青霉素G酰化酶工程菌培养条件的研究

固定化青霉素酰化酶

以琳固定化青霉素酰化酶 由于β-内酰胺类抗生素（β-lactam antibiotics）广谱的抗菌作用，使得这类抗生素在临床上得到了广泛的应用。随着各类青霉素衍生物：如苄青霉素（Benzylpenicillin）、阿莫西林（Amoxicillin）、福米西林（formidacillin）等在医疗上的广泛应用，半合成（semisynthetic)β-内酰胺母核的需求量已经超过了青霉素。目前PGA 主要用于水解青霉素G生成6-氨基青霉烷酸（6-APA）及苯乙酸，然后催化母核和不同的侧链间的合成反应生成半合成的β－内酰胺类抗生素，生物催化合成半合成的β－内酰胺类抗生素在工艺要求、产率、经济效益及环保方面都优于化学法，因此人们在这一方面进行了深入和细致的研究。早在50 年代初就有人发现，黄青霉Q176（PenicillinmChrysoyeumn）和米曲霉（Aspergillus.oryzae）中存在水解青霉素成为6-APA的酶，即青霉素酰化酶（Penicillin acylase）青霉素G 酰化酶主要有两种来源，革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌，其中四种来源于革兰氏阴性菌的PGA（大肠杆菌青霉素酰化酶、类粪产碱杆菌青霉素酰化酶、雷氏普罗威登斯菌青霉素酰 化酶、克莱博氏菌青霉素酰化酶）已经克隆到大肠杆菌中进行了重组表达,并测定了序列。青霉素酰化酶根据其底物的专一性不同，可分为三种：（1）优先水解青霉素G 的叫青霉素G 酰化酶（PGA），（2）优先水解青霉素V的叫青霉素V 酰化酶（PVA），（3）专一水解氨苄西林的氨苄青霉素酰化酶。青霉素是一种胞内酶，PGA由α，β亚基组成，PGA 的两亚基通过轻键作用结合在一起。单独的α亚基和β亚基均不具有酶的活性，只有当两者以适当的形式结合后才具有活性。PGA的α亚基与青霉素的侧链结合，决定酶的底物专一性；β亚基包含催化位点以及与催化有关的残基。

青霉素酰化酶的固定化与应用新进展

作者：周成王安明王华杜志强祝社民杨明张俊沈树宝 【摘要】青霉素酰化酶被广泛应用于半合成抗生素及中间体的制备、手性药物的拆分和多肽合成等方面。高效固定青霉素酰化酶能提高酶对温度、ph值、溶剂极性等方面的适用性和反复使用的稳定性，将成为拓宽青霉素酰化酶在工业中应用的必然选择和关键。本文主要介绍了青霉素酰化酶固定化技术的进展，讨论了不同固定化技术的特点和固定化酶在非水相体系中的催化作用，并展望了固定化青霉素酰化酶的发展前景。 【关键词】青霉素酰化酶；载体；固定化；反应介质；固定化酶的应用 1 固定化的载体 有效固定是固定化青霉素酰化酶的核心技术，载体的材料选择与制备是技术的关键。性能优越的载体能提高固定化酶的催化性能，降低酶法生产成本。 1.1 有机高分子载体有机载体具有较好的机械强度且已产业化。天然有机高分子载体无毒性、传质性能好，常用甲壳素和壳聚糖［2］。合成的有机高分子强度大，但传质较差，如聚乙烯醇［3］和聚丙烯酰胺［4］等。mateo等［5］选用ep sepabeads类高密度环氧结构的载体固定青霉素酰化酶，过程如图1所示。pasini等［6］研究eupergit c载体固定化酶，催化活力较游离酶明显增加，重复使用稳定性好。 1.2 无机分子载体 随着材料学的迅速发展，出现了具有多维孔道结构介孔分子筛的载体，可制备高活性高稳定性的固定化酶。何静等［7］报道的介孔分子筛mcm 41具有高比表面积、较小扩散阻力的特点，可吸附固定，也可利用载体表面醛基与酶蛋白的氨基相互反应共价连接。roger等［8］实验表明mcm 41载体的孔径(3～3.5nm)明显小于青霉素酰化酶尺寸(7nm×5nm×5nm)，载体可大部分与酶以吸附形式固定。roger等研究了硅载体通过交联剂与酶共价固定的过程，如图2所示。此硅载体孔径较大，固定化酶的干酶活力达110bpug-1，活力回收80%，热稳定性明显优于eupergit c固定化酶。薛屏等［9］以mcm 48介孔分子筛为载体，固定青霉素酶12h，相对活力65.10%；肖清贵等［10］研制的中空硅微管载体，负载率和活力回收分 图1 青霉素酰化酶与高密度环氧载体共价结合过程别为97.20%和88.80%；bernardino等［11］研制的磁性硅载体可减少扩散阻力，便于催化剂分离回收；王卫等［12］研究的磁性环氧颗粒载体最适ph和温度分别为8.5和45℃，交联密度为30%，固定化酶经使用80次仍保持94.2%的催化活力。 采取对无机载体先表面修饰再与酶固定的方法，性能有很大提高。本课题组曾采用表面氨基的介孔二氧化硅固定青霉素酰化酶［13］，相对活力达90%以上，循环使用10次后催化活力仍保持初始条件的94%。此外选用介孔泡沫硅(mcfs)载体固定青霉素酰化酶，制得的mcfs载体［14，15］经电镜检测，颗粒表面密集分布大量孔道，孔径较大呈泡沫状。由bet法计算得到mcfs的比表面积为331.43m2/g。由bjh公式计算得到的孔体积及平均孔径分别为2.16cm3/g和26nm。固定化酶负载率约95%，催化活力最高达200u/mg以上，载体性能较好。 1.3 复合载体 有机载体和无机载体各有优势。有研究立足于结合这两种材质的载体，改进材料的性能，如针对壳聚糖颗粒机械强度不够和比表面积不大的缺点，用无机多孔材料硅藻土在低压下强化吸附壳聚糖以固定青霉素酰化酶，优化机械强度，固定化酶性能得到提高［16］。 2 青霉素酰化酶的固定化方法 固定方法的选择是酶与载体固定过程的关键步骤。载体固定通常有吸附法、包埋法和共价偶联法；无载体固定法常用无载体交联酶和交联酶聚集体两种，不同固定化方法优缺点如表1所示。 2.1 载体固定法 吸附法通过载体表面与酶表面次级键互相作用固定，可分为物理吸附和离子吸附。物理吸附

青霉素酰化酶SOP

青霉素酰化酶SOP 1. 目的 1.1为了保证原材料检验的准确性和具有可追溯性，便于抽查、复查，满足监督管理 要求、分清质量责任，特制定本检验规程。 2. 职责 2.1 公司质管部负责本制度的编制、修订和解释。 3. 范围 3.1 本标准规定了本品的技术要求、试验方法、检验规则、贮存。 本标准适应于6-APA用原料。 5. 引用标准 HNPZ07-09《原辅材料质量标准附录—滴定液与标准液》 HNPZ07-010《原辅材料质量标准附录—指示液指示剂》 HNPZ07-05《化验采样、留样管理制度》 6. 技术要求 7. 检验方法： 7.1 外观： 取本品1g置透明玻璃容器中，室内自然光下目测。 7.2 粒径： 采用微钠粒度仪（winner 99）测定。 7.3 活力： 7.3.1 原理：青霉素(Pen G)在IPA作用下转化成6-APA和苯乙酸，用NaOH滴定苯乙

酸，根据NaOH消耗量计算出IPA酶活力。 7.3.2 定义： 一个IPA酶活单位定义为，每分钟转化1微摩尔Pen G成6-APA的所需酶量。 7.3.3 试剂 a) 磷酸盐缓冲液（0.02M PH 7.8），配置见HNPZ07-12《原辅材料质量标准附录 —缓冲液》 b) 青霉素G钾10%（用7.3.3.1缓冲液配制而成的溶液）。 c) NaOH滴定液（0.1mol/L），配置与标定见HNPZ07-09《原辅材料质量标准附 录—滴定液与标准液》 7.3.4 仪器 自动滴定装置（浆式搅拌，恒温，PH自动滴定仪） 7.3.5 检测 精确称取固定化酶样品200～300mg 于50mL 的烧杯中，加入预热到28℃的30~40ml 10%的青霉素钾溶液，开启搅拌，控制反应温度28℃，反应中用0.1M NaOH溶液调PH至8.0，控制反应PH8.0，记录约10分钟左右NaOH 的消耗体积。 酶活力计算公式： V NaOH消耗体积（ml）×C NaOH摩尔浓度（μmol/ml） 酶活力（28℃）= ─────────────────────（u/g） W酶重量（g）×H反应时间（min） 7.4β—内酰胺酶： 7.4.1试剂溶液 6-APA底物溶液：称取0.627g6APA，用100mL磷酸盐缓冲液（PH7.0）溶解。 磷酸盐缓冲液（PH7.0）：配置见HNPZ07-12《原辅材料质量标准附录—缓冲液》。 醋酸钠缓冲液（PH4.5）：配置见HNPZ07-12《原辅材料质量标准附录—缓冲液》。 硫代硫酸钠滴定液（0.01mol/L）：配置与标定见HNPZ07-09《原辅材料质量标

【CN110760496A】一种青霉素G酰化酶的共交联固定化方法【专利】

(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910417451.8 (22)申请日 2019.05.07 (71)申请人 宁波大学 地址 315211 浙江省宁波市江北区风华路 818号宁波大学材化学院 (72)发明人 吴嘉沁　张瑞丰　李艳　肖通虎　 龙能兵　 (51)Int.Cl. C12N 11/10(2006.01) C12N 11/089(2020.01) (54)发明名称 一种青霉素G酰化酶的共交联固定化方法 (57)摘要 本发明是关于一种青霉素G酰化酶的共交联 固定化方法。使用油溶性的丁二醇双丙烯酸酯作 为交联剂，水相中的反应物为含有氨基的青霉素 G酰化酶以及胺化环氧树脂与β-环糊精形成的 超分子复合物，利用双键与氨基的迈克尔加成反 应，在较低的温度下发生共交联聚合反应，制备 出不同负载量的固定化青霉素G酰化酶。通过控 制交联程度，提高分散性，改善其内部的传质微 环境，该固定化酶具有较高的催化活性，负载量 在37mg酶/g载体时其相对活性达到游离酶的 91％。权利要求书1页 说明书4页 附图1页CN 110760496 A 2020.02.07 C N 110760496 A

1.一种青霉素G酰化酶共交联固定化方法，其特征在于使用水/油两相反应体系，油相为交联剂丁二醇双丙烯酸酯， 水相中的反应物为青霉素G酰化酶及结构如下的分子复合物： 所述的青霉素G酰化酶共交联固定化方法，按以下步骤操作： 1)将数均分子量为392的双酚A环氧树脂、甲醇和二乙烯三胺三种组分按照2∶2∶1的质量比混合，在25～35℃范围内搅拌反应4～5小时，将混合物倒入水中，沉淀物用水反复洗涤除去甲醇和少量的胺，然后放入真空烘箱中常温干燥，得到环氧树脂胺化物； 2)将环氧树脂胺化物与β-环糊精按照1∶2.1～1∶2.3的摩尔比加入到水中，加热搅拌至环氧树脂胺化物全部转化为分子复合物而溶解在水中，保持该水溶液的总质量浓度在5～6wt.％范围； 3)将青霉素G酰化酶溶解在pH＝7.5的磷酸钠缓冲溶液中，酶的浓度保持在1.0～7.0mg/mL范围； 4)将不同浓度的青霉素G酰化酶溶液与上述分子复合物水溶液按照55mL ∶20mL的比例混合； 5)在搅拌下将1.2g丁二醇双丙烯酸酯加入到上述混合水溶液中，反应温度保持在25～30℃范围，10～15分钟后有白色凝胶颗粒形成，停止搅拌使反应体系放置6～7小时，过滤后即得到不同负载量的青霉素G酰化酶固定化产物。 权　利　要　求　书1/1页2CN 110760496 A

固定化青霉素酰化酶合成头孢拉定的工艺研究

中国医药工业杂志 Chinese Journal of Pharmaceuticals 2007, 38(9) · · 619头孢拉定(cephadine ，1)，化学名为(6R ,7R )-7-[(2R )-氨基-2-(1,4-环己二烯-1-基)乙酰胺基]-3-甲基-8-氧代-5-硫杂-1-氮杂二环[4.2.0]辛-2-烯-2-羧酸，是美国Squibb 公司开发的头孢菌素类抗生素，1977年首次在日本上市，临床用于治疗敏感菌引起的支气管炎、支气管扩张感染、肺炎、肾盂肾炎、膀胱炎和尿道炎等 [1,2] 。 1的合成可分为化学法和酶法。目前国内多用化学法的混酐法生产工艺[3]。酶法合成1具有污染小、操作简单和反应条件温和等优点 [4-7] 。本研究用 7-氨基-3-脱乙酰氧基头孢霉烷酸(7-ADCA )和2,5-二氢苯甘氨酸甲酯盐酸盐(DHME )为原料，在磷酸盐缓冲液中，经固定化青霉素酰化酶(PGA )催化合成1(图1)，并考察了7-ADCA 和DHME 的浓度、固定化酶的用量、pH 及温度等影响因素，优化了工艺：7-ADCA 的浓度约为反应体系的10％；缓慢滴加DHME ，可有效降低其降解速度，控制副产物双 固定化青霉素酰化酶合成头孢拉定的工艺研究 叶树祥，徐成苗，王佳兵 (浙江昂利康制药有限公司，浙江嵊州 312400) 摘要：用7-氨基-3-脱乙酰氧基头孢霉烷酸和2,5-二氢苯甘氨酸甲酯盐酸盐在磷酸盐缓冲液体系中(20℃，pH 7.0)，利用固定化青霉素酰化酶催化合成抗生素头孢拉定，收率90％。关键词：头孢拉定；青霉素酰化酶；抗生素；酶法合成 中图分类号：R978.1+1 文献标识码：A 文章编号：1001-8255(2007)09-0619-02 收稿日期：2007-04-12 作者简介：叶树祥(1967)，男，硕士，从事化工、药学的生产和研究。Tel ：0575-*******，013587318918E-mail ：yeshux@https://www.wendangku.net/doc/84466545.html, Synthesis of Cephradine with the Immobilized Penicillin Acylase YE Shu-xiang, XU Cheng-miao, WANG Jia-bing (Zhejiang Anglikang Pharmaceutical Co., Ltd., Shengzhou 312400) ABSTRACT : Cephadine was synthesized from 7-ADCA and DHME in the phosphate buffer (20℃, pH 7.0) with the immobilized penicillin acylase as a catalyst in a yield of 90％. Key Words : cephradine ; penicillin acylase; antibiotic; enzymatic synthesis 氢苯甘氨酸的产生。pH 7.0、20℃反应效果好，收率可达90％。本研究酶用量较大，但可回收套用。 实验部分 PGA (浙江东阳顺风海德尔公司)；7-ADCA (浙江新东海医药化工有限公司)；DHME (自制)。其他试剂均为分析纯。 头孢拉定一水合物(1) 固定化青霉素酰化酶30g (湿品，干品约10g )加至底部有砂芯过滤装置(孔径约100μm )、机械搅拌和夹层保温装置的酶反应器中，加入0.lmol/L 磷酸盐缓冲液(pH 7.0，60ml )，20℃加入7-ADCA (15g ，70mmol )和亚硫酸氢钠(0.2g )，搅拌下用8％氨水调至pH 7.0。 另一反应瓶中加入DHME (15.7g ， 77mmol )和水(28ml )，搅拌至溶。20℃下90min 内，滴至如上酶反应器中，其间用8％氨水维持pH 7.0。加毕同温、同pH 条件下搅拌5h ， H PLC 跟踪反应(7-A DCA 残留低于 2mg/ml )。冷却至0～5℃，用8％氨水调至pH 8.5，从反应器底部滤出反应液，用水(15ml×2)冲洗酶反应器，合并滤液和洗液，过滤，升温至50℃，用10℃的稀盐酸-水(1∶2，v /v )调节至pH 5.0，冷却至5℃，静置析晶，过滤，

青霉素G酰化酶反应机理的说明

青霉素G酰化酶反应机理的说明 对变异的大肠杆菌ATCC 11105中提取的青霉素G酰化酶的反应及其逆反应动力学的研究和其反应常数的确定，结果表明，酶会被过量的青霉素G和两种产物所抑制。在正反应方向的脱酰作用中观察到6-氨基青霉烷酸（6-APA）的非竞争性抑制和苯乙醛酸的竞争性抑制。逆酰化反应的最适pH是5.7。此逆反应的机制被研究，底物抑制的影响也被研究，如6-APA，苯乙酸和产物。结果表明，青霉素G是逆反应的混合型抑制剂。版权为2001 Elsevier科学股份有限公司所有。 标签：青霉素G酰化酶；单一可逆反应；可逆单一反应；抑制；动力学；反应机理 1 简介 青霉素G酰化酶（PG酰化酶，EC3.5.1.11）催化青霉素分子中线性氨键水解成β-内酰胺分子，6-氨基青霉烷酸（6-APA）和相应的羧酸。PG酰化酶用于工业半合成青霉素和头孢菌素的6-APA和7-氨基-3-脱酰头孢菌酸（7-ADCA）的生产过程中。半合成青霉素是在酸性或中性环境中（pH4.0-7.0）产生，而6-APA 和7-ADCA则是在碱性中（pH7.5-8.5）产生。PG酰化酶可以利用酵母，细菌或霉菌生产。多数的PG酰化酶是用大肠杆菌生产的。重组大肠杆菌（如ATCC 31052，11105，21285和14945）消除了一些PG酰化酶生产中遇到的问题如糖和其他碳源的代谢抑制。在多数的工业生产过程中，部分纯化酶用在细胞或酶在不同支持物上的固定化。由于产品成本低，细胞的固定催化会更有利益。 在间歇和连续培养的搅拌反应器中用固定化青霉素酰化酶和它的不能溶解衍生物，描述为大肠杆菌中PG酰化酶的分离和动力学青霉素酰化酶转化为6-APA。最近的研究包括从大肠杆菌ATCC 11105的变种中提取出的并固定在过氧聚丁二烯-丙烯酸凝胶上青霉素G酰化酶的反应动力学机理，青霉素G酰化酶生物催化剂的特点和应用以及工业上以硅土为载体的青霉素G酰化酶的准备的固定化研究。 在水相中，青霉素G酰化酶断开青霉素G分子的肽链，产生一种羧酸和6-APA。目前，青霉素G酰化酶无论是自由的还是固定化的都只有其正反应动力学被研究过，至今还没有关于其逆反应动力学的报道，例如6-APA和羧酸在青霉素G酰化酶的作用下产生青霉素G和水的生物催化反应。正逆反应的研究和因此整个反应动力学的参数与完成比率的相等的结论需要用来预测应用在这种酶反应的反应器的性能。在目前的文章中，研究了正逆反应的稳态动力学。底物和产物对反应机理和抑制的影响以及整个反应的动力学参数都已经确定了。 2 材料和方法 2.1 材料和微生物

青霉素酰化酶固定化载体的设计合成

硕士学位论文 目录 摘要................................................................................................................... I Abstract ............................................................................................................... III 第1章绪论 . (1) 1.1青霉素酰化酶简介 (1) 1.1.1来源及分类 (1) 1.1.2结构 (1) 1.1.3催化机理 (3) 1.1.4青霉素酰化酶的应用 (3) 1.2青霉素酰化酶的固定化 (4) 1.2.1固定化方法 (4) 1.2.2固定化载体 (5) 1.3 固定化青霉素酰化酶存在的问题 (7) 1.4 本论文的研究内容 (8) 第2章以CLX1180为载体固定化PGA的研究 (10) 2.1 引言 (10) 2.2 实验仪器及药品 (10) 2.2.1 仪器 (10) 2.2.2 药品 (11) 2.3 实验部分 (11) 2.3.1 LX1180的氯甲基化反应 (11) 2.3.2 相关溶液的配制 (11) 2.3.3 6-APA最大吸收波长的测定 (12) 2.3.4 6-APA标准曲线的测定 (13) 2.3.5 游离PGA活力的测定 (13) 2.3.6 PGA的固定化 (14) 2.3.7 固定化PGA的红外光谱表征 (14) 2.3.8 固定化PGA活力和负载率的测定 (14) 2.3.9 固定化PGA的操作稳定性 (14) 2.3.10 固定化PGA的储存稳定性 (14) 2.4 结果与讨论 (15) 2.4.1 固定化PGA的红外光谱表征 (15) 2.4.2 时间对PGA负载率和固定化PGA活力的影响 (15) 2.4.3 游离PGA用量对PGA负载率和固定化PGA活力的影响 (16) 2.4.4 pH对PGA负载率和固定化PGA活力的影响 (17) 2.4.5温度对PGA负载率和固定化PGA活力的影响 (17) 2.4.6 固定化PGA的操作稳定性 (18)

青霉素生产

专业：化学工程与工艺（石油化学工程）学号：1111401224 姓名：汤冠挺 青霉素盐的发展与生产工艺 一、概述： 1、介绍：青霉素是由青霉、曲霉等属真菌产生的一种抗生素。青霉素是人类发现的第一种能够治疗人类疾病的抗生素。1929年英国细菌学家弗莱明首先从点青霉中获得青霉素。因其化学结构中侧链的不同而有许多种。青霉素可人工合成，用化学方法改造其部分结构，能制取一些新型衍生物。目前用人工合成的青霉素约有30种投入临床应用。用人工方法制造的青霉素具有毒性低、疗效高等优点。如青毒素G仅对革兰氏阳性细菌有效、对酸不稳定，而氨苄青霉素对酸稳定，抗菌谱广。 青霉素的发现是20世纪医学上的重大成就，为人类健康作出了重要贡献，同时也推动了整个发酵工业的发展。青霉素对革兰氏阳性细菌如链球菌、葡萄球菌、梭菌、芽孢杆菌等具有活性；而对革兰氏阴性如大肠杆菌、弧菌、分枝杆菌等无活性或活性低。青霉素对人和大多数动物无害，经肌肉或皮下注射后能迅速扩散到血液中去并几乎到达所有组织。在临床上青霉素用于治疗肺炎、脓肿、细菌性脑膜炎、梅毒、牙齿及口腔感染、骨髓炎以及其他对青霉素敏感的细菌引起的各种创伤感染。但青霉素能引起某些受药者过敏反应，严重时可引起休克、甚至死亡，故应用前必须做皮肤试验。 2、分子结构：

二、名称： 原名：青霉素 别名：苄青霉素、青霉素G、配尼西林 外文名：Benzylpencillin 、Penicillin G 三、青霉素的种类： 青霉素类抗生素是β-内酰胺类中一大类抗生素的总称，目前已发展了三代：第一代青霉素指天然青霉素，如青霉素Ｇ（苄青霉素）；第二代青霉素是指以青霉素母核——６－氨基青霉烷酸（６－ＡＰＡ）改变侧链而得到的半合成青霉素，如甲氧苯青霉素、羧苄青霉素、氨苄青霉素；第三代青霉素是母核结构，它带有与青霉素相同的β－内酰胺环，但不具有四氢噻唑环，如硫霉素、奴卡霉素。天然的青霉素共有7种，其中以青霉素G 效用较好，含量也比其它青霉高。 四、用途： 1、临床应用：青霉素适用于溶血性链球菌、肺炎链球菌、对青霉素敏感（不产青霉素酶）金葡菌等革兰阳性球菌所致的感染，包括败血症、肺炎、脑膜炎、咽炎、扁桃体炎、中耳炎、猩红热、丹毒等，也可用于治疗草绿色链球菌和肠球菌心内膜炎，以及破伤风、气性坏疽、炭疽、白喉、流行性脑脊髓膜炎、李斯特菌病、鼠咬热、梅毒、淋病、雅司、回归热、钩端螺旋体病、奋森咽峡炎、放线菌病等。青霉素尚可用于风湿性心脏病或先天性心脏病患者进行某些操作或手术时，预防心内膜炎发生。 2、青霉素的作用机理： 青霉素霉素的抗菌作用是：低浓度时抑菌，高浓度时杀菌，但机理却比较复杂。已发现所有细菌以及衣原体等的细胞膜上均具有一些能与青霉素和其它β-内酰胺类抗生素结合的蛋白，即青霉素结合蛋白（penicillin binding proteins, PBPs）。这些存在于细菌细胞内膜上的青霉素结合蛋白是青霉素作用的靶分子。 PBPs系分子量为4万到12万的膜蛋白，是细菌细胞壁合成过程中不可或缺的具有催化