主要方式，细胞进行有丝分裂具有周期性。 1、细胞周期：连续分裂的细胞，从一次分裂完成时开始到下一次分裂完成为止。 △不同的细胞，细胞周期的时间不相同，只有连续分裂的细胞才有细胞周期。例如皮肤的生发层细胞、根的分生区细胞、植物形成层细胞等；而高度分化，失去分裂增殖能力的细胞，例如神经细胞，就不具有细胞周期。 2、两个阶段：分裂间期、分裂期。 ㈠、分裂间期： ⑴概念：整个细胞周期中的一部分，在这个期间细胞完成染色体中 DNA的复制和相关蛋白质的合成，染色质呈现出长的细丝状。 ⑵分裂间期与分裂期的关系：分裂间期为分裂期提供物质上的准备。 ⑶阶段：①G1期（DNA合成前期）：RNA和蛋白质迅速合成，细 胞体积显着增大，为进入S期准备。 ②S期（DNA合成期）：DNA的合成。 ③G2期（DNA合成后期）：RNA和蛋白质大量合成，为进入M期准备。 ⑷特点：为分裂期进行活跃的物质准备，完成DNA的复制和蛋白质的合成，同时细胞也有适度的生长。 ㈡、分裂期（M期）：分裂期是一个连续的过程，为了研究的方便，人为分为四个时期，即：前期、中期、后期和末期。 ⑴动植物细胞在分裂过程中的异同点 ⑵分裂期现象口诀： 前期：膜仁消失显两体（核膜、核仁消失，显现纺锤体和染色体）。 中期：形定数晰赤道齐（染色体的形态固定，数目清晰，着丝点排列在赤道板上）。 后期：点裂数加均两极（着丝点分裂，染色体数目加倍，并平均移向两极〉。 末期：两消两现重开始（两消:纺锤体消失，染色体变染色质；两现：核膜、核仁重新出现）。 ⑶细胞周期的图解： a→d是一个完整的细胞周期 ⑷动植物细胞有丝分裂的区别 植物细胞动物细胞

细胞cck 检测实验

细胞增殖-毒性实验步骤 1、细胞复苏、细胞传代、细胞计数、细胞增殖-毒性实验步骤： 实验准备：用75%酒精擦生物安全柜台面2遍，紫外线消毒30分钟（枪、枪头、15ml及50ml离心管、剪刀、封口膜、记号笔、打火机、酒精灯、培养瓶），复温实验所需试剂[细胞培养液（DMEM、1640）、磷酸缓冲盐溶液（PBS）、胰酶（0.25% Trypsin-EDTA）、胎牛血清（FBS）、双抗]，所有的试剂、仪器放入生物安全柜前要用酒精喷洒消毒。显微镜下看细胞生长状态，有无污染。 1）从液氮中取出细胞株,37-40℃温水迅速复苏，常规培养于含10%FBS、80U/ml 青霉素及0.08mg/ml链霉素的培养基中，放入３７℃、５％ＣＯ２、饱和湿度的培养箱中培养，每２天换液１次。 2）倒去培养瓶内的培养液； 3）加入PBS2ml洗涤培养瓶内细胞2次； 4）加入胰酶500ul/0.5ml2～10min（具体时间因细胞而异，可在显微镜下看是否贴壁，必要时轻拍培养瓶促使细胞脱落）； 5）加入含10%FBS的培养液1～1.5ml[培养液：胰酶=（2～3）:1]中和胰酶；6）轻轻吹打成单细胞悬液，吹打力度以不起气泡为宜； 7）将单细胞悬液吸入10～15ml离心管中，低速离心800rpm3分钟，倒去上清液； 8）加入含10%FBS细胞培养液1～2ml吹打悬浮细胞至单细胞悬液； 9）吸取20ul细胞悬液（10ul细胞悬液+10ul台盼兰液：给坏死细胞染色，判断细胞活力）至细胞计数板，进行细胞计数； CCK-8实验： 10）在96孔板中，给每孔加100μL（约10000个细胞）的细胞悬液，每组设５个复孔，将培养板放在培养箱预培养24-72小时（37℃，5%CO2），使细胞贴壁；11）向培养板中加入100ul含药物培养基 12）将培养板在培养箱干预24、48、72ｈ后，每孔加入20ulCCK-8液，在培养箱继续培养0.5-２ｈ，酶标仪检测450nm处吸光值（A），计算抑制率 抑制率＝（阴性对照A值－二甲双胍各浓度A值）／阴性对照A值×100% 注意：如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK之前更换新鲜培养基（除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基），去掉药物影响。当然药物影响比较小的情况下，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。 13）若暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10μL0.1M的HCL溶液或者1%w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下24小时内测定，吸光度不会发生变化。 CCK8对照组的设置及测定的注意事项

《细胞增殖》第1课时-细胞增殖实验

《细胞增殖》第1课时|细胞增殖实验 一、教材内容分析（一）教学内容的地位《细胞增殖》是高中生物必修教材第二章《生命活动的基本单位――细胞》中第二节内容，它是建立在已经学习第一节《细胞结构和功能》，掌握了细胞的基本结构及功能的基础之上来学习该节内容，同时，为学习第五章《生物的生殖、发育》中减数分裂和第六章《遗传和变异》中遗传的基本规律知识奠定基础，起到了承前启后的作用，并且是历年来高考的重要考点，在近五年的各地高考试卷中，总分达47分，具有十分重要的作用。（二）教学目标1、知识目标知道细胞增殖的方式、意义以及无丝分裂的过程和特点。识记有丝分裂细胞周期的概念；动植物细胞有丝分裂过程的异同点；有丝分裂的特征和意义。应用有丝分裂过程各时期的特点。2、能力目标1）凭借有丝分裂过程图、图文结合，培养学生的识图能力，形象思维能力。2）运用坐标曲线归纳出有丝分裂过程中染色体数目DNA含量变化，培养学生的分析能力。3）情感目标细胞分裂――运动是物质的根本属性，建立生命活动的唯物主义观点。（三）教学重点、难点1、教学重点真核细胞有丝分裂的细胞周期的概念和特点以及真核细胞有丝分裂的过程。2、教学难点真核细胞有丝分裂过程中，各个时期染色体的变化特点。 二、教学对象分析首先，作为高二的学生，已经具备了一定的阅读能力、自学能力，对于一些基础知识可由其自学；其次，生物这门学科是高二初开的一门学科，学生对其学习的方法和技巧欠缺，有关生物的基础知识积累少；第三，激发学生对于生物这门学科的学习兴趣也很重要。三、教学时间安排由于学生实际情况，加之本节内容知识点多，学生理解较为困难，因而教学时间安排为3课时（讲授2课时，实验1课时），本次说课内容仅限于第1课时（内容：细胞增殖方式、意义；有丝分裂细胞周期的概念，植物细胞有丝分裂过程）。四、教法和学法学生是教学的主体，让学生积极参与到探求知识的过程中，主动去获取知识，这是现代教学理念的基本观点，因而，在本课教

高中生物必修一细胞的增殖

第1节细胞的增殖 1.多细胞生物体体积的增大，即生物的生长，既靠增大细胞的体积，还要靠增加细胞的数量。 2.不同动植物同类器官或组织的细胞大小一般，器官大小主要决定于。 3.细胞体积越大，其相对表面积越，细胞的物质运输的效率就越。的关系限制了细胞的长大。 4. 是重要的生命活动，是生物体生长、发育、繁殖、遗传的基础。 5.细胞在分裂之前，必须进行一定的。细胞增殖包括：和整个连续的过程。 6.细胞周期：。其包括两个阶段：。 7.分裂间期为分裂期进行活跃的物质准备，完成，同时细胞有。 8.分裂期的前期：期的染色质丝螺旋缠绕，缩短变粗，成为染色体。核仁逐渐，核膜逐渐。从细胞的发出，形成一个的纺锤体。染色体分布在纺锤体的中央。 9.分裂期的中期：每条染色体的排列在细胞中央的一个平面上，这个平面的位置成为。 10.分裂期的后期：每个分裂成两个，分开，成为两条子染色体，由纺锤丝着分别向细胞的移动。这两套染色体的和完全相同。 11.分裂期的末期：纺锤丝逐渐，出现了新的。在赤道板的位置出现了一个，细胞板有细胞的向，逐渐形成了新的。大多数子细胞进入下一个细胞周期的状态。 12.动物细胞有丝分裂的过程，与植物细胞的基本相同。不同的特点是：第一，动物细胞有由一对构成的中心体，中心粒在倍增，成为两组。中心粒的，发出无数条放射状的，两组中心粒之间的形成了。第二，动物细胞分裂的末期不形成细胞板，而是细胞膜从细胞的，最后把细胞成两部分，每部分都含有一个。 13.有丝分裂的重要意义，是将亲代细胞的。 14.由于染色体上有遗传物质，因而在细胞的和之间保持了遗传性状的。 15.因为在分裂过程中没有出现的变化，所以叫做。 16.细胞无丝分裂的过程比较简单，一般是，，缢裂成为两个细胞核；接着，整个细胞从中部成两部分，形成两个子细胞。 17.在高等植物体内，有丝分裂常见于等细胞。由于各个细胞的分裂是进行的，因此在同一分生组织中可以看到处于的细胞。染色体容易被着色。 18.解离液是，目的是用药液使。 19.漂洗：待根尖后，用镊子取出，放入盛有的玻璃皿中漂洗。 20.染色：把根尖放入盛有质量浓度为的龙胆紫溶液或。 21.制片的目的是使，有利于观察。 22.把制成的装片先放在显微镜下观察，扫视整个装片，找到分生区细胞：。再换成显微镜仔细观察，首先，然后再观察。注意观察各时期细胞内的特点。最后观察的细胞。 23.有条件的学校，可以观察的有丝分裂装片。 24.装片的制作流程为：。 25.统计全班的结果，求每个时期细胞数目的。

MTS细胞增殖检测方法

MTS细胞增殖与毒性检测试剂盒 产品组成： 产品编号BB-4204-1 BB-4204-2 BB-4204-3 规格250 assays 500 assays 1000 assays MTS溶液 2.5ml 5ml 10ml 产品简介： BestBio贝博MTS细胞增殖与毒性检测试剂盒是应用新型的水溶性甲臢化合物[3-（4，5-二甲基噻唑-2-基）-5-（3-羧甲酯基）-2-（4-磺苯基）-2H-四唑（金翁），内盐；MTS]快速高灵敏度检测细胞增殖和细胞毒性的比色检测产品。 MTS被细胞生物还原成一种可溶于组织培养基的甲臢化合物，新陈代谢活跃的活细胞内的脱氢酶类将MTS转化成液态可溶的甲臢化合物，这种甲臢化合物在490nm的吸收值可以直接在96孔板上测量，而不需要另外作处理。由490nm测量的吸收值所表示的甲臢产物的数量与培养物中活性细胞的数量成正比。细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。对于同样的细胞，颜色的深浅和细胞数量呈线性关系。 活性测定使用方法： 1、收集细胞，加细胞悬液100ul（约5000-10000个细胞）到96孔板（边缘孔用无菌水或PBS填充）。每板设对照（加100 l培养基）。 2、置37℃，5% CO2孵育过夜，倒置显微镜下观察。 3、每孔加入10 ul 待检测药物溶液， 37℃孵育。 4、每孔加入10 ul MTS溶液，37℃孵育1-4 小时。 5、测定490 nm各孔的吸光值。 5、同时设置空白孔（培养基和MTS溶液，无细胞），对照孔（不加药培养基和MTS溶液，有细胞），每组设定3-5复孔。 结果分析 ： 细胞活力计算： 将各测试孔的OD值减去调零孔OD值或对照孔OD值。各重复孔的OD值取平均数。 细胞活力% =（加药细胞OD-空白OD/对照细胞OD-空白OD）×100 数量测定使用方法： 1、先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，然后接种细胞。 2、按比例(例如：1/2比例) 依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度，一般要做3-5 个细胞浓度梯度，每组3-6个复孔。 3、接种后培养2-4小时使细胞贴壁，然后加MTS试剂培养一定时间后测定O.D值， 制作出一条以细胞数量为横坐标(X轴)，O.D值为纵坐标(Y轴) 的标准曲线。根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量(使用此标准曲线的前提条件是实验的条件要一致，便于确定细胞的接种数量以及加入MTS后的培养时间)。