高纯度黑色素细胞培养方法的改进

收稿日期:2002-07-23;修回日期:2002-10-26

作者简介:刘源(1974-),男,山东济南人。博士生(导师:金岩),助教高纯度黑色素细胞培养方法的改进

刘　源,金　岩,王新文,赵　宇

(第四军医大学口腔医学院,陕西西安710032)

[摘　要] 目的:探讨如何以简便快捷的方法获得大量生长状态良好的高纯度黑色素细胞。方法:以包皮组织作为细胞来源,用消化法获得表皮细胞悬液,用本实验室设计的方法对细胞进行纯化,然后用两种不同培养基M C1、M C2培养细胞,Dopa 染色和透射电镜鉴定细胞来源,通过M T T 和流式细胞仪分析观察细胞的生长状态。结果:用本实验室的纯化方法获得的黑色素细胞中未见角朊细胞和成纤维细胞污染,M T T 和流式细胞仪检测结果显示用M C2培养的黑色素细胞处于旺盛的增殖状态,明显高于M C1培养的黑色素细胞。结论:结果表明本实验方法可以获得大量处于良好生长状态的高纯度黑色素细胞。

[关键词]皮肤;黑色素细胞;培养

[中图号]R780.2 [文献标识码]A [文章编号]1005-2593(2003)01-0021-03

[牙体牙髓牙周病学杂志,2003,13(1):21]

Improvements in culturing skin melanocytes

LIU Yuan ,JIN Yan ,WANG Xin -wen ,et al

(College of S tomatology ,The Fourth Military Medical University ,X i ′an 710032,China )

[A bstract ] AIM :To develop a rapid and reproducible method for the isolation of pure melanocy tes in good condi -tions from foreskin .METH ODS :T he melanocytes were isolated and purified by a method employed in our lab .Two different media MC1and M C2were used to culture the cells .T he biological conditions of the cells were examined by M T T detection and flowcy tometry (FCM )analysis .RESULTS :T he melanocy tes obtained by this method were free of keratinocytes and fi -broblasts contamination .And the cells maintained in M C2showed better proliferation abil ity than those cultured in MC1.C ONC LUSION :The pure melanocytes in good conditions can be attained rapidly by our method .

[Key words ]skin ;melanocy te ;tissue culture

[Chinese Journal of Conservative Dentistry ,2003,13(1):21]

黑色素细胞(melanocy te ,M C )位于表皮的基

底层,与表皮细胞共同组成表皮黑素单位,其主要

功能是产生黑素小体保护皮肤免受损害[1]。关于

黑色素细胞培养技术的探讨最早始于1957年,迄

今为止已经建立了许多黑色素细胞的培养方

法[2-4]。但是如何在短时间内获得大量生长状态

良好的高纯度黑色素细胞一直是众多学者关注的

焦点。本实验拟在细胞的培养方法上做一定的改

进,从而以快捷的方法获得大量生长状态良好的高

纯度黑色素细胞。

1　材料和方法1.1　材料青少年包皮环切术后包皮组织;DM EM 培养基(低糖型,GIBCO ),F12培养基(GIBCO ),谷氨酰胺(GIBCO ),K -SFM 角朊细胞培养基(GIBCO ),胎牛血清(GIBCO ),胰酶(Sigma ),Dispase (Sigma ),TPA (Sig ma ),IBMX (Sigma ),霍乱毒素(Sigma )。1.2　方法1.2.1　培养液的配制M C1:参照司徒镇强等方法配制[5],DMEM 和F12各一份混合,加入100m L /L 胎牛血清,TPA

·

21·牙体牙髓牙周病学杂志(Chin J Conserv Dent )2003,13(1)DOI :10.15956/j .cn ki .chin .j .conserv .dent .2003.01.011

85nmol/L,霍乱毒素2.5nmol/L,IBMX0.1 nmol/L,谷氨酰胺6nmol/L。

M C2:本实验室设计配制,以K-SFM为基础培养基,加入TPA10ng/mL,50mL/L胎牛血清。

1.2.2　黑色素细胞的分离纯化

①取新生儿或青少年包皮环切术后包皮组织,处理前在750m L/L乙醇中浸泡1min;将包皮组织转入培养皿中,用加入抗生素的PBS清洗,用眼科剪和眼科镊去除皮下组织,将组织分切为2mm ×10mm,用1.2U/m L的Dispase4℃消化过夜。

②将表皮与真皮分离,收集表皮,2.5g/L胰酶消化10min,反复吹打以获得单细胞悬液,将细胞分为两份,用含100mL/L血清的DMEM培养基接种细胞,在37℃孵箱中放置1h,倾弃上清,加入角朊细胞培养液K-SFM培养3d,以抑制成纤维细胞的生长,然后将培养液分别更换为黑色素细胞培养液MC1和MC2,继续培养7d即可获得纯净的黑色素细胞。

③原代细胞长满70%～80%时,用2.5g/L 胰酶消化传代。

1.2.3　黑色素细胞的鉴定

取第三代细胞做Dopa染色、透射电镜观察,同时结合细胞形态鉴定细胞来源。

1.2.4　M TT检测

取第四代细胞,以4×103/m2的密度接种于96孔板。培养3d后,每孔加入M TT(5g·L-1) 20μL,继续培养4h,吸弃上清,加入150μL DMSO振荡15min,用酶联免疫检测仪测定490nm 的A值。组间进行统计学分析。

1.2.5　流式细胞仪分析

取第四代细胞5×106,800r/min,离心5min,弃上清,用PBS洗两次,700m L/L乙醇固定,4℃过夜。上机前离心去除乙醇,PBS洗两次,加入PI (溴化丙锭)染液1mL,4℃闭光染色30min,上机检测分析。组间进行统计学分析。

2　结果

2.1　黑色素细胞的生长和鉴定

细胞接种4h后,即可见细胞贴壁伸展,第二天细胞呈典型的树突状,随培养时间的延长突起更加明显。原代细胞培养10d后即可传代,此时细胞密集,形态呈长梭型,类似雪旺氏细胞,未见角朊细胞和成纤维细胞污染(图1,见彩插);Dopa染色可见细胞浆内阳性着色(黑色或灰色颗粒)(图2,见彩插),苏木精衬染未见阴性细胞;透射电镜显示细胞浆内有黑色素颗粒(图3,见彩插),此外在M C2组细胞中可见核分裂(图4,见彩插),显示细胞增殖旺盛,而在M C1组细胞中未见核分裂。

2.2　M T T检测

如表1所示,MC2组细胞活力高于M C1组。组间比较有统计学差异,P<0.05。

表1　M T T检测结果

组别n A值

M C1100.412±0.022

M C2100.604±0.024

2.3　流式细胞仪分析结果

结果(表2)与M TT检测相符合,M C2组细胞增殖能力明显高于MC1组。

表2　流式细胞仪分析结果

组别G1S G2M

PrI(S+

G2M) M C180.811.87.4

M C270.717.411.9

3　讨论

黑素的合成代谢被认为与皮肤色素沉着病、恶性黑色素瘤和Parkinson′s病等密切相关[6]。而黑色素细胞的培养在研究正常及病变组织中黑素合成代谢的作用具有重要意义。虽然黑色素细胞的培养可以追溯到50年代,但是直到80年代才真正建立了可靠的黑色素细胞培养方法[7]。由于黑色素细胞仅占表皮细胞数量的3～7%,因此,如何在培养过程中去除角朊细胞是黑色素细胞培养的重点。采用既能促进黑色素细胞生长又能抑制角朊细胞的TPA (12-o-tetradecanoyl phorbol-13-ac etate)和霍乱毒素基本上解决了上述问题[8]。为了促进细胞增殖,大多数黑色素细胞培养液中都加入了一定量的血清,所以即使在培养过程中混入了极少量的成纤维细胞也会导致培养的失败。而即使是最有经验的细胞培养者也很难保证无成纤维细胞的混杂[9]。一旦发生了成纤维细胞的混杂,大多数学者采用加入G418等有丝分裂细胞抑制剂的方法以去除成纤维细胞[10]。此外也有学者用降低钙离子浓度或机械刮除等方法,但是大多数方法在抑制成纤维细胞的同时也影响了黑色素细胞的生长。

本实验室在前期培养角朊细胞的时候发现,黑

色素细胞可以在角朊细胞培养液中短期存活并且状态良好,于是根据文献资料[8]以及预实验结果设计了前面所述黑色素细胞培养液,在促进黑色素细胞保持高增殖活力的同时大大减少了TPA的用量。传统方法所培养的原代黑色素细胞大约需要3～4周的时间才可以长满传代[5],而本实验室所培养的原代细胞一般在培养8～10d后即可传代,同时透射电镜、M TT和流式细胞仪分析均显示细胞生长状态良好。

角朊细胞培养液可以抑制成纤维细胞的增长而在短期内对黑色素细胞无显著影响,而本实验室所配制的黑色素细胞培养液可以抑制角朊细胞的生长,所以将两种培养液的优点结合,设计了前面所述的纯化方法。同时根据黑色素细胞在有血清培养基中贴壁快的特点,先用普通含血清DM EM 培养基接种细胞,待大多数黑色素细胞贴壁后,再更换培养液,而此时大部分角朊细胞尚未贴壁。实验结果显示,用上述方法可以获得100%纯度的黑色素细胞。

黑色素细胞的培养在皮肤色素疾病、恶性黑色素瘤等的研究和治疗中具有重要意义,本实验的研究结果为简便快捷获得大量生长状态良好的高纯度黑色素细胞提供了重要的实验依据。

参考文献:

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掌跖角化—牙周破坏综合征1例

尹晓敏,刘　虹,彭解英

(中南大学湘雅医院,湖南长沙410008)

掌跖角化—牙周破坏综合征又名Papillon-Lefevre综合征。其特点是手掌和脚掌部位的皮肤过度角化,牙周组织严重破坏,患者全身一般健康,智力正常。本病罕见,作者在门诊遇见1例,现报道如下。

患者女,10岁。因牙齿松动脱落6年来我院就诊。患儿平产,7个月乳牙开始萌出,2岁半乳牙全部萌出。4岁左右全口牙松动,牙齿变长,至5～6岁时乳牙全部脱落,乳牙脱落2～3周后,恒牙开始萌出,于2000-11牙齿出现松动,牙龈红肿、疼痛,经“青霉素”、“维生素”、“林可霉素”治疗好转(具体用法不详)。患儿出生6个月时,脚掌部出现皮肤干燥、皲裂、脱屑;6岁时双手发痒、粗糙脱皮;8岁时膝部亦出现上述症状,肘部见少许白色改变。家庭中无类似患者。

检查:前牙Ⅲ°深覆牙合。11,12,16,21,22,26,31,32, 36,41,42,46萌出,牙龈红肿、充血,31,41牙龈萎缩,22,41松动Ⅲ°。全颌曲面断层X线片显示:31,36,牙槽骨弧形吸收达根尖1/3处,11,12,21,22,46牙槽骨水平吸收达根中1/3,余恒牙胚存。双足底,手掌及手背关节伸侧面红斑、干燥、皲裂、脱屑,双膝、肘部角化较轻,皮肤颜色变白、粗糙、患儿智力正常,体健。

诊断:掌跖角化一牙周破坏综合征。

治疗:局部龈上洁治、龈下刮治,30mL/L过氧化氢液冲洗牙周袋,上碘甘油。口服四环素片:0.25×tid×10d;甲硝唑片:0.2×tid×10d;口泰液漱口:30mL×tid×10d。建议拔除22,41。

(收稿日期:2002-02-19)

细胞传代培养的原理及操作步骤,细胞冻存,细胞复苏

细胞传代培养的原理及操作步骤 （一）原理：细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，须进行传代再培养。传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。 （二）细胞传代培养具体操作 1、细胞：贴壁细胞株 2、操作步骤 1）将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。 2)加入0.5-1ml 0.25％胰酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液中。 3)瓶口塞好橡皮塞，放在倒置镜下观察细胞。随着时间的推移，原贴壁的细胞逐渐趋于圆形，在还未漂起时将胰酶弃去，加入10ml培养液终止消化。 观察消化也可以用肉眼，当见到瓶底发白并出现细针孔空隙时终止消化。一般室温消化时间约为1-3分钟。 4)用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，分到另外两到三瓶中，实践培养液塞好橡皮塞，置37℃下继续培养。第二天观察贴壁生长情况。 细胞冻存 1. 实验前准备：细胞室及工作台紫外线照射15min；培养液、PBS、胰酶、小牛血清、DMSO、恒温水 浴箱37℃预热备用；收集对数生长期细胞，在冻存前一天最好换液 2．用吸管吸出培养瓶中的细胞培养液，PBS清洗2遍吸出冲洗液，加入适量胰蛋白酶消化。 3. 适时去掉胰蛋白酶，加入少量新培养液。吸管吸取培养液吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的 细胞悬液。 4. 用吸管将培养液加入冻存管中，离心(1000r/min，10分钟)。 5. 去上清液，加入与细胞悬液等量的冻存液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀 6. 冷存管置于4℃10分钟----20℃30分钟----80℃16～18小时(或隔夜)---液氮槽vaporphase长期储 存。-20℃不可超过1h，以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。 7．记录每一个冷冻管的位置以确保在以后应用时能够找到每一个冷冻管。 细胞复苏 1.室内紫外消毒；培养基、PBS于37℃恒温水浴预热备用。 2.自液氮罐中取出冷冻管，立即放入37℃水槽中快速解冻，离心。 3.去上清，加入培养基，吹打，然后移入培养瓶中，用培养基清洗冻存管，清洗液也移入培养瓶中。 4.于培养瓶中加入适量培养基，放入CO2培养箱中培养 5.记录复苏日期；次日换液。

巨噬细胞的原代培养

1 原理巨噬细胞属天然免疫细胞，具有趋化运动、吞噬、分泌和参与免疫调节等功能，是科学工作者研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。巨噬细胞容易获得，便于培养，并可进行纯化。巨噬细胞属不繁殖细胞群，在条件适宜下可生活2－3周多用做原代培养，不易长期生存。巨噬细胞也建有无限细胞系，大多来自小鼠，如P331、S774A.1、RAW309Cr.l等，均获恶性，培养中呈巨噬细胞形态和吞噬功能，易于传代和瓶壁分离，但难以建株。目前，单核巨噬细胞株也有，比如RAW264.7，但价格比较贵，且保存也不方便。培养巨噬细胞可用各样方法和各种来源来获取细胞，目前以小鼠腹腔取材法最为实用，而目前获取小鼠巨噬细胞的方法有两种，一种是直接用培养液灌洗实验动物腹腔，从腹腔灌洗液中分离巨噬细胞，还有一种方法向动物腹腔中注射刺激物（如牛血清，淀粉，糖原，脂多糖，矿物油，PRMI1640培养液等），这样使机体产生大量巨噬细胞后再腹腔灌洗，但由于许多刺激物能激活巨噬细胞，而被激活的巨噬细胞大量吞噬刺激物，有此得到的巨噬细胞培养用于培养时，细胞中的刺激物不能很快被消化而残留在细胞中，影响细胞代谢，同时也不能很好的模拟体内环境，所以我们直接用培养液灌洗实验动物腹腔，从腹腔灌洗液中分离巨噬细胞。我们选择6周龄的昆明小鼠是因为此年龄小鼠能产生最多的巨噬细胞。 2试验材料 昆明种小鼠10只体重约18g～25g（约6周龄）由广西医科大学动物实验中心提供 公鸡1只 PRMI1640培养基 新生小牛血清 HEPES D-Hanks液 青霉素 链霉素 3试验仪器 无菌操作台手术刀解剖剪解剖镊止血钳5m注射器注射针，试管、培养瓶（12），12孔培养板(12)等。 二氧化碳培养箱 生物显微镜 高速冷冻离心机 低温冰箱 4实验步骤 4．1细胞培养液的制备及消毒制备方法: 将RPMI1640干粉一袋，HEPES4. 77g加入800m1三蒸水中，充分溶解后缓慢加入碳酸氢钠并逐步添加三蒸水，使溶液的pH值处于7. 2-7. 4之间，容积为1000m1。 鸡红细胞悬液制备:按无菌操作,自鸡翼下静脉采血,立即置入盛有五倍于取血量的1%肝素抗凝剂的三角烧瓶中,混匀,4℃冰箱内保存。使用前,以无菌生理盐水离心洗涤3次,前一次离心速度为1500r/min,离心5分钟,弃上清液和界面粒细胞层,最后连续离心2次(2000r/min,5分钟),用生理盐水配成1%鸡红细胞悬液备用。 培养液的无菌处理： (1)将0.45微米和0.22微米的微孔滤膜浸过三蒸水，与zeiss过滤装置所需的清洁不锈钢筒、钢筛、胶管安装好，并高压灭菌。 (2)在净化室内，打开己消毒的zeiss抽滤器，将配制好的RPMI1640培养液进行过滤，开将过滤后的RPMI1640培养液分装，置入4℃冰箱中备用。

如何去除脸上黑色素,七嘴八舌

如何去除脸上黑色素，七嘴八舌 除了斑点之外，脸上的黑色素沉淀也十分影响形象。怎么才能快速有效的去除脸上的黑色素沉积呢？想要拥有白净脸蛋，祛斑去色素很重要。脸上有黑色素怎样去除呢？ 脸上黑色素沉淀怎么去除?告知你怎么有效去除黑色素。 一、注意劳动保护避免直接在阳光下暴晒，紫外线能促进黑色素细胞产生黑色素颗粒，使皮肤变黑，最好在暴晒部位涂一些增白防晒霜。 二、注意饮食。平时要多饮水，多吃新鲜蔬菜、山楂、胡萝卜，少吃食盐，以减少黑色素的形成。 三、口服维生素C，它能将多巴醌还原为多巴，从而抑制黑色素的形成。 四、和顺七情，保持心情舒畅，禁忌忧思恼怒。 五、饮食适量，多食新鲜蔬菜水果，勿食油腻辛辣及酒酪之品。 以上这些方法对于脸上黑色素的去除有一定的作用，要想彻底去除黑色素推荐使用初源漾，专业配方的初源漾樱花嫩红素，从多种名贵植物中萃取多种高活性植物祛黑色素因子，它能迅速渗入肌肤，在不影响细胞增殖浓度的同时，有效地抑制皮肤中的酪氨酸酶的活性，阻断黑色素的形成，通过自身与酪氨酶直接结合，加速黑色素的分解与排泄，使其顺利代谢，从而减少皮肤色素沉积，层层净化达到祛黑色素美白的作用，彻底解决黑色素反复。 初源漾，设有专门的客户服务机构，特邀多位美肌专家顾问，提供专业的售前服务、积极的售中服务、完善的售后服务，打造立体式，专家全程跟踪式服务体系。同时为了规范市场秩序，初源漾实行全国统一官网销售，私密发货，快递单上只写快递单号及必要的收件人信息等，不会出现任何敏感字样，确保用户的隐私和产品品质！ 对于女性消费者来说,正规嫩红素品牌是什么?并不是越贵的,也不是越稀有的,只有最合适的才是最佳的。初源漾采用现代高科技制作,以肌肤为基础,有针对性的补充营养,让女性重新拥有白皙肌肤的同时,不用担心反弹的问题。

常规细胞培养方法

常规细胞培养方法（原代培养和传代培养）初代培养 原理 将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。 仪器、材料及试剂 仪器：培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃） 材料：动物组织块 试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank′s 液，碘酒 初代消化培养法

1.准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。 2.布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。 3.处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中3 0~60分钟。 4.剪切：用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块，以便于消化。加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。 5.消化：或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。 6.分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速（500 ~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。

7.计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7. 4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHC O3调整。 8.培养：置于36.5℃温箱培养，如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。 初代组织块培养法 1.剪切：把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸静Hanks液，用眼科剪反复剪切1mm 3块为止。 2.摆布：用弯头吸管吸取若干小块，置于培养瓶中，用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底部，小块相互距离以0.5cm为宜，每一2 5ml培养瓶底可摆布20~30块。 3.轻轻翻转培养瓶，另瓶底向上，注意翻瓶时勿另组织小块流动，塞好瓶塞，置36.5℃温箱培养2小时左右（勿超过4小时），使小块微干涸。 4.培养：从微箱中取出培养瓶，开塞，46度斜持培养瓶，箱瓶底脚部轻轻注入培养液少许，然后缓缓再把培养瓶翻转过来，让培养液

巨噬细胞培养

腹腔巨噬细胞的获取和培养 1.实验目的： 掌握腹腔巨噬细胞的获取方法及其培养技术 2.实验原理： 利用巨噬细胞具有趋化运动，吞噬，分泌和参与免疫调节的功能，向成熟大鼠腹腔内注射煮沸灭菌的4%的硫代乙酸钠，使血液中的单核细胞趋化至腹腔，即巨噬细胞。硫代乙酸钠刺激后4日腹腔内巨噬细胞数量较多且其他细胞成分少（如淋巴细胞）。 3.实验器材及材料： （1）成年大鼠 （2）手术器械：解剖剪，解剖镊和止血钳 （3）其他用品：注射器，培养皿和吸管，酒精及酒精棉球等 （4）清洗液：HBSS和不含Ca和Mg的HBSS。 （5）培养液：DMEM（加10%血清） （6）细胞计数板和计数器 4.实验步骤： （1）取细胞4d前，动物腹膜腔内注射5-10ml 4%硫代乙酸钠。（2）乙醚麻醉后，拉颈处死动物，经颈总动脉放血。将动物仰置，

剪去腹壁皮毛，用70%酒精消毒。 （3）沿正中线剪开腹壁，将5-10mlHBSS注入腹膜腔，用吸管反复冲洗腹膜腔的细胞。 （4）吸出腹膜腔的细胞悬液，离心（1000r/min,10min）。 （5）用培养液混悬沉淀细胞，将细胞悬液加入培养皿中，培养2h. （6）吸去培养液，用不含Ca2+和Mg2+的HBSS清洗2次，去除漂浮的细胞，得到附着于培养皿底部的巨噬细胞。 （7）采用刮取法或酶消化法取出贴壁的巨噬细胞，离心（1000r/min,10min）。用培养液混悬细胞，将细胞调整至1-3X106个/ml,继续培养或直接用于实验研究。 5.实验结果分析： （1）除巨噬细胞外，自腹膜腔洗出的细胞还含有淋巴细胞等。由于淋巴细胞不贴壁，培养2h后用HBSS清洗，可除去淋巴细胞和其他悬浮细胞。最终获得95%以上是巨噬细胞。（利用巨噬细胞贴壁能力较其他细胞强）。 （2）巨噬细胞大小约50μm,一般不分裂，在培养条件下可存活1-3周。直接从腹腔取得的巨噬细胞为静止性的，呈圆形，伪足不明显。经硫代乙酸钠刺激可获得大量的炎症性巨噬细胞，培养2h后，细胞多呈梭形并伸出伪足，即“有头有尾”，具有较强的变形运动和吞噬能力。

如何治疗黑色素沉着呢

如何治疗黑色素沉着呢 色素沉着，是现在非常常见的一种现象。人们总会因为各种原因导致身体上的皮肤会呈现出各种不一样的颜色。人们的黑皮肤有的也是因为色素沉着。人们总是会因为色素沉着影响了美观。那么，色素沉着应该怎么办呢?接下来，就要来告诉大家这部分 的一些相关内容。 体内激素的变化可引起黑色素在皮肤中沉积，而导致皮肤色素沉着，一些药物的使用也会导致色素沉着，日光照射也可促进皮肤色素沉着。皮肤色素沉着按类型分有黄褐斑、妊娠斑、蝴蝶斑、老年斑、咖啡斑和雀斑。 皮肤干燥、衰老，日晒、紫外线辐射，睡眠不足、身体劳累等等都是促进色素沉淀的原因。随着年龄的增长，色斑增多，严重影响人们的面部美观，带来了衰老的心理压力，从而影响生活质量。 皮肤色素沉着的治疗自然应从两方面人手，一是针对病因的

治疗，二是局部对症治疗。后者是采用物理或化学方法祛除局部色素。从以上色素沉着的病因分析中不难看出，遗传性和肿瘤性疾病病因明确，较少受体内因素影响，局部治疗多可获得满意疗效。一般去除色素沉着常用的是净美白。这个感觉挺好的。 平时要特别注意饮食的搭配，含高感光物质的蔬莱，如芹菜、胡萝卜、香菜等，最好在晚餐食用，食用后不宜在强光下活动，以避免黑色素的沉着。 夏日外出打太阳伞、戴遮阳帽，做完饭后清洗面部和手臂，尤其注意清洗被热油溅到的部位，烫油易造成永久性的黄褐斑，对中老年人尤为重要，所以应立即用凉水冲洗干净; 通过上述的资料介绍，大家应该可以清楚地了解到在遇到色素沉着的时候应该如何处理了吧。人们在平时的生活当中，应该注意调节好自己身体里面的内分泌激素，要注意自己的饮食的清淡，还要少面对电脑和手机，这样可以有效的避免黑色素的沉着。

细胞培养操作步骤

培养基的配置：基础培养基500ml+胎牛血清50ml+双抗5ml 冻存液的配置：DMSO18ml+胎牛血清2ml。 依次比例酌量配置。 超净工作台常规配置 移液器1套（2.5μl、20μl、200μl、1ml），酒精灯1盏，液器1台，斜架1台，酒精喷壶1个，酒精棉球缸1个，污缸1个， 常规耗材：培养瓶（50㎝2），定量移液管（5ml、10ml），枪头（1ml、200μl、10μl），培养皿，6/24/48/96孔板，医用脱脂棉球，保种管 所需试剂：gibco高糖培养基，胎牛血清，双抗，DMSO，胰酶，苯扎溴氨，75%酒精…… 实验前准备： 所需的各项高压后的耗材放于超净工作台内，用酒精喷壶喷洒实验台面，并关闭工作台打开紫外灯照射30min后开始实验操作。 首次传代前细胞的复苏，首先用一大烧杯盛满37℃的温水放于液氮罐旁边，待细胞株取出后留上端1/3于37℃水面上尽最大速摇动管使其在2min内迅速融化。若种管顶部含有冻存的细胞液在摇动期间用力甩动使其降于管底后再摇动。这一过程可在超净工作台外操作。 实验步骤 一、原代细胞的培养 1.紫外消毒30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作 者的双手。 2.将所需的培养基确保瓶身干净后放于工作台面内，点燃酒精灯，将培养基瓶 口用酒精棉球擦拭后，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3次，旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖，分别放于酒精灯的两侧。特别是将培养基瓶放于斜架上，瓶口对准酒精灯，且放在距离酒精灯最近的位置，瓶盖置于酒精灯的另一侧。 3.取1个高压后的新培养瓶，瓶口在酒精灯上消毒2-3次，旋开后分别再次消 毒瓶口和瓶盖2-3次分别放于酒精灯两侧，把保种管在超净台外用酒精棉球擦拭下2/3后拿进超净台内在酒精灯上消毒保种管口2-3次放于台面左手边，取1ml移液器快速移动在酒精灯上消毒1-2次，然后再装上枪头吸取保种管内的细胞液，悬空移入培养瓶内。 4.拿出1支高压后的5ml定量移液管，在酒精灯上灼烧尾部后装于电动移液器 上，再次放于酒精灯上灼烧整个定量移液管管身2-3次，悬空进入培养基瓶内吸取4ml培养基再悬空移入培养瓶内，将培养瓶瓶口和瓶盖在酒精灯上消毒2-3次后拧紧平放，在瓶身做好实验标记。 5.将培养基瓶口和瓶盖消毒2-3次后拧紧，熄灭酒精灯，整理实验台面，取出 实验试剂及污缸等，关闭超净工作台。 6.将培养瓶放于28℃,5%CO2的培养箱内培养，旋开瓶口少许。注意整个培养箱 底托盘内一定要放高压后的水，且定期更换确保无菌。 在CO2培养箱内培养10-12h，瓶盖拧紧后拿出培养箱，置于荧光倒置显微镜下观察细胞贴壁情况，及细胞形态。最后更换培养液。 二、培养液的更换

山羊肺泡巨噬细胞体外分离与原代培养技术研究

安徽大学 本科毕业论文（设计、创 作） 题目：山羊肺泡巨噬细胞体外分离与原代培养技术研 究 学生姓名：孙义学号：D3******* 院（系）：生命科学学院专业：生物工程 入学时间：2012年9月 导师姓名：班谦职称/学位：博士 导师所在单位：安徽大学 完成时间：2016年5月

山羊肺泡巨噬细胞体外分离与原代培 养技术研究 摘要 肺泡巨噬细胞是存在于肺泡中的免疫细胞，它是免疫系统的重要组成部分，肺泡巨噬细胞免疫功能非常活跃。它是肺脏抵御外来微生物侵害的第一道防线。本次实验通过研究山羊巨噬细胞的体外分离和体外培养技术，从而建立一套完整可行的巨噬细胞分离培养技术方法。人体吸入空气中的尘粒、细菌等异物进入肺泡和肺间质，多被巨噬细胞吞噬清除，在今天空气污染日趋严重的情况下，研究肺泡巨噬细胞对于免疫学和人类健康有重要的意义。而研究巨噬细胞分离培养技术将为肺泡巨噬细胞的免疫学研究奠定坚实的基础。本实验从健康无病变的羔羊肺脏灌洗液中分离肺泡巨噬细胞，加入脂多糖进行诱导刺激。实验表明，通过此次实验的方法，获得了高纯度的山羊肺泡巨噬细胞，在CO2培养箱中连续培养30天左右未发现细胞大规模死亡，LPS刺激下发现其仍具有免疫活性。为进一步通过山羊肺泡巨噬细胞进行各种致病菌导致的疾病的治疗和肺泡巨噬细胞的免疫学功能研究奠定实验基础。 关键词：肺泡巨噬细胞；分离培养；LPS；山羊。 Isolation and primary culture of goat alveolar macrophages in vitro Abstract Alveolar macrophages are present in alveolar in immune cells, it is an important part of the immune system, immune function of alveolar macrophages is very active. It is the first line of defense against microbial invasion of the lung. This experiment through study on goat macrophages in vitro isolation and in vitro culture techniques, so as to establish a complete set of feasible macrophage separation cultivation techniques. Inhaled dust particles in the air, bacteria and other foreign matter into the alveolar and interstitial lung, is phagocytosis of macrophages, in today's air pollution increasingly serious situation, study of alveolar macrophages is important for immunology and human health. And the study of macrophage isolation technology will lay a solid foundation for Immunology Study on alveolar macrophages. The separation of alveolar macrophages from healthy lamb lung lavage fluid of lesions in this experiment, With lipopolysaccharide induced stimulation. The experimental results show that through the experimental method, goat alveolar macrophages in high purity and in CO2 culture box in continuous culture about 30 days found no large-scale cell death, under the stimulation of LPS found it still has the immune activity. Study on the immunological function of further by goat alveolar macrophages were all pathogenic bacteria caused the disease treatment and alveolar macrophages lay the experimental foundation.

皮肤色素痣6种治疗方法的比较

皮肤色素痣6种治疗方法的比较 〔摘要〕目的：筛选皮肤色素痣的最佳治疗方法。方法：用三种物理治疗法(CO2激光器、高频治疗仪、液氮冷冻)和三种外科治疗法(微型环钻切除缝合法、单纯环形切除法、梭形切除缝合法)治疗皮肤色素痣，3个月后随访，比较不同方法的复发率和美学效果。结果：三种物理治疗法治疗色素痣复发率大于66.5%，美容效果差。三种手术疗法治疗色素痣复发率小于2.0%，美容效果优良。结论：三种物理治疗法不宜用于治疗皮肤色素痣。1～3mm的色素痣应首选微型环钻切除缝合法、3～8mm的色素痣应选择单纯环切缝合法或梭形切除缝合法。 〔关键词〕色素痣物理疗法外科疗法 〔Abstract〕Objective：Tosieveoutthebestmethodsfornevustreatment.Methods：Threesortsofphysiotherapy(CO2laser,highfrequencyelectricityandliquidnitrogenfreezing)andthree sortsofsurgicaltherapy(miniatureringdrillexcisionplussuture,simpleringdrillexcisionandspindleexci sionplussuture)wereusedfornevustreatment.Allpatientswerefollowedupthreemonthsaftertreatme nt.Aestheticeffectsandcomplicationrateswereevaluated. Results：Threesortsofphysiotherapygainedover66.5%ofcomplicationrateswithbadaestheticeffects.Threesor tsofsurgicaltherapygained2.0%ofcomplicationrateswithidealaestheticeffects.Conclusion：Threesortsofphysiotherapycouldnotbeusedfornevustreatment.Miniatureringdrillexcisionplussutur eisthebestchoicefor1～ 3mmnevi.Simpleringdrillexcisionorspindleexcisionplussutureissuitablfor3～8mmnevustreatment. 〔Keywords〕NevusPhysiotherapySurgicaltherapy 皮肤色素痣是常见的良性病变，其直径一般为1～3mm，面颈部多发。因面颈部色素痣要求治疗者占美容外科患者的5.7%。自1990年，我们用CO2激光器、高频治疗仪、冷冻、微型环钻切除缝合法、单纯环切缝合法和梭形切除缝合法治疗面部皮肤色素痣273例，随访198例，共1202颗色素痣。本文对以上6种治疗方法的近期和远期治疗结果进行了比较。 1临床资料 面部皮肤色素痣患者273例，随访198例，随访率为72.5%。色素痣最小直径为1mm，最大直径为8mm。直径大于5mm的色素痣均高出皮肤。 2治疗方法 2.1CO2激光器气化法采用CO2激光器，输入电压220V，输出功率20～30W。治疗中作术区消毒，采用脉冲输出方式汽化色素痣组织，用75%酒精棉球擦拭黑痣碳化物，至局部黑色组织成分完全清除。 2.2高频电灼法启用综合美容治疗机的高频功能，频率范围3000～5000kHz，工作头为针式电极。操作方式同CO2激光器气化法。 2.3冷冻治疗法采用干冰铜棒冷冻治疗器，治疗头直径为1～10mm，接触时间3秒，消融时间10～15秒，每个色素痣共用3个冻融周期。 2.4微型环钻切除缝合法直径在1～3mm以下的微型痣作微型环钻切除治疗，环钻直径分别为2、3、4mm。治疗时用2%利多卡因作色素痣下皮丘样局部麻醉，将环钻套准色素痣，顺时针方向旋转两圈，摘除皮柱。痣摘除后的创面呈椭圆形，用8～0无损伤缝合线缝合。 2.5单纯环形切除法直径在3～8mm的黑痣用大环钻切除，形成椭圆形的小伤口，出血停止后手法合拢伤口缩小创面面积，用皮肤粘合胶带固定。局部换药至愈合。 2.6梭形切除缝合法直径在3～8mm的黑痣作梭形切除，作切口两侧皮下游离，用5-0丝线缝合术后7天拆线。 3结果 六种治疗方法结果见附表。 CO2激光器法、高频电灼法和冷冻治疗法治疗效果差。早期损伤面积大、伤口愈合时间长、伤口愈合后色素沉着面积和密度大。随访结果，色素需6～12个月才能消退，色素痣复发率高，冷冻治疗法的复发率高达87.3%。CO2激光器法和高频电灼法治疗后遗留边界清楚的凹陷瘢痕，复发的色素痣有局部扩散现象。?1?7环钻切除缝合法损伤面积小，缝合后愈合快，术后早期有轻微的色素沉着，缝合口呈红色小点，2～3个月后颜色完全消退，复发率为2.0%。单纯环形切除法不损伤正常皮肤，直径大于5mm的创面需要换药，愈合时间需2～3周，愈合口为红色圆点样瘢痕，直径约为原色素痣面积的1/2左右，周围为轻度微

小鼠腹腔巨噬细胞的分离培养与鉴定

小鼠腹腔巨噬细胞的分离培养与鉴定 【摘要】目的建立一种小鼠腹腔巨噬细胞分离培养的简便方法。方法以无血清的DMEM培养液灌洗小鼠腹腔，分离获取小鼠腹腔巨噬细胞，在含有10%成牛血清的DMEM培养液中培养。采用倒置显微镜观察细胞形态，台盼蓝染色计算存活率，瑞氏染色计算纯度。结果获得高纯度的巨噬细胞，具备巨噬细胞的形态特征。结论该方法是一种简单可行的分离巨噬细胞的方法。 【关键词】小鼠；巨噬细胞；分离；培养；鉴定 0.引言 巨噬细胞是动物机体内重要的免疫细胞，具有抗肿瘤和免疫调节等重要作用[1，2] ，被广泛应用于体外免疫增强药物的非特异性免疫功能评价[3] 。有很多文献报到已能从多种组织和器官中分离纯化巨噬细胞，但这些方法大多都是繁琐、复杂，所需时间长且耗资较大。本实验以小鼠腹腔巨噬细胞为研究对象，探索建立一种巨噬细胞体外分离培养与鉴定简便的方法。 1.材料与方法 1.1实验对象 清洁级巴贝斯小鼠，体重在（30-32g），由兰州大学实验动物中心提供。 1.2实验方法 1.2.1小鼠腹腔单核巨噬细胞的分离培养 随机选取巴贝斯小鼠，腹腔注射不含小牛血清的RPMI-1640培养液5ml。轻柔小鼠腹部2-3min，静置5-7min后将小鼠颈椎脱臼处死，至于解剖板上，无菌条件下打开腹腔，用注射器抽取腹腔液，离心5min （1000r/min），弃上清，用PBS洗涤2遍。再用含10%成牛血清的RPMI-1640培养液（0.1%双抗溶液）调节至2×106ml-1，接种于培养瓶及6孔板，置37℃，5%CO2培养箱培养2h，弃上清。用不含小牛血清的RPMI-1640培养液洗涤2遍，然后加含有10%小牛血清的RPMI-1640培养液在37℃CO2培养箱中继续培养[4]。倒置显微镜观察细胞形态。 1.2.2巨噬细胞的观察与鉴定 （1）台盼蓝染色计算存活率。 4%台盼蓝母液：称取4g台盼蓝，加少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100ml，用滤纸过滤，4度保存。使用时。用PBS稀释至0.4%。（也可买Gibco的成品）；

黑色素的产生多与内分泌失调

黑色素的产生多与内分泌失调，日光照射有关，黑色素细胞的多少主要取决于遗传，另外，还与内分泌激素及营养状况有关，如何改善皮肤黑色素一直是美容界和皮肤科学界的难题，由黑色素导致的疾病如：雀斑、黄褐斑、黑变病等，成为美容界研究的课题，祖国中医认为：凡七情内伤、饮食不调、劳倦失宜、肾水不足、妇人经血不调等，均可致病，国际上增添了为解决这个间题主要从缓解局部黑色素形成和促进色斑的分解排泄两方面实施各种技术方法，常用抗氧化防止紫外线幅射作用的有效成分包括SOD、茶多酚、辅酶口10，亚盐酸、生育酚、万年青、当归、黄芩、芦荟等。类似SOD的抗自由基物的有抗紫外线幅射，减缓色斑形成作用。 改变黑色素生成途径的物质如：骨胱甘肽曲酸、熊果叶苷、维生素C亦可制作祛斑。具有抑制黑色素细胞形成有效成分有：氯喹、吲哚美辛、维生素C、9一胡萝卜素、绿茶、曲酸、黑白素、乌梅、桂皮、甘草油、溶提取物，那么怎样防止黑色素的产生而使皮肤变黑呢? 一、注意劳动保护避免直接在阳光下暴晒，紫外线能促进黑色素细胞产生黑色素颗粒，使皮肤变黑，最好在暴晒部位涂一些增白防晒霜。 二、注意饮食。平时要多饮水，多吃新鲜蔬菜、山楂、胡萝卜，少吃食盐，以减少黑色素的形成。 三、口服维生素C，它能将多巴醌还原为多巴，从而抑制黑色素的形成。 四、可口服中药六味地黄丸，每次8丸，每日2—3次。 五、外用脱色或祛斑剂，可选用3％双氧水、5％白降汞软膏或选用增白防皱霜、消斑增白霜、蛋白嫩肤霜、蛋白人参美容霜、特别增白粉蜜等。如长期使用可使黑皮肤有一定转白作用。 六、禁用含有雌激素的软膏或化妆品，因雌激素可促进黑色素形成，如涂用这些化妆品会使漳肤更黑，长期使用会导致皮肤病变。 七、和顺七情，保持心情舒畅，禁忌忧思恼怒。 八、饮食适量，多食新鲜蔬菜水果，勿食油腻辛辣及酒酪之品。 介绍健康美白的十二个方法 1、如果不是必须，尽量避免在夏季早上10点—下午2点出去，因为一天当中，这段时间的阳光最强、紫外线最具威力，对肌肤的伤害最大。 2、外出时尽可能戴帽子、撑阳伞、戴太阳眼镜、穿长袖衣裤，以保护肌肤。

动物细胞培养常用方法

一.细胞增殖周期（cell proliferatinal cycle）概念 细胞周期是描述细胞增殖和分化交替发生变化的概念。而细胞增殖周期主要是从细胞增殖角度赋予细胞活动的概念，两者不应混为一谈。细胞增殖周期是指细胞从一次分裂结束开始生长，到下一次分裂结束所经历的过程。根据细胞增殖周期不同时期的生化特点，划分为四个连续的时期，即G 1 期（DNA合成前期），S 期（DNA合成期），G 2期（DNA合成后期），M期（有丝分裂期）。如以G 1 期为起点， 那么细胞增殖周期的各时期应循着G 1-S-G 2 -M的顺序进行，G 1 、S、G 2 三期合称为 细胞间期，此期完成细胞生长过程。M期完成遗传物质的分配。 因此，细胞增殖周期=间期（G 1期+S期+G 2 期）+分裂期（M期）。 二.培养细胞生命期（life span of culture cells） 很多细胞特别是正常细胞，在体外的生存不是无限的，而是具有一个生命期。索维培养细胞生命期，是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。培养细胞的生命期与细胞的种类、性状和原供体的年龄、健康等情况有关。人胚二倍体成纤维细胞，在不冻存和反复传代条件下，科传30~50代，相当于150~300个细胞增殖周期，能维持1年左右的生存时间，最后衰老凋亡。如供体为成体或衰老个体，则生存时间较短；其他细胞如肝细胞或肾细胞，生存时间更短，仅能传几代或十几代。只有当细胞发生遗传性改变，如获永生性或恶性转化时，细胞的生存期才可能发生改变。正常细胞培养时，不论细胞的种类和供体的年龄如何，在细胞生命的全过程中，大致都经历以下三个阶段：原代培养期、传代期、衰退期。 三.培养细胞一代生存期 培养细胞的生存空间和营养是有限的，当细胞增殖达到一定密度后，则需要分离出一部分细胞和更新营养液，否则将影响细胞的继续生存，这一过程叫传代（Passage或Subculture）。每次传代以后，细胞的生长和增殖过程都会受一定的影响。传代的频率或间隔与培养液的性质、接种细胞的数量和细胞增殖的速度

小鼠腹腔巨噬细胞和肾脏细胞的原代培养2013

细胞工程综合实验报告 小鼠腹腔巨噬细胞和肾脏细胞的原代培养 班级 xxxx 姓名 xxxx 学号 xxxxxxxxxx 指导教师 xxxx 实验时间 xxxx 成绩

小鼠腹腔巨噬细胞和肾脏细胞的原代培养 姓名学号班级 一、实验目的 1.了解细胞原代培养培养的基本方法和操作过程。 2.初步掌握培养过程中的无菌技术。 3.了解在相差显微镜下观察培养细胞的形态和生长状况。 二、实验原理 原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞、组织和器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），经消化，分解成单个游离细胞，在人工培养下，使其不断的生长及繁殖。 细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。要使细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必须的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度与渗透压的调节。二是严格控制无菌条件。 巨噬细胞属天然免疫细胞，具有趋化运动、吞噬、分泌和参与免疫调节等功能，是科学工作者研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。巨噬细胞容易获得，便于培养，并可进行纯化。巨噬细胞属不繁殖细胞群，在条件适宜下可生活2－3周多用做原代培养，不易长期生存。巨噬细胞也建有无限细胞系，大多来自小鼠，如P331、S774A.1、RAW309Cr.l等，均获恶性，培养中呈巨噬细胞形态和吞噬功能，易于传代和瓶壁分离，但难以建株。目前，单核巨噬细胞株也有，比如RAW264.7，但价格比较贵，且保存也不方便。 培养巨噬细胞可用各样方法和各种来源来获取细胞，目前以小鼠腹腔取材法最为实用，而目前获取小鼠巨噬细胞的方法有两种，一种是直接用培养液灌洗实验动物腹腔，从腹腔灌洗液中分离巨噬细胞，还有一种方法向动物腹腔中注射刺激物（如牛血清，淀粉，糖原，脂多糖，矿物油，PRMI1640培养液等），这样使机体产生大量巨噬细胞后再腹腔灌洗，但由于许多刺激物能激活巨噬细胞，而被激活的巨噬细胞大量吞噬刺激物，有此得到的巨噬细胞培养用于培养时，细胞中的刺激物不能很快被消化而残留在细胞中，影响细胞代谢，同时也不能很好的模拟体内环境，所以我们直接用培

怎样淡化疤痕黑色素,值得信赖

怎样淡化疤痕黑色素，值得信赖 在现实生活中，很多女性都会遇到黑色素沉淀的问题。就是不知道怎么回事，脸上就开始出现一片片淡淡的黑色。由此，十分影响外观，久而久之还会造成自卑心理，对于人的影响是很大的。那么有了疤痕黑色素怎么淡化最有效呢？ 1、避免接触紫外线：黑色素的形成和紫外线息息相关，所以平时我们要减少强烈阳光的接触，特别是中午12:00后几个小时，阳光是最强烈的。出门要戴防晒伞，涂防晒霜什么。除此之外，我们日常接触的电子产品辐射中也带有对皮肤不良的成分，应加以注意。 2、皮肤对食物的反应是比较大的。有皮肤病的人千万要注意不要涉及辛辣刺激、难消化的、油炸的食物，以及甘肥厚腻重口味一类，远离人工添加剂，慎用激素和避孕药。多吃蔬果。 3、我们的身体是很敏感的，一点点小的伤害都会有所反应，如果疾病反应在皮肤上，就会表现出晦暗、炎症、色斑等。所以要想保养皮肤，一定要在平时养成一个良好的生活习惯。特别是不能熬夜，会导致不少黑色素沉积。除此之外，三餐起居要尽量规律，早睡早起。 每顿七、八分好就行，晚上九点后不要吃东西了，食物都是带点毒的，特别是甘肥厚腻的。劳逸结合，避免过劳，适当运动，培养一个好体质，就会光鲜照人。 以上这些方法对于黑色素的消除起到一定的作用，要想彻底消除黑色素推荐使用初源漾，初源漾采用高科技生物萃取技术,提炼樱花所蕴含的活性分子精华。融入抗坏血酸、生育酚、透明质酸、木糖醇基葡萄苷等成分,结合特有的渗、清、修、护四步疗法,销售以来,已经帮助数千万的女性有效改善皮肤状态,恢复红嫩、水润状态。初源漾上市前产品由国家卫生部门检测,全部合格,可放心使用。 初源漾，设有专门的客户服务机构，特邀多位美肌专家顾问，提供专业的售前服务、积极的售中服务、完善的售后服务，打造立体式，专家全程跟踪式服务体系。同时为了规范市场秩序，初源漾实行全国统一官网销售，私密发货，快递单上只写快递单号及必要的收件人信息等，不会出现任何敏感字样，确保用户的隐私和产品品质！ 以上总结到的这些是希望可以为大家提供参考,也希望大家选择初源漾可以早日远离黑色素的困扰,还给自己原本白净粉嫩肌肤!

巨噬细胞培养

1、实验前三天，向每只小鼠腹腔内注入无菌硫羟乙酸肉汤1ml（勿注入肠内）。 2、引颈杀死动物，手提鼠尾将全鼠浸入70%酒精中3～5秒。 3、置动物于解剖台上，用针头固定四肢，双手持镊撕开皮肤拉向两侧，暴露出腹膜， 但勿伤及腹膜壁。 4、再用70%酒精擦洗腹膜壁后，用注射器吸10mlEagle液注入腹腔中，同时从两侧用 手指揉压腹膜壁，令液体在腹腔内充分流动。 5、用针头轻轻挑起腹壁，使动物体微倾向一侧，使腹腔中液体集于针头下吸取入针管 内。 6、小心拔出针头，把液体注入离心管中，250g4℃离心10分钟，去上清，加10mlEagle 培养基。 7、计数细胞，每只小鼠可产生20～30×105细胞，其中90%为巨噬细胞。 8、为获取3×105帖附细胞/平方厘米，需接种2.5×106/ml。 9、为纯化培养细胞，去除其它白细胞，接种数小时后，去除培养液，用Eagle液冲洗1～2 次后，再加新Eagle培养液置37℃CO2温箱中培养 小鼠单核/巨噬细胞RAW 264.7 1.在ATCC对该细胞传代的描述中是采用细胞刮棒进行的。我们的经验是，以0.25%胰 酶+0.02%的EDTA作为消化液。使用温至室温的消化液进行消化，消化时镜下观察，并用手掌轻拍细胞贴壁的瓶底，约3~5 mi n后，待约10%左右的细胞脱离瓶壁即可终止消化，弃去胰酶，以含10%FBS的DMEM培养基吹打细胞。值得注意的是该细胞对机械损伤比较敏感，所以不要用吸管反复吹打细胞。该细胞很难将瓶内所有细胞都吹下来，所以换瓶传代就行了。看了楼主的描述，感觉是细胞难以耐受机械损伤而导致裂解了。 2.消化液：0.5％胰酶、0.2％EDTA，实验前加温到37度以50ml培养瓶为例：1、细胞 贴壁生长，长满瓶底80％时，弃去培养液，加D-HANKS 漂洗两次；2. 加入含胰酶和EDTA 的消化液1－2ml,消化37℃约2-5min，镜下可见细胞基本圆形回缩即中止消化，弃消化液加D-HANKS 漂洗两次；3.加入新培养液10ml复吹打混悬细胞，按需要分入新的培养瓶3.我得操作如下：实验前将DPBS及DMEM加温到37度使用Flask75培养瓶：1、 细胞贴壁生长，长满瓶底70％时，弃去培养液，加DPBS(磷酸盐缓冲液)10ml漂洗一至两次；弃去2. 加入10mlDPBS,然后用scratcher轻轻刮即可，离心后去除DPBS.用DMEM 培养液10ml复吹打混悬细胞3.分入新的培养瓶；4. 入37℃5％CO2孵箱，几小时后即可再贴壁；4. 入37℃5％CO2孵箱，几小时后即可再贴壁。 4.RAW264.7细胞传代后贴壁时间比较短，半小时就能贴很多，刚贴壁时细胞呈圆形，折 光度很好，镜下观察明亮如小珍珠状一个个地散落于瓶底面。生长一段时间后，部分细胞会变为类似四角形，伸出伪足之类的吧。这个时候其实就是提示你注意传代了，这部分细胞如再不传代，很容易就老化掉。 5.细胞老得特别快,用DMEM培养基本上一天培养基就会变黄,需要换液,如果换液换晚了 的话细胞就感觉长融在一起细胞壁不清楚,但基本上不会有死细胞 6.小鼠的单核细胞系RAW264.7细胞(ATCC号:TIB-71)用含10% 胎牛血清(FBS，美国 GIBCO公司)的无酚红DMEM (美国Promega公司)培养液培养，其中含50 U/ml青霉素和 50 μg/ml庆大霉素。3 d换液1次,细胞汇片后, 用胰酶二乙胺四乙酸（EDTA）消化液消化 细胞,根据不同的实验目的接种于不同规格的培养板上。 7.ATCC complete growth medium:The base medium for this cell line is ATCC-formulated Dulbecco's Modified Eagle's Medium（DMEM）, Catalog No. 30-2002. To make the complete growth medium, add the following components to the base medium: fetal bovine serum to a final concentration of 10%.

色素污渍的去除方法

色素污渍的去除方法 色素污渍多种多样，一旦沾染到衣物上就很难去掉，要根据污渍的颜色和性质，分别采用不同的方法去除。 1、染料渍的去除 染料弄到了衣物上，可先用稀醋酸擦拭，然后再用双氧水漂洗。也可以用松节油刷洗后，再用汽油擦拭。最后都要用清水漂净。 2、红墨水渍的去除 新染上的红墨水渍可先水洗，然后放入温热的皂液中浸泡，待色渍去掉后，再用清水漂亮洗干净。污染时间较长的红墨水渍，先用水洗后，再用10%的酒精水溶液擦拭去除。 3、蓝墨水渍的去除 新沾污的蓝墨水渍可用肥皂，洗衣粉等洗涤剂搓洗去除。污染时间较长的蓝墨水渍，可用草酸溶液浸泡后搓洗，然后再用洗涤剂清洗去除。 4、红药水渍的去除 衣物上染上红药水，先用温热的洗涤剂溶液洗后，接着分别用草酸和高锰酸钾溶液顺次浸泡、搓洗，最后再用草酸溶液脱色，再进行水洗，红药水渍即除。 5、紫药水渍的去除 紫药水中的主要成分是从龙胆草中提取出来的，所以紫药水又叫龙胆紫，是常用的外用药剂，沾在衣物上，青紫颜色，非常显眼。 去除方法是：把衣物用水浸泡后，稍加拧干，用棉签蘸上20%的草酸水溶液由里向外涂抹污渍。稍浸片刻后即可用清水反复漂洗、揉搓，污渍便可去除。另外，对一些沾染上紫药水的白色织物，也可先用溶剂酒精除去浮色，再用氧化剂次氯酸钠或双氧水溶液进行漂白处理，经水洗后就能达到预想的效果。 6、黄药水渍的去除 浅色的尤其是白色的衣物洒上了黄药水，要除黄药水渍是比较麻烦的，首先用醋酸滴在污染处，如见效不大，可放在酒精中洗涤。 如果仍不能彻底除掉，就要依据衣物的质料纤维性质选用适合的氧化剂，进行去渍或漂白。 7、碘酒渍的去除 衣物染上碘酒，可以选用酒精或碘化钾来去除。在100毫升的水中要加5~7克碘化钾，用碘化钾溶液去渍后的衣物一定要用清水漂洗干净。也可把染上碘的衣物放入热水或15%~20%浓度的大苏打（硫代硫酸钠）热溶液中浸泡2小时，使污渍彻底溶解而脱离衣物。还可以用水淀粉浆糊涂在污渍之处，当污处出现黑色时，再用洗涤剂洗涤，最后漂洗干净即可。 8、药膏渍的去除 先用溶剂汽油或酒精刷洗后，再用四氯化碳或苯刷洗，最后再用优质洗涤剂清洗干净。 也可以先用三氯钾烷刷洗，再用洗涤剂洗涤，最后用清水漂净。还可以把加热后的食用面碱撒在污处，再加些温水进行揉搓，即可除去。 9、新染上的酒精或啤酒渍