石油降解希瓦氏菌
第21卷第2期极地研究Vol.21,No.2 2009年6月CH I N ESE JOURNAL OF P OLAR RESE ARCH June2009
研究论文
影响南极海洋石油烃低温降解菌希瓦氏菌NJ49生长和降解率的环境因素研究
刘芳明1,2 缪锦来1,2 臧家业1 董春霞3 王以斌1,2 (1国家海洋局第一海洋研究所,青岛266061;2海洋生物活性物质国家海洋局重点实验室,青岛266061;
3颐中(青岛)实业有限公司,青岛266021)
提要 以柴油为唯一碳源和能源,从南极海水海冰微生物资源库中筛选到一株石油烃低温降解菌希瓦氏菌NJ49,并对影响其生长和降解率的环境因素(pH、温度、盐度、营养盐和表面活性剂)进行了初步研究。结果表明:希瓦氏菌可作为低温海域石油烃污染生物修复的菌源,其生长和降解的最适条件为:初始pH7.5,温度15℃,盐度6%,摇瓶装量80m l,最佳氮源硝酸铵,最佳磷源为磷酸二氢钾和磷酸氢二钾的混合物,添加表面活性剂可促进希瓦氏菌NJ49的生长和生物降解率。
关键词 南极海洋 低温降解菌 柴油 生物降解 环境因素
0 引言
随着海上石油开采、运输和各类交通活动的日益频繁,海洋中石油烃污染物逐渐增多,而大规模溢油事件也时有发生,给海洋生态及近岸环境造成严重危害,由于自然微生物的生物修复是清除海洋石油烃污染的一种重要机制[1],因此备受关注。国内研究者对海洋中温降解菌的生物降解曾进行了广泛研究[2—4],但对低温环境中石油烃降解研究较少。
南极低温微生物资源丰富,从中获取低温降解菌成为新的研究热点,国外学者已从南极海洋中分离筛选得到不同种属的降解细菌,如Ha lo m onas[5]、R hodococcus[6]和Sphin2 go m onas[7],有的降解菌可以在4℃条件下降解烷烃[8],甚至在更低的温度条件下降解多环芳烃[9],为低温环境石油烃污染修复提供了新的思路。
柴油是一种复杂的蒸馏混合物,内含碳原子数为C9—C20范围的石油烃,因此是研
[收稿日期] 2008年11月收到来稿,2009年2月收到修改稿。
[基金项目] 国家自然科学基金项目(40876107)资助。
[作者简介] 刘芳明,男,1978年出生。实习研究员,主要从事海洋环境污染、监测与修复研究。
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究碳氢化合物生物降解的优良底物[10]。本研究以市售柴油为唯一碳源和能源,从南极微生物资源库中筛选低温降解石油烃的细菌,并对影响其生长和石油降解率的环境因子进行研究,以期为低温海域石油烃污染的生物修复提供基础资料。
1 材料与方法
1.1 细菌样品
所用样品于2001年11月—2002年3月中国第18次南极科学考察期间采集,并分离纯化得到,共50个,菌株编号分别为NJ29—NJ60,NJ280—NJ297。
1.2 培养基
1.2.1 2216E液体培养基
酵母粉,1g;蛋白胨,5g;磷酸铁0.1g;过滤海水,1000mL;pH,7.0—7.5。
1.2.2 2216E固体培养基
在上述液体培养基中加1.5%琼脂即可。
1.2.3 筛选、发酵用无机盐培养基(MMC)
NaCl,24g;MgS O4?7H2O,7.0g;NH4NO3,1.0g;KCl,0.7g;KH2P O4,2.0g; Na2HP O4,3.0g;蒸馏水,1000mL;pH7.4。灭菌后补以适量柴油,摇匀。
1.2.4 MMC固体培养基
MMC液体培养基加1.5%琼脂,灭菌并待培养基凝固后,用移液枪吸取适量柴油,涂布均匀。
以上培养基灭菌条件均为121℃湿热灭菌20m in。试剂均为分析纯;海水取自胶州湾,经沉淀灭菌后备用;柴油为市售0号柴油,经0.22μm滤膜过滤灭菌后备用。
1.3 南极低温降解菌的筛选
将斜面培养基上保存的南极细菌活化后,菌液以5%接种量接至2216E液体培养基中,培养7d后从培养液中移取1mL培养液,转接到添加柴油的2216E液体培养基中,连续驯化培养3次后,取1mL培养液到MMC液体培养基中。以不接种的MMC做空白对照,置低温摇床培养箱,8℃,120r/m in条件下,振荡培养15d。挑取摇瓶中显现浑浊的样品,吸取样品液0.1mL,在无菌操作条件下,涂布于MMC琼脂平板,置恒温培养箱中8℃下培养7d。能够在MMC琼脂平板上生长的细菌,被视为南极石油烃低温降解菌。
1.4 南极低温降解菌NJ49生长曲线的测定
移取5.0mL活化的南极低温降解菌NJ49菌液,加入装有100mL以柴油为唯一碳源的MMC液体培养基三角烧瓶中,于15℃,120r/m in振荡培养,每隔24h取样;以未接菌的MMC液体培养基做空白,光电比浊法[11]测540n m处的吸光值(OD
)。以培养时
540nm
间为横坐标,吸光值为纵坐标作图,得出菌株在该条件下的生长曲线。
1.5 环境因子影响的实验测定
1.5.1 pH对NJ49降解率影响的测定
用1mol/L HCl或1mol/L Na OH调节2216E液体培养基的pH值依次至5、6、7、8、9和10,分别接种南极低温降解菌NJ49,于15℃,120r/m in培养至对数生长期,取样,分别
于250n m 和540n m 处测定吸光值,并计算降解率。降解率计算参照文献[12]。
1.5.2 温度对NJ49降解率影响的测定
将MMC 液体培养基的pH 值调节为7.5,分别接种,设温度依次为0、10、15、20、30和35℃,南极低温降解菌NJ49发酵培养,120r/m in 培养至对数生长期,取样,分别于250n m 和540n m 处测定吸光值,并计算降解率。
1.5.3 盐度对NJ49降解率影响的测定
用NaCl 溶液调节MMC 液体培养基的盐度依次至4.0%、5.0%、6.0%、7.0%、8.0%和9.0%,分别接种NJ49,于15℃,120r/m in 培养至对数生长期,取样,分别于250nm 和540nm 处测定吸光值,并计算降解率。
1.5.4 通气量对NJ49降解率影响的测定
在6只250mL 摇瓶中分别装入20、50、80、100、120和150mL MMC 培养基,培养基的pH 值调节为7.5,分别接种南极低温降解菌NJ49,于15℃,120r/m in 培养至对数生长期,取样,分别于250n m 和540n m 处测定吸光值,并计算降解率。
1.5.5 氮源对NJ49降解率影响的测定
选取硝酸钾、硝酸铵、硫酸铵、氯化铵、尿素作为氮源,其浓度均为1.0g/L,接种南极低温降解菌NJ49,于15℃,120r/m in 培养至对数生长期,取样,分别于250nm 和540nm 处测定吸光值,并计算降解率。
1.5.6 磷源对NJ49降解率影响的测定
选取磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾+磷酸氢二钾做为磷源,其浓度均为0.1g/L,分别接种南极低温降解菌NJ49,于15℃,120r/m in 培养至对数生长期,取样,分别于250n m 和540nm 处测定吸光值,并计算降解率。
1.6 表面活性剂对南极低温降解菌NJ49降解率影响的测定
在MMC 液体培养基中分别加入十六烷基三甲基溴化铵(CT AB )、十二烷基磺酸钠(S DS )、鼠李糖脂、鼠李糖脂+S DS,其浓度均为100mg/L,分别接种南极低温降解菌NJ49,于15℃,120r/m in 培养至对数生长期,取样,分别于250nm 和540nm 处测定吸光值,并计算降解率。
2 结果与分析
2.1 南极低温降解菌的筛选
经过3次的驯化培养和15d 的筛选培养后,发现所有样品中有4个摇瓶里的培养液变得浑浊,表明经过驯化培养后,4株南极细菌,即NJ41、NJ44、NJ49、NJ289,能以柴油为唯一碳源和能源在低温(8℃)进行生长,其中NJ49生长态势最好,见图1。通过16S r RNA 分子鉴定,已确定NJ49属于希瓦氏菌属(数据未发表),NCB I Gene Bank 序列号为EU788041。后续实验以希瓦氏菌NJ49为研究对象。
2.2 希瓦氏菌NJ49的生长曲线
测定南极低温降解菌NJ49的生长曲线,从图2可以看出,培养4d 后NJ49达到稳定期,此时南极低温降解菌NJ49细胞数量达到最高峰,生长与死亡处于一个动态平衡中。
38第2期 刘芳明等:影响南极海洋石油烃低温降解菌希瓦氏菌NJ49生长和降解……
第8d 后,由于培养基中的营养基本被消耗,生长速率小于死亡速率,细菌数量开始减少,进入衰亡期
。
图1 MMC 培养基中的南极细菌NJ49.左:空白对照,右:MMC 培养基
Fig .1.Antarctic bacteria NJ49in MMC culture .Left:contr ol,R ight:
MMC
图2 希瓦氏菌NJ49的生长曲线
Fig .2.The gr owth curve of Antarctic cold 2adap ted degrading bacteria She w anell s p.NJ49
2.3 培养基初始pH 值对希瓦氏菌NJ49降解率的影响
培养基的初始pH 值对希瓦氏菌NJ49生长和降解的影响见图3。可以看出,在pH 5—10培养基条件下,菌株NJ49都能生长和降解;在pH 7—8培养基条件下,菌株生长和降解处于最高状态
。
图3 培养基初始pH 对希瓦氏菌NJ49生长和降解率的影响
Fig .3.Effects of culture initial pH on She w anell s p.NJ49gr owth and degradati on efficiency
48极地研究第21卷
2.4 温度对希瓦氏菌NJ49降解率的影响
希瓦氏菌NJ49在15℃时生长量和降解率均达到最高,见图4。随着温度的增加其降解率开始下降。在0—25℃时,希瓦氏菌NJ49菌株可以生长并对柴油进行降解,但超过25℃,菌株生长非常缓慢,30℃时已经停止生长。希瓦氏菌NJ49在0—5℃的低温条件下,可以对柴油进行降解,一般情况下在此低温范围,中温降解菌代谢活性非常低,生长缓慢
。
图4 培养温度对希瓦氏菌NJ49生长和降解率的影响
Fig .4.Effects of different te mperture on She w anell s p.NJ49gr owth and degradati on efficiency
2.5 盐度对希瓦氏菌NJ49降解率的影响
希瓦氏菌NJ49在4%—9%盐度范围内均能生长和降解柴油,在6%盐度下,生长和降解达到最高。随着盐度的增加,其生长和降解受到限制,见图5
。
图5 盐度对希瓦氏菌NJ49生长和降解率的影响
Fig .5.Effects of different salinity on She w anell s p.NJ49gr owth and degradati on efficiency
2.6 通气量对希瓦氏菌NJ49降解率的影响
在250mL 摇瓶中装入50—120mL 培养基时,菌株希瓦氏菌NJ49生长和降解量均处于较高的状态;当装量为80mL 时,希瓦氏菌NJ49生长最好,降解率也最高,但随着培养基含量超过120mL,其生长和降解量则大幅度下降,见图6。
5
8第2期 刘芳明等:影响南极海洋石油烃低温降解菌希瓦氏菌NJ49生长和降解……
图6 摇瓶装量对希瓦氏菌NJ49生长和降解率的影响
Fig .6.Effects of air content on She w anell s p.NJ49gr owth and degradati on efficiency
2.7 氮源对希瓦氏菌NJ49降解率的影响
影响希瓦氏菌NJ49的降解率的氮源中,硝酸铵最高,达到55%;硫酸铵和氯化铵次之;硝酸钾和尿素最低。吸光值最高的也是硝酸铵;其次是硫酸铵和氯化铵;尿素和硝酸钾最低,见图7
。
图7 氮源对希瓦氏菌NJ49生长和降解率的影响
Fig .7.Effects of different nitr ogen s ources on She w anell s p.NJ49gr owth and degradati on efficiency
2.8 磷源对希瓦氏菌NJ49降解率的影响
作为磷源,将磷酸二氢钾和磷酸氢二钾两者混合添加,吸光值和降解率均为最高,见图8。可能是由于两者混合不仅提供了细菌生长需要的磷源,根据测定不同磷源培养基的pH 值结果(数据另文刊出),两者混合也起到调节、稳定环境pH 值的作用,更适宜细菌的生长。
68极地研究第21卷
图8 磷源对希瓦氏菌NJ49生长和降解率的影响
Fig .8.Effects of phos phorus s ources on She w anell s p.NJ49gr owth and degradati on efficiency
2.9 表面活性剂对希瓦氏菌NJ49降解率的影响
本文分别选取了阴离子、阳离子、非离子表面活性剂,以及表面活性剂混和使用,研究其对NJ49低温降解的影响。结果表明,所选用的表面活性剂均对希瓦氏菌NJ49的生长和降解有促进作用,其中,以鼠李糖脂和S DS 混用效果最佳,见图9。说明低剂量的表面活性剂对降解菌是没有毒性的;由于非离子表面活性剂能与阴离子表面活性剂混合使用,对柴油产生显著的协同增溶作用,有效增强柴油的生物可利用性,而鼠李糖脂自身兼备碳源和能源,可以被希瓦氏菌NJ49利用,所以鼠李糖脂和S DS 混用大大增强了希瓦氏菌NJ49对柴油的降解
。
图9 表面活性剂对希瓦氏菌NJ49生长和降解率的影响
Fig .9.Effects of different surfactants on She w anell s p.NJ49gr owth and degradati on efficiency
7
8第2期 刘芳明等:影响南极海洋石油烃低温降解菌希瓦氏菌NJ49生长和降解……
88极地研究第21卷3 讨论
国内已见报道中的石油烃降解菌多是从土壤中分离得到[13—15],土壤与海洋的环境组成大不相同,土壤降解菌无法适应海洋多盐寡营养的环境;而从海洋中分离的石油烃降解菌多是在中温(25—28℃)条件下筛选所得[2—4]。本文通过低温条件的筛选,获得一株石油烃低温降解菌NJ49,可以在低温石油烃培养基中生长,并显示出低温降解的效果。
环境因素影响着石油烃降解的速率和程度。多项研究表明[16],氮、磷营养盐是限定生物降解率的因素之一,本文仅对不同氮源和磷源影响低温降解菌NJ49进行了研究,模拟海水的真实营养成分、氮磷浓度限值、氮磷比例等的影响尚需进一步了解;温度通过影响石油烃的物理性质和化学组分、微生物的代谢速率和微生物群落组成,间接对烃的降解速率产生影响[17]。温度过低,石油烃中的轻质组分不易蒸发,增加了底物的毒性,溶解态石油组分浓度也较小,降解菌对底物的生物利用性降低,这也是中温降解菌在低温环境修复污染无法克服的困难,本文筛选的南极低温降解菌在0—10℃范围内仍保持降解活力,为中国冬季北方低温海域石油烃污染修复提供了菌源。
作为降解石油烃的一种机动机制,降解菌通过产表面活性剂以有效促进石油烃的生物可利用性[18],在作者进行的另一项实验中(数据待发表),NJ49自身并不产表面活性剂,本文研究显示,通过向培养基中添加各种表面活性剂,可以明显促进降解菌的生长,提高降解率。
本实验对影响希瓦氏菌NJ49的因素进行了初步研究,获知实验室培养条件下,希瓦氏菌NJ49降解的最适条件为:最佳初始pH为7.5,温度为15℃,盐度为6%,摇瓶装量为80mL,最佳氮源为硝酸铵,最佳磷源为磷酸二氢钾和磷酸氢二钾的混合物。然而,自然海洋环境相当复杂,外源降解菌一旦进入受污海域可能面临寡营养、缺氧等问题,因此,如何构建适应恶劣环境条件的低温降解菌并进行应用修复仍需深入研究。
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I N FLU ENC E O F ENV I R ONM EN TAL FAC TO R S ON THE
GROW TH AND D EGRADAT I O N EFF I C I ENC Y O F
COLD 2ADAP TED P ETROLEUM HY DRO CARBON 2
D EGRAD I N G SH
E WAN ELL S P.BAC TER I A
I SOLATED FROM AN TARC T I C S EA
L iu Fang m ing 1,2,M iao J inlai 1,2,Zang J iaye 1,Dong Chunxia 3and W ang Yibin
1,2(1First I nstitute of Oceanography,S OA,Q ingdao 266101,China;
2Key Lab ofMarine B i oactive Substances,S OA,Q ingdao 266101,China;
3Est ong (Q ingdao )I ndustry Company,L td,Q ingdao 266021,China )
Abstract
Antarctic petr oleum hydr ocarbon 2degrading bacteria NJ49was screened fr om m icr oorgan 2is m culture collecti ons of Antarctic sea and sea 2ice,using diesel as s ole carbon s ource .A p re 2li m inary study of influence of envir onmental fact ors on the gr owth and degradati on efficiency of NJ49has been made .I n the laborat ory,thr ough setting several kinds of cultivati on conditi ons,
98第2期 刘芳明等:影响南极海洋石油烃低温降解菌希瓦氏菌NJ49生长和降解……
influence of initial pH,temperature,salty,nutriti on and bi osurfactant on the gr owth and degra 2dati on efficiency of S he w anell s p.NJ49were assessed .Results revealed that the op ti m al combi 2nati on of nutrient constituents and conditi on t o gr ow and degrade were deter m ined as NH 4NO 3,KH 2P O 4and K 2HP O 4,NaCl 6%,pH 7.5,15℃,80mL volu me .Adding bi osurfactant,es 2pecially combinati on negative i on surfactant (S DS )with positive i on surfactant (rha mnoli p id )could i m p r ove S he w anell s p.NJ49gr owing and degrading .
Key words Antarctic sea,cold 2adap ted degrading bacteria,diesel,bi odegradati on,envir on 2mental fact ors .
09极地研究第21卷
石油降解微生物的研究现状
石油降解微生物的研究现状 陈宇翔生物工程学号：11208523802538 摘要：本文简单介绍了石油降解微生物的概念，并叙述了石油降解微生物的降解机理和影响微生物降解的条件。举例说明了生物降解石油烃的研究现状和对未来研究方向的展望。 Abstract: this paper briefly introduces the concept of microorganism oil, and describes the degradation of microorganism oil mechanism and influencing microbial degradation of conditions. For example the biodegradation petroleum hydrocarbons, the research present situation and prospect of the future study trends. 关键词：石油烃降解微生物石油污染高效性研究现状展望Keywords: petroleum hydrocarbon microorganism oil pollution efficiency research-status prospect 引言： 石油作为重要能源之一已被世界各国广泛使用，随之而来的石油烃污染已经对人类生存的土壤及水体环境造成了严重的危害，微生物降解是一种处理石油烃污染的理想方法。在石油及石油产品的开发利用中，不可避免的会对人类生存环境造成污染，防范、治理石油污染成为环境保护的重要任务之一。目前用于石油污染治理的方法主要有：物理修复法，化学修复法和生物修复法。与传统的物理化学方法比较，生物修复法具有经济花费少、对环境影响小、遗留问题少、最大限度地降低污染物的浓度、修复时间较短、就地修复、操作方便等特点[1]，是国内外科研工作者关注的热点领域，在石油污染的治理中具有广阔的应用前景。 本文从介绍石油降解微生物开始人手，认真分析了石油降解微生物的种类、菌种特征、降解机理，分析了目前用于处理石油污染的微生物的技术特点，现阶段研究现在和具体应用，并对未来的研究方向做出了大胆的设想和展望。
微生物石油降解
微生物石油降解综述 Abstract: Oil as a important energy has been one of the countries all over the world widely used, because in the exploitation of oil, storage, transportation, processing and petrochemical products in the process of production, and the sudden discharge of oil leakage accident cause large oil into the environment pollution. Oil pollution harm main performance in the column of \"soil ecosystem tao and the function of the damage, the serious influence the permeability of soil and water permeability, lead to soil harden. Fertility dropped; In the water surface formation oil film, cause the oxygen in the water fell sharply. Cause massive death of aquatic organisms, destroying the aquatic ecological environment and fishery resources; Still can into the underground water system, direct pollution underground water sources, the influence of water and irrigation residents; Some of the oil teratogenic carcinogenic substance but also by biological function of enrichment of the food chain and immediate harm to human health. 摘要：石油作为重要能源之一已被世界各国广泛使用，由于在石油的开采、储存、运输、加工和石化产品生产等过程中的漏油以及突发性泄油事故致使大量的石油进入环境造成污染。石油污染的危害主要表现在列土壤生态系统的结掏和功能的破坏，严重影响土壤的透气性和渗水性，导致土壤板结。肥力下降；在水体表面形成油膜，致使水中溶氧量急剧下降．造成水生生物的大量死亡，破坏水生生态环境和渔业资源；还可进入地下水系，直接污染地下水源，影响居民用水和农田灌溉；石油中的一些致畸致癌物质还可通过食物链的生物富集作用而直接危害人类健康。 随着人们对环境问题的日益关注，石油烃类的微生物降斛研究工作也不断得以深入。近十年米这一领域义有许多研究和相关报道，本文对相关工作进行了综述。 1国内外研究现状 1.1.石油烃类化合物被微生物氧化成为低分子化合物或完全分解为二氧化碳和水的作用。 1.2石油入海后发生一系列物理、化学和生物的变化，其中微生物对石油烃的降解起重要作用。微生物降解烃类是19世纪末发现的。20世纪50年代前，以美国C.E.佐贝尔为代表，对海洋微生物降解石油烃进行了广泛的研究。50年代初气相色谱问世，放射性同位素示踪法的普遍应用，对研究石油烃的微生物降解机制起了积极的作用。60年代以来，由于海上石油污染日趋严重，促使不少沿海国家，如美国、加拿大、日本、英国和苏联等国，积极开展了有关海洋微生物降解石油烃的研究工作。70年代中期，美国学者还用基因工程的技术培育了“超级微生物”，以期能有效地降解石油烃。 中国自1975年起，先后对青岛胶州湾、渤海、厦门港、黄海和东海石油降解微生物的数量、分布、种类组成和影响降解因素等进行了调查研究。 1.1烃类微生物概述 能够降解（氧化）石油烃，或以石油烃为其碳源的微生物称为烃类微生物。
石油降解菌的分离
从环境样品中分离筛选石油 降解菌的方案
引言 随着经济技术的迅速发展，石油日渐成为我过的主要能源，且需求量日益增大。研究表明，石油生产和运输环节会对土壤造成严重污染，且污染面积不断扩大。目前，我国石油行业每年产生的含油污泥多大八十万吨。由于石油的粘度大、粘滞性强，会再短时间内形成小范围的高浓度污染，长期的石油污染还会影响土壤的通透性，减少土壤肥力，阻碍植物生长。同时，石油中所含的多环芳香烃具有“三致”效应，一些挥发组分能引起人体麻醉、窒息和化学性肺炎等疾病。因此，石油污染对土壤生态系统的平衡和人体健康都有很大的危害。 目前，针对石油污染治理的方法主要包括：物理方法、化学方法以及生物修复法，但物理方法修复费用较高，耗材较多：化学方法会使用大量化学淋洗剂，很容易造成二次污染。相较而言，微生物修复技术由于生产费用低、不产生二次污染等特点而被视为一项最具有应用前景的修复技术。而且随着分子生物学的发展，无论是DNA文库的建立，还是多态性分析方法的进步，都为污染物的生物修复提供了全新的技术支持。既然生物修复法有诸多优点，那么就应该充分发挥其特性。本文则是着眼于环境样品，分离筛选其中的石油降解菌，以扩大培养进行更大规模的石油降解。 摘要 在长期被石油污染的土壤中，微生物可逐渐改变自身的代谢条件以适应环境。即以石油烃为碳源进行生长、繁殖，同时将石油烃降解。因此在这种土壤中存在着可降解石油烃的微生物，但石油烃降解菌的筛选、分离是生物法处理石油污染的关键。从这个角度考虑，以长期石油污染的土壤中微生物为菌源，从中筛选、分离出高效的石油烃降解菌。要降解哪里的石油就用哪里的土壤培养石油降解菌。目前，国内对极端条件下石油降解微生物研究较少，尤其是对低温、耐盐的石油降解菌，中国北方的大部分湿地，盐碱程度比较高，成年气温较低。无论是来源于海上还是来源于石油化工的污染都比较严重。本文针对大连开发区因石油泄露而被污染的白石湾，就地选取材料进行石油降解菌的筛选以及分离研究。
石油降解希瓦氏菌
第21卷第2期极地研究Vol.21,No.2 2009年6月CH I N ESE JOURNAL OF P OLAR RESE ARCH June2009 研究论文 影响南极海洋石油烃低温降解菌希瓦氏菌NJ49生长和降解率的环境因素研究 刘芳明1,2 缪锦来1,2 臧家业1 董春霞3 王以斌1,2 (1国家海洋局第一海洋研究所,青岛266061;2海洋生物活性物质国家海洋局重点实验室,青岛266061; 3颐中(青岛)实业有限公司,青岛266021) 提要 以柴油为唯一碳源和能源,从南极海水海冰微生物资源库中筛选到一株石油烃低温降解菌希瓦氏菌NJ49,并对影响其生长和降解率的环境因素(pH、温度、盐度、营养盐和表面活性剂)进行了初步研究。结果表明:希瓦氏菌可作为低温海域石油烃污染生物修复的菌源,其生长和降解的最适条件为:初始pH7.5,温度15℃,盐度6%,摇瓶装量80m l,最佳氮源硝酸铵,最佳磷源为磷酸二氢钾和磷酸氢二钾的混合物,添加表面活性剂可促进希瓦氏菌NJ49的生长和生物降解率。 关键词 南极海洋 低温降解菌 柴油 生物降解 环境因素 0 引言 随着海上石油开采、运输和各类交通活动的日益频繁,海洋中石油烃污染物逐渐增多,而大规模溢油事件也时有发生,给海洋生态及近岸环境造成严重危害,由于自然微生物的生物修复是清除海洋石油烃污染的一种重要机制[1],因此备受关注。国内研究者对海洋中温降解菌的生物降解曾进行了广泛研究[2—4],但对低温环境中石油烃降解研究较少。 南极低温微生物资源丰富,从中获取低温降解菌成为新的研究热点,国外学者已从南极海洋中分离筛选得到不同种属的降解细菌,如Ha lo m onas[5]、R hodococcus[6]和Sphin2 go m onas[7],有的降解菌可以在4℃条件下降解烷烃[8],甚至在更低的温度条件下降解多环芳烃[9],为低温环境石油烃污染修复提供了新的思路。 柴油是一种复杂的蒸馏混合物,内含碳原子数为C9—C20范围的石油烃,因此是研 [收稿日期] 2008年11月收到来稿,2009年2月收到修改稿。 [基金项目] 国家自然科学基金项目(40876107)资助。 [作者简介] 刘芳明,男,1978年出生。实习研究员,主要从事海洋环境污染、监测与修复研究。
石油烃类的微生物降解研究
石油烃类的微生物降解研究 石油作为重要能源之一已被世界各国广泛使用，随之而来的石油烃污染已经对人类生存的土壤及水体环境造成了严重的危害，微生物降解是一种处理石油烃污染的理想方法。综述了降解菌种类和不同烃类的微生物代谢途径，分析了包括温度、营养物、氧和pH值等环境因素对石油烃降解的影响，为进一步的研究应用提供参考依据。 随着工业和经济的发展，人类对能源的需求日渐增多，促进了石油工业的飞速发展；在石油生产、贮运、炼制加工及使用过程中，不可避免地会有石油烃类的溢出和排放，造成土壤及水体的石油污染。据统计全球每年倾注到海洋的石油总量在200~1000万t之间。辽宁省环境中心监测站的化验结果显示，在辽河油田的重度污染区内，土壤中的含油量已达到10 000 mg／kg以上，是临界值(200 mg／kg)的50多倍，严重影响了油田附近的生态环境。 石油烃类物质引起的环境污染越来越引起人们的关注。利用物理、化学方法处理石油烃可以得到较受到了限制翻。生物处理方法是近年来发展起来的，具有处理效果好、费用低、对环境影响小、无二次污染及应用范围广等优点，是迄今为止处理石油烃污染比较好的一种方法。 1.降解石油烃类的微生物种类 国外在20世纪40年代就开展了细菌降解石油烃的研究，我国这方面的研究始于20世纪70年代末期。研究表明，在土壤和水体环境中存在着大量能够降解石油烃的微生物，主要是细菌和真菌；细菌在海洋生态系统的石油烃类降解中占主导地位，而真菌则是淡水和陆地生态系统中更为重要的修复因子。石油烃降解菌和藻类见表1。
大量研究表明，当菌群处于石油污染环境中时，利用烃类化合物的微生 物数量急剧增长，尤其是含降解质粒的微生物。Atlas报道在正常环境下降解菌一般只占微生物群落的1％，而当环境受到石油污染时，降解菌比例可提高到10％。含质粒细菌在石油烃污染环境中出现的频率和数量LL-t~污染环境高，说明质粒在石油烃的降解中可能起着重要作用。降解质粒的存在为降解工程 菌的构建提供了可能。 2.石油烃类的微生物代谢途径 2.1 直链烷烃 通常认为饱和烃在微生物作用下，直链烷烃首先被氧化成醇，醇在脱氢 酶的作用下被氧化为相应的醛，然后通过醛脱氢酶的作用氧化成脂肪酸；氧 化途径有单末端氧化、双末端氧化和次末端氧化[7]。在转化为相应的脂肪酸后，一种转化形式为直接经历随后的／3一氧化序列，即形成羧基并脱落2个 碳原子；另一种转化形式为脂肪酸先经历60一羟基化形成∞一羟基脂肪酸， 然后在非专一羟基酶的参与下被氧化为二羧基酸，最后再经历一氧化序列
高效石油降解菌的筛选
海洋中高效石油降解菌的筛选 楼浩 04016158
摘要 本研究利用原油为唯一碳源，采用富集培养分离的方法从象山港的表层海水和底泥混合物中筛选到两株石油降解菌株F3和F4。通过检测，两种菌株在油浓度为2000mg·L-1、温度为28℃的条件下培养七天后，降解率分别达到了48.1%和51.3%，与目前已筛选出的海洋石油降解菌相比较，F3、F4均属于降解率较高的菌株。本研究还对营养盐、原油浓度等影响F3、F4菌株生长和降解率的相关因素进行了初步探讨。结果表明：①氮、磷营养盐在较大程度上限制了F3、F4菌株对原油的降解率，是主要的限制因子。在氮磷浓度≥1.0m g·L-1时，F3菌株才能达到最大的降解效率48.1%，在氮磷浓度≥1.5m g·L-1时，F4菌株才能达到最大的降解效率57.3%。②F4菌株的降解率随原油浓度的降低而增加。在原油浓度为400mg·L-1时，F3、F4菌株的降解率分别达到57.6%和61.5%，而在油浓度为4000 mg·L-1时，F3、F4菌株的降解率仅为27.5%、11.2%，相比之下F3菌株对原油浓度的耐受能力更强。 关键词：石油降解菌；筛选；原油降解率；氮磷营养盐；原油浓度
ABSTRACT The use of oil as the sole carbon source, using enrichment culture method from the surface water and sediment which in the Xiangshan Port isolated two strains of oil degradation, Named as F3 and F4. To detect these two strains in the oil concentration was 2000mg/L, the temperature is 28℃ training seven days ,The degradation rate respectively reached 48.1% and 51.3%, compared with that which has been selected marine oil degrading bacteria, F3, F4 belong to the higher efficiency degradation of crude oil strain. The issue also conducted a preliminary test about nutrients, oil concentration and so on which Impact F3, F4 strain growth and the degradation efficiency. The results showed that: ①nitrogen and phosphorus nutrient limitation to a greater extent on the F3, F4 strains degradation efficiency , is the main limiting factor. In the concentration of nitrogen and phosphorus ≥ 1.0mg/L, F3 strain to achieve normal degradation efficiency 48.1%, the concentr ation of nitrogen and phosphorus in ≥ 1.5 mg/L, F4 strains to reach the degradation efficiency is 57.3%. ② the degradation of the F4 strain increasing when the concentration of oil reduced. in the concentration of 400 mg/L, The degradation rate of F3, F4 strains respectively reached 57.6% and 61.5%, the concentration of oil in the 4000mg/L, The degradation rate F3, F4 strains of was only 27.5%, 11.2%, but compared with F4, F3 strains better adapted to the higher concentration of oil. Key Words: Petroleum Degrading strains; Screening;Degradation of oil;nutrients of nitrogen and phosphorus; Oil concentration
石油烃降解菌的研究【文献综述】
文献综述 食品科学与工程 石油烃降解菌的研究 [摘要]石油烃降解菌，是一种能在油水表面上生长而降解石油的微生物，因土壤和近海中含有丰富的N、P等营养原料，所以在近海和土壤中的石油烃降解菌的密集度较高，然而，由于远海中会缺乏N、P等营养物质，所以石油降解菌的繁殖受到一定的制约。当海水一旦受到石油的污染后，降解菌就不能很快消除污染物，所以培养适应能力和降解率高的石油降解菌是解决石油污染的主要方法。 [关键词]石油污染；石油烃降解菌；石油烃（TPH），微生物 作为现代工业的关键燃料和原料，石油及其加工品广泛应用在生产和生活的各个领域，包括工业、军事、交通等各行业，但是随着石油工业的快速发展,石油同时也成为海洋环境的主要污染物.据初步统计,由于各种原因,全世界每年有约1.0×107t的石油进入海洋环境中,我国每年排入海洋的石油达1.15×105t[1]。 由于工艺水平的限制和处理技术的落后，大量含石油类的废水、废渣不可避免的被排入到生态环境中，严重了影响整个生态系统，尤其是土壤和海洋系统。虽然石油在人类社会发展提供有力的能源来源，但伴随带来的环境污染问题也日益加剧。土壤，是人类赖以生存的重要自然资源之一，要对受石油污染土壤进行完整的治理，并使它在短时间内达到可耕作的标准水平，对于保护生态环境、实现农业和工业的可持续发展具有非常重要的意义。在污染土壤的各种治理的方法中，微生物修复法对环境破坏性小而且消费低而受到人们的重视，近年来的发展尤为迅速，在一定程度上为污染土壤的修复带来技术上的更新，也为解决石油污染问题带来新的希冀。但是，从污染性质来看，即使油井关闭后，其对环境的影响仍会持续相当长的时间[2]。这些都引起了社会各界的普遍关注,近年来，从中央到地方各大主要媒体对这一问题均作了大量专题报道[3]。 一、土壤石油污染的来源 石油污染,一般指原油的初级加工产品(包括汽油、柴油等)以及各类石油的分解产物所造成的污染。在石油的开采、加工和使用的过程中，造成的石油溢出和泄漏，对环境（空气、土壤、海洋等）产生极大的负面影响。而土壤是作为物质流动和能量循环的重要环境，常常是污染物迁移、停留和积累的最终承受者。 石油污染物主要是通过五种方式进入到土壤中：⑴原油的泄漏和溢油意外引起的落地原油污染；⑵含油的矿渣、污泥和废物的堆放，导致石油向土壤渗透并向四周扩散；⑶使用含油污水灌溉农田；⑷汽车尾气的排放所产生的气态石油类污染物渗入到土壤中；⑸药剂污染，即作为各种杀虫剂、防腐剂的溶剂和乳化剂等的石油类物质随药剂使用而进入到土壤中。在这些因素中，前三个因素是引起土壤石油污染最主要的原因，造成污染的面积
微生物对石油烃的降解机理研究
云南化工Yunnan Chemical Technology Sep.2018 Vol.45，No.9 2018年9月第45卷第9期 石油是一种重要的能源，可以说是现代经济的血液。日常生活、工业生产、航天军工都需要石油作为能源和原料，是国家生存和社会发展不可或缺的战略资源。但是，与此同时石油在开采、运输、储存、加工和利用过程中的各种泄漏事故对环境造成的污染和破坏也是不可估量的，其对人类和其他生物的生存和发展也造成一定的威胁，并已成为全球范围内亟待解决的重要问题。了解石油烃污染物在自然界的生物降解转化规律，研究石油烃污染物微生物降解的技术和方法，培养可高效降解石油烃的工程菌，消除和减少石油烃在环境中的滞留，将有利于维护和创造高质量的人类生存环境。 1 石油烃降解菌的降解机理 微生物对石油中不同烃类化合物的代谢途径和机理是不同的。饱和烃包括正构烷烃、支链烷烃和环烷烃。通常认为，在微生物作用下，直链烷烃首先被氧化成醇，源于烷烃的醇在醇脱氢酶的作用下被氧化为相应的醛，醛则通过醛脱氢酶的作用氧化成脂肪酸。相同条件下，一般微生物对不同种类石油烃降解的倾向先后顺序是不同的。一般而言，石油烃被微生物降解的先后规律为：直链烷烃>支链烷烃>环烷烃>多环芳烃>杂环芳烃。在某石油烃降解菌修复不同碳链石油烃污染的研究中得出结论，该菌属对短链石油烃的分解率相对较高，而对芳香烃和润滑油组分的降解率较短链石油烃低。一般微生物降解正烷烃由氧化酶酶促进行。正烷烃第一步氧化为醇后，醇氧化成醛，醛再转化为相应脂肪酸，脂肪酸经 β-氧化为乙酰辅酶A，乙酰辅酶A进入三羧酸循环，分解成CO2和H2O，或进入其他生化过程。另外，链状烷烃可经脱氢步骤转变为烯烃，烯经氧化成为醇，然后醇可转化为醛，最后醛变为脂肪酸；链状烷烃还可通过直接氧化成烷基过氧化氢，然后经脂肪酸途径进行降解。有的可通过亚末端氧化成仲醇，再变成伯醇或脂肪酸进行氧化分解。还有些微生物可将烯烃变为不饱和脂肪酸，通过双键位移或甲基化等，变为支链脂肪酸，再进行降解。 2 石油烃降解菌的种类 2.1 普通石油烃降解菌 在受石油污染的土壤和水环境中存在许多能降解石油烃的微生物，细菌、放线菌、真菌、酵母、霉菌和藻类中均有能降解石油烃的微生物，据研究表明目前发现100余属、200多种石油烃降解微生物。不同种类的微生物对石油烃的降解能力不同，通常细菌比真菌、放线菌对原油的降解能力强。细菌中降解石油烃的主要有无色杆菌属、假单胞菌属、不动杆菌属、产碱杆菌属、黄杆菌属、芽孢杆菌属、诺卡氏菌属以及微球菌属等。 2.2 特殊石油烃降解菌 2.2.1 低温石油烃降解菌 低温微生物在地球上广泛存在，一般分布于南北极、海洋深底、高原冰川以及冻土地区等低温环境中。目前发现的低温微生物种类繁多，通常为真细菌、酵母菌、蓝细菌、单细胞藻类等，这些微生物正逐渐引起科学家的广泛重视[1]。随着石油污染问题日益突出和国内外对低温石油烃降解菌研究的深入，低温石油烃降解菌修复 doi：10.3969/j.issn.1004-275X.2018.09.081 微生物对石油烃的降解机理研究 李 洲 （西安石油大学，陕西 西安 710065） 摘 要：随着工业和经济的发展，环境问题成为人们普遍关注的焦点，石油污染成了不可忽视的问题。微生物修复作为一种新型环保的生物修复技术，已成为石油污染生物修复的核心技术。对石油降解微生物的种类即细菌、蓝藻、真菌以及藻类进行了总结，对微生物对石油烃的降解途径与降解机理进行了综述。 关键词：微生物；石油烃；降解机理 中图分类号：X74 文献标识码：A 文章编号：1004-275X（2018）09-179-02 Study on the mechanism of microbial degradation of petroleum hydrocarbons Li Zhou （Xi’an Petroleum University，Xi’an 710065，China） Abstract：With the development of industry and economy，environmental problems have become the focus of attention，and oil pollution has become a problem that can not be ignored.As a new environmental protection bioremediation technology，microbial remediation has become the core technology of bioremediation of petroleum pollution.The types of petroleum-degrading microorganisms such as bacteria，cyanobacteria，fungi and algae were summarized.The pathways and mechanisms of petroleum hydrocarbon degradation by microorganisms were reviewed. Key wordss：microorganism；petroleum hydrocarbon；degradation mechanism；research ·179·
蒋勇 石油烃降解微生物研究进展
一前言 石油给人们带来巨大的利用价值和经济利益的同时,也对生态环境造成了巨大的威胁。在勘察、开采、运输以及储存过程中,油田周围大面积的受到严重污染。石油污染使得土壤理化性质发生改变,从而不利于农作物正常生长，石油类物质还通过地下水的污染以及污染的转移构成对人类生存环境多个层面上的不良胁迫。因此,治理石油污染具有重要意义。当今世界，治理石油污染具体措施中最安全、最环保、最经济的方法是生物修复技术，石油降解菌是一类具有分解矿化石油烃能力的微生物，在石油污染的生物修复中具有重要作用。本文就石油污染物生物降解方面的研究进行了综述及展望。
二本论 2．1 石油降解和菌的种类和分离 2．1．1石油降解和菌的种类 国外在20世纪40年代就开展了细菌降解油污的研究[1]，我国这方面的研究始于20世纪70年代末期[2]。已知降解石油的微生物共有70属200余种。细菌有28个属，霉菌30个属，酵母12个属。能够降解石油烃的细菌有假单胞菌属（Pseudomonas)、弧菌属（Vibrio）、不动杆菌属（Acinetobacter）、黄杆菌属（Flavobacterium）、气单胞菌属（Aeromonas）、无色杆菌属（Achromobacter）、产碱杆菌属（Alcaligenes）、肠杆菌科（Enterobacteriaceae)、棒杆菌属（Coryhebacterium）、节杆菌属（Arthrobacter）、芽孢杆菌属（Bacillus）、葡萄球菌属（Staphylococcus）、微球菌属（Micrococcus）、乳杆菌属（Lactobacillus）、诺卡氏菌属（Nocardia）等；酵母菌有假丝酵母属（Candida）、红酵母菌属（Rhodotorula）、毕赤氏酵母菌属（Pichia）等；霉菌有青霉属（Penicillium）、曲霉属（Apergillus）、镰孢霉属（Fusarium）等[3]。 2．1．2 石油降解和菌的分离 石油降解菌一般从受石油污染的土壤、水中进行分离并筛选，为了进一步的应用，还要进行驯化。根据研究目的与要求不同，在筛选时往往控制不同的条件从而得到不同功能的菌落。以烷烃为底物筛选出的菌落，对烷烃的去除效率会较高，由于烷烃相对于芳烃较易分解，且大部分的石油降解菌对烷烃的降解效果均较好，因此专门以烷烃为底物进行的研究不多见，郑金秀[4]以烷烃为底物培养出分属于不同菌属的菌落，其中不动细菌菌属的菌株降解率为69%，芽孢杆菌属的菌株降解率为71%，假单胞菌属的降解率可达73%；以环烷烃为底物，得到不动细菌菌属与芽孢杆菌属的菌株，石油降解率均为67%。两种底物研究降解时间均为48h。由于芳香烃及多环芳烃降解难度大，且其危害比较大，对降解芳烃的研究比较多。 2．2 石油降解菌的降解机理与影响因素 2．2．1石油降解菌的降解机理 微生物对石油的降解作用存在选择性,优先消耗碳链长度中等(C10—C24)的n-链烷烃类分子，其规律为:小于C10的直链烷烃>C10—C24或更长的直链烷烃>单环芳烃>环烷烃>多环芳烃,同种类型的烃类中分子量越大,降解越慢[5]。 通常认为饱和烃在微生物作用下，直链烷烃首先被氧化成醇，醇在脱氢酶的作用下被氧化为相应的醛，然后通过醛脱氢酶的作用氧化成脂肪酸；氧化途径有单末端氧化、双末
【开题报告】石油烃降解菌的筛选
开题报告 食品科学与工程 石油烃降解菌的筛选 一、综述本课题国内外研究动态，说明选题的依据和意义 目前，常有有关石油及其产品的微生物降解方面的研究报道，但对这些研究大多数以分离鉴定微生物种类为主，对混合菌株性能评价以及它们对高含油量的油泥降解研究很少。 作为现代社会的最主要动力燃料与化工原料，石油及其产品广泛应用于生产和生活的各个方面，包括工业、农业、军事、交通运输等各个行业，因此人们将石油称作“黑色的金子”。但是随着石油工业的发展，由于工艺水平和处理技术的限制，在许多环境特别是海洋环境中，石油污染已经成为一个普遍而严重的问题，石油的主要成分是烃类，在一个典型的石油样品中，含有的烃类可达200~300种之多，石油进入海洋后，石油中的一些成分可直接挥发而进入空气；一小部分海洋表面的石油受到紫外线作用可发生光化学分解，但速度极慢；而绝大部分石油要通过微生物的降解作用才得到净化。石油烃降解菌是一类能在油水界面上生长繁殖而降解石油的微生物，在近海、海湾等处，因海水中含有丰富的N、P等营养物质，石油降解菌的数量较多，然而，由于外洋海水中N、P等营养组织的缺乏，石油降解菌的繁殖受到制约，一旦污染，不容易很快消除，所以培养石油降解菌成为治理海上石油污染的主要方式。 而且在污染土壤的各种治理方法中，微生物修复由于具有费用低、处理效果好并且对环境破坏性小等诸多优点而受到人们的重视。所以筛选和培养石油烃降解菌对减轻石油污染是一个非常有意义的事情。 二、研究的基本内容，拟解决的主要问题： 1、降解石油烃的菌类哪些比较常见 2、石油烃降解菌降解石油的情况是怎样，会不会对环境产生二次污染 3、石油烃降解菌降解石油的能力会受环境的哪些因素影响 三、研究步骤、方法及措施： 1.用牛肉膏蛋白胨培养基进行菌种分离纯化与斜面保藏。