ips细胞简介

一、ips细胞的制备

制备iPS细胞的几个关键步骤和环节

目前，iPS 细胞制备流程及其鉴定如图1 所示，简言之：

a．分离和培养宿主细胞；

b．通过病毒(逆转录病毒、慢病毒或腺病毒) 介导的方式将外源基因导入宿主细胞；

c．将病毒感染后的细胞种植于饲养层细胞上，并于ES 细胞专用培养体系中培养，同时在培养液中根据需要加入相应的小分子物质( 如Wnt3a、5-AZA、BIX-01294、VPA、TSA、BayK8644、PD0325901或CHIR99021 等)以促进重编程；d．数天后，出现ES 克隆样的克隆；

e．在细胞形态、基因表达谱、表观遗传学、畸胎瘤形成和体外分化等方面对这些克隆进行鉴定．

二、ips细胞的进一步研究

不同因子组合将小鼠的不同类型细胞诱导为iPS细胞

结论a．不同诱导水平的重编程因子均可将体细胞诱导为iPS 细胞；

b．转录因子转基因活性的持续时间与重编程效率有直接相关性；

c．许多不同组织来源的体细胞均可被重编程；

d．不同类型体细胞重编程为iPS 细胞所需转录因子诱导水平是不同的

总之，任何一种(小鼠和人的)体细胞在理论上均可被这些转录因子重编程为iPS 细胞

（不同因子组合将人的不同类型细胞诱导为ips细胞

联合运用遗传的和化学的方法将小鼠和人的体细胞重编程为iPS细胞）

三、基因导入方式

（ips细胞最主要的一步就是如何将外源基因导入宿主细胞）

目前，通过逆转录病毒、慢病毒、腺病毒和转座子介导的方式均可将转录因子对应的基因导入体细胞，进而将其重编程为iPS 细胞．新近，Hochedlinger 小组和Yamanaka 小组均通过腺病毒介导的转基因方式将转录因子的基因导入体细胞，进而瞬时表达这些基因即可获得无病毒载体整合的iPS细胞．这两个小组的研究结果表明，将体细胞重编程为iPS 细胞只需转录因子基因在体细胞内瞬时表达即可达到目的，而无需病毒载体整合进宿主细胞基因组中，但是该方法将体细胞诱导为iPS细胞的效率较逆转录病毒和慢病毒的低许多

非整合方式实现体细胞重编程为iPS 细胞的理论基础是：在通过逆转录病毒介导的方式将转录因子基因导入体细胞而获得的iPS 细胞上检测发现，转录因子转基因表达水平非常低或外源转基因完全沉默，而内源性转录因子基因被激活而维持很高表达水平，这时iPS 细胞多潜能性靠内源性转录因子表达来维持，至此，外源转录因子转基因已完成自己的使命而

不表达

．

最初，每一个逆转录病毒载体或慢病毒载体仅携带一个转录因子基因，采取如下策略生产病毒和感染细胞

．逆转录病毒的生产有两种方案：一是“直接混合”的方案，即用含4 种或更多因子质粒的混合物转染包装细胞，进而获得携带4 种或更多因子基因的病毒混合物，接着用病毒混合物感染细胞；

二是采用“先分后混”的方案，即先生产携带每一种因子基因的病毒，然后将收集的病毒上清等比例混合后感染目标细胞．慢病毒生产只能采取鼠或人的体细胞因子组合(遗传方法)

四、无遗传修饰的ips细胞

iPS细胞的未来是发展安全、高效、有临床应用价值的治疗型干细胞，从安全角度看，目前的研究正在逐步接近．迄今，通过逆转录病毒慢病毒和腺病毒介导的方式均可将转录因子基因导入体细胞而获得iPS 细胞．逆转录病毒和慢病毒介导的转基因方式使病毒载体整合进宿主基因组，实现转基因稳定表达，但这两种转基因方式容易激活致癌基因，获得的iPS 细胞可能是有毒害副作用的．Hochedlinger 小组和Yamanaka 小组先后通过腺病毒将转录因子基因导入体细胞，瞬时表达这些转录因子而获得了无毒害副作用的或无病毒载体整合的iPS 细胞，因为这种基因导入方式一般不会使病毒载体整合进宿主基因组中，有望成为临床应用的比较安全的方法

．当然，腺病毒载体也有可能整合进基因组中，尽管这种可能性很小．以病毒作为载体导入外源基因会使细胞发生遗传修饰，带有潜在的危险性，同时该方法操作起来比较麻烦且不实用．上述建立iPS 细胞的方法均涉及到基因的过量表达(或变化)，那么这些通过遗传修饰的细胞如何恢复基因的常量表达，此外，饲养层细胞、小片段载体污染、体外培养细胞的同质性、表观遗传改变和基因组稳定性等都需要加以考虑．腺病毒介导的转基因方式虽然实现用某些因子的短暂性表达代替基因的永久性整合而获得virus-free adeno-iPS 细胞，但是该方法仍然不是获得安全、高效、有临床应用价值的治疗型iPS 细胞的最佳方法．

最理想、最实用的方法是用小分子化合物代替外源基因导入实现体细胞重编程而获得iPS 细胞，这一想法在不久的将来有望变为现实．

五、现状

同时，研究者已成功地将iPS 细胞在体外定向诱导分化为神经前体细胞、功能性的成熟神经细胞，如运动神经元和多巴胺能神经元、星形胶质细胞、造血前体细胞、造血细胞、胰腺细胞和肝细胞、分泌胰岛素的β细胞、心肌细胞、平滑肌细胞、血管内皮细胞、胰腺细胞和耳蜗毛细胞等．

由iPS 细胞体外定向诱导分化出的细胞(包括前体细胞)在治疗相应疾病方面均展示出一定疗效．

将由iPS 细胞在体外诱导分化来的神经前体细胞宫内移植进13.5 天胎鼠脑中后，其可在体内进一步分化为胶质细胞和各类神经元(包括谷氨酰胺能神经元、GABA 能神经元和儿茶酚胺能神经元)，这些神经细胞功能性地整合进宿主脑中，并展现出成熟神经元的活性

．同时，将由小鼠iPS 细胞在体外诱导分化来的多巴胺能神经元移植进帕金森病大鼠模型脑内，一段时间后可有效缓解大鼠疾病症状和改善其行为

．此外，iPS 细胞来源的造血前体细胞、内皮前体细胞和成熟内皮细胞及耳蜗毛细胞分别成功用于治疗镰状红细胞贫血、血友病A和治疗神经感觉性听力障碍

六、前景展望

iPS 细胞研究成果在干细胞和发育生物学研究领域中无疑具有里程碑意义，其在短时间内取得了一系列突破，可以预见，有朝一日，iPS 细胞必将应用于临床，解决人类面临的各种疾患等，但在获得安全、高效、实用、有临床应用价值的治疗型

七、遇到的困难

iPS细胞之前，还面临许多问题、急待突破的瓶颈和需要深入研究的领域：

a．解析诱导体细胞重编程为iPS 细胞的分子机制，

b．研究iPS 细胞生物学特性和行为(如自我复制、增殖和分化等)调控的机制及iPS 细胞体外定向诱导分化机制，

c．提高iPS 细胞制备效率，d．充分评价iPS 细胞临床应用的安全性，

e．建立高效、安全、实用制备人iPS细胞的方法，即在阐明体细胞重编程为iPS 细胞机制的基础上建立无遗传修饰的iPS 细胞制备策略与方法(如仅利用一些小分子物质即将人的细胞重编程为iPS 细胞)，

f．在前一项研究的基础上，探索一条简便制备“个体特异的”或“疾病特异的”治疗型人iPS 细胞的技术路线和方法，等等．

高考生物热点：iPS细胞

2010年高考生物热点：iPS细胞 山东刘峰 一、时事资料 材料一：国际权威科学杂志《自然》（Nature）7月23日在线发表中国科学院动物研究所研究员周琪领导的研究组和上海交通大学医学院教授曾凡一领导的研究组共同完成的一项研究成果，我国科学家首次利用iPS细胞（诱导性多能干细胞），通过四倍体囊胚注射得到存活并具有繁殖能力的小鼠，从而在世界上第一次证明了iPS细胞的全能性。 iPS细胞全称为诱导性多能干细胞，是由体细胞诱导而成的干细胞，具有和胚胎干细胞类似的发育多潜能性。2006年7月，日本科学家首次宣布发现了将小鼠皮肤细胞转化为多能干细胞的方法；2007年11月，美国和日本科学家将人类细胞诱导为iPS细胞，被《科学》（Science）杂志评为2008年世界十大科技进展之首。iPS细胞在生物和医学领域具有广阔的应用前景，有望成为实施再生医学和细胞治疗的重要细胞来源。 iPS的研究突飞猛进，但是iPS细胞是否真正拥有与胚胎干细胞一样的全能性？是否能够真正与胚胎干细胞媲美呢？四倍体囊胚注射方法是目前国际上验证细胞是否具有全能性的“黄金标准”。这一方法是将胚胎干细胞注射进四倍体的小鼠早期胚胎，这种胚胎没有进一步发育能力，仅提供营养环境的胚胎，然后再移植入代孕母鼠体内，胚胎干细胞可以发育成正常的小鼠。但此前的研究发现，iPS细胞不能像胚胎干细胞一样通过四倍体囊胚注射发育成活体小鼠，iPS细胞注射后形成的小鼠胎儿在怀孕早期至晚期全部死亡，这些结果表明iPS细胞尚不具有全能性。 周琪等制备了37株iPS细胞，利用其中6株iPS细胞系注射了1500多个四倍体胚胎，最终3株iPS细胞系获得了共计27个活体小鼠，经多种分子生物学技术鉴定，证实该小鼠确实从iPS细胞发育而成，有些小鼠现已发育成熟并繁殖了后代。这是世界上第一次获得完全由iPS细胞制备的活体小鼠，有力地证明了iPS细胞具有真正的全能性。这项工作为进一步研究iPS技术在干细胞、发育生物学和再生医学领域的应用提供了技术平台，将iPS细胞研究推进到了一个新的高度，成为中国科学家在这一国际热点研究领域所作出的一项重要贡献。 材料二：iPS细胞全称为诱导性多能干细胞，是由体细胞诱导而成的干细胞，具有和胚胎干细胞类似的发育多潜能性。2006年7月，日本科学家首次宣布发现了将小鼠皮肤细胞转化为多能干细胞的方法；2007年11月，美国和日本科学家将人类细胞诱导为iPS细胞，被《科学》（Science）杂志评为2008年世界十大科技进展之首。iPS细胞在生物和医学领域具有广阔的应用前景，有望成为实施再生医学和细胞治疗的重要细胞来源。 材料三：日本研究人员利用质粒代替病毒载体运送基因，成功用实验鼠皮肤细胞培育出诱导多功能干细胞（iPS细胞）。科学家说，这项研究成果将有助于这种“万能细胞”技术的普及。日本京都大学和科学技术振兴机构10日发布联合新闻公报说，以前培育iPS细胞

iPS细胞简述

iPS细胞 基本概念 诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPS cells）最初是日本人山中申弥（Shinya Yamanaka）于2006年利用病毒载体将四个转录因子（Oct4, Sox2, Klf4 和c-Myc）的组合转入分化的体细胞中，使其重编程而得到的类似胚胎干细胞的一种细胞类型[1]。随后世界各地不同科学家陆续发现其他方法同样也可以制造这种细胞。 细胞可分为全能干细胞、多能干细胞和单能干细胞，诱导多能干细胞即通过向体细胞中导入诱导基因，使体细胞重编程获得具有胚胎干细胞样特性的多能干细胞，也称为去分化。 发展趋势 自2008年开始，小鼠和人的ips细胞研究取得了极大的发展，并在体细胞的选择、转录因子的组合和数量、病毒载体、筛选条件和小分子化合物等方面进行了完善，还逐步向疾病的治疗方面深入，镰刀形红细胞贫血症治疗的研究，从理论和实践上为人类单基因遗传病的治疗奠定基础。此外，猴、大鼠和猪ips细胞的建立在人类疾病研究上具有重大应用价值，既可构建人类疾病的动物模型，又能进行细胞移植实验，为将来的实验细胞替代治疗奠定基础。 2009年3月，Nagy小组和Kaji小组采用转座子法取代病毒载体的基因投递的方法，高效率制备了基因组无病毒整合的鼠iPS细胞，获得iPS细胞后，他们又成功将先前导入的转录因子基因从iPS细胞中移除。随着越来越多研究模型的建立，越来越多的体细胞被成功诱导为多能干细胞，以及无病毒整合技术的发现和有害基因的成功敲除，使得诱导多能干细胞向更加系统，更加安全，更加高效的方向发展。 伴随着ips细胞被诱导分化成为多巴胺神经元、能分泌胰岛素的细胞、心脏实质细胞、视网膜的前驱细胞和神经前体细胞等的成功，越来越多的体细胞得意诱导分化成功，为患帕金森综合症、糖尿病、心血管疾病和视网膜病变等疾病的患者提供了治愈的可能。 面临问题 第一，诱导体细胞重编程的分子机制至今仍不清楚。第二，iPS细胞的制备效率很低，一般只有0.05%，因此，在应用上很困难。第三，iPS细胞存在极大的风险，由于载体使用的一般是逆转录病毒和慢病毒，而且oct、c-Myc、klf4、sox2基因都可认为是原癌基因，所以iPS细胞有极大的致癌性。

Ips细胞的研究状况及其应用 干细胞

iPS细胞的研究状况及其应用与安全 摘要：诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPS cells）是由通过导入特定的转录因子，将分化的体细胞重编程而形成的类似胚胎干细胞的一种细胞类型。iPS细胞由于其潜在的广阔应用前景而迅速成为干细胞研究领域的新热点。本文对iPS 细胞的研究状况，其应用与前景及其安全性问题做一综述。 关键词：iPS细胞；安全性 The research status of iPS cells and its applications and security Abstract: The induced pluripotent stem cells is by through the import of specific transcription factors, will be differentiated cells reprogramming, in the form of a similar embryonic stem cells cell types. Ips cells is quickly becoming a new hotspot of stem cell research because of its potential broad application prospect. this article is to draw a conclusion about the status of study of iPS cells, its application and prospect and its safety problem. Keywords: Induced pluripotent stem cells; safety 1 iPS细胞历史回顾 2006年8月，Takahashi和Yamanaka1将小鼠的成纤维细胞诱导为iPS细胞。次年11月，他们又利用4种同样的转录因子将人的皮肤成纤维细胞诱导为iPS细胞2。 该细胞系在细胞形态、生长特性、表面标志物、形成畸胎瘤等方面与小鼠Es细胞非常相似，只是在基因表达谱、DNA甲基化方式及形成嵌合体动物方面却不同于小鼠Es细胞，故将其命名为诱导多能干细胞3。随后独立建立了人iPS细胞系。 2 iPS细胞研究现状 2010年11月23日，日本研究员首先利用人体皮肤组织纤维母细胞和脐血细胞培养出了诱导多功能细胞( iPS细胞)，然后加入几种血液细胞增殖因子和营养细胞，得以培养出了能够制造血小板的巨核细胞，最终制造出了血小板，并且能发挥正常功能4。因为血小板中不存在细胞核，而混杂其中的其他细胞的细胞核可以通过照射放射线或过滤去除，所以临床应用培养出的血小板不会有癌变的风险。

ips细胞简介

一、ips细胞的制备 制备iPS细胞的几个关键步骤和环节 目前，iPS 细胞制备流程及其鉴定如图1 所示，简言之： a．分离和培养宿主细胞； b．通过病毒(逆转录病毒、慢病毒或腺病毒) 介导的方式将外源基因导入宿主细胞； c．将病毒感染后的细胞种植于饲养层细胞上，并于ES 细胞专用培养体系中培养，同时在培养液中根据需要加入相应的小分子物质( 如Wnt3a、5-AZA、BIX-01294、VPA、TSA、BayK8644、PD0325901或CHIR99021 等)以促进重编程；d．数天后，出现ES 克隆样的克隆； e．在细胞形态、基因表达谱、表观遗传学、畸胎瘤形成和体外分化等方面对这些克隆进行鉴定． 二、ips细胞的进一步研究 不同因子组合将小鼠的不同类型细胞诱导为iPS细胞 结论a．不同诱导水平的重编程因子均可将体细胞诱导为iPS 细胞； b．转录因子转基因活性的持续时间与重编程效率有直接相关性； c．许多不同组织来源的体细胞均可被重编程； d．不同类型体细胞重编程为iPS 细胞所需转录因子诱导水平是不同的 总之，任何一种(小鼠和人的)体细胞在理论上均可被这些转录因子重编程为iPS 细胞 （不同因子组合将人的不同类型细胞诱导为ips细胞 联合运用遗传的和化学的方法将小鼠和人的体细胞重编程为iPS细胞） 三、基因导入方式 （ips细胞最主要的一步就是如何将外源基因导入宿主细胞） 目前，通过逆转录病毒、慢病毒、腺病毒和转座子介导的方式均可将转录因子对应的基因导入体细胞，进而将其重编程为iPS 细胞．新近，Hochedlinger 小组和Yamanaka 小组均通过腺病毒介导的转基因方式将转录因子的基因导入体细胞，进而瞬时表达这些基因即可获得无病毒载体整合的iPS细胞．这两个小组的研究结果表明，将体细胞重编程为iPS 细胞只需转录因子基因在体细胞内瞬时表达即可达到目的，而无需病毒载体整合进宿主细胞基因组中，但是该方法将体细胞诱导为iPS细胞的效率较逆转录病毒和慢病毒的低许多 非整合方式实现体细胞重编程为iPS 细胞的理论基础是：在通过逆转录病毒介导的方式将转录因子基因导入体细胞而获得的iPS 细胞上检测发现，转录因子转基因表达水平非常低或外源转基因完全沉默，而内源性转录因子基因被激活而维持很高表达水平，这时iPS 细胞多潜能性靠内源性转录因子表达来维持，至此，外源转录因子转基因已完成自己的使命而

诱导多能干细胞IPS及发展简述

诱导多能干细胞IPS及发展简述 1.定义：通过一定的途径将与细胞多能性有关的基因导入到已分化的体细胞中，或者同时添加一些辅助作用的小分子化合物使体细胞去分化重 编程回到胚胎干细胞状态，所获得的细胞即为IPS细胞。 IPS细胞与胚胎干细胞（ES）形态相似、核型、端粒酶活性、体外分化潜能均相同，同时也能够表达相同的表面标志分子。 诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPS cells）最初是日本人山中申弥（Shinya Yamanaka）于2006年利用病毒载体将 四个转录因子（Oct4, Sox2, Klf4 和c-Myc）的组合转入分化的体细胞中，使其重编程而得到的类似胚胎干细胞的一种细胞类型。随后世界各地不 同科学家陆续发现其它方法同样也可以制造这种细胞。 2.获取原理:ES细胞和IPS细胞具有相同的基因。不同的是，ES细胞中的与细胞多能性有关的基因能够表达，如：oct4，Sox2等。而已分化的体细胞中的这些基因不能表达。通过导入与多能性有关的外源基因来激活体细胞中的多能性基因，从而使体细胞从分化状态重编程为多能性干细胞。 （1）分离和培养宿主细胞； （2）通过病毒介导或者其他的方式将若干多个多能性相关的基因导入宿主细胞； （3）将病毒感染后的细胞种植于饲养层细胞上，并于ES细胞专用培养体系中培养，同时在培养中根据需要加入相应的小分子物质以促进重编程； （4）出现ES样克隆后进行iPS细胞的鉴定（细胞形态、表观遗传学、体外分化潜能等方面）。 3.应用前景： 3.1建立疾病模型通过体外研究这些疾病特异性的iPS细胞，有助于间接推断疾病的发病机制及寻找有效的治疗措施。 3.2 研究人类发育生物学及新基因的发现而iPS细胞与Es细胞在生长条件、细胞表型、细胞的多能分化特性等许多方面有相似点，在一定程度上它可以代替ES细胞担任基础研究及临床应用角色。iPS细胞体外自发分化的拟胚体可以模拟胚胎发育过程，可以作为组织、器官发生、发育研究的模型，弥补完整人胚不能用于这方面研究的缺陷。 3.3 自体干细胞移植不依靠人工或捐献者的器官，凭借本人强大的自然治愈能力让丧失功能的器官再生是最理想的治疗方式。对于遗传性疾病，利用自体成体细胞建立iPS细胞，通过基因打靶技术纠正遗传性缺陷基因，再诱导分化为特化细胞进行移植。 3.4新药发现及筛选目前新药的药理、药代学、毒理学、药效学等细胞水平的研究及生物学模型，大都在其他种属的细胞系进行。然而异种细胞与人之间毕竟有不完全相同的药物反应。而患者及疾病特异性源性iPS细胞的建立可以实现在体外以人源细胞为对象的试验性用药，观察药物对其基因结构及表达的影响，间接判断该药物对某种疾病的疗效，这是一种全新探索及筛选药物治疗的模式。 4．问题 4.1重编程机制如上所述，目前已经可以不用病毒介导转基因技术获得iPS细胞，表明病毒插入突变不是必需的。对于转录因子，则意见不一。没有c—Myc参与或只用Oct4因子也可以获得iPS细胞111·18l，但是其采用的初始细胞是已表达高水平某些转录因子的神经祖细胞，所以也不能完全排除对转录因子的依赖性。 4.2诱导效率此前报道iPS细胞诱导效率不到0．1％，效率太低阻碍了对重编程机制的研究，也阻碍了iPS细胞进一步发挥其应用价值，因此提高诱导效率的研究势在必行。添加SV40大T抗原将转染效率提高了23—70倍；添加强力霉素提高了至少100倍。PB转座子系统的转染效率与病毒系统无差异。Sail 4(Sal．1ike 4)也是胚胎干细胞相关转录单位之一。添加转录因子Sall 4比单用Oct3／4、Sox2、l(1f4诱导效率提高了lO倍。使用基因敲除技术敲除Sail 4后诱导效率显著降低，但仍不明确Sall 4是否可被同组蛋白Sall l或其他因子取代。降低培养环境的氧气溶度可以提高诱导效率，在5％02培养下效率可达0．40％，联合使用I型组蛋白去乙酰化酶抑制剂ValproicAcid(VPA)效率可达0．48％，但何种氧气溶度以及在低氧环境下培养多长时间最为合适仍不明确。 4.3致瘤性iPS细胞诱导过程中使用的转录因子c-Myc和Klf4都是癌基因，病毒插入也可以导致肿瘤发生，而且，未分化iPS细胞自身尚可在体内形成畸胎瘤，因此，iPS细胞的致瘤性是其进一步推广应用的一大障碍。虽然现在已经可以在没有c—Myc、圈f4和病毒情况下获得iPS细胞，而且随着细胞的分化，iPS细胞形成畸胎瘤的能力也逐渐减弱，但关于如何在细胞移植前将混杂在其中的未分化iPS细胞去除，以及在何分化阶段移植，目前还没有这方面安全应用的研究报道。 虽然iPS细胞距离临床应用还有一段时间，但伴随细胞生物学、分子生物学、发育生物学、功能基因组学以及转基因技术的进一步发展，iPS技术必将在细胞移植治疗、药物筛选和发病机制研究中发挥重要作用。

诱导产生多能性干细胞(iPS细胞)的研究进展

诱导产生多能性干细胞(iPS细胞)的研究进展 2006年, Takahashi和Yamanaka将几个转录因子导入已分化的小鼠皮肤成纤维细胞, 进而获得了类似于胚胎干细胞(embryonic stem cells, ES细胞)的多能性干细胞, 称之为“诱导产生的多能性干细胞”(induced pluripotent stem cells, iPS细胞). 这一研究明确地证实了分化的细胞可以通过少数几个因子的外源导入而被重编程到具有多能性的状态, 因而受到了整个生命科学领域的广泛关注. 本文将对这一新进展进行概述 1 细胞重编程的研究概况 细胞的多能性(pluripotency)是指其能够分化为机体内各种细胞类型的潜能 细胞核重编程是指,成熟的细胞由分化的状态被逆转到一种未分化状态的过程. 首先, 细胞核的重编程现象最早是在核移植实验中被发现的. 核移植实验最初是在两栖动物中实现的, 通过将体细胞核注入到去核卵母细胞中.. 其次, 将成熟的体细胞与多潜能细胞(ES细胞、胚胎癌细胞(EC细胞)等)融合[6~9], 或者用胚胎干细胞提取物来处理体细胞, 也可以在一定程度上使体细胞发生重编程.体细胞与多能性细胞的融合效率比较低, 融合之后的细胞具有两套染色体, 并且在移植后会发生排斥现象, 这就制约了细胞融合的临床应用 此外, 多能性干细胞可以由某些类型的细胞在体外培养时自发产生 2 iPS细胞的研究概况 iPS细胞首先是由Takahashi和Yamanaka在2006年建立的. 他们利用逆转录病毒载体在小鼠成纤维细胞中导入了4个与多能性有关的基因——Oct4, Sox2, c-myc和Klf4. 接着利用另一个多能性标志分子Fbx15的表达对转染后的细胞进行了筛选, 最终得到了具有胚胎干细胞够嵌合到生殖系中. 在新近的研究中, Yamanaka等人[21]用他们在小鼠中使用过的4种因子实现了人类皮肤成纤维细胞的重编程; 3 iPS细胞系建立的一些重要环节 iPS细胞建立的大致过程如下: 首先, 将几个重要的多能性相关基因通过逆转录病毒转染的方法导入小鼠或人类的成纤维细胞中; 其次, 基因导入一段时间后, 通过药物或形态学特征对转染的细胞进行选择; 最后, 筛选出的子, 如Oct4, Sox2和Nanog, 它们对于ES细胞和早期胚胎的多能性维持有着必不可少的作用; 3.2 iPS细胞的筛选 针对细胞的重编程是不完全这一问题, Yamanaka小组[16]以及Maherali[17]和Wernig[18]等人提出假设: 如果选用对多能性更为关键的基因作为报告基因, 得到的iPS细胞或许会具备更多ES细胞的特性. 他们利用基因重组技术建立了具有药物抗性基因的小鼠成纤维细胞, 这些细胞的抗性受内源性Nanog或Oct4表达的调控. 这两个转录因子在细胞多能性维持方面的作用已被研究得相当充分. Maherali等人[17]发现, 仅依靠形态学筛选可能就足以建立iPS细胞系. 后来的两项研究证实了在不对供体细胞做任何额外遗传修饰的情况下, 仅利用形态学的标准对细胞进行筛选也能够分离出小鼠的iPS细胞. 进行筛选的时间对于iPS细胞的产生也有明显的影响.造成这一现象的原因是, 细胞发生重编程而产生多能性是一个渐变的过程, 多能性基因的激活也是随着时间推移而逐渐发生的. 3.3 获得细胞的鉴定 细胞的多能性要满足两个基本条件: 强大的自我更新能力和分化潜能. 目前有很多种具体的指标可用来评判获得 的iPS细胞是否像真正的ES细胞一样具有多能性, 如形态学标准、标志分子的表达、生长特性、发育潜能、表观遗传学特征等. 5.1 应用价值 iPS细胞的出现, 在干细胞研究领域、表观遗传学研究领域以及生物医学研究领域都引起了强烈的反响.在基础研究方面, iPS细胞为研究细胞核重编程提供了一个全新的视角.这一技术人们可以制造特定病人来源的iPS细胞, 可望用“个性化”的移植来治疗诸多疾病. 5.2 发展方向

iPS细胞培养步骤

For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures. An Introduction to Stem Cell Maintenance Publication Part Number MAN0006676 Revision Date 22 August 2012 Introduction Pluripotent Stem Cells (PSCs) can divide indefinitely, self-renew, differentiate and functionally develop into almost any cell in the body, given the right conditions. There are several kinds of pluripotent stem cells: ? Embryonic Stem Cells: Isolated from the inner cell mass of the blastocyst stage of a developing embryo. These early cells were destined to create a fetus following implantation. ? Embryonic Germ Cells: Derived from aborted fetuses. These early cells were destined to become sperm and eggs. ? Embryonic Carcinoma Cells: Isolated from certain types of fetal tumors. ? Induced Pluripotent Stem Cells: Generated via ectopic expression of one or more genes to reprogram an adult somatic cell. PSCs are generally maintained on a layer of feeder cells for many passages without any compromise to proliferation, pluripotency or differentiation potential. Feeder cells are usually murine embryonic fibroblasts (MEF), which must be irradiated or chemically treated to inactive them (noted as iMEF) prior to culturing with PSCs. Alternatively, PSCs can be maintained in feeder-free conditions using specialized media systems on a matrix-coated tissue culture surface. This introduction will discuss the feeder-dependent and feeder-free culture of human ESCs and iPSCs (noted as hESCs and hiPSCs), which will be referred to as PSCs. Feeder-based medium is comprised of basal medium supplemented with 15–20% KnockOut ? Serum Replacement (KSR) and other additives. Feeder-free medium is either Conditioned Medium (CM), which is comprised of feeder-based medium that has been conditioned on iMEFs and therefore can be used to grow PSCs in the absence of feeders, or commercially available media that support feeder-independent growth of PSCs. Helpful Tips and Tricks ? General maintenance of PSC cultures requires daily removal of spent media and replenishment with fresh PSC medium. It is crucial to add fresh bFGF, aseptically on a daily basis, to the pre-warmed media prior to adding to the cells. Daily visual inspection of cell morphology is highly recommended for proper growth and for the removal of any differentiating colonies via manual dissection. ? As daily maintenance of the PSC cultures is required, it is helpful to develop an optimal working schedule. PSCs should be split every 3–4 days, based on colony size and distribution. Hands-on experience and a keen eye are most important in PSC culture. To avoid spontaneous differentiation of the colonies, do not : - allow colonies to overgrow and touch each other - over incubate the colonies in enzyme, when passaging them - passage huge colonies