HPLC色谱柱选择
Waters高效液相色谱柱简单介绍与选择
Waters高效液相色谱柱简单介绍与选择 2016-04-25 Bruce Lee 生产高效液相色谱柱的厂家有很多，如Waters，Agilent，Phenomenex，Shimadzu，Thermo等，每家供应商又生产多个系列，导致市场上的液相色谱柱的可选择性极强。 目前实验室以及公司，企业使用最多的是Waters以及Agilent所生产的RP液相色谱柱。Waters主要有Symmetry，Sunfire，XTerra，XBridge，XSelect，CORTECS以及Atlantis系列等，其详细分类以及键合相如下。 Figure 1 Waters Symmetry column family Figure 2 Waters Sunfire column family Symmetry与Sunfire系列色谱柱使用高纯度硅胶（B型）作为固定相基质，摒除金属离子杂质对固定相Si-O键的促进水解作用，此外由于金属离子含量特别低，在对其表面键合选择性烃基或内嵌极性官能团烃基时，可通过配体添加量控制硅胶表面键合相的多少，因此其最大特点在于批次之间的重现性。两个系列均采用封端技术，Sunfire C8与C18表面载碳量分别为12%和16%；SymmetryC8与C18载碳量均为12%，因此两个系列的C8色谱柱对于分析物的保留能力上没有本质的区别，而Sunfire C18色谱柱则相比Symmetry C18色谱柱，对于非极性比较大的分析物具有更强一些的保留能力，当然对于有机相的最低比例也相对比较高一些。Symmetry C8 Prep与C18 Prep色谱柱的填料粒径为7 um，其设计用途为制备；Symmetry300 C18（孔径300埃，载碳量8.5%）与Symmetry300 C4（孔径300埃，载碳量2.8%）则是为生物大分子多肽以及蛋白质的分离，分析而设计。Symmetry Shield RP 18内嵌极性官能团色谱柱，由于在靠近硅胶表面的极性官能团的存在，增加了硅胶表面的水分子浓度，改善了与水之间的浸润状况;因此可以允许使用极高水相作为分离，分析条件，而不会
液相色谱柱的选择
液相色谱柱的选择、使用、维护和常见故障及排除液相色谱的柱子通常分为正相柱和反相柱。正相柱大多以硅胶为柱，或是在硅胶表面键合 -CN,-NH3等官能团的键合相硅胶柱；反相柱填料主要以硅胶为基质，在其表面键合非极性的十八烷基官能团（ODS）称为C18柱，其它常用的反相柱还有C8,C4,C2和苯基柱等。另外还有离子交换柱，GPC柱，聚合物填料柱等。本文重点介绍反相色谱柱的选择和使用： 一、反相色谱柱的选择 1．柱子的PH值使用范围 反相柱优点是固定相稳定，应用广泛，可使用多种溶剂。但硅胶为基质的填料，使用时一定要注意流动相的PH范围。一般的C18柱PH值范围都在2-8，流动相的PH值小于2时，会导致键合相的水解；当PH值大于7时硅胶易溶解；经常使用缓冲液固定相要降解。一旦发生上述情况，色谱柱人口处会塌陷。同样填料各种不同牌号的色谱柱不尽相同。如果流动相PH较高或经常使用缓冲液时，建议选择PH范围大的柱子，例如戴安公司的Acclaim柱PH 2-9或Zorbax的PH 2-11. 5的柱子。 2．填料的端基封尾（或称封口） 把填料的残余硅羟基采用封口技术进行端基封尾，可改善对极性化合物的吸附或拖尾；含碳量增高了，有利于不易保留化合物的分离；填料稳定性好了，组分的保留时间重现性就好。如果待分析的样品属酸性或碱性的化合物，最好选用填料经端基封尾的色谱柱。 3．戴安公司Acclaim柱子介绍—极性封尾C16固定相柱 戴安公司有28种类型的柱子，Acclaim反相柱填料高纯，金属含量极低，完全封尾。PH 2-9范围内兼容，低流失，高柱效。尤其是2003年推出的Acclaim极性封尾C16柱，是最先商品化的磺酰氨-O链接键的色谱柱，具极低的硅羟基活性，能在极性溶剂甚至100%水的条件下长期使用。对酸
高效液相色谱柱
高效液相色谱柱 怎样选择色谱柱 现代高效液相色谱中，分离效果好坏很大程度上取决于色谱填料的选择。但是色谱填料的选择范围很宽，要做合适的选择，必须对此有一定的认识和了解。 1、正相色谱 正相色谱用的固定相通常为硅胶（Silica），以及其他具有极性官能团，如胺基团(NH2,APS)和氰基团（CN，CPS）的键合相填料。由于硅胶表面的硅羟基（SiOH）或其他团的极性较强，因此，分离的次序是依据样品中的各组份的极性大小，即极性强弱的组份最先被冲洗出色谱柱。正相色谱使用的流动相极性相对比固定相低，如：正乙烷（Hexane）,氯仿（Chloroform）,二氯甲烷（Methylene Chloride）等。 2、反相色谱 反相色谱填料常是以硅胶为基础，表面键合有极性相对较弱的官能团的键合相。反相色谱所使用的流动相极性较强，通常为水，缓冲液与甲醇，已腈等混合物。样品流出色谱柱的顺序是极性较强组合最先被冲出，而极性弱的组份会在色谱柱上有更强的保留。常用的反相填料有C18（ODS）、C8（MOS）、C4（B）、C6H5（Phenyl）等。 二、聚合物填料 聚合物调料多为聚苯乙烯-二乙烯基苯或聚甲基丙酸酯等，其主要优点是在PH值为1～14均可使用。相对与硅胶基质的C18填料，这类填料具有更强的疏水性；大孔的聚合物填料对蛋白质等样品的分离非常有效。现在的聚合物填料的缺点是相对硅胶基质填料，色谱柱柱效较低。 三、其他无机填料 其它HPLC的无机填料色谱柱也已经商品化。由于其特殊的性质，一般仅限于特殊的用途。如石墨化碳也用于正逐渐成为反相色谱填料。这种填料的分离不同与硅胶基质烷基键合相，石墨化碳的表面即是保留的基础，不再需其它的表面改性，该柱填料一般比烷基键合硅胶或多孔聚合物填料的保留能力更强，石墨化碳可用于分离某些几何导构体，又由于HPLC流动相中不会被溶解，这类柱可在任何PH与温度下使用。氧化铝也可用于HPLC，氧化铝微粒刚性强，可制成稳定的色谱柱柱床，其优点是可在PH高达12的流动相中使用。但由于氧化铝与碱性化合物作用也很强，应用范围受到一定的限制，所以未能广泛应用，新型氧化锆填料也可用于HPLC，商品化的仅有聚合物涂层的多孔氧化锆微球色谱柱，应用PH范围1～14，温度可达100℃。由于氧化锆填料几年才开始研究，加之面临的实验难度，其重要用途与优势尚在进行中。 怎样选择填料粒度 目前，商品化的色谱料粒度从1um到超过30um均有销售，而目前分析分离主要用3um、5um
怎样选择色谱柱
怎样选择色谱柱 现代高效液相色谱中，分离效果好坏很大程度上取决于色谱填料的选择。但 是色谱填料的选择范围很宽，要做合适的选择，必须对此有一定的认识和了解。 1、正相色谱 正相色谱用的固定相通常为硅胶（Silica），以及其他具有极性官能团，如胺基团 (NH2,APS)和氰基团（CN，CPS）的键合相填料。 由于硅胶表面的硅羟基（SiOH）或其他团的极性较强，因此，分离的次序是依据样品 中的各组份的极性大小，即极性强弱的组份最先被冲洗出色谱柱。 正相色谱使用的流动相极性相对比固定相低，如：正乙烷（Hexane）,氯仿（Chloroform）,二氯甲烷（Methylene Chloride）等。 2、反相色谱 反相色谱填料常是以硅胶为基础，表面键合有极性相对较弱的官能团的键合相。 反相色谱所使用的流动相极性较强，通常为水，缓冲液与甲醇，已腈等混合物。 样品流出色谱柱的顺序是极性较强组合最先被冲出，而极性弱的组份会在色谱柱上有 更强的保留。 常用的反相填料有C18（ODS）、C8（MOS）、C4（B）、C6H5（Phenyl）等。 二、聚合物填料
聚合物调料多为聚苯乙烯-二乙烯基苯或聚甲基丙酸酯等，其主要优点是在PH值为1～ 14均可使用。 相对与硅胶基质的C18填料，这类填料具有更强的疏水性；大孔的聚合物填料对蛋白 质等样品的分离非常有效。 现在的聚合物填料的缺点是相对硅胶基质填料，色谱柱柱效较低。 三、其他无机填料 其它HPLC的无机填料色谱柱也已经商品化。由于其特殊的性质，一般仅限于特殊的 用途。如石墨化碳也用于正逐渐成为反相色谱填料。这种填料的分离不同与硅胶基质烷基 键合相，石墨化碳的表面即是保留的基础，不再需其它的表面改性，该柱填料一般比烷基 键合硅胶或多孔聚合物填料的保留能力更强，石墨化碳可用于分离某些几何导构体，又由 于HPLC流动相中不会被溶解，这类柱可在任何PH与温度下使用。氧化铝也可用于HPLC， 氧化铝微粒刚性强，可制成稳定的色谱柱柱床，其优点是可在PH高达12的流动相中使用。 但由于氧化铝与碱性化合物作用也很强，应用范围受到一定的限制，所以未能广泛应用， 新型氧化锆填料也可用于HPLC，商品化的仅有聚合物涂层的多孔氧化锆微球色谱柱，应 用PH范围1～14，温度可达100℃。由于氧化锆填料几年才开始研究，加之面临的实验难 度，其重要用途与优势尚在进行中。
高效液相色谱流动相选择
高效液相色谱流动相选择 流动相 流动相的性质要求：一个理想的液相色谱流动相溶剂应具有低粘度、与检测器兼容性好、易于得到纯品和低毒性等特征。 流动相选择 1：由强到弱：一般先用90%的乙腈(或甲醇)/水(或缓冲溶液)进行试验，这样可以很快地得到分离结果，然后根据出峰情况调整有机溶剂(乙腈或甲醇)的比例。2：三倍规则：每减少10%的有机溶剂(甲醇或乙腈)的量，保留因子约增加3倍，此为三倍规则。这是一个聪明而又省力的办法。调整的过程中，注意观察各个峰的分离情况。 3：粗调转微调：当分离达到一定程度，应将有机溶剂10%的改变量调整为5%，并据此规则逐渐降低调整率，直至各组分的分离情况不再改变。 选择流动相时应考虑以下几个方面： ①流动相应不改变填料的任何性质。低交联度的离子交换树脂和排阻色谱填料有时遇到某些有机相会溶胀或收缩，从而改变色谱柱填床的性质。碱性流动相不能用于硅胶柱系统。酸性流动相不能用于氧化铝、氧化镁等吸附剂的柱系统。②纯度。色谱柱的寿命与大量流动相通过有关，特别是当溶剂所含杂质在柱上积累时。③必须与检测器匹配。使用UV检测器时，所用流动相在检测波长下应没有吸收，或吸收很小。当使用示差折光检测器时，应选择折光系数与样品差别较大的溶剂作流动相，以提高灵敏度。④粘度要低(应<2cp)。高粘度溶剂会影响溶质的扩散、传质，降低柱效，还会使柱压降增加，使分离时间延长。最好选择沸点在100℃以下的流动相。⑤对样品的溶解度要适宜。如果溶解度欠佳，样品会在柱头沉淀，不但影响了纯化分离，且会使柱子恶化。⑥样品易于回收。应选用挥发性溶剂。 流动相的pH值 采用反相色谱法分离弱酸(3≤pKa≤7)或弱碱(7≤pKa≤8)样品时，通过调节流动相的pH值，以抑制样品组分的解离，增加组分在固定相上的保留，并改善峰形的技术称为反相离子抑制技术。对于弱酸，流动相的pH值越小，组分的k值越大，当pH值远远小于弱酸的pKa值时，弱酸主要以分子形式存在;对弱碱，情况相反。分析弱酸样品时，通常在流动相中加入少量弱酸，常用50mmol/L磷酸盐缓冲液和1%醋酸溶液;分析弱碱样品
HILIC色谱柱介绍
亲水作用色谱（HILIC）是近年来色谱领域研究的热点之一。本文简介了HILIC的起源、定义、分离特点；比较了HILIC和反相色谱（RPLC）的选择特性，讨论了HILIC与质谱联用技术的特点，并对其使用中的注意事项进行了总结。 1. HILIC的概念 亲水色谱（HILIC）是一种用来改善在反相色谱中保留较差的强极性物质保留行为的色谱技术。它通过采用强极性固定性，并且结合高比例有机相/低比例水相组成的流动相来实现这一目的。而这样的流动相组成尤其有利于提高电喷雾离子化质谱（ESI-MS）的灵敏度。2. HILIC的分离机制 HILIC的分离机理在目前还存在着争议，主要包括以下三个方面：（1）分配机理（2）离子交换（3）偶极-偶极相互作用。更多的试验现象则表明HILIC的保留机理包含氢键作用、偶极作用和静电作用等多种次级效应，很难将其区分开来。 3.HILIC影响保留的主要因素 普遍认为HILIC保留行为受到多种参数的影响，如固定相的官能团、有机改性剂的含量、流速、柱温、流动相缓冲体系的pH值、缓冲盐的种类和浓度。 影响样品在固定相上的保留行为的最主要因素都是流动相中有机相的比例，例如乙腈的含量的增加会显著增加样品的保留因子。在HILIC分离模式中，溶剂洗脱能力由弱到强为：四氢呋喃<丙酮<乙腈<异丙醇<乙醇<甲醇<水, 流动相中水是最强的洗脱溶剂。一般采用乙腈-水体系作为流动相，其中水相的比例为5%-40%以保证其显著的亲水作用。如图1所示，将流动相中的水相用甲醇、乙醇、异丙醇代替，随着流动相极性的减小，待测物在柱上的保留就会增强。 Figure 1. HILIC retention as a function of polar modifier. 100 mm length ACQUITY UPLC BEH HILIC column. Peaks: 1 = methacrylic acid, 2 = cytosine, 3 = nortriptyline, 4 = nicotinic acid. 4. HILIC与RP-HPLC的比较 传统的反相色谱（RPLC）对强极性和亲水性的小分子物质的保留和分离能力较弱，通常流动相需要采用高比例的水相才能实现其保留，然而高比例的水相会导致一系列问题，比如固定相的反浸润和ESI-MS灵敏度的下降。 HILIC正好可以解决这些问题，它提供了一种与传统RPLC互补的保留方式，能够使在RPLC 上保留较弱或没有保留的物质在HILIC柱上提供合适的保留，如图2所示：
高效液相色谱的色谱柱的类型和流动相的选择方法_徐红
高效液相色谱的色谱柱的类型和流动相的选择方法The Choicing W ays of Chromatographic Colum n and Mobil Phase about HPLC 徐 红 侯 健 (新疆昌吉州产品质量检验所,新疆昌吉831100) 摘 要:高效液相色谱仪的核心是色谱柱。另外,流动相对改善分离效果也有重要的辅助效应。色谱柱的关键内容是制备出高效的填料。现代高效液相色谱填料多使用键合固定相。色谱柱的填充技术直接影响柱效的发挥。在研究制定一个高效液相色谱方法时,选择适宜的流动相也很重要。 关键词:高效液相色谱;色谱柱;填料;流动相;溶剂 色谱柱的关键内容是制备出高效的填料。这些填料装成的色谱柱既要有好的选择性,又要有高的柱效。要提高柱效是现代高效液相色谱的又一重要问题。所以填料和装柱技术是关键问题。 现代高效液相色谱填料多使用键合固定相,其固定相膜很薄,因而大大提高了柱效。高效液相色谱填料的基质有以下几种:(1)全多孔硅胶。现代高效液相色谱填料绝大多数用键合的方法把活性基团接枝到基质上,全多孔硅胶是使用最为普遍的基质。全多孔硅胶的孔径有三种类型:①微孔全多孔硅胶,孔径<2nm;(2)中孔全多孔硅胶,孔径<50nm,>2nm;(3)大孔全多孔硅胶,孔径>50nm。高效液相色谱填料使用中孔和大孔全多孔硅胶,在分离低分子量的混合物时,选择(6～15)nm孔径的全多孔硅胶,其比表面相当于(500～200)m2/g。在分离合成聚合物或生物大分子时,要使用(15～100)nm的全多孔硅胶。如果使用<2nm的全多孔硅胶,色谱峰就会拖尾。(2)其他金属氧化物基质。由于硅胶有一些缺点:在碱性介质中(pH>8)不稳定;在孔隙中大分子扩散困难,降低柱效;硅胶表面上的剩余硅羟基有离子交换作用。为此近年来用氧化铝、氧化锆、氧化钍和氧化钛作为高效液相色谱填料的基质有很大的H PLC应用前景。高效液相色谱固定相有以下几种:(1)硅胶表面键合或涂渍各种聚合物。(2)其他氧化物表面上涂渍聚合物。(3)无孔单分散填料。(4)有机高聚填料。(5)灌注色谱填料。(6)手性固定相填料。 色谱柱的填充技术直接影响柱效的发挥。如果色谱柱填充不好,如填料颗粒之间不均匀、不密实,就会使涡流扩散项增加,导致柱效下降。高效液相色谱柱的性能主要决定于固定相填料,但是色谱柱的填充好坏也有很大的影响。填充色谱柱的方法有干法和湿法两种,一般大颗粒的(如外径>20nm)可以用干法填充;一般小粒径的填料宜用湿法填充。湿法填充也称作匀浆法,即用密度和填料相近的液体或混合液作分散介质,用超声波处理此浆液,然后用高压泵快速压入色谱柱管中,这样就可以制备出高效的色谱柱。 在研究制定一个高效液相色谱方法时,选择适宜的流动相也很重要。在选择流动相溶剂时,首先要考虑的是溶剂的物理性质,其次要考虑溶剂对所要分离样品的容量因子,最后是所使用的溶剂要有分离能力。用作高效液相色谱流动相溶剂,首先要满足以下几点要求:(1)容易得到;(2)适合于所用的检测器;(3)纯净、有一定的惰性;(4)无毒、使用安全;(5)对所分离的样品有一定的溶解性能。 下面介绍选择流动相的要点: (1)首先要考虑溶剂对检测器的适应性。 高效液相色谱在多数情况下要使用紫外检测器,所以必须考虑所用溶剂在紫外波段的吸收。如使用示差折光检测器,要考虑溶剂的折光率。 (2)溶剂的活性 有许多溶剂可能与样品发生反应,或在某些固定相的存在下产生聚合,他们就不能作为流动相使用。 (3)溶剂的沸点和粘度 溶剂的沸点和粘度密切相关,低沸点的溶剂通常其粘度也低。通常选用沸点高于柱温(20～50)℃、粘度不大于5×10-4Pa.S的流动相。 (4)高效液相色谱流动相溶剂的极性 在分配色谱和吸附色谱中,溶剂的极性是用混合溶剂的比例来调节的,一个极性强的溶剂和一个极性弱的溶剂经过适当的混合可以得到一定极性的混合溶剂。 (5)溶剂的选择性和溶剂的分类 选择流动相的极性能使被分离样品的分配容量在1～5之间,这时如果有两个或几个色谱峰重叠,可以通过调节溶剂的选择性来解决。 选择合适的色谱柱和流动相是高效液相色谱的关键。 参考文献 [1]富玉,陈能武.高温液相色谱的原理及研究进展.中国测试技术, 2006(3)36. 作者简介:徐红,女,副高级工程师,所长。工作单位:新疆昌吉州产品质量检验所。通讯地址:831100新疆昌吉市健康西路17号。 侯健,新疆昌吉州产品质量检验所(昌吉831100)。 收稿时间:2009-10-16 10 《计量与测试技术》2010年第37卷第2期
常用色谱柱简介
常用色谱柱简介 气相色谱毛细柱 （键合，聚二甲基硅氧烷） HP-1，DB-1，P-1，CP-SIL5CB， Ultra-1,007-1,RTx-1,AT-1 类似固定相：SE-30，SP-2100，OV-1，OV-101,使用 温度：-60℃-320℃ 应用范围：烷烃，芳烃，多环芳烃，醇，酚，酮，酯，醛，胺，卤代烃，吡啶，糖衍生物，氨基酸衍 生物，维生素衍生物，镇痛药，农药，溶剂，胆固SPB-50型中等极性柱 醇，香料，咖啡，食品添加剂等。 (键合, 50%二苯基,50%二甲基聚硅氧烷) 对照品牌：HP-50，HP-17，DB-17，RTx-50，AT-50 SPB-5型弱极性柱 类似固定相：OV-17, SP-2250,使用温度：30℃-310℃（键合，5%苯基，95%甲基聚硅氧烷） 应用范围：烷烃，低沸点芳烃，多环芳烃，醇，甘 对照品牌：HP-5，DB-5，BP-5，CP-SIL 8CB， 油三酸酯，喹啉，卤素化合物，香料，农药，酯，Ultra-2, ,RTx-5,AT-5 镇痛药，除草剂等。 类似固定相：SE-54，SE-52，OV-73 使用温度： -60℃-320℃ PTE-5，PTE-5QTM型弱极性柱
应用范围：烷基苯，多环芳烃，醇，酚，酮，脂肪(MS专用柱,键合,5%苯基,95%甲基聚硅氧烷) 酸酯，苯二甲酸酯，硝基芳烃，芳胺，烷基胺，联 对照品牌：HP-5 MS，DB-5 MS, DB-5.625，XTI-5， 苯胺，卤代烃，多氯联苯，，糖类衍生物，维生素衍BPX625，半挥发污染物分析柱（US EPA方法525， 生物，有机酸，镇痛药，农药，抗组胺药，溶剂，625.5，625） 生物碱，防腐剂，香料等。 类似固定相：SE-54,SE-52 使用温度：-60℃-320℃ 应用范围：多氯联苯，胺，有机磷，有机氯农药，SUPELCOWAX 10型极性柱 含氯除草剂，酚，苯胺，香料等。 (键合,聚乙二醇二万) 对照品牌：HP-Wax，DB-Wax，BP-20，CP-Wax 52CB，SPB-1701型中等极性柱 HP-INNO Wax,AT-Wax (键合, 14%氰丙基,86%二甲基聚硅氧烷) 类似固定相：PEG-20M, CARBOWAX-20M,使用温 对照品牌：HP-1701，DB-1701，RTx-1701，AT-1701，度：35℃-280℃ BP-10，CPSil19CB 应用范围：低沸点芳烃，醇，酮，酸，酯，醛，醚， 类似固定相：OV-1701,SP-2250 使用温度：室温-280 乙二醇，丙二醇，甘油，吡啶，胺，亚硝胺，卤代 ℃ 烃，胆汁酸衍生物，冰片，薄荷，精油，香料，酒，
常用高效液相色谱柱SOP
常用高效液相色谱柱SOP 1 目的： 色谱柱的使用和保养：液相色谱仪由高压液体泵、检测器及液相色谱柱等三部分组成，其中液相色谱柱的正确安装和使用，是液相色谱工作的关键；也是液相色谱工作者获得正确可靠的实验数据的必经之路。 建立高效液相色谱柱日常维护与保养规程，保证能正常使用。 2 适用范围： 本规程适用高效液相色谱柱的维护与保养。 3 责任人： 液相色谱柱使用者。 4 液相色谱柱的安装： 4.1 液相色谱柱的结构： 4.1.1 液相色谱柱由柱管、压帽、卡套（密封环）、筛板（滤片）、接头、螺丝（封头）与柱填料等组成。 柱管：多用不锈钢制成，若果使用时柱压不高于70 kg/cm2时，也可采用厚壁玻璃或石英管，管内壁要求有很高的光洁度。用于柱填料的装填。空柱各组件均为不锈钢材质，能耐受一般的溶剂作用。但由于含氯化物的溶剂对其有一定的腐蚀性，故使用时要注意，柱及连接管内不能长时间存留此类溶剂，以避免腐蚀。 压帽：即色谱柱两端套合于柱管端外壁的塑性圆柱帽，中部有小孔，多为聚四氟乙烯制成，用于固定筛板。 密封环：位于接头螺旋环内壁的弹性环，多为聚四氟乙烯制成，用于色谱柱两端压帽与柱外壁的密封。 4.1.2柱填料： 液相色谱柱的分离作用是在填料与流动相之间进行的，柱子的分类是依据填料类型而定。 正相柱：多以硅胶为柱填料。根据外型可分为无定型和球型两种，其颗粒直径在3-10 μm的范围内。另一类正相填料是硅胶表面键合-CN，-NH2等官能团即所谓的键合相硅胶。
反相柱：主要是以硅胶为基质，在其表面键合十八烷基官能团(ODS)的非极性填料。也有无定型和球型之分。 常用的其他的反相填料还有键合C8、C4、C2、苯基等，其颗粒粒径在3-10 μm之间。 4.2色谱柱的安装： 4.2.1拆开柱包装盒，确认色谱柱的类型、尺寸、出厂日期以及柱内贮存的溶剂。 4.2.2拧下柱两端接头的密封堵头放回包装盒供备用。 4.2.3 按柱管上标示的流动相流向，将色谱柱的入口端通过连接管与进样阀出口相连接(如条件允许，建议在柱前使用保护柱)；柱的出口与检测器连接。连接管是外径为1.57 mm、内径为0.1-0.3 mm的不锈钢管。连接管的两端均有空心螺钉及密封用压环。在接管时一定要设法降低柱外死体积。连接管通过空心螺钉、压环后尽量用力插到底，然后顺时针拧紧空心螺钉，直到拧不动为止。 5 液相色谱柱的使用： 色谱柱在使用前，最好进行柱的性能测试，并将结果保存起来，作为今后评价柱性能变化的参考。但要注意：柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同；另外，在做柱性能测试时是按照色谱柱出厂报告中的条件进行(出厂测试所使用的条件是最佳条件)，只有这样，测得的结果才有可比性。 5.1样品的前处理： 5.1.1最好使用流动相溶解样品。 5.1.2使用予处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质。 5.1.3使用0.45 μm的过滤膜过滤除去微粒杂质。 5.2 流动相的配制： 液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到分离的目的，因此要求流动相具备以下的特点： 5.2.1流动相对样品具有一定的溶解能力，保证样品组分不会沉淀在柱中(或长时间保留在柱中)。
如何选择色谱柱
如何选择色谱柱？ 要选择色谱柱，首先需要确定要使用的是填充柱还是毛细管柱。 填充柱或毛细管柱？填充柱比毛细管柱具有更高的样品容量，虽然这一差距由于HP 发明了大孔 530mm 毛细管而大大缩小。检测器灵敏度的改进也减少了对大剂量样品的需要。填充柱可能具有优势的领域是气体样品的分析。 对于几乎所有的其他样品，毛细管柱具有高很多的效率（窄峰），这可以大大改进峰分离。实际上，分离能力很大，以至于许多分析物在很简单的分析中使用非常短的色谱柱就可以完成分离了。节省的时间可以直接转化为循环时间的缩短和样品通量的增加。 对于新的或更新的方法，如果没有非常具有说服力的理由使用填充柱的话，我们推荐使用毛细管柱。 色谱柱材料 这种材料必须尽可能是惰性的，尤其是对于痕量分析或容易拖尾的化合物，例如硫醇或类似的活性化合物。对于毛细管柱，熔融石英是可选的材料。 有两种类型的熔融石英毛细管柱：壁涂开管柱 (WCOT) 色谱柱和多孔层开管柱(PLOT) 色谱柱。WCOT 色谱柱是固定相液膜涂渍在去活的色谱柱壁上。这是气相色谱中最常用的色谱柱。PLOT 色谱柱中固定相是固体物质涂渍到色谱柱壁上。填充柱可以是玻璃或金属，通常是不锈钢的。金属虽然比较有活性，但其对非极性物质比较稳定。但是如果样品中有极性组分需要分析，请选择玻璃柱。如果玻璃柱还是活性强（引起峰拖尾、样品丢失等），请进行去活处理。 固定相 选择毛细管柱时，首先需要确定是否需要 PLOT 色谱柱。下面是 3 种 PLOT 色谱柱的典型应用领域： 分子筛不挥发气体，对水比较敏感 二乙烯基苯 (DVB) — HP-PLOT Q C1 到 C3 全部异构体的分离，部分 C4 和更高的（直到 C14）的异构体分离，极性化合物，挥发性溶剂可以允许含水 氧化铝 Al2O3 C1 到 C10 异构体的分离, 对水比较敏感 如果上面提到的应用没有感兴趣的，则您可以选择一个 WCOT 类型色谱柱。 当面对一种未知样品时，首先尝试目前在 GC 上的色谱柱。如果不能获得满意的结果，请考虑所了解的样品信息。基本原理是分析物与具有相似化学性质的固定相间更容易相互作用。这意味着了解的样品信息越多，越容易找到最佳分离固定相。 最重要的步骤是确定分析物的极性特征： § 非极性分子—通常只包含碳氢原子没有偶极距。 § 直链碳氢化合物（n-烷烃）是非极性化合物的例子。 § 极性分子—主要包含碳氢，也包含氮、氧、磷、硫或卤原子。例如醇、胺、硫醇、酮、腈、有机卤化物等。 § 可极化的分子—主要包含碳氢，也包含不饱和键。例如烯烃、炔烃和芳香族化合物。 针对特定分离需要提供正确的固定相：样品是具有相同化学类型的非极性物质的混合物吗？例如大多数石油馏分中的碳氢化合物？请尝试非极性色谱柱，如 HP-1，可以将它们按（近似）沸点顺序分离。如果怀疑有一些芳香族化合物，请尝试 HP-5 或 HP-35 等适用苯基化合物的色谱柱。
如何正确选择色谱柱
如何正确选择色谱柱 色谱分析技术主要是应用在化学医药实验室或研究所等领域内，主要是用来分析液体或气体样品的内部成分情况。色谱柱是色谱分析系统中非常的关键的核心部件，它的作用是使得样品内部成分以不同的速率通过色谱柱，而让检测器检测通过色谱柱成分的各个不同色谱峰，最终确定其成分。下面我们来了解一下如何正确选择色谱柱： 一、选择色谱柱时，首先根据其所需要进行成分含量分析的样品进行大致的类型分类，例如可以根据分离规模来进行选择色谱柱的类别，如色谱柱根据其直径的大小尺寸不同具有非常多的型号。如直径较大的是制备柱，它的尺寸一般大于10mm，还有分析柱的直径尺寸大概是2-5mm，一些微型柱，包括有纳米柱毛细管管柱等。 二、其次，可以从需要分析样品的物理和化学性质入手，如在选柱前提前找好关于该物质的资料，包括其分子量、溶解性、是否会出现解离现象等等详细的信息，然后根据这些找出合适的色谱柱类型。如脂溶性的样品适合的色谱柱是调料式的孔径，而水溶性非离子型的则比较适合反向色谱柱法等。 三、当具体到选择哪一款色谱柱时，应当保证填料所能耐受的ph范围符合分析条件的要求。因为如果其硅胶材质不与需要测量的样品的酸碱值不能够相适应，就会发生键合相水解或者是硅胶溶解的多种现象，当然其填料的孔径也要选择与色谱柱相适应的，不然很可能会导致分析结果不准确。
四、色谱柱的规格情况：色谱柱的规格包括它的长度，内外径等，细内经色谱柱的优点是比较节约溶剂、且灵敏度较高，成分测量测量也比较准确，但是它对整个色谱系统的分析精度也要求较高；如果是组分较多的色普柱，则就适合长度较长的色谱柱，才能达到更好的分离和分析的效果。 综上所述，在众多型号和尺寸的色谱柱中选择一款合适的色谱柱来使用，进行分析相应样品的成分是需要一定的技巧的。不仅要考虑考虑到该样品可能具有哪些物理和化学性质，还要考虑到色谱柱的规格尺寸以及它的填料材质和直径尺寸等，当然色谱柱售后有保障也是需要考虑的，只有考虑到多方面相关的知识和注意要点才能选到合适的评价高的色谱柱。
气相色谱法检测时色谱柱的选择
气相色谱法检测时色谱柱的选择 气相色谱柱是样品中残留溶剂测定的理论与物质基础,所以对色谱柱的选择也是最关键的步骤。气相色谱柱可分为填充柱和毛细管柱两大类,其中填充柱又分玻璃柱和不锈钢柱;毛细管柱按柱__口直径一般又有0153mm和0132mm两种规格,前者又叫大口径毛细管柱,柱容量大,在残留溶剂测定中应用较多。由于毛细管柱造价高,中国药典2000年版结合中国国情,用填充柱测定,美国药典24版（USPXXIV）和英国药典2000年版（BP2000）要求用毛细管柱。从填料来分,填充柱一般选用高分子多孔小球系列（GDX101,GDX102,GDX103,GDX301,GDX401）直接测定。GDX的表面积大（1～500m2/g）,有一定的机械强度,可在250℃以下应用。无论极性还是非极性物质,在这种固定相上的拖尾现象都降到最低限度;它和羟基的化合物亲和力极小,可使水、醇类物质大大提前流出柱子;氧化氮、HCN、NH3、SO2、COS等活泼气体可以很快流出,不干扰测定,这些优点对残留溶剂测定来说是比较理想的。 这类填料的应用约占填充柱测定残留溶剂的文献的90%。GDX既是性能优良的吸附剂,能直接作为气相色谱的固定相,直接用于气固分析,也能作为担体涂布 PEG系（PEG20M,PEG2M,PEG10000,PGE5000）,DEGS（丁二酸二乙二醇酯）,DG （缩二甘油）,丙二醇乙二酸聚酯,OV- 225,SE52（苯基甲基硅酮）等固定液,用于残留溶剂测定,当然担体的选择也有多种,如6201、硅藻土、PoraparkQ等。在柱子的选择上,一般选用GDX系列就能解决问题,但对于某些样品,就需要用某些固定液来进行分离才能满足要求,如二甲基甲酰胺26。选择原则是相似相溶,对于醇、胺等能形成氢键的物质,除上面介绍的GDX外,也可选择极性固定液。另外也可将不同极性的固定液混合涂布在担体上进行分离27。 毛细管柱的种类也很多,如 OV-101,SE-54,CP-Sil-5CB28,AC-20,SE-30,HP-5,HP-20M,100%二甲基硅氧 烷,AT- 624,TFAP等,一般长10～30m不等。填充柱价格便宜,易得,一直占据溶剂残留量检测的主导地位,只是柱效较低,只有500～1000左右,分离复杂样品的能力差。杨绍英、陈志华在测定心痛定中两种残留溶剂时就分别用两种色谱条件,比较麻烦29。但填充柱仍然是我们的首要选择。张咏梅、洪铮在紫杉醇原料药中有机溶剂残留量的气相色谱分析中,应用GDX401填充柱同时检测甲醇、乙酸乙酯、二氯甲烷,方法准确可靠30。王卫、高立勤在测定盐酸莫索尼定有机溶剂残留量时以正丙醇为内标,用GDX-401填充柱测定乙醚和异丙醇的残留量,方法灵敏、准确、可信31。 邓湘昱也用GDX-401填充柱测定盐酸土霉素中残留甲醇,结果证明方法简单可靠32。黄剑英、顾以振用GDX-401填充柱、用恒温条件建立同时测定中国药典规定的7种溶剂的测定方法,方法分离度较好,准确可靠33。这些均说明填充柱在测定残留溶剂中的重要作用。近年来,毛细管柱应用越来越多,有取而代之的趋势。特别是近两年,文献报道关于残留溶剂测定的文章中,用毛细管柱测定的约占总数的90%,填充柱只占10%,由此可见其趋势。毛细管柱的理论塔板数约为10万左右,与填充柱相比柱效和灵敏度均要高的多,对复杂和微量残留溶剂的分析能力有极大的提高,所以选择毛细管柱一般都能解决分离问题。其中柱口直径为0153mm的大口径毛细管柱因其柱容量大尤其应用广泛。姚倩、李章万、张
高效液相色谱柱的选择、使用与维护
高效液相色谱柱的选择、使用与维护 辛金菲 天津大沽化工股份有限公司，天津塘沽区300457 摘要：随着社会的进步，色谱分析理论和技术也得到了较大的发展，高效液相色谱现已广泛应用于分析的各个领域，聚集了检测与分离双重性能。其中的色谱柱是样品组分分离的场所，更是高效液相色谱的核心部件，并且属于仪器的耗材，费用比较高。正确的使用方式，才能使其保持良好的性能，而错误的操作方式，可能会导致报废。所以，正确的使用和维护才能保证检测的准确性，而且还能延长使用寿命，降低检测的成本。色谱柱的选择、使用与维护方面的研究在现实中具有非常重要的意义，同时也是色谱工作者和仪器厂商所关注的热点。 关键词：高效液相色谱柱；选择；使用；维护 1前言 高效液相色谱属于色谱法中的一个分支，其流动相为液体，运用的是高压输液系统，将单一或是混合的溶剂和缓冲液流动相泵入装后有固定相的色谱柱，待各成分被分离，再进入检测器，以此实现对试件的分析。由于要分析的样品种类比较多，并且样品的基质都比较复杂，色谱柱很容易被污染，这也是导致分离能力下降和柱压升高的原因之一。通常来说，样品中都会含有一定的不利于分析的物质，其中保留值相对比较弱的物质，一般情况下能快速地从色谱柱中洗脱出
来，才不会对分析产生干扰，对于基质复杂的样品来说，一根色谱柱可能只能使用百余次，并且每一种色谱柱只能适用有限的样品，一次错误进样有时候甚至能导致色谱柱失效。 2高效液相色谱柱的选择 一般情况下，选择保护柱的首先考虑因素是样品的清洁程度，对于大部分相关研究者来说，最合适的保护柱的选择是2cm或3cm，自然所装填的色谱填料随着保护柱的增长而增多，同时它也更能减少污染物进入分析色谱柱。样品的保留时间也会随着保护柱的增长而增长。 保护柱的内径应与分析色谱柱的内径相同或相当，现如今薄膜装填过的保护柱，使用起来也比较简单方便，而且可以干装，但是比较的不经济，一次性使用相对费用较高。另外，薄膜装填法的保护柱所装填的色谱填料是有限的，提供的保护作用有限，但是因为装填了较少的色谱料，保护柱也比较短，所以对分析样品的保留时间的影响小。另外一种保护柱结构的实质是缩短色谱分析柱，设计方式上有整体式、手紧式或直连式；从保护柱的结构可分为是否可以更换保护柱柱芯，以此降低保护柱的成本。 3高效液相色谱柱的正确使用 3.1加装保护柱 加装保护柱的作用比较大，特别是在分析中成药、中药等生物样品和复杂混合物之时，更是保护分析柱的重要措施，保护柱填料与分析柱应该保持一致，保护柱属消耗品，在经过大量的样品分析(50～100次)之后,当峰形变坏或柱压显著升高或基线漂移之时,应考虑
色谱柱选择
氰基柱与C18柱都是以球形硅胶微粒（通过无孔硅胶聚集成）为基质，只不过氰基柱键合的有机分子中含有极性基团，吸附活性较空白硅胶低，常用于正相操作。氰基柱能与某些含有双键的化合物发生选择性相互作用，因而对双键异构体或含有不等量双键的环状化合物有更好的分离能力。所以在选择极性键合相的柱子中，氰基柱是首选。 氰基柱可用于非极性、弱极性和中等极性化合物分析，在反相模式下，其保留性弱于C18，但对强极性化合物的保留强于C18(C18基本不保留强极性化合物)。氰基柱还可用于正相模式。 所以C18与氰基柱能够分析的化合物有一定的重合，但是两者的选择性有很大不同。C18是目前适用范围最广的色谱柱，适用于非极性、弱极性和中等极性化合物分析，某些强极性化合物配合离子对流动相也可以用C18分析，C18为纯反相柱。通常来说，化合物在正辛醇-水中的分配系数有一定差异，C18就能很好的分离它们。氰基柱上有极性基团，所以它对化合物的极性相互作用的强弱是分离化合物的基础，一般，化合物上极性基团的种类、数量或位置有差异，往往就能在氰基柱上较好分离。 氨基和氰基柱的使用和保养 氰基柱的使用和保养 CN基柱作反相色谱，操作和维护和C18柱完全相同。CN柱用于反相条件时，CN键会水解，尤其是在pH1.5-7.0范围以外，在极端酸性和碱性条件下柱寿命会下降很快，如果在这个条件下使用，需要清洗一下，也需要用10倍柱体积溶液冲洗，如下：95%水/5%乙腈、THF 四氢呋喃、95%乙腈/5%水并保持95%乙腈/5%水继续冲洗，以低流速0.2-0.5mL/min过夜冲洗。在pH1.5-7.0条件时，也比较伤柱子，使用完以后要注意冲洗，可以参照上述方法，时间不需要那么长，可适当减少。柱子使用一定时间后，柱效下降，老化，也可如正相时清洗一下柱子恢复柱性能，清洗时用10倍柱体积的下列溶液冲洗：95%水/5%乙腈THF四氢呋喃95%乙腈/5%水再走流动相即可。 CN柱用于正相使用时没什么问题，当柱子使用一定时间后，柱效下降，柱子老化，可清洗一下恢复柱性能。清洗时用10倍柱体积的下列溶液冲洗：氯仿、异丙醇、二氯甲烷再走流动相即可。 如果在pH 2.0-5.0条件时用流动相平衡一下即可，这是最理想的pH范围。 CN柱子不使用时，可用异丙醇或正己烷保存，两端封好。流动相改变时要注意过渡，比如缓冲盐过渡到有机相时需要先用水冲洗再走有机相。
常用高效液相色谱柱SOP
常用高效液相色谱柱S O P Prepared on 24 November 2020
常用高效液相色谱柱SOP 1 目的： 色谱柱的使用和保养：液相色谱仪由高压液体泵、检测器及液相色谱柱等三部分组成，其中液相色谱柱的正确安装和使用，是液相色谱工作的关键；也是液相色谱工作者获得正确可靠的实验数据的必经之路。 建立高效液相色谱柱日常维护与保养规程，保证能正常使用。 2 适用范围： 本规程适用高效液相色谱柱的维护与保养。 3 责任人： 液相色谱柱使用者。 4 液相色谱柱的安装： 液相色谱柱的结构： 4.1.1 液相色谱柱由柱管、压帽、卡套（密封环）、筛板（滤片）、接头、螺丝（封头）与柱填料等组成。 柱管：多用不锈钢制成，若果使用时柱压不高于70 kg/cm2时，也可采用厚壁玻璃或石英管，管内壁要求有很高的光洁度。用于柱填料的装填。空柱各组件均为不锈钢材质，能耐受一般的溶剂作用。但由于含氯化物的溶剂对其有一定的腐蚀性，故使用时要注意，柱及连接管内不能长时间存留此类溶剂，以避免腐蚀。 压帽：即色谱柱两端套合于柱管端外壁的塑性圆柱帽，中部有小孔，多为聚四氟乙烯制成，用于固定筛板。
密封环：位于接头螺旋环内壁的弹性环，多为聚四氟乙烯制成，用于色谱柱两端压帽与柱外壁的密封。 4.1.2柱填料： 液相色谱柱的分离作用是在填料与流动相之间进行的，柱子的分类是依据填料类型而定。 正相柱：多以硅胶为柱填料。根据外型可分为无定型和球型两种，其颗粒直径在3-10 μm的范围内。另一类正相填料是硅胶表面键合-CN，-NH2等官能团即所谓的键合相硅胶。 反相柱：主要是以硅胶为基质，在其表面键合十八烷基官能团(ODS)的非极性填料。也有无定型和球型之分。 常用的其他的反相填料还有键合C8、C4、C2、苯基等，其颗粒粒径在3-10 μm之间。 色谱柱的安装： 4.2.1拆开柱包装盒，确认色谱柱的类型、尺寸、出厂日期以及柱内贮存的溶剂。 4.2.2拧下柱两端接头的密封堵头放回包装盒供备用。 4.2.3 按柱管上标示的流动相流向，将色谱柱的入口端通过连接管与进样阀出口相连接(如条件允许，建议在柱前使用保护柱)；柱的出口与检测器连接。连接管是外径为1.57 mm、内径为-0.3 mm的不锈钢管。连接管的两端均有空心螺钉及密封用压环。在接管时一定要设法降低柱外死体积。连接管通过空心螺钉、压环后尽量用力插到底，然后顺时针拧紧空心螺钉，直到拧不动为止。
如何选择色谱柱
如何选择色谱柱，比较一下C-18及C-8柱的硅烷基质 C-18和C-8硅烷色谱柱是高效液相色谱（HPLC）中最常使用的色谱柱，而且，在美国市场上有多于100种C-18和C-8色谱柱出售。面对这么多可供选择的色谱柱，分析工作者很难从中选出适当的色谱柱来具体使用，同时更难选择出一根合适的替换柱。 对于非极性样品（如小分子芳烃）或弱极性样品（如对羟基苯甲酸酯），C-18和C-8色谱柱是最容易选择的。对于这类样品，色谱柱之间的主要差异在于保留因子（k）；而在选择性方面却只有微小的差异。但对于极性和中等极性样品色谱柱的选择却相当困难。例如含氨基或酸性基团的药物化合物。分析工作者会发现极性样品在保留时间、选择性和峰形都有很大的差别。 色谱柱的选择性和峰形受到担体硅胶的影响远大于键合相的影响。另外，有研究报道在反相色谱中表面硅烷醇、硅酸及金属杂质的影响。在特殊情况下，选择性的差异可由填料制备时使用的键合过程决定的。 通常情况下，色谱工作者选择HPLC色谱柱是通过比较由色谱柱供应商所提供的填料介质的规格来决定的。这些规格内容包括：表面积、末端封尾、含碳量、颗粒形状、颗粒尺寸、孔径、孔容积、装填密度和键合度。含碳量和键合度仅由色谱制造商提供，没有这些规格使用者不可能计算出碳的克数，也不可能计算出一根色谱柱中键合相的微分子数。分析工作者可使用这两个数据来估计一根色谱柱的疏水性质。然而，即使制造商提供所有上述规格数据，使用者也不可能精确地预测出色谱柱对含有极性官能团的化合物的选择性。 由于色谱的保留时间是基于分析物和填充基质之间许多微妙的相互作用，我们建议使用混合物测试来比较填充基质的规格与性能。Engelhardt 和他的同伴回顾了硅烷反相色谱的特性，并且提出用溶解物试验来描述固定相的疏水性和亲硅基醇特性。另外有一些人也改进了测试条件和方法来解释那些色谱数据，但他们只测试了很少的商品色谱柱，并且在他们的测试混合物中没有羧酸。在本文中，我们使用了一个含有羧酸的测试混合物来收集了86根C-18和C-8硅烷色谱柱（见表1）的数据。我们将测试结果详细描述如下。表1：研究中所使用的色谱柱的生产商(略)。 在我们的比较中，我们使用了含有6种物质的测试混合物，此6种物质列于图1。每一种物质在测试混合物中都起特殊的作用。尿嘧啶是用于产生空体积。甲苯是测试色谱柱的疏水性。吡啶和N，N-二甲基苯胺是用来测试硅醇基对碱性物质的活性的碱性胺类物质。苯酚是一种弱酸，用于与吡啶联合起来确定活性担体硅的数量。4-正丁基苯甲酸是一种用于测试硅醇基对酸性物质的活性羧酸，此方面是色谱柱制造者开发碱性去活色谱柱来作胺类物质分析时经常忽略的。 我们使用的流动相是含有65%的乙腈和35%的浓度为0.05M的磷酸钾混合溶液，pH值为3.2。pH=3.2的缓冲溶液可使4-正丁基苯甲酸质子化，同时可提高吡啶和N，N-二甲基苯胺的保留时间的重现性。我们发现使用没有加缓冲溶液的流动相，如65%乙腈和35%水，即使我们使用同一瓶流动相，也无法得到重现性较好的保留时间和峰形。高离子强度的缓冲溶液，如本次测试所使用的0.05M的缓冲溶液，会抑制一些硅醇基的活性（2，5），但对于将胺从一些非碱性去活的反相色谱柱中洗脱下来，有一些抑制作用是必要的。 我们测试过另外两种缓冲溶液，但它们的作用均少于pH=3.2的0.05M磷酸钾溶液。0.01M 磷酸钾缓冲溶液在pH=3.2时，胺类化合物在有些色谱柱中产生前移峰。0.05M磷酸钾缓冲溶液在pH=7时，胺类物质产生的峰形比在pH=3.2时更好。吡啶和N，N-二甲基苯胺的pKa 均大约为5.2；因此，这些组分在pH=7时未质子化并且呈中性，同时并不与强酸性的硅醇基发生离子交换作用。 液相色谱柱原理