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石蜡切片中提取RNA

分析测试百科?经验共享? [急求]石蜡切片可以做RTPCR吗？

2011-10-7 10:47 阿敏

[急求]石蜡切片可以做RTPCR吗？

[size=4][color=Black][font=楷体_GB2312][b][急求]石蜡切片可以做RTPCR吗？

小妹刚开始设计试验，很菜鸟，想请问各位大侠：我做子宫内膜癌的两个基因的rtpcr，石蜡标本可以做rtpcr吗，有什么特殊要求？如果要用冰冻的收集时该注意那些问题呢？[/b][/font][/color][/size]

2011-10-7 10:48 +田田+

[size=4]当然可以，查询：石蜡包埋组织的DNA提取及其应用[/size]

2011-10-7 10:49 阿敏

[size=4][color=Black][font=楷体_GB2312][b]谢谢主任，不过大概是我没有讲清楚，我要做的是提取mRNA,逆转录cDNA.听说用石蜡切片很难出结果。[/b][/font][/color][/size]

2011-10-7 10:49 阿敏

2011-10-7 10:49 #甜#

[size=4][color=Purple][font=仿宋_GB2312]RNA早降解了，还怎么作RT-PCR！即使是新鲜的标本如果没有及时放入液氮冻存都作不出来。

别在这上面浪费时间了。[/font][/color][/size]

2011-10-7 10:50 131415

[size=4]理论上是可以的，也有报道作出来的，但我周围没有，如果有时间和钱，可以一试，否则，就别浪费了[/size]

2011-10-7 10:50 韩梅梅

[size=4]关键是从石蜡组织中提取RNA，我用如下方法：

1. 切片8μm×10张，置1.5ml EP管

2. 脱蜡：加二甲苯1200μl, 震荡混匀，8600rpm, 10 min ×3

3. 无水乙醇1200μl, 震荡混匀，8600rpm, 5min ×2

4. 吸弃乙醇，37℃烤箱干燥30min

5. 加裂解液200μl，酶K（20mg/ml）5μl

6. 组织溶解后，95℃水浴10min,

7. 4℃冰箱冷却

8. 加1mlTrozol混匀，

9. 加氯仿200μl，充分混匀，置3min

10. 4℃, 13000rpm 15min.

11. 吸取水相，加入等体积的异丙醇，-20℃2h

12. 4℃, 13000rpm 15min.

13. 弃上清，加75%乙醇1200μl清洗，

14. 4℃, 11000rpm 10min.

15. 弃上清，室温干燥8min，加20μl DEPC水溶解RNA，55℃10min

16. -70℃保存[/size]

2011-10-7 10:51 韩梅梅

[size=4]我按上面的方法提取的石蜡组织里的mRNA ,效果不错.

操作要注意:

1.注意DEPC消毒

2.活检组织及早固定\包埋

3.注意实验的第一步里,切片了马上开始提取

4.提取MRNA时,最好有人在一旁指导. [/size]

2011-10-7 10:52 微笑的海豚

[size=3][color=Navy][b]关于韩梅梅网友“石蜡组织中提取RNA”的几点商榷：

1、石蜡包埋组织大多来自病理科，这种组织一般是从手术室几经周折到达病理科，其中间环节较多，很少有人会注意避免RNA的降解，因此这些组织中的RNA是很难逃脱降解的命运；

2、即使有RNA保留也很难逃过上述脱蜡、烘烤等处理过程；

3、“DEPC消毒”表达不妥，其作用是灭活RNA酶；

4、石蜡包埋组织中DNA提取绝对没问题，提取RNA恐怕...............？[/b][/color][/size]

2011-10-7 10:52 冰激凌小姐

[color=DarkOrchid][size=4][font=楷体_GB2312][b]我有个师姐曾经用石蜡切片做过原位杂交，可以得到阳性结果，但用的是新鲜制备的蜡块，作RT也应该没问题吧[/b][/font][/size][/color]

2011-10-7 10:53 饭团团

[size=4]求救:

请问各路高手,小妹要做的是从石蜡切片中提取DNA，从什么可以较上面的连接节省时间的方法阿？不胜感激！

谢谢！

急[/size]

2011-10-7 10:53 不懂

[size=4][color=Sienna]理论上是可以做TR-PCR的，可是效果不是很好，尤其是在石蜡切片上，如果真的想做一下，我认为应该注意一下几点：

1 采取的组织应尽快的固定，并且采取时按照做RT-PCR的采样注意事项进行。

2 包埋的各步骤用的玻璃器皿应该用DEPC处理

3 在提取是也应防止RNA的降解，

理论上是可以的。我近期也做RNA的原位杂交，是用石蜡切片[/color][/size]

2011-10-7 10:53 椰子叶子

[size=4]用石蜡切片做RT实在是一个需要很大勇气的工作。我认为这一设想不可行，理由有以下几点：

1. 如果你用的是病理科保存的石蜡块，由于组织送的不及时，RNA无疑有降解，结果不可信。如果是你用新鲜组织做，直接提取就行，何必石蜡包埋。

2. 由于RNA的降解以及石蜡提取过程中的丢失，你所取得的RNA质量要打一个大大的问号。要出结果很难。付出于回报不成比例。

3. 建议可以用免疫组化来代替。[/size]

2011-10-7 10:54 阿敏

用石蜡切片做RT实在是一个需要很大勇气的工作。我认为这一设想不可行，理由有以下几点：1. 如果你用的是病理科保存的石蜡块，由于组织送的不及时，RNA无疑有降解，结果不可信。如果是你用新鲜组织做，直接提取就行，何必石蜡包埋。

2. 由于RNA的降解以及石蜡提取过程中的丢失，你所取得的RNA质量要打一个大大的问号。要出结果很难。付出于回报不成比例。

3. 建议可以用免疫组化来代替。

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[size=4][color=Black][font=楷体_GB2312][b]我也觉得是这样，可是老师让做，也没办法，现在已经进行了初步的预试验，结果还可以，过两天要试试看看能不能引出b-actin.

谢谢大家！[/b][/font][/color][/size]

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石蜡切片免疫组化染色步骤

石蜡切片免疫组化染色步骤 1、载玻片的处理：抗原修复过程中，由于高温、高压、辐射等诸多因素的影响，极易造成脱片。为保证试验的正常进行，可选用我公司提供的ZLI-9001 APES、ZLI-9003 Histogrip TM或ZLI-9005 Poly-L-Lysine等几种试剂，对已清洗的载玻片进行处理。具体方法如下： 1.1 APES：现用现配。将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的APES中，停留20~30秒钟，取出稍停片刻，再入纯丙酮溶液或蒸馏水中涮去未结合的APES，置通风橱中晾干即可。用此载玻片捞片时应注意组织要一步到位，并尽量减少气泡的存在，以免影响染色结果。 1.2 Histogrip TM：将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的Histogrip液中，停留1~2分钟，然后用双蒸水快速清洗三次，室温干燥或60o C烤箱烘烤一小时，装盒备用。 1.3 Poly-L-Lysine：将洗净、干燥的载玻片放入以1:10比例去离子水稀释的多聚赖氨酸溶液中，浸泡5分钟，60o C烤箱烘烤一小时或室温过夜干燥。装盒备用。试验中使用的器具均为非玻璃制品。 2、常用酶消化： 2.1 胰蛋白酶：一般使用浓度为0.05%~0.1%，消化时间为37℃、10~40分钟，主要用于细胞内抗原的显示。 2.2 胃蛋白酶：一般使用浓度为0.4%，消化时间为37℃、30~180分钟，主要用于细胞间质抗原的显示，如：Laminin（层粘蛋白），Collagen IV（IV型胶原）等。 2.3 皂素（Saponin）：一般使用浓度为2~的saponin溶液，消化时间为室温孵育30分钟。 3、抗原热修复：可根据实验室的具体条件，选用微波炉抗原修复、高压锅抗原修复或水浴高温抗原修复。抗原热修复可选用各种缓冲液，如TBS、PBS、重金属盐溶液等，但实验证明，以0.01M枸橼酸盐缓冲液（pH6.0）效果最好。请选用我公司提供的ZLI-9064 枸橼酸盐缓冲液（粉剂）配制，取该粉剂一包溶于1000ml 的蒸馏水中，混匀，其pH值在6.0 0.1，如因蒸馏水本身造成的pH值偏差，请自行调整。 3.1 石蜡切片微波炉抗原修复操作方法：切片脱蜡至水后，3％H2O2处理10分钟，蒸馏水洗2分钟×3。将切片放入盛有枸橼酸盐缓冲液（工作液）的容器中，置微波炉内加热使容器内液体温度保持在92℃~98℃之间并持续10~15分钟（注意：无论是使用医用或家用微波炉，请根据具体机型酌情设置条件，务必满足以上步骤中对温度和时间的要求）。取出容器，室温冷却10~20分钟（注意：不可将切片从缓冲液中取出冷却，以便使蛋白能够恢复原有的空间构型）。PBS洗，下接免疫组化染色步骤。 3.2 石蜡切片高压抗原修复操作方法：切片脱蜡至水。将1500ml~3000ml的枸橼酸盐缓冲液（工作液）注入不锈钢压力锅中加热至沸腾。切片置于金属架上，放入锅内，使切片位于液面以下，盖锅压阀。当压力锅开始慢慢喷气时（约加热5~6分钟后），计时1~2分钟，然后将压力锅端离热源，冷水冲至室温后，取下气阀，打开锅盖，取出切片，蒸馏水洗后，PBS洗2分钟×3，下接免疫组化染色步骤。 3.3 石蜡切片电炉煮沸抗原修复操作方法：切片脱蜡至水后，放入盛有枸橼酸盐缓冲液（工作液）的容器中，并将此容器置于盛有一定数量自来水的大器皿中，电炉上加热煮沸，从小容器的温度到达92℃~98℃起开始计时15~20分钟，然后端离电炉，室温冷却20~30分钟，蒸馏水冲洗，PBS洗，下接免疫组化染色步骤。 4、免疫组化染色步骤：（以美国ZYMED公司SP试剂盒为例） 4.1石蜡切片脱蜡至水。 4.2 3%H2O2室温孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。 4.3蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，(如需采用抗原修复，可在此步后进行)。

石蜡切片的基本操作流程

石蜡切片的基本操作流程一、取材选取目的组织块，修剪到合适的大小；二、固定将组织块放入福尔马林固定液（10%甲醛溶液），固定时间由组织块大小而定，一般不少于24h；体积1cm3的组织块，一般为3-7天；三、冲水自来水洗几下，泡1小时；四、系列酒精脱水 50%酒精，1h； 70%酒精，1h； 80%酒精，1h； 90%酒精，1h； 100%酒精（I），1h； 100%酒精（II），1h；五、透明酒精：二甲苯=1：1溶液，过夜；二甲苯，1h；六、包埋二甲苯：石蜡=1：1，65-70 ℃，2h；新鲜石蜡（I），65-70 ℃，1h；新鲜石蜡（II），65-70 ℃，4h；新鲜石蜡包埋；七、切片切片厚度为5-7um；八、展片温水（40-42 ℃）展片；九、捞片将展好的片子贴于载玻片上；十、烘片42 ℃将片子上的水烘干；十一、烤片60 ℃烤片12-24h；十二、脱腊二甲苯（I）：2min；酒精：二甲苯=1：1溶液：2min；十三、水化 100%酒精（I）：1min； 100%酒精（II）：1min； 95%酒精：1.5min； 80%酒精：1.5min； 70%酒精：1.5min； 50%酒精：1.5min；自来水洗：2min 十四、H&E染色 Hematoxylin染色3-5min(2.5min时取出观察染色效果)，自来水洗3次，盐酸分化（2/3杯玻璃缸+3滴1N盐酸），10s；自来水洗蓝化，镜下观察染色效果；（伊红）Eosin染色30-50s，直接脱水（90%酒精-----100%酒精I，100%酒精II各1分------酒精：二甲苯=1：1溶液：1-1.5min）；十五、脱水 90%酒精-100%酒精-100%酒精，各1min；十六、透明二甲苯：酒精：1-1.5min；二甲苯：2min；

HE石蜡切片步骤,免疫组化步骤

HE染色 1．取材切取的组织块不宜太大，以利于固定剂穿透，通常以6mm×6mm×5mm为宜。注意事项：（1）取材动作要迅速，不宜作太久的拖延以免组织细胞的成分、结构等发生变化。（2）切片材料应根据需要观察的部位进行选，尽可能不要损伤所需要的部分。 2．固定将切好的组织用生理盐水组织洗3次，立即投入10%中性福尔马林固定液或4%多聚甲醛中固定，固定36小时。注意事项：（1）一般固定液，都以新配为好，配好后应贮存在阴凉处，不宜放在日光下，以免引起化学变化，失去固定作用。（2）有些混合固定液的成份之间会发生氧化还原作用，一定要在使用前才混合，如果混合太早，固定时就没有作用了。（3）固定材料时，固定液必须充足，一般为材料块的20~30倍，有些水分多的材料，中间应更换1-2次新液。（4）材料固定完毕后，保存于严密紧塞或加盖的容器里，同时在容器外上标签，并随同材料在溶液中投入相应的标签，以免相互混淆。标签上注明固定液、材料来源、日期等。标签上的文字，应用黑色铅笔或绘图黑墨水书写。脱钙72小时中间不换液是样本30倍中杉金桥（进口脱钙液）镊子触质粒由硬变韧性为准。（美）：固定3-5天根据组织大小确定天数，越大固定时间越长。 3. 洗涤材料经固定后,PBS或双蒸水冲洗约3小时。（20，30，30，60）（美）：流水冲洗约4小时 4. 脱水材料依次经80%、90%、100%、100%各级乙醇溶液脱水，各30min 注意事项：（1）脱水必须在有盖的玻璃品中进行，防止吸收空气中的水分。（2）在更换高一级的脱水剂时，最好不要移动材料以免损坏，可用吸管吸出器皿中的脱水剂，再用吸水吸尽器皿内剩余液，然后于皿中加入高一级脱水剂。（3）在低浓度酒精中，每级停留不宜太长，否则易使组织变软，助长材料的解体。（4）在高浓度或纯酒精中，每级停留的时间也不宜太长，否则会使组织变脆，影响切片。（5）如需过夜，应停留在80%酒精中。（6）脱水必须彻底，否则不易透明，甚至使透明剂内出现白色混浊现象（美）：80％的酒精×2小时 95％的酒精×2小时 100％的酒精×2小时×2 100％的酒精×1小时或者更长时间 5．透明（环保透明脱蜡液）中杉金桥纯酒精、二甲苯等量混合液15min，二甲苯Ⅰ60min、Ⅱ30min（至透明为止）。由于乙醇与石蜡不相溶，而二甲苯既能溶于乙醇又能溶于石蜡，所以脱水后还要经过二甲苯以过渡。当组织中全部被二甲苯占有时，光线可以透过，组织呈现出不同程度的透明状态。

石蜡切片制作标准程序

动物病理组织学石蜡切片制作标准操作程序（SOP）一、\器材和试剂准备（一）载玻片和盖玻片的清洁 1.载玻片和盖玻片清洗方法 (1)锅内倒入适量清洗液（100 mL水+30 m L洗洁精+30 mL 84消毒液）； (2)将玻片逐片放入锅中, 加热至沸腾10 min, 停止加热, 自然冷却; (3)捞出玻片流水冲洗10min,彻底冲净泡沫（弹簧夹上后，单片过水）; (4)将玻片从水中取出, 用蒸馏水冲洗三遍（最好单片过水）; (5)将玻片放入 95%乙醇（分析纯）中浸泡；（6）取出玻片，码在切片盒，自然干燥（或无风适度高温干燥）备用；注意：由于盖玻片很薄，不能同载玻片放在一起处理；盖玻片从95%乙醇溶液中取出后要放在吸水纸上摊开，干燥后，放在小盒子中备用。 2.粘片剂（蛋白甘油）的制作及载玻片的预处理（1）蛋白甘油的制作取新鲜鸡蛋，先将其尖端用眼科剪或拨针挑破一小孔，再将蛋的另一端挑破一小孔并稍加扩大，大孔端朝下，使蛋白流入100~200毫升的烧杯中（不要蛋黄），以玻棒打拌蛋白完全变为雪花状泡沫，然后倒入垫有几层纱布的漏斗中过滤而得到透明、清凉的的蛋白液，再加入等量甘油，振摇使之充分混合，加入1%麝香草酚或樟脑防腐。一般将其盛入滴瓶或树胶瓶中备用，不用时盖好防尘。或1个鸡蛋的蛋清+500mL双蒸馏水，混匀，加10mL浓氨水。（2）将蛋白甘油倒在小烧杯中，载玻片用弹簧夹夹上后侵入蛋白甘油中，贴壁刮干，放在切片盒内晾干备用。二、石蜡组织切片的制作（一）取材注意事项： 1.材料质量：材料必须新鲜，应争取在死后半小时内处理完毕。 2.取材体积：组织块力求小而薄（厚度不要超过5mm，以2mm最佳） 3.取材力度：取材器具锋利。勿使组织块受挤压，切割时不可来回挫动。夹取组织时，切勿猛压，以免挤压损伤组织。取材时，组织块可稍大一点，以便在固定后，将组织块的不平整部分修去。 4.固定形状：固定尽量保持组织的原有形态新鲜组织经固定后，或多或少会产生收缩现象，有时甚至完全变形。为此可将组织展平，以尽可能雅持原形。对神经、肌肉、皮肤组织等，则可将其两端用线扎在木片上或硬纸片上固定。 5.切向选择：选好组织块的切面应熟悉器官组织的结构并据此决定其切面的走向。纵切或横

石蜡切片详细步骤

石蜡切片 1.仪器石蜡切片机、烘箱、显微镜、染色缸、小培养皿、镊子、毛笔、吸水纸、纱布、载玻片、盖玻片等。 2. 试剂 FAA固定液(70%酒精90ml、冰醋酸5ml、福尔马林5ml)、10%番红水溶液、0.5%固绿（用95%的酒精配制）、酒精（100%、95%、80%、70%、50%）、二甲苯、蒸馏水、甘油、中性树胶等。 3.取材幼嫩的油菜植株叶片和茎 4.方法与步骤(参照) 1．固定： FAA固定液固定48小时以上。 2．脱水： 50%酒精→70%酒精→83%酒精→95%酒精→100%酒精→100%酒精。每级2h。100%酒精中1.5h。其中70%酒精处可长期保存。 3．透明： 1/2二甲苯+1/2无水乙醇 (2h) →纯二甲苯(1.5h) →纯二甲苯(1.5h) 4．浸蜡：将处理的材料置于1/2石蜡(固体粉末状)+1/2二甲苯中，40℃烘箱敞口过夜。 5．包埋：先提升恒温箱的温度至60℃，换纯蜡3次，每次1-2h，用硬的电光纸、牛皮纸叠纸盒，置于45-60℃的烫板上，倒入材料，摆放好材料，把标签（正面向外置于底部），补足石蜡，倒好后轻轻的置于冷水盆中，注意底面要接触盆中凉水，待石蜡全部凝固后可取出晾干，也可在凉水盆中放置过夜。 6．切片对包埋的材料进行修块、粘块、整修后，保证材料四周都有石蜡包围。但不可太多。切面的上、下边平行。用加热的解剖刀蘸取少许石蜡碎屑，并迅速将石蜡块四周的碎屑烫平，使石蜡块牢固地粘在台木上。检查切片机，安装切片刀、调整好刀的角度，调整石蜡块与刀口之间的角度与位置后开始切片。

7．粘片将粘贴剂置簿玻片上，再取切片浮置粘片剂上，然后置烘片台上，使切片展开烫平，材料不现皱纹为度。最后将切片依次排好，用滤纸吸去多余水分，同时以记号笔在玻片上编号，放入温箱中烘干，温度30～40℃中过夜。 8．脱蜡脱蜡用二甲苯，把烤好的载玻片放于盛二甲苯的染缸中：纯二甲苯(10-20min)→纯二甲苯(5-10min) 9．染色将纯二甲苯脱蜡完全的材料，1/2 二甲苯十1/2纯酒精→100%酒精→95％酒精→85％酒精→70％酒精→50％酒精→1%番红染色(4h以上) →50％酒精→70％酒精→85％酒精→95％酒精→0.5%固绿(1min)→95％酒精→100%酒精→100％酒精(未注明时间各级均为3min) 10．胶封滴加加拿大树胶封藏。 11.镜检，拍照

组织切片石蜡切片过程

石蜡切片过程一、石蜡包埋: 1.脱水：组织水洗后便可酒精脱水，70% →80% →90% →95%→ 100%酒精（无水乙醇）→100%酒精，各级酒精脱水时间30-45 min。（注意：80%酒精内组织可留之较久，当天如果来不及做完就可以暂时保存一晚上，次日再继续做下去。70%的酒精可作为更久的保存剂。） 2.透蜡：脱水后组织：50%酒精+50%二甲苯30 - 45min. 二甲苯（组织透明即可停止) 15min. 50%二甲苯+50%石蜡20-30min. 纯石蜡1 45min. 纯石蜡2 45min.（透腊之前做好准备工作：准备腊杯，烘箱温度保持55—60℃左右，使石腊熔化，温度不宜过高，以免使组织发脆。） 3.包埋： a.折好纸盒，准备小镊子、酒精灯、解剖针、冷水等。 b.用温热吸管吸取石蜡注入纸盒。等待底稍微凝固，温镊子夹住样品放入盒子中央，面朝底(可以将蜡一次倒入纸盒，然后待蜡表面起膜后，用温镊子夹住样品放入蜡中，待冷却即可，整个操作过程中，切勿让蜡中起气泡)。 c.两手拿着两端，入冷水一半，吹气，使表面石蜡形成移较厚腊层，然后急速全部进入冷水中3分钟。 d.修正蜡块（上下两个面一定要平行并且光滑） e.固着蜡块

二、切片 1.切片（切片时，可以在刀片以及刀片周围涂上一点甘油） 2.贴片烤片（甘油蛋白=1/2甘油+1/2鸡蛋清）（在贴片时，用细吸管取一点点甘油蛋白（越少越好）于载玻片上，然后用手抹匀，手一定要干净。将切片放在载玻片（光亮面朝向下），然后滴几滴冷水使切片悬于水上。接着将载玻片放在37℃上烘烤。常见问题分析： 1.切片分离不能形成蜡带：?室温过低，蜡过硬。 2.蜡带弯曲：?蜡块口下面不平行，或蜡块不与刀刃平行所致。 3.切片厚薄不一:?切片刀或蜡块未固定紧。 4.切成片后，组织与蜡块脱离：?脱水不干净等。 5.蜡片易粘在切片上或蜡片萎缩：?室温太高或蜡太软或刀的角度太小。 6.切片破裂：?浸蜡不足或浸蜡温度过高，或在脱水剂、透明剂中时间过长，引起组织发脆或有杂质，材料脱钙不完全，此种无法补救。 7.蜡片上卷，切过刀口即破裂：?刀口太钝或沾有石蜡或刀的角度过大或蜡太硬。 *：包埋时，时间长会使标本变质，过短则石蜡不能透进标本。石蜡包埋过程中，注意控制温度保持在58-60℃，石蜡不能融化。

石蜡切片步骤

石蜡切片制作大致步骤：取材、固定、洗涤和脱水、透明、浸蜡、包埋、切片和粘片、脱蜡、染色、脱水、透明、封片等步骤。 1、取材植物材料选择时必须尽可能不损伤植物体或所需要的部分。取材必须新鲜，尽可能割取所需要的组织块，并随即投入固定液。取材时刀要锐利，避免因挤压细胞使其受到损伤。切取的材料应该小而薄，便于固定剂迅速渗入内部。一般厚度不超过2mm，大小不超过5*5mm2。 2、固定用适当的化学药液—固定液浸渍切成小块的新鲜材料，迅速凝固或沉淀细胞和组织中的物质成分、终止细胞的一切代谢过程、防止细胞自溶或组织变化，尽可能保持其活体时的结构。固定液的选用：FAA固定液 FAA固定液配制：福尔马林（38%甲醛）5 ml 冰醋酸 5 ml 70%酒精 90 ml 5 ml甘油（丙三醇）固定时间根据材料块的大小及松密程度而定。 3、洗涤与脱水固定后的组织材料需要除去留在组织内的固定液及其结晶沉淀，否则会影响以后的染色效果。多数用流水冲洗：使用含有苦味酸的固定液固定的则需要用酒精多次浸洗；如果组织经酒精或酒精混合液固定，则不必洗涤，可直接进行脱水。酒精为常用的脱水剂，为了减少组织材料的急剧收缩，应使用从低浓度到高浓度递增的顺序进行，通常从30%或50%酒精开始，经70%、85%、95%直至纯酒精（无水乙醇），每次时间为1-数小时，如不能及时进行脱水，材料可以放在70%酒精中保存，因高浓度酒精易使组织收缩硬化。 4、透明选用二甲苯为酒精和石蜡的浸媒液，替换出组织内的酒精。通常组织先经过纯酒精和透明剂各半的混合液浸渍1-2小时，再转入纯透明剂中浸渍。时间根据材料块大小而定。 5、浸蜡与包埋用石蜡取代透明剂，使石蜡浸入组织而起支持作用。通常把组织材料块放在熔化的石蜡和二甲苯的等量混合液浸渍1-2小时，再先后移入2个熔化的石蜡液中浸渍3小时左右，浸蜡应在高于石蜡熔点3℃左右的温箱中进行，以利于石蜡浸入组织内。浸蜡后的组织材料块放在装有蜡液的容器中（摆好在蜡中的位置），待蜡液表层凝固即迅速放入冷水中冷却，即做成含有组织块的蜡块。容器可用光亮且厚的纸折叠成纸盒或金属包埋框盒。如果包埋的组织块数量多，应进行编号，以免差错。石蜡熔化后应在蜡箱内过滤后使用，以免因含有杂质而影响切片质量，且可能损伤切片刀。 6、切片包埋好的蜡块用刀片修成规整的四棱台，以少许热蜡液将其底部迅速贴附于小木块上，夹在轮转式切片机的蜡块钳内，使蜡块切面与切片刀刃平行，旋紧。切片刀的锐利与否、蜡块硬度适当都直接影响切片质量，可用热水或冷水等方法适当改变蜡块硬度。通常切片厚度为 4-7微米，切出一片接一片的蜡带，用毛笔轻托轻放在纸上。 7、贴片与烤片

肌纤维石蜡组织切片的制作

肌肉组织学常用测量指标及方法一、肌纤维直径和面积测量（H.E染色）：（方法见附件一）各样品测100条肌纤维，在5个不同的切面视野上，随机取样。方法1――在10X 40倍显微镜下，用直线测微尺随机测量，由于肌纤维横断面常为不规则椭圆形或多边形，所以无法精确测量其直径。参考椭圆形长短轴的测量方法求其直径。先通过中点量出肌纤维横断面上最长两点间的距离为长径—反之为短径，然后长短径的几何平均数为每条肌纤维的直径，计算出面积。方法2――以日本产MICRO-SCALE定每个样品的肌纤维长径和短径，每个样品测定200根肌纤维的值，肌纤维的选取尽量以肌束为单位，完整测量各肌束内所有肌纤维，以减小取样误差。肌纤维的面积以“长径X短径X 0.7 ”的经验公式求得。取所测定的100根肌纤维的平均值作为每个样品的值用于以后的研究。二、肌束内肌纤维根数的测量（H.E染色）：（方法见附件一）在10X40倍显微镜下，随机选择视野，记录每个样本20束肌束内肌纤维根数, 求其平均值和标准误。三、肌纤维间距、肌束间距，肌大束间距的测量（H.E染色）：（方法见附件一）在10X40倍显微镜下，直线形目微尺测量，各样品测100个间距，在5个不同的切面式视野上随机取样。四、肌纤维密度（H.E染色）：（方法见附件一）在目镜中加入网格目测微尺，在10X 40倍显微镜下，用网格形目测微尺测量5个视野内的肌纤维根数，换算成每平方毫米面积内肌纤维的根数。在选择视野时避开较大的肌束膜。五、肌纤维、结缔组织、脂肪组织的面积比和体积比（H.E染色）：（方法见附件一）方法1――取染色的切片，用显微投影仪放大技术放大于白纸上，对3种组织绘出或打印，剪下分别称重并换算出其3种组织面积比。方法2――采用测量单位参照面上肌纤维与结缔组织的面积分数来反映其体积分数。在15X40倍显微镜下，每个样本取5个不同视野进行显微摄影，再将照片洗出（彩色5寸或更大）。将所得照片按肌纤维与结缔组织分别剪下，用1/ 10000电子分析天平称重，分别得出肌纤维与结缔组织的重量。由于相纸密度相同，所以此重量比能反映其面积和体积比。六、肌节长度：方法1——于新鲜肉样中心部位取3cm1左右的一小块与20ml的0.08mol/L KCl 溶液混合,于高速组织捣碎机中均质30s,制压片一张,用相差显微镜10X 100 倍显微测量肌节长度，每个样本随机测定20根肌原纤维的肌节，其平均值代表该肌肉样本的肌节长度。方法2——电子显微镜超微结构观察：新鲜取样约1 cm X 1.5cm,置于2.5%戊二醛溶液中预固定，用眼科剪刀剪切成 1 cm3大小，放在戊二醛溶液中继续固定，经PBS冲洗后用1%的锇酸固定2.5小时，梯度丙酮脱水（50%, 70%, 85%, 90%, 100%）, Epon-812树脂包埋。超簿切片机切成50nm超薄切片，经醋酸铀和柠檬酸铅染色，透射电镜（1-4万倍）观察、拍照、冲洗印相，用游标卡尺测量肌节长度、肌原纤维直径，I带及A带长度，并观察肌纤维超微结构的特征，肌纤维间线粒体、肌糖元、脂肪滴的含量。（我校为70-80元/张，只需要采样后交给电镜室即

石蜡切片教学文档

石蜡切片（paraffin section）组织学常规制片技术中最为广泛应用的方法。石蜡切片不仅用于观察正常细胞组织的形态结构，也是病理学和法医学等学科用以研究、观察及判断细胞组织的形态变化的主要方法，而且也已相当广泛地用于其他许多学科领域的研究中。教学中，光镜下观察切片标本多数是石蜡切片法制备的。活的细胞或组织多为无色透明，各种组织间和细胞内各种结构之间均缺乏反差，在一般光镜下不易清楚区别出；组织离开机体后很快就会死亡和产生组织腐败，失去原有正常结构，因此，组织要经固定、石蜡包埋、切片及染色等步骤以免细胞组织死亡，而能清晰辨认其形态结构。石蜡切片制作基本技术石蜡切片法包括取材、固定、洗涤和脱水、透明、浸蜡、包埋、切片与粘片、脱蜡、染色、脱水、透明、封片等步骤。一般的组织从取材固定到封片制成玻片标本需要数日，但标本可以长期保存使用，为永久性显微玻片标本。 1.取材应根据要求选取材料来源及部位。例如植物细胞有丝分裂多选取洋葱根尖，细胞分裂快又便于切取；猪的肝小叶边界清晰明确；耳蜗以豚鼠的内耳易于定位和剥离。材料必须新鲜，搁置时间过久则产生蛋白质分解变性，导致细胞自溶及细菌的滋生，而不能反映组织活体时的形态结构。 2.固定用适当的化学药液——固定液浸渍切成小块的新鲜材料，迅速凝固或沉淀细胞和组织中的物质成分、终止细胞的一切代谢过程、防止细胞自溶或组织变化，尽可能保持其活体时的结构。固定能使组织硬化，有利于切片的进行，而且也有媒浸作用，有利于组织着色。固定液的种类很多，其对组织的硬化收缩程度以及组织内蛋白质、脂肪、糖类等物质的作用各不相同。 3.洗涤与脱水固定后的组织材料需除去留在组织内的固定液及其结晶沉淀，否则会影响以后的染色效果。多数用流水冲洗；如果组织经酒精或酒精混合液固定，则不必洗涤，可直接进行脱水。固定后或洗涤后的组织内充满水分，如不除去水分就无法进行以后的透明、浸蜡与包埋，因为透明剂多数是苯类，苯类和石蜡均不能与水相融合，水分不脱尽，苯类不能浸入。酒精为常用脱水剂，它既能与水相混合，又能与透明剂相混，为了减少组织材料的急剧收缩，应使用从低浓度到高浓度递增的顺序进行，通常从30％或50％酒精开始，经70％、85％、95％直至纯酒精（无水乙醇），每次时间为1～数小时，如不能及时进行各级脱水，材料可以放在70％酒精中保存，因高浓度酒精易使组织收缩硬化，不宜处理过久。正丁醇、叔丁醇、丙酮及二氧陆环等也可做脱水剂。 4.透明纯酒精不能与石蜡相溶，还需用能与酒精和石蜡相溶的媒浸液，替换出组织内的酒精。材料块在这类媒浸液中浸渍，出现透明状态，此液即称透明剂，透明剂浸渍过程称透明。常用的透明剂有二甲苯、苯、氯仿、正丁醇等，各种透明剂均是石蜡的溶剂。通常组织先经纯酒精和透明剂各半的混合液浸渍1～2小时，再转入纯透明剂中浸渍。透明剂的浸渍时间则要根据组织材料块大小及属于囊腔抑或实质器官而定。如果透明时间过短，则透明不彻底，石蜡难于浸入组织；透明时间过长，则组织硬化变脆，就不易切出完整切片，最长为数小时。 5.浸蜡与包埋用石蜡取代透明剂，使石蜡浸入组织而起支持作用。通常先把组织材料块放在熔化的石蜡和二甲苯的等量混合液浸渍1～2小时，再先后移入2

石蜡切片的制作过程(精)

石蜡切片的制作目的要求:了解生物制片的基本原理和方法;了解石蜡切片制作的基本过程;学会制作石蜡切片。一、生物制片的基本原理 (一生物制片的目的与发展概况生物制片是研究生物有机体微观结构的基础方法,其目的是提供在显微镜下以适度的样品,有效地对其进行形态和功能观察研究。 (二生物制片的方法当我们研究生物体的组织或细胞时,除了某些生物体可用相差显微镜或偏光显微镜等方法达到观察目的外,其余大部分生物体,因为组织较厚,光线不易透过内部等关系而达不到观察的要求,为了达到此目的,就必须将生物体的组织切成薄切片或不切片,经过一系列处理,使光线易于透过,即可进行观察。因此,根据标本的制作方法分为切片法和非切片法两种。这些方法,各有优缺点,应该适当的配合使用,才能获得比较理想的结果。 1.切片法 (1切片法的种类切片法就是利用锐利的刀具,将器官组织或幼小个体分割成许多极薄的薄片,而制成切片标本的一种方法。切片法在切成薄片以前必须设法使组织内渗透某种支持物质。使组织保持一定的硬度,然后利用切片机进行切片。根据所用支持物质的不同切片法又可分为石蜡切片法、火棉胶切片法、冰冻切片法、炭蜡切片法等类型。现分述如下: ⅰ.石蜡切片法

石蜡切片法即用石蜡作为支持剂进行切片的方法。石蜡切片法是一般组织学、病理学等常规制片方法,因此用得最多,它有很多优点:比较省时间,容易操作,可切成极薄的切片(4um 以下,能制作连续切片,组织块可包埋在石蜡中永久保存。缺点是只能用于较小的组织块,较大的组织块不易切好,容易破碎,组织在脱水透明过程中产生收缩并易变脆。制片时间太长。 ⅱ.火棉胶切片法火棉胶切片法是以火棉胶为支持剂进行切片的方法。此法的优点是包埋过程中不用二甲苯及石蜡,不经高温,可避免组织收缩及变脆,适于精细材料(如脑的切片,也引火棉胶有韧性切片不知有折卷或破裂,适宜于大块组织及多空洞的组织(脑、眼球,硬度较高的组织(骨、肌腱。缺点:手续麻烦、费时间,切片不能切薄,起码在10um以上,不能作连续切片,因此,在生物制片技术上已经不经常采用。 ⅲ.冰冻切片法冰冻切片法是利用液体二氧化碳或其它药剂(如氯乙烷在变成气体时吸收大量的热使组织迅速结成冰块而后再进行切片的方法。目前国内外用半导体致冷调节器来代替二氧化碳的冰冻,冷冻速度更快更为方便。冰冻切片法的优点是较前两种方法简便,组织不经脱水、透明、包埋等手续即可切片,因而可节省很多时间,十分钟左右即能制成切片。常用于临床病理手术诊断,银材料不经溶媒处理就可直接进行切片,材料不受试剂的激烈刺激及温度影响,所以组织没有显著的收缩,细胞形态不致有大的改变,也引冰冻切片不需有机溶剂处理,所以能保存脂肪、类脂等成分,所以冰冻切片法常用于组织化学,尤其是神经组织,临床病理学等方面的研究。新鲜的组织或已经固定的组织,经短时间处理后即可进行切片。用任何固定及处理的材料均适合冰冻切片,但一般的经验用福尔马林固定的材料最适合冰冻切片,而用酒精、甘油保存的材料必须充分水洗后才易于冰冻,否则不易切成完整的切片

石蜡切片步骤

石蜡切片基本步骤（一）取材和固定根据实验目的选择材料。将整个虫体或虫体的内部器官（如肠道、马氏管、唾液腺等）取出后，立即投入固定液。取材大小：0.5cm×0.5 cm×0.2或者1.0 cm×1.0 cm×0.2，厚度不宜超过3mm。固定液：2.5%的戊二醛固定液，Bouin氏液，10%甲醛等。固定时间：4oC固定24小时。注意事项：取材：1．勿使组织块受挤压切取组织块所用刀、剪要锋利，切割时不可来回切割。夹取组织时，镊子要轻，切勿挤压，以免损伤组织。取材时，组织块可稍大一点，以便在固定后，将组织块的不平整部分修去。 2.选好组织块的切面应熟悉器官组织的组成，并根据观察目的来确定纵切或横切。 3．保持材料的清洁组织块上如有血液、污物、粘液、食物等，先用生理盐水冲洗干净，再入固定液。 4．切除（清除）不需要的部分特别是组织周围的脂肪等，应尽可能清除掉，以免影响以后的程序和观察。固定：1．材料新鲜取出组织后须立即固定。否则时间相隔过久，体积就要收缩变形或发生自溶现象。 2．抽气生物组织常有气体的存在，使材料不能沉入固定液中，抽气使得固定液有效渗入。真空泵抽气或者用空针管抽气。昆虫整体固定，固定前用解剖针刺数个小孔，以利用固定液渗透。 3．固定剂用量一般为组织体积的10~20倍。勿使组织贴于瓶底或瓶壁，以免影响固定剂的渗入。 4．避免阳光尽可能避免接触阳光以免失去固定作用。 5．加速固定轻轻摇动盛器使组织移动有利于固定液渗入，对长期固定的标本可经常更换固定液。

（二）洗涤 2.5%戊二醛固定液固定的组织：0.2M, pH7.2磷酸缓冲液漂洗三次，每次10min Bouin氏固定液固定的组织：直接入70%酒精更换数次即可脱水，注意苦味酸。甲醛固定的组织：直接投入50%或70%酒精脱水，不经水洗。但如果在甲醛中时间过长，则仍应当用流水冲洗。陈旧性标本和混合性固定液应及时洗涤，有利于脱水、切片和染色。否则会影响以后的染色效果。（三）脱水与透明漂洗后即入酒精脱水，经50%，70%，80%，90%，95%，100%酒精脱水，其中95%，100%酒精需重复两次。每级10min。脱水后，入1/3二甲苯+2/3乙醇混合液→1/2二甲苯+1/2乙醇混合液→2/3二甲苯+1/3乙醇混合液→二甲苯→二甲苯，每次约10min，至组织透明为止。注意： 1. 一般经水洗的材料脱水可从35%开始，柔弱的材料从15%开始，若用酒精洗涤，则可直接移入50%或70%酒精中继续脱水。 2. 每级脱水时间，依照材料的大小、性质以及留在固定液中的时间长短和固定液的溶解性而定。动物组织每级10~30min。 3. 脱水应彻底，否则与二甲苯混合后混浊，必须倒回重脱水且效果不好；如需过夜，则停留在70%酒精中。（四）透蜡透明后，先把组织材料块放在熔化的石蜡和二甲苯的等量混合液浸渍3小时，再先后移入2个熔化的石蜡液中浸渍6小时左右，直至用石蜡完全置换了组织块中的二甲苯，浸蜡应在高于石蜡熔点3℃左右（60°C）的温箱中进行，以利石蜡浸入组织内。便于今后的包理与切片。

植物组织石蜡切片制作

植物组织石蜡切片的制作一、实验目的 1．熟练掌握石蜡切片的方法。 2．掌握永久制片的制作过程，为研究植物的内部结构奠定基础。 3．学会植物内部结构的比较研究方法。二、实验器具与试剂 1．器具石蜡切片机、烘箱、显微镜、染色缸、小培养皿、镊子、毛笔、吸水纸、纱布、载玻片、盖玻片等。 2．试剂 10%番红水溶液、0.5%固绿（用95%的酒精配制）、酒精（100%、95%、80%、70%、50%）、二甲苯、蒸馏水、甘油、中性树胶等。三、实验材料幼嫩植物各部分，根据季节选择材料。四、实验内容与方法石蜡切片法是显微技术上最重要、最常用的一种方法。它是把材料封埋在石蜡里面，用旋转切片机切片，可以切出很薄的切片。凡是精细的工结构，大都用石蜡切片。全都过程如下：1．固定 2．洗涤 3．脱水与硬化 4．脱酒精 2．封埋 6．切片 7．粘片 8．脱蜡 9．染色 10．脱水 11. 透明 12．胶封（一）固定 1．固定的意义：固定就是用药品把细胞杀死，使细胞的原生质凝固，死后不发生变化，尽可能保持原来的结构以供我们观察。良好的固定剂，应是穿透力强，使细胞立刻致死，原生质全部凝固；不发生任何变形，增强折光率，并且不妨碍染色。 2．固定液的种类：固定液的种类很多，根据配制成分可划分为： (1) 简单固定液：以一种化学药品配制的固定液。常用的简单固定液有： A．酒精即乙醇，用作固定液，常用纯酒精或95％酒精。酒精穿透力强，固定时间常在1小时以内。高浓度酒精有使材料收缩的作用。70％的酒精可作保存液。配制低度酒精必需要用普通酒精即95％的酒精，绝不可用纯酒精。酒精为还原剂，不能与铬酸、锇酸、重铬酸钾等氧化剂配合。酒精可使核酸，蛋白质及肝醣等发生沉淀，但能溶解脂肪及拟脂。 B．福尔马林即甲醛，具强烈刺激性的气味，纯净的甲醛，为无色透明液体。固定用的浓度为4-10％甲醛也是强还原剂。不能与铬酸、锇酸等氧化剂配合。经固定后，材料变硬，通常不引起皱缩，但随后经过他种药剂处理时，就每每出现皱缩。所以甲醛一般不单独作固定，而与其他液体混合使用。 C．醋酸：为无色透明的液体，刺激性极强，冷则凝结成冰，故又叫冰醋酸。醋酸以与水和酒精配成各种比例的溶液，所用浓度为0.2～5％，也常与其他固定剂配合使用。醋酸穿透性很强，单独使用，有使原生质膨胀的作用，故常与酒精，甲醛等合用，醋酸为固定染色体的优良固定液，因此固定染色体的固定液中，几乎都含有醋酸。 (2) 混合固定液：由几种药剂，适量配制而成。常用的有下列几种： A、F.A.A固定液(又称万能固定液)： [用途]这个固定液在植物研究上，应用最多，为植物组织最常用的固定液。固定时间，不受

石蜡切片免疫组化操作步骤

石蜡切片免疫组织化学操作流程一、组织获取（本实验室多做脑组织，所以以脑组织为例） 1.动物麻醉：所用麻醉药物（水合氯醛水溶剂）剂量为350mg/kg动物体重，常用麻醉药物浓度为5%、6%、7%、10%（麻醉浓度越大，动物进入麻醉时间越短，但麻醉致死率相应较高，本人使用7%浓度，若注射位置正确，约3min进入麻醉状态）；动物麻醉后，将其固定于灌流操作平台，仰卧位； 2.动物灌流手术：以胸骨剑突为起点，沿左右两侧肋下缘剪开老鼠皮肤至腋下，再次以剑突为起点，剪开皮下肌肉层，沿同样方向剪开肌肉至腋下，避免伤到内部脏器，剪破膈膜，沿左右两侧剪断胸骨，用止血钳夹住剑突向上翻转，充分暴露心脏；用弯镊分离心脏表面黏膜；左手持止血钳轻夹起心脏，倾斜一定角度，使心尖方向与升主动脉尽量位于同一直线上，右手持灌流针，沿直线所在所在角度由左心室进针，将灌流针直接插入升主动脉（可挑动灌流针于升主动脉内观察是否正确插入，此方法操作不熟练易插错血管或是直接刺穿心脏——或者直接将灌流针插入左心室，但前方法灌流效率较高）；固定器械（器械松动或是位置变化会严重影响灌流质量，有时会因为器械位置的变动直接将心脏牵扯下来导致灌流失败，应给与充分注意） 3.动物灌流：C57小鼠25-30g左右，灌流开始，可见右心耳充盈，用剪刀剪开，便于血液流出：吊瓶灌流——以生理盐水50-100ml快速冲洗血液，持续最好不要超过5min（时间过长会导致脑组织降解），待无明显血迹流出后换用4%多聚甲醛进行灌流，约 100-150ml，灌流速度不宜过快，约10min，固定液较充分的固定组织；注射器灌流——生理盐水50ml快速推注，后换用4%多聚甲醛50ml缓慢推注。灌流成功的标志——灌流开始，可见肝脏颜色迅速变浅，随着灌流进行，肝脏颜色逐渐变为乳黄色或是白色；换用4%多甲固定液后小鼠全身痉挛抽搐，组织僵硬。 4.开颅取脑：根据实验取材位置的不同，分为不同的取脑方式：应注意需要的组织区域，避免取脑过程中损坏，多从小脑后方依次向前剥离颅骨，获取脑组织（在颅骨剥开后，应注意脑膜的存在，因为会发生脑膜将皮层割裂损伤的情况） 5.脑组织修块：将多余脑组织去除，便于固定充分均匀，应留出试刀或找平的部分多余组织（本人实验中因需要海马组织，故修块时沿大脑皮层后边缘切除多余小脑，人字缝前约2.5-3mm切除前脑部分） 6.固定过夜：将修块完成的脑组织，浸泡于4%多聚甲醛中，固定过夜，通常不要超过18 小时（固定时间越长，组织抗原损失越严重，呈数量级损失），一般控制在12小时以内为宜二、组织石蜡包埋 7.组织梯度脱水透明：将过夜固定的脑组织取出置于包埋窗内，并用铅笔做好相应标记，自来水流水冲洗约10min，去除残留的杂质成分，进行梯度酒精脱水（注意：不同的组织类型，同组织类型不同组织块大小所需的每阶段脱水时间不同，需根据自身需要进行简单摸索；若盲目脱水透明，脱水透明过头，会使组织脆性增加，切片时全为粉末状，无法成形；脱水透明不够，会使组织与蜡块分离，无法获取平整组织切片）本实验中，组织样本为脑组织，组织修块后所进行的脱水流程如下：自来水冲洗完成→50%乙醇 25min→70%乙醇 25min→80%乙醇 25min→90%乙醇 25min →95%乙醇I 10min→95%乙醇II 15min→无水乙醇I 10min→无水乙醇II 15min→二甲苯I 15min→二甲苯II 15min 8.组织浸蜡：在进行二甲苯透明开始的时候，将石蜡用沸水融化，置于60度烘箱内备用（此过程中应注意将盛放石蜡的烧杯上口封闭，避免水分溅入；根据组织块的数目准备

石蜡组织切片实验操作练习详细指导

石蜡切片实验操作练习详细指导提供给实验室的实验用品及每个小组的用量： 1、器材切片刀，切片机，恒温箱，温台，熔蜡炉，蜡杯，酒精灯，蜡铲，展片台，解剖刀，解剖针，解剖剪，解剖盘，培养皿，吸管，镊子，单面刀片，台木，毛笔，洒精灯，包埋纸盒，染色缸，盖玻片，载玻片，玻片盘，树胶，树胶瓶，显微镜，温度计，脸盆，水浴锅。 2、试剂卡诺氏固定液、FAA固定液、各种浓度的酒精、二甲苯、石蜡、蜂蜡、埃利希苏木精染液，1%伊红酒精溶液，1%盐酸酒精溶液，甘油蛋白粘片剂，郝普特氏粘片剂，中性树胶。1%番红，1%固绿，1%过碘酸，Schiff试剂，0.5%偏重亚硫酸钠溶液，醋酸酐-吡啶混合液，0.5%~1%淀粉糖化酶溶液。 3、材料鼠肝、肾、心肌、骨骼肌或其他组织、大豆或小麦、绿豆、洋葱、大蒜、蚕豆的根、茎、叶等。 4、每个实验小组的用量 (一)器材切片机，切片刀，温台，恒温箱，熔蜡炉，水浴锅等这类几个小组用一台就行；解剖刀，单面刀片，小台木，毛笔一只，蜡铲一个，盖玻片和载玻片30个，脸盆一个，酒精灯各一个，包埋纸盒2~3个，染色缸一个，瓷杯3个，显微镜一台。（二）试剂 FAA固定液50ml、1%番红100ml、1%固绿100ml、1%过碘酸100ml、Schiff试剂100ml、亚硫酸盐300ml、醋酸酐-吡啶混合液100ml、0.5%~1%淀粉糖化酶溶液200ml，石蜡半盒、蜂蜡10块、埃利希苏木精染液100ml、1%伊红酒精溶液100ml、1%盐酸酒精溶液100ml、95%酒精5瓶、二甲苯2瓶，甘油蛋白粘片剂数滴，中性树胶数滴。（三）材料小白鼠一只、蚕豆种，小麦和大豆种10~20粒，洋葱和大蒜由实验室统一种，然后取其所需部分。石蜡切片法实例（一）

石蜡切片

（请教）石蜡切片时碎片的缘故！ vetsyl 发贴:67 积分: 1 状态:离线 2005-04-28 17:08 石蜡切片时怎么老是碎片和片堆积到一起，褶皱很大啊 vetsyl 发贴:67 积分: 1 状态:离线 2005-04-28 17:10 请各位专家给出宝贵的建议！谢谢 bluelove 用心做好每件事发贴:164 积分:33 状态:隐身 2005-04-28 19:28 组织切下来之后要先放到水浴锅里，温度一般是40度左右，待组织完全展开之后再捞片，就不会皱了！碎片的原因有很多，有可能是你的组织处理(脱水问题）的问题，也有可能是切片时蜡块没有修齐，要找到原因再对症处理了！ vetsyl 发贴:67 积分: 1 状态:离线 2005-04-29 15:58 这边展片不是在水浴锅里，是放在载玻片上，然后放到一个加热的板上。但是问题是切片时那些薄片松散的很厉害，像一包渣样，假如有浴锅可能都放不进去呀，不知道是刀片的问题，还是脱水的问题，还是修切的问题？ bluelove2005-04-29 19:53

用心做好每件事发贴:164 积分:33 状态:隐身我个人认为组织放到载玻片上之后就沾上去了展片效果不好,还是在水浴锅里等组织完全展开之后再捞片效果好一些! 你的切片是什么地方烂?如果是组织烂就可能是组织处理的问题,如果石蜡部分都是烂的,恐怕就是你修切的问题了吧! 野原诺言来之不易丁香园版主发贴:3774 积分:404 状态:隐身 2005-04-30 08:12 vetsyl wrote: 这边展片不是在水浴锅里，是放在载玻片上，然后放到一个加热的板上。但是问题是切片时那些薄片松散的很厉害，像一包渣样，假如有浴锅可能都放不进去呀，不知道是刀片的问题，还是脱水的问题，还是修切的问题？ 1.切片时用一块冰在石蜡切面上冷冻一下蜡块再切。 2.使用的蜡太软，换用硬一些的蜡再次浸蜡包埋。 3.换用新刀片，找高手切。 4.标本处理有问题，在纯酒精中时间太久导致组织脱水严重从而质地变硬变脆。 GOOD LUCK! bluelove 用心做好每件事发贴:164 积分:33 状态:隐身 2005-04-30 13:07 野原wrote: 1.切片时用一块冰在石蜡切面上冷冻一下蜡块再切。 2.使用的蜡太软，换用硬一些的蜡再次浸蜡包埋。 3.换用新刀片，找高手切。 4.标本处理有问题，在纯酒精中时间太久导致组织脱水严重从而质地变硬变脆。

石蜡切片的操作流程

在显微镜下观察植物体内部的细微结构之前,必须根据植物材料的特性,采用不同的方法,对植物材料进行处理,把材料制成透明的玻片标本.根据材料的性质和制作法的不同,常用的植物显微制片技术可以分为切片法与非切片法两大类,前者常用的有徒手切片法,冰冻切片法,火棉胶切片法,石蜡切片法,冷冻切片法等,其中以石蜡切片法最为常用.后者包括整体封藏法,涂布法,压片法等. 石蜡切片法石蜡切片法是以石蜡作包埋剂,用旋转切片机将材料切成薄片,经一系列处理制成永久制片的方法.在研究植物的细胞,组织,胚胎以及形态等方面石蜡切片法是最理想的制片方法. 石蜡切片法的一般流程为:取材→固定→抽气→洗涤→脱水→透明→浸蜡→包埋→修块→切片→粘片→染色→封片. 取材用锋利的刀片切取新鲜的植物材料,选定适宜的材料,立即固定. 取材的注意事项如下: (1)取材料要新鲜.动作要迅速,以免挤压损坏组织;取病理材料时,应设置对照材料. (2)所取材料大小要适当:根和茎一般直径≤5mm,切取成5-10mm 小段;叶片一般取过中脉处,切成2-5mm宽,5-8mm长.在切材料时,必须注意刀片与中轴成直角,两切面平行,否则制成的切片细胞是斜的. 雌,雄蕊一般不需分割.

(3)取材时间可根据切片要求有所区别.如:在进行植物发育的研究过程时,需要找到细胞分裂相,一般在晴天的早晨9:00-10:00时取材,此时植物细胞分裂活动较明显. (4)取材不易过老,否则制片有难度(过老的材料须在滑走切片机上进行);对纵切的材料适当多取材,如根尖,茎尖等,因为切到材料正中的概率较低. (二)固定将已切好的材料尽快地浸入相当于材料10-15倍体积的固定液中.借助固定液的作用,使细胞的新陈代谢瞬时停止,并保持细胞或组织的形态构造及其内含物的状态不发生变化.从而达到使组织变硬从而便于切片,增强内含物的折光度,令细胞易于着色的目的,同时具有防腐作用.以新鲜配制固定液效果较好.固定的时间依材料的种类,性质,大小等而定.材料固定完毕,保存于加盖的容器内,贴上标签. 良好的固定剂,应是穿透力强,使细胞立刻致死,原生质全部凝固;不发生任何变形,增强折光率,并且不妨碍染色. 常用固定液: 简单固定液以一种化学药品配制的固定液. ⑴乙醇为凝固型固定剂.常用无水乙醇或95%乙醇. ⑵甲醛为非凝固性固定剂.具强烈刺激性气味.纯净的甲醛为无色透明液体.固定用的浓度为4%-10%. ⑶醋酸为凝固型固定剂.为无色透明的液体,刺激性极强,低温