春季传染病病原菌的生长繁殖

春季传染病病原菌的生长繁殖实验方案

一．实验设计思想

1.实验设计原因

任何生物都有出生、发育、繁殖、衰老和死亡的过程。微生物也不例外。不过，微生物的生长规律和大生物有些不同，大生物通常是以一个个体为对象，而微生物的生长通常指细胞数目的增加。如果把单细胞的微生物接种到体积一定的液体营养液中，在适宜的培养条件下进行培养，这些单细胞微生物就会不断增殖，细胞数目会不断增加，但是体内及自然界病原菌的生长繁殖会受机体免疫因素和环境因素的多方面影响，不会出现象培养基中那样典型的生长曲线。掌握病原菌生长规律，可有目的地研究控制病原菌的生长，发现和培养对人类有用的病原菌。

微生物细胞个体吸收营养物质，进行新陈代谢，原生质与细胞组分的增加称为个体生长。 一般说，微生物（病原菌）重量的变化比个数的变化更能在本质上反应出生长的过程。

2.实验设计意义

如果单细胞微生物接种到体积一定的液体营养液中就会不断增殖，细胞数目不断增加，把这种增加情况画一个对数曲线，就呈现出一定的规律，叫做单细胞微生物的生长曲线。其纵坐标为每毫升培养液中微生物细胞数目的对数，横坐标为培养时间。生长曲线代表病原菌在一个新的适宜的环境中生长繁殖以至衰老死亡的全部过程的动态。

不同的微生物有不同的生长曲线，同一种微生物在不同的培养条件下，其生长曲线也不一样。因此，测定微生物的生长曲线对于了解和掌握微生物的生长规律是很有帮助的。

根据微生物的生长曲线可以明确微生物的生长规律，对生产实践具有重大的指导意义。故根据对数期的生长规律可以得到培养菌种时缩短工期的方法:接种对数期的菌种,采用最适菌龄，加大接种量，用与培养菌种相同组成的培养基。如，根据稳定期的生长规律，可知稳定期是产物的最佳收获期，也是最佳测定期，通过对稳定期到来原因的研究还促进了连续培养原理的提出和工艺技术的创建。

二．实验目的

1.了解病原菌生长曲线特征，测定病原菌繁殖的代时；

2.学习液体培养基的配制以及接种方法；

3.了解不同病原菌，不同接种方法在同一培养基上生长速度的不同；

4.掌握利用病原菌悬液混浊度间接测定病原菌生长的方法

三．实验基本流程

四．实验原理

接种 培养

比浊

计数 绘制曲线

1、病原菌生长繁殖的条件

1）．充足的营养：必须有充足的营养物质才能为病原菌的新陈代谢及生长繁殖提供必需的原料和足够的能量。

2）．适宜的温度：细胞生长的温度极限为-7℃～90℃。各类病原菌对温度的要求不同，可分为嗜冷菌（Psychrophiles）,最适生长温度为（10℃～20℃）；嗜温菌（Mesophiles）,20℃～40℃;嗜热菌（Thermophiles）,在高至56℃～60℃生长最好。病原菌均为嗜温菌，最适温度为人体的体温，即37℃，故实验室一般采用37℃培养病原菌。

有些嗜温菌低温下也可生长繁殖，如5℃冰箱内，金黄色葡萄球菌缓慢生长释放毒素，故食用过夜冰箱冷存食物，可致食物中毒。

3）．合适的酸碱度：在病原菌的新陈代谢过程中，酶的活性在一定的PH范围才能发挥。多数病原菌最适PH为中性或弱碱性（pH7.2～7.6）。人类血液、组织液PH为7.4，病原菌极易生存。胃液偏酸，绝大从数病原菌可被杀死。个别病原菌在碱性条件下生长良好，如霍乱孤菌在PH8.4～9.2时生长最好;也有的病原菌最适pH偏酸，如结核杆菌（pH6.5～6.8）、乳本乡杆菌（pH5.5）。病原菌代谢过程中分解糖产酸，PH下降，影响病原菌生长，所以培养基中应加入缓冲剂，保持PH稳定。

4）．必要的气体环境：氧的存大与否和生长有关，有些病原菌仅能在有氧条件下生长；有的只能在无氧环境下生长；而大多数病原菌在有氧及无氧的条件下均能生存。一般病原菌代谢中都需CO2，但大多数病原菌自身代谢所产生的CO2即可满足需要。有些病原菌，如脑膜炎双球菌在初次分离时需要较高浓度的CO2（5～10%），否则生长很差甚至不能生长。

2、病原菌生长繁殖的方式与速度

病原菌的生长繁殖包括菌体各组分有规律的增长及菌体数量的增加。

病原菌以简单的二分裂方式无性繁殖，其突出的特点为繁殖速度极快。病原菌分裂倍增的必须时间，称为代时（Generation time）,病原菌的代时决定于病原菌的种类又受环境条件的影响，病原菌代时一般为20～30分钟，个别菌较慢，如结核杆菌代时为18～20小时，梅素螺旋体为33个小时。

1）病原菌个体的生长繁殖

病原菌一般以简单的二分裂法进行无性繁殖，个别病原菌如结核杆菌偶有分枝繁殖的方式。在适宜条件下，多数病原菌繁殖速度极快，分裂一次需时仅20～30分钟。球菌可从不同平面分裂，分裂后形成不同方式排列。杆菌则沿横轴分裂。病原菌分裂时，菌细胞首先增大，染色体复制。在革兰氏阳性菌中，病原菌染色体与中价体相连，当染色体复制时，中价体亦一分为二，各向两端移动，分别拉着复制好的一根染色体移到细胞的侧。接着细胞中部的细胞膜由外向内陷入，逐渐伸展，形成横隔。同时细胞壁亦向内生长，成为两个子代细胞的胞壁，最后由于肽聚糖水解酶的作用，使细胞壁肽聚糖的共价键断裂，全裂成为两个细胞。革兰氏阴性菌无中介体，染色体直接连接在细胞膜上。复制产生的新染色体则附着在邻近的一点上，在两点之间形成新的细胞膜，将两团染色体分离在两侧。最后细胞壁沿横膈内陷，整个细胞分裂成两个子代细胞。

单菌落大肠杆菌生长曲线

2）病原菌群体生长繁殖规律

病原菌繁殖速度之快是惊人的。大肠杆菌的代时为20分钟，以此计算，在最佳条件下8小时后，1个细胞可繁殖到200万上，10小时后可超过10亿，24小时后，病原菌繁殖的数量可庞大到难以计数据和程度。但实际上，由于病原菌繁殖中营养物质的消耗，毒性产物的积聚及环境PH的改变，病原菌绝不可能始终保持原速度无限增殖，经过一定时间后，病原菌活跃增殖的速度逐渐减慢，死亡病原菌逐增、活菌率逐减。

将一定数的病原菌接咱适当培养基后，研究病原菌生长过程的规律，以培养时3.病原菌群体的生长繁殖可分为四期：

4.病原菌的计数

1）血球计数板法:血球计数板是一种有特别结构刻度和厚度的厚玻璃片，玻片上有四条沟和两条嵴，中央有一短横沟和两个平台，两嵴的表比两平台的表面高0.1 mm ，每个平台上刻有不同规格的格网，中央0.1 mm 面积上刻有400个小方格。通过油镜观察，统计一定大格内微生物的数量，即可算出1毫升菌液中所含的菌体数。这种方法简便，直观，快捷，但只适宜于单细胞状态的微生物或丝状微生物所产生的孢子进行计数，并且所得结果是包括死细胞在内的总菌数。

2）染色计数法：为了弥补一些微生物在油镜下不易观察计数，而直接用血球计数板法又无法区分死细胞和活细胞的不足，人们发明了染色计数法。借助不同的染料对菌体进行适当的染色，可以更方便的在显微镜下进行活菌计数。如酵母活细胞计数可用美蓝染色液，染色后在显微镜下观察，活细胞为无色，而死细胞为蓝色。

3）比例计数法：将已知颗粒（如霉菌孢子或红细胞）浓度的液体与一待测细胞浓度的菌液按一定比例均匀混合，在显微镜视野中数出各自的数目，即可得未知菌液的细胞浓度。这种计数方法比较粗放。并且需要配制已知颗粒浓度的悬液做标准。

4）液体稀释法：对未知菌样做连续十倍系列稀释，根据估计数，从最适宜的三个连续的10倍稀释液中各取5毫升试样，接种1毫升到3组共15只装培养液的试管中，经培养后记录每个稀释度出现生长的试管数，然后查最大或然数表

MPN

（most probably number）得出菌样的含菌数，根据样品稀释倍数计算出活菌含量。该法常用于食品中微生物的检测，例如饮用水和牛奶的微生物限量检查。

5）平板菌落计数法：这是一种最常用的活菌计数法。将待测菌液进行梯度稀释，取一定体积的稀释菌液与合适的固体培养基在凝固前均匀混合，或将菌液涂布于已凝固的固体培养基平板上。保温培养后，用平板上出现的菌落数乘以菌液稀释度，即可算出原菌液的含菌数。一般以直径9cm的平板上出现50-500个菌落为宜。但方法比较麻烦，操作者需有熟练的技术。平板菌落计数法不仅可以得出菌液中活菌的含菌数，而且同时将菌液中的病原菌进行了一次分离培养，获得了单克隆。5.微生物的新陈代谢

新陈代谢：简称代谢，广义的代谢——生命体进行的一切化学反应。是指发生在活细胞中的各种分解代谢与合成代谢的总和。其中，分解代谢是指复杂的有机物分子通过分解代谢酶系的催化，产生简单分子、腺苷三磷酸(ATP)形式的能量或还原力(或称还原当量，以[H]表示)的作用；合成代谢则与分解代谢相反，是指在合成代谢酶系的催化下，由简单小分子、ATP形式的能量与[H]形式的还原力一起合成大分子的过程。微

分解代谢和合成代谢微分解代谢：复杂

营养物分解为简

单化合物（异化

作用）。

合成代谢：简单

小分子合成为复

杂大分子（同化

作用）。

二者关系：合成

代谢与分解代谢

在生物体中偶联

进行，它们之间

既有明显差别，

但又紧密相关。

分解代谢为合成

代谢提供所需要

的能量和原料，

而合成代谢则是

分解代谢的基

础。

初级代谢和次级代谢初级代谢：能使营养物转化为结构物质、具生理活性物质或提供生长能量的一类代谢。产物有小分子前体物、单体、多聚体等生命必需物质。

次级代谢：某些微生物中并在一定生长时期出现的一类代谢。产物有抗生素、酶抑制剂、毒素、甾体化合物等，与生命活动无关，不参与细胞结构，也不是酶活性必需，但对人类有用。

新陈代谢

二者关系：先

初后次，初级

形成期也是生

长期，只有大

量生长，才能

积累产物。

能量代谢和物质代谢

五．实验药品及仪器

1. 活材料：大肠杆菌(E.coli)。

2. 培养基和试剂：牛肉膏蛋白胨液体培养基14支(每支10 mL)，浓缩5 倍的牛肉膏蛋白胨培养基1支。无菌酸溶液(甲酸：乙酸：乳酸=3：1：1)。

3. 器材：1 mL无菌吸管、摇床、冰箱、光电比色计、标签等。

六.实验步骤

1. 接种

取13支装有牛肉膏蛋白胨培养液的试管，贴上标签(注明菌名、培养处理、培养时间、组号)。按无菌操作法用吸管向每管准确加入0.2 mL的大肠杆菌培养液，接种后，轻轻摇荡，使菌体混匀。另一支不接种的培养管注明CK(对照)。

2. 培养

将接种后的培养管置于摇床上，在37℃下振荡培养。其中9支培养管分别于培养的0、1．5、3、4、6、8、10、12和14 h后取山，放冰箱中贮存，待测定。加酸处理。取出经4h培养的另二支培养管，按无菌操作法加入1 mL无菌酸溶液，摇匀后放回摇床上，继续振荡培养，于培养8 h和14 h后取出放冰箱中贮存，待测定。加富营养物处理。余下的二支培养管于培养6h后取出，按无菌操作法加入浓缩5倍的牛肉膏蛋白胨培养液1 mL，摇匀后，继续进行振荡培养，于培养8 h和14 h后取出，放入冰箱中贮存，待测定。

3. 比浊

将培养不同时间、形成不同细胞浓度的病原菌培养液进行适当稀释，使光密度值在0.0-0.4范围内，以未接种的牛肉膏蛋白胨液体培养基调零点，在光电比色计上，选用400-440nm波长的滤光片进行比浊，从最稀浓度的菌悬液开始，依次测定。

4. 比色

将大肠杆菌接入装有牛肉膏蛋白胨培养液的小试管中(试管要能插入放比色杯的比色槽内)。37℃下振荡培养，分别在0、1.5 、3、4、6、8、10、12和14 h取出，以未接种培养液调零点，在光电比色计上比色。比色时应自制一个暗盒将培养管和比色槽罩住，以形成一个暗室。

5.计数

我们将上述培养0，1.5，3，4，6，8，10，12，14h的病原菌悬液用稀释平板测数法进行测数，测出不同时间的含菌数。

6.绘制曲线

以病原菌数量为纵坐标，培养时间为横坐标，给出大肠杆菌在正常生长、加酸处理和加富培养三种条件下的生长曲线。或者以菌悬液比浊的光密度值为横坐标，以病原菌的数量为纵坐标，绘制一标准曲线，这样在测得了任一培养时间的菌悬液光密度值后，就可以在此标淮曲线上查出含菌数。这种方法已在工业上广泛采用，它可以节省许多稀释平板测数的时间，直接用比浊法测得的光密度值查标准曲线以了解各个培养时期的菌数消长情况。

从生长曲线我们可以算出细胞每分裂一次所需要的时间，即代时，以G 表示。

其计算公式为：

2lg /)lg (lg 1212W W t t G --= 式中t1和t2为所取对数期两点的时间；

W1和W2分别为相应时间测得的细胞含量（g/L ）或OD 。