抗氧化功能评价方法

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抗氧化功能评价方法

试验项目、试验原则及结果判定

Items, Principles and Result Assessment

1 试验项目

动物实验

体重

脂质氧化产物：丙二醛或血清8-表氢氧异前列腺素（8-Isoprostane）

蛋白质氧化产物：蛋白质羰基

抗氧化酶：超氧化物歧化酶或谷胱甘肽过氧化物酶

抗氧化物质：还原性谷胱甘肽

人体试食试验

脂质氧化产物：丙二醛或血清8-表氢氧异前列腺素（8-Isoprostane）

超氧化物歧化酶

谷胱甘肽过氧化物酶

2 试验原则

动物实验和人体试食试验所列的指标均为必测项目。

脂质氧化产物指标中丙二醛和血清8-表氢氧异前列腺素任选其一进行指标测定，动物实验抗氧化酶指标中超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶任选其一进行指标测定。

氧化损伤模型动物和老龄动物任选其一进行生化指标测定。

在进行人体试食试验时，应对受试样品的食用安全性作进一步的观察。

3 结果判定

动物实验：脂质氧化产物、蛋白质氧化产物、抗氧化酶、抗氧化物质四项指标中三项阳性，可判定该受试样品抗氧化功能动物实验结果阳性。

人体试食试验：脂质氧化产物、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶三项指标中二项阳性，且对机体健康无影响，可判定该受试样品具有抗氧化功能的作用。

抗氧化功能检验方法

Method for the Assessment of Antioxidative Function

1 动物实验

实验动物

选用10月龄以上老龄大鼠或8月龄以上老龄小鼠，也可用氧化损伤模型鼠。单一性别，小鼠每组10－15只，大鼠8－12只。

剂量分组及受试样品给予时间

实验设三个剂量组和一个溶剂对照组，以人体推荐量的10倍（小鼠）或5倍（大鼠）为其中的一个剂量组，另设两个剂量组，高剂量一般不超过30倍，必要时设阳性对照组、空白对照组。受试样品给予时间30天，必要时可延长至45天。

实验方法

老龄动物

选用10月龄以上大鼠或8月龄以上小鼠，按血中MDA水平分组，随机分为1个溶剂对照组和3个受试样品剂量组。3个剂量组给予不同浓度受试样品，对照组给予同体积溶剂，实验结束时处死动物测脂质氧化产物含量、蛋白质羰基含量、还原性谷胱甘肽含量、抗氧化酶活力。

D－半乳糖氧化损伤模型

原理

D-半乳糖供给过量，超常产生活性氧，打破了受控于遗传模式的活性氧产生与消除的平衡状态，引起过氧化效应。

造模方法

选25-30g健康成年小鼠，除空白对照组外，其余动物用D-半乳糖40mg－kg BW颈背部皮下注射或腹腔注射造模，注射量为10g，每日1次，连续造模6周，取血测MDA，按MDA水平分组。随机分为1个模型对照组和3个受试样品剂量组，3个剂量组经口给予不同浓度受试样品，模型对照组给予同体积溶剂，在给受试样品的同时，模型对照组和各剂量组继续给予相同剂量D-半乳糖颈背部皮下或腹腔注射，实验结束处死动物测脂质氧化产物含量、蛋白质羰基含量、还原性谷胱甘肽含量、抗氧化酶活力。

乙醇氧化损伤模型

原理

乙醇大量摄入，激活氧分子产生自由基，导致组织细胞过氧化效应及体内还原性谷胱甘肽的耗竭。

造模方法

选25－30g健康成年小鼠（180－220g大鼠），随机分为4个组，1个模型对照组和3个受试样品剂量组，必要时可增设1个空白对照组。3个剂量组给予不同浓度受试样品，模型对照组给予同体积溶剂，连续灌胃30天，末次灌胃后，模型组对照组和3个剂量组禁食16小时（过夜），然后1次性灌胃给予50%乙醇12ml/kgBW，6小时后取材（空白对照组不作处理，不禁食取材），测血清或肝组织脂质氧化产物含量、蛋白质羰基含量、还原性谷胱甘肽含量、抗氧化酶活力。

脂质氧化产物测定

血中过氧化脂质降解产物丙二醛（MDA）含量测定

血中过氧化脂质降解产物丙二醛（MDA）含量可采用荧光法和比色法测定，方法任选其一。

.1 荧光法

. 荧光法原理

MDA（malondiadehycle）是细胞膜脂质过氧化的终产物之一，测其含量可间接估计脂质过氧化的程度。1个丙二醛（MDA）分子与2个硫代巴比妥酸（TBA）分子在酸性条件下共热，形成粉红色复合物。以波长536nm为激发光，在550nm有最强荧光强度。可用荧光法进行微量测定。

. 仪器与试剂

仪器：荧光分光光度计、微量加样器、恒温水浴锅、普通离心机、混旋器、具塞离心管

试剂：

10mmol/L四乙氧基丙烷（贮备液，棕色瓶4℃保存12个月），临用前用纯水稀释成1nmol/mL

29mmol/L硫代巴比妥酸工作液

硫代巴比妥酸

25mg

谷胱甘肽（还原型）1mg

用L NaOH 50 mL 溶解（微温助溶，棕色瓶4℃保存2周）酸水解液

L H2SO4 125mL

L Na2SO4 125mL

加水150mL用 H2SO4 调pH ，加水稀释至500mL

正丁醇

以上所用玻璃器皿均需经50％硝酸浸泡24h后，再经蒸馏水、双蒸水淋洗干燥，试剂（选AR级）最好用双蒸水配制。

. 实验步骤

. 样品制备

全血上清液：取血50μl加入生理盐水，2000r/min离心10min，取上清液待测。

血清样品：取血室温静置10min，2000r/min离心10min，取上清液待测。. 标准曲线制作

将10nmol/mL四乙氧基丙烷，用双蒸水稀释成、、、、、2、3、5、

10nmol/mL分别取加入酸水解液 2mL、TBA工作液→混匀，避光、沸水浴60min →流水冷却至室温→3mL正丁醇振荡抽提1min→3000r/min离心5min→取上清液（正丁醇层）测荧光强度（入射狭缝，出射狭缝5nm，激发波长536nm，发射波长550nm）

以四乙氧基丙烷浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标作图。

.样品测定

试剂空白管样本管标准管10mL具塞离心管蒸馏水血清*标准＃酸水解液2mL2mL2mL

TBA工作液

混匀，避光沸水浴60min，流水冷却

正丁醇3mL3mL3mL

振荡抽提1min，3000r/min 离心5min

*全血上清液（空白管加蒸馏水，标准管加标准、蒸馏水）

＃1nmol/mL四乙氧基丙烷（标准）

血清（或全血上清液）→加入酸水解液 2mL、TBA工作液→混匀，避光、沸水浴60min→流水冷却至室温→3mL正丁醇振荡抽提1min→3000r/min离心5min→取上清液（正丁醇层）测荧光强度（入射狭缝，出射狭缝5nm，激发波长536nm，发射波长550nm）

. 计算公式：

B-A B-A

过氧化脂质含量（nmol/mL血清）＝———×C×K =————×1×1

F-A F-A

B-A B-A 1

过氧化脂质含量（nmol/mL血液）＝———×C×K =———×1×———— F-A F-A

A：空白管荧光度

B：样品荧光度

F：四乙氧基丙烷荧光度

C：四乙氧基丙烷浓度（1nmol/mL）

K：稀释倍数

.2比色法

.比色法原理

MDA（malondiadehycle）是细胞膜脂质过氧化的终产物之一，测其含量可间接估计脂质过氧化的程度。1个丙二醛（MDA）分子与2个硫代巴比妥酸（TBA）分子在酸性条件下共热，形成粉红色复合物。该物质在波长532nm有极大吸收峰。可用分光光法进行测定。

. 仪器与试剂

仪器：可见光分光光度计、酶标仪、微量加样器、恒温水浴锅、普通离心机、混旋器、具塞离心管。

试剂：乙酸盐缓冲液

乙酸溶液 185mL

乙酸钠溶液 15mL

1mmol/L四乙氧基丙烷（贮备液，4℃保存3个月），临用前用水稀释成40nmol/mL

%十二烷基硫酸钠SDS

%硫代巴比妥酸TBA

磷酸盐缓冲液

磷酸氢二钠 1920mL

磷酸二氢钾 480mL

. 实验步骤

. 样品制备

溶血液样品：取血20μL加入蒸馏水制成2％溶血液。

.样品测定

试剂空白管样品管标准管2％溶血液*

40nmol/mL四乙氧基丙烷

%SDS

乙酸盐缓冲液

%TBA

H2O

混匀，避光沸水浴60min，流水冷却，于532nm比色

注：如用试剂盒，可按试剂盒的操作要求进行。

*若用血清，样品管，标准管。

.计算

B – A B – A

过氧化脂质含量（nmol/mL2%溶血液）＝————×C×K = —————×40×1 F – A F – A

B – A B – A

过氧化脂质含量（nmol/mL血清）＝————×C×K = —————×40×1

F – A F – A

A: 空白管吸光度

B：样品吸光度

F：四乙氧基丙烷吸光度

C：四乙氧基丙烷浓度（40nmol/mL）

K：稀释倍数

组织中过氧化脂质降解产物丙二醛（MDA）含量测定

.1 原理

见.

.2 仪器与试剂

仪器：可见光分光光度计、酶标仪、微量加样器、恒温水浴锅、普通离心机、混旋器、具塞离心管、组织匀浆器

试剂：见.

.3 实验步骤

. 样品制备

组织匀浆样品：取一定量的所需脏器，生理盐水冲洗、拭干、称重、剪碎，置匀浆器中，加入磷酸盐缓冲液，以20000r/min匀浆10s，间歇30s，反复进行3次，制成10％组织匀浆（W/V），3000r/min离心5－10min，取上清液待测。

.样品测定

试剂空白管样品管标准管10％组织匀浆

40nmol/mL四乙氧基丙烷

%SDS

乙酸盐缓冲液

%TBA

H2O

混匀，避光沸水浴60min，流水冷却，于532nm比色

注：如用试剂盒，可按试剂盒的操作要求进行

.计算

B - A B- A 1

过氧化脂质含量＝————×C×K = ———×40×————————（nmol/mg组织） F - A F - A ×10%×1000

A: 空白管吸光度

B：样品管吸光度

F：四乙氧基丙烷吸光度

C：四乙氧基丙烷浓度（40nmol/mL）

K：稀释倍数

血清中8-表氢氧-异前列腺素（8-Isoprostane）测定

.1原理

8-表氢氧-异前列腺素（8-Isoprostane）是体内脂质氧化应激反应稳定而具有特异性的标志物，其含量能间接反应因机体内自由基的产生而导致组织细胞的脂质过氧化程度。

.2仪器与试剂

仪器：酶标仪、生化培养箱、微量振荡器、微量加样器、洗板机

试剂：8-Isoprostane KIA Kit (酶联免疫试剂盒)

8-Isoprostane EIA 抗体血清、8-Isoprostane AChE示踪物、8-Isoprostane EIA标准品、EIA缓冲液、洗涤缓冲液、吐温20、鼠抗-兔IgG抗体、EIA示踪染色剂、EIA抗体血清染色剂、Ellman’s试剂

.3实验步骤

.样品制备

小鼠眼内眦静脉丛取血，3000r/min离心10min。取上清液，用EIA 缓冲液稀释15倍备用。

.样品测定

按试剂盒说明操作。

8-表氢氧异前列腺素标准孔浓度分别为：500 pg/mL、200 pg/mL、80

pg/mL、32 pg/mL、 pg/mL、 pg/mL、 pg/mL、mL

标准或样品孔吸光度— NSB孔吸光度

%B/B0= ——————————————————×100

B0孔吸光度— NSB孔吸光度

以标准物的浓度的对数（log）为横坐标，%B/B0为纵坐标绘制标准曲线，亦可将数据转换成logit(B/B0)或ln[B/B0/(1-B/B0)]做为纵坐标绘制标准曲线，计算回归方程。将样品的%B/B0值，代入方程式，计算出样品的浓度，再乘以稀释倍数，即为样品中的8-表氢氧异前列腺素浓度。

蛋白质氧化产物测定

H2O2或O2·ˉ自由基对蛋白质氨基酸侧链的氧化可导致羰基产物的积累。羟自由基也可直接作用于肽链，使肽链断裂，引起蛋白质一级结构的破坏，在断裂处产生羰基。羰基化蛋白极易相互交联、聚集为大分子从而降低或失去原有蛋白质的功能，蛋白质羰基含量可直接反映蛋白质损伤的程度。蛋白质羰基形成是多种氨基酸在蛋白质的氧化修饰过程中的早期标志，它随着年龄的增长而增加。

血清中蛋白质羰基测定

.1原理

被氧化后的蛋白质羰基含量增多，羰基可与2，4-二硝基苯肼反应生成2，4-二硝基苯腙，2，4．二硝基苯腙为红棕色的沉淀，将沉淀用盐酸胍溶解后即可在分光光度计上读取370 nm下的吸光度值，从而测定蛋白质的羰基含量。.2仪器与试剂

仪器：紫外分光光度计、酶标仪、微量加样器、生化培养箱、恒温水浴锅、低温高速离心机、混旋器、2ml离心管。

试剂：10 mmol/L 2，4-二硝基苯肼(DNPH)

99毫克2，4-二硝基苯肼用50ml 2 mol/L HCL 溶解，4℃避光保存。

2 mol/L HCL

200 g/L 三氯乙酸（TCA）

6 mol/L 盐酸胍

无水乙醇乙酸乙酯混合应用液

将无水乙醇和乙酸乙酯按照体积比1：1的比例配置成混合溶液，现用现配。

.3操作步骤

涡旋混匀，将全部沉淀溶解，以12000r/min离心15min，取上清液在370nm处比色，6 mol/L 盐酸胍试剂调零，测定OD值。用双缩脲法测定血清（或血浆）蛋白质含量。

注：如用试剂盒，可按试剂盒的操作要求进行。

.4计算公式

测定管OD-对照管OD

蛋白质羰基含量 = ——————————————————————×125×105

（nmol/mgprot） 22×比色光径（cm）×样本蛋白浓度（mg/L）

组织中蛋白质羰基测定

.1原理

见.1

.2 仪器与试剂

仪器：紫外分光光度计、酶标仪、微量加样器、生化培养箱、恒温水浴锅、天平、匀浆器、低温高速离心机、混旋器、2ml离心管。

试剂：

10 mmol/L HEPES缓冲液

克N-2-羟乙基哌嗪-2’-乙磺酸（HEPES）溶入1000ml双蒸馏水，用

lN NaOH 调pH至，4℃保存。

100 g/L 硫酸链霉素

1g硫酸链霉素，溶入10ml双蒸馏水，4℃避光保存。

10 mmol/L 2，4-二硝基苯肼(DNPH)

99毫克2，4-二硝基苯肼用50ml 2 mol/L HCL 溶解，4℃避光保存。

2 mol/L HCL

200 g/L 三氯乙酸（TCA）

6 mol/L 盐酸胍

无水乙醇乙酸乙酯混合应用液

将无水乙醇和乙酸乙酯按照体积比1：1的比例配置成混合溶液，现用现配。

.3 实验步骤

.样品处理

取组织，在冰的生理盐水中漂洗，以去掉表面的血迹。加人的冰的10 mmol/L HEPES缓冲液，制成10％的匀浆。将匀浆液以3000r/min的转速，离心10 min，保留上清。取100g／L的硫酸链霉素溶液50μl，加入上清液450μl

（v/v,1:9），室温放置10 min后，以11000r/min的转速，离心10 min，取上清液待测。

涡旋混匀，将全部沉淀溶解，以12000r/min离心15min，取上清液在370nm处比色，6 mol/L 盐酸胍试剂调零，测定OD值。用双缩脲法测定匀浆上清液蛋白质含量。

注：如用试剂盒，可按试剂盒的操作要求进行。

.计算公式

测定管OD-对照管OD

蛋白质羰基含量 = ——————————————————————×125×105

（nmol/mgprot） 22×比色光径（cm）×样本蛋白浓度（mg/L）

注意事项

.1 加入硫酸链霉素：在匀浆上清液中加人硫酸链霉素溶液的作用是沉淀核酸。核酸中的一些碱基如鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶和胸腺嘧啶等也含有羰基，如不去除核酸，这些碱基就会与DNPH结合，并反应生成有色物质，这些物质会增加最后溶液的吸光度，使结果偏大。

.2 DHPH的溶解：DNPH不溶于水，只能溶于稀酸和稀碱等溶液，因此，用2 mol ／L HC1来溶解DNPH。设对照管是为了避免HC1与反应液中一些物质反应生成对比色有影响的物质。

.3 反应体系应避光：当蛋白质溶液中加人DNPH

进行反应时，反应体系需置于黑暗中，因为DNPH不稳定，见光会分解。如果反应体系遇到光，DNPH分解，体系中会有剩余的没有变成蛋白质腙衍生物，对反应比色有影响。

.4 去除未与蛋白质结合的DNPH：由于DNPH在370nm左右有强烈的光吸收，因而用乙醇和乙酸乙脂混合物反复洗涤沉淀，去掉未与蛋白质结合的DNPH，否则，会增加吸光值。

抗氧化酶活力测定

SOD催化超氧阴离子自由基（O2·ˉ）生成H2O2，再由其它抗氧化酶如谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）和过氧化氢酶作用生成水，这样可以清除O2·ˉ对细胞的毒害作用。SOD、GSH-Px在动物某些器官和人体血红细胞中的含量均有明显的增龄变化，酶活性与生物年龄的增长成反比。消除自由基的能力与酶活性成正比。

血或组织中超氧化物歧化酶（SOD）活力测定

.1 原理

O2·ˉ氧化羟胺的最终产物为亚硝酸盐，后者在对氨基苯磺酸及甲萘胺作用下呈现紫红色，在波长530nm处有极大吸收峰，可用分光光度法进行测定，当SOD消除O2·ˉ后形成的亚硝酸盐减少。

.2仪器与试剂

仪器可见光分光光度计、酶标仪、离心机、恒温水浴、匀浆器

试剂 65mM磷酸盐缓冲液（PBS）

10mmol/L盐酸羟胺

盐酸羟胺，加PBS至10mL

L黄嘌呤

黄嘌呤，加 NaOH 溶解，加PBS至10mL

L黄嘌呤氧化酶

取10g/L黄嘌呤氧化酶加冰冷PBS 至10mL

%甲萘胺

取α-甲萘胺溶于40mL沸蒸馏水，凉至室温加50mL冰醋酸，再加

110mL凉蒸馏水至200mL

%对氨基苯磺酸

取对氨基苯磺酸溶于150mL温蒸馏水，加50mL冰醋酸至200mL

SOD标准品

三氯甲烷

95％乙醇（v/v）

%生理盐水

.3 实验步骤

红细胞抽提液制备：10μl全血冲入生理盐水，2000r/min离心3min，弃上清，加冰冷的双蒸水混匀，加入95％乙醇，振荡30s，加入三氯甲烷，置快速混合器抽提1min，4000r/min离心3min，分层，上层为SOD抽提液，中层为血红蛋白沉淀物，下层为三氯甲烷，记录上清液体积待测。

组织匀浆的制备：剪取一定量的所需脏器，生理盐水冲洗、拭干、称重、剪碎，至玻璃匀浆器中加入冷生理盐水20000r/min匀浆10s，间歇30s，反复

进行三次，制成1％组织匀浆，（最好用超声波发生器处理30s），使线粒体振破，以中性红－詹钠氏绿B染色证明线粒体已振碎。以4000r/min离心5min，取上清液20μl待测。

SOD标准抑制曲线将SOD标准品用磷酸盐缓冲液配制成750U/mL的溶液，再稀释到50倍，即SOD量为15U/mL（μg/mL），用本法测定不同量的SOD标准液的百分抑制率，以百分抑制率为纵坐标，以SOD活力单位U/mL为横坐标绘制标准曲线。

对照管OD－测定管OD

SOD百分抑制率＝──────────────×100％

对照管OD

计算每mL反应液中SOD抑制率达50％时所对应的SOD量为一个单位。

（对照管OD-测定管OD）×100％

对照管OD 反应液总量（6mL）

SOD活力（U/mL）＝─────────×──────────×样品稀释倍数

50％取液量

也可用酶比活法即以每管样品的百分抑制率从SOD标准曲线查出相应的SOD U/mL，乘以稀释倍数（1mL/取样量）。

若样品为组织匀浆液，根据匀浆浓度或组织蛋白质含量，将单位换算为

U/g组织或U/mg蛋白。若样品为红细胞抽提液，根据血红蛋白含量，可换算为U/g Hb。

样品测定步骤：

试剂测定管对照管

1/15mol/L磷酸盐缓冲液（mL）

样品A*

10mmol/L盐酸羟胺（mL）

L黄嘌呤（mL）

mL黄嘌呤氧化酶（mL）

双蒸水（mL）

混匀，37℃恒温水浴30min

%对氨基苯磺酸（mL）

%甲萘胺（mL）

混匀15min后，倒入1cm光径比色杯，以蒸馏水调零，530nm处比色测定OD

值。

* A 所用样品的量

红细胞抽提液10 μl

血清（或血浆）20－30 μl（溶血样品剔除）

1%组织匀浆10－40 μl

注：如用试剂盒，可按试剂盒的操作要求进行。

血或组织中谷胱甘肽过氧化物酶（GSH－Px）活力测定

.1 原理

谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）是体内存在的一种含硒清除自由基和抑制自由基反应的系统。对防止体内自由基引起膜脂质过氧化特别重要，其活力以催化GSH氧化的反应速度，及单位时间内GSH减少的量来表示，GSH和5,5’-二硫对硝基苯甲酸（DTNB）反应在GSH-Px催化下可生成黄色的5-硫代2-硝基苯甲酸阴离子，于423nm波长有最大吸收峰，测定该离子浓度，即可计算出GSH 减少的量，由于GSH能进行非酶反应氧化，所以最后计算酶活力时，必须扣除非酶反应所引起的GSH减少。

.2 试剂和仪器

仪器：可见光分光光度计、酶标仪、低温高速离心机、匀浆器、恒温水浴锅、微量加样器

试剂：叠氮钠磷酸缓冲液

N a N3终浓度L

EDTA-N a2终浓度L

N a2HPO4终浓度L

N a H2PO4终浓度L

加蒸馏水至100mL，用少量HCL、N a OH调，4℃保存。

1mmol/L谷胱甘肽（还原型GSH）溶液

GSH 加叠氮钠磷酸缓冲液至100mL，临用前配制，冰冻保存1－2

日。

－LH2O2溶液

取30％H2O2－，用双蒸水稀释至100mL，作为贮备液，4℃避光保存，临用前将贮备液用双蒸水稀释10倍即可。

偏磷酸沉淀液

HPO3（先用蒸馏水溶解）

EDTA

N a Cl280g

加蒸馏水至1000mL，用普通滤纸过滤，室温保存。

LN a2HPO4溶液:

N a2HPO4加蒸馏水至500mL，室温保存。

DTNB显色液

DTNB40mg

柠檬酸三钠

加蒸馏水至100mL，4℃避光保存1个月。

磷酸缓冲液

%生理盐水

.3 实验步骤

. 样品制备

溶血液：取鼠血10μl加入到1mL双蒸水中，充分振摇，使之全部溶血

1:100待测，4h内测定酶活力。若当天来不及测定，将肝素抗凝全血置-20℃冻存，3d内测定，若4℃存放，28h内必须测完。测前取出样品室温自然解冻。

组织上清液：动物禁食过夜，处死后，立即取出所需脏器，放入冷生理盐水中洗去浮血，剔除脂肪及结缔组织，滤纸吸干后，在冰浴上剪成碎块，称取适量组织，加冷磷酸缓冲液，以20000r/min匀浆10s，间歇30s，反复3次制成5%组织匀浆，操作在冰浴中进行，匀浆以12500×g离心10min（低温高速离心机），以沉淀为破碎的细胞、细胞碎片、核及线粒体，上清液用以测胞液中的酶活力，最好当天测，否则加20％（v/v）甘油分装于塑料管，放置-20－-80℃，可保存数周，而酶活力不减。

. GSH标准曲线的制作：

取LGSH溶液0、、、、、，分别置于10mL小容器瓶中，各加入偏磷酸沉淀剂8mL，用双蒸水稀释至10mL刻度，即得到浓度为0、20、40、60、80、100μmol/L的 GSH标准液。

取上述不同浓度标准液各2mL，放入试管中，加入L Na2HPO4，比色前加入DTNB显色液用光径1cm杯，5min内在可见光423nm波长测OD值，以双蒸水调零点。

以GSH含量（μmol/L）为横坐标，OD423值为纵坐标，绘制标准曲线。

. 测定步骤：

试剂样品管（mL）非酶管（mL）空白管

（mL）LGSH

样品**

双蒸水*

37℃水浴预温5min

H2O2（37℃预

热）

37℃水浴准确反应3min （严格控制时间）

偏磷酸沉淀液44

3000r/min离心10min

离心上清液22

双蒸水

总抗氧化能力检测试剂盒(FRAP法)

总抗氧化能力检测试剂盒(FRAP法) 产品编号产品名称包装 S0116 总抗氧化能力检测试剂盒(FRAP法) 100次 产品简介： 总抗氧化能力检测试剂盒(FRAP法)，即Total Antioxidant Capacity Assay Kit with FRAP method，简称T-AOC Assay Kit，是一种采用Ferric Reducing Ability of Plasma (FRAP)方法，可以对血浆、血清、唾液、尿液等各种体液，细胞或组织等裂解液、植物或中草药抽提液、或各种抗氧化物(antioxidant)溶液的总抗氧化能力进行检测的试剂盒。 活性氧(Reactive oxygen species, ROS)主要包括羟基自由基、超氧自由基和过氧化氢。在细胞或组织的正常生理代谢过程中会产生活性氧，同时一些环境因子例如紫外照射、γ射线照射、吸烟、环境污染等也可以诱导活性氧的产生。活性氧产生后，可以导致细胞内脂、蛋白和DNA等的氧化损伤，诱发氧化应激(Oxidative stress)，继而导致各种肿瘤、动脉粥样硬化、风湿性关节炎、糖尿病、肝损伤、以及中枢神经系统疾病等。 机体中存在多种抗氧化物，包括抗氧化大分子、抗氧化小分子和酶等，可以清除体内产生的各种活性氧，以阻止活性氧诱导的氧化应激(oxidative stress)的产生。一个体系内的各种抗氧化大分子、抗氧化小分子和酶的总的水平即体现了该体系内的总抗氧化能力。因此测定血浆、血清、尿液、唾液等各种体液，细胞或组织等裂解液中的总抗氧化能力具有非常重要的生物学意义。 植物或中草药抽提液、或各种抗氧化物溶液的总抗氧化能力的检测可以用于检测各种溶液的抗氧化能力的强弱，可以用于筛选强抗氧化能力的药物。 FRAP法测定总抗氧化能力的原理是酸性条件下抗氧化物可以还原Ferric-tripyridyltriazine (Fe3+-TPTZ)产生蓝色的Fe2+-TPTZ，随后在593nm测定蓝色的Fe2+-TPTZ即可获得样品中的总抗氧化能力。由于反应在酸性条件下进行，可以抑制内源性的一些干扰因素。并且由于血浆等样品中的铁离子或亚铁离子的总浓度通常低于10μM，因此血浆等样品中的铁离子或亚铁离子不会显著干扰FRAP法的检测反应。由于反应体系中的铁离子或亚铁离子是和TPTZ螯合的，样品本身含有的少量金属离子螯合剂通常也不会显著影响检测反应。 Antioxidant Fe3+-TPTZ ——————> Fe2+-TPTZ (蓝色) 提供了抗氧化物Trolox作为对照。Trolox是一种维生素E的类似物，水溶性较好，抗氧化能力和维生素E相近。 本试剂盒方便快捷，加入待测样品后3-5分钟即可进行吸光度测定，通常10-20个样品可以在十多分钟内检测完毕。 本试剂盒可以检测100个样品。 包装清单： 产品编号产品名称包装 S0116-1 TPTZ稀释液 15ml S0116-2 TPTZ溶液 1.5ml S0116-3 检测缓冲液 1.5ml S0116-4 FeSO4·7H2O 200mg S0116-5 Trolox溶液 (10mM) 0.1ml —说明书1份 保存条件： -20℃保存，一年有效。其中S0116-2 TPTZ溶液，S0116-3 检测缓冲液和S0116-5 Trolox溶液 (10mM)需避光保存。 注意事项： 在酸性条件下呈蓝色或接近蓝色的试剂会对本试剂盒的检测产生干扰，需尽量避免。 如果样品中含有外加的较高浓度的铁盐或亚铁盐，会干扰测定。但血浆、血清、细胞或组织裂解液等样品中含有的微量的铁盐或亚铁盐不会干扰测定。 样品中不能添加DTT、巯基乙醇等影响氧化还原反应的物质，也不宜添加Tween、Triton和NP-40等去垢剂。 测定时需可以测定A593的酶标仪一台(测585-605nm也可以)或可以测定微量样品的分光光度计一台。 TPTZ对人体有刺激性，请注意适当防护。 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

抗氧化实验方法

1还原力的测定 样品2ml加到2ml 0.2mol/L磷酸盐缓冲液（pH6.6）和2ml 1%的铁氰化钾溶液的混合液中。混合物在50℃保温20min，然后在反应混合物中加入2ml 10%的TCA，混合后以3000rpm 离心10min，取上清液2ml与2ml蒸馏水以及0.4ml 0.1%氯化铁在反应试管中反应，10min 后测定其在700nm处的吸光值。吸光值越大表明还原力越强。 注意：建议蛋白浓度以5mg/ml左右变化，例如2.5，5之类变化。但具体情况应根据吸光值大小而定。 0.2mol/L pH6.6的磷酸盐缓冲液的配制见附表。 铁氰化钾溶液应盛装在棕色瓶中。 比色皿的用法：可见光(>400nm)用玻璃比色皿（即没有标字母或者标G的比色皿），紫外光时（<400nm）用石英比色皿（即标Q字比色皿）。 2 DPPH自由基清除活性的测定 将1.5ml样品液添加到1.5ml含0.1 mmol/L DPPH的95％乙醇中，混合，振荡，在 室温下放置30min，然后在波长517nm处检测（Ai）。清除率计算公式为： 空白为1.5 ml 95%的乙醇加入1.5 ml蒸馏水调零。 式中：Ac——对照为1.5 ml DPPH溶液加上1.5 ml蒸馏水在517nm处的吸光值；Aj——1.5ml样品液加上1.5 ml 95%的乙醇在517nm处的吸光值； Ai——1.5ml样品液加上1.5 ml DPPH溶液在517nm处的吸光值； 注意：建议酶解液蛋白浓度以2mg/ml 左右变化，如0.5,1,2,2.5之类变化，但是具体情况应视清除率而定，最终结果应有清除率大于50%和小于50%的情况。 DPPH样品有毒，需戴口罩和手套进行操作。而且DPPH试剂很昂贵，用时注意节约。0.1m mol/L DPPH 乙醇溶液的配制：准确称取0.00395gDPPH，用95%的乙醇溶液溶解并定容到100ml。 3 在卵黄磷脂体系中抗氧化能力的测定 以卵黄脂蛋白为底物的LPO模型反应体系包括:体积比为1:25稀释的卵黄悬液(卵黄用等体积的pH7.45，0.lmol/LPBS配成，使用前磁力搅拌10min)0.2 mL、一定浓度的样品溶液0.lmL、25m moll/LFeSO4溶液0.2mL，用PBS缓冲液补足至2.0mL。对照管除不加样液外其他试剂同前。将上述2种试管同时置37℃恒温水浴锅中保温培养1h。取出后，加入20%TCA0.5mL，静置10 min后，与对照管于3500r/min离心10min，取2.0mL上清液，分别加入质量分数为0.8%硫代巴比妥酸(TBA)溶液1.0mL，加塞于100℃水浴15min，取出冷却。空白管以2.0mLPBS溶液代替，在532nm下测定吸光度，样品对卵黄脂蛋白LPO的抑制率表示为: SA(%)=(Ac一AS)/A C×100 式中:Ac一不加样品的吸光度 As一加入样品的吸光度 注意：卵黄溶液不用时应放置冰箱保存。 酶解液蛋白浓度以5mg/ml左右调整，但具体应视清除率大小而定，对酶解液蛋白浓度

防污涂层的纳米微结构制备与防污性能研究

防污涂层的纳米微结构制备与防污性能研究 国防科学技术大学 硕士学位论文 姓名：田小洲 申请学位级别：硕士 专业：应用化学 指导教师：王建方 2010-11 国防科学技术大学研究生院硕士学位论文 摘要 随着全球环保呼声的日益高涨，开发新型无毒、安全高效的防污涂料已迫在眉睫。本文的研究受到自然界生物防污方式的启发，模仿荷叶表面，在制备低表面能聚合物的同时，重点研究表面微结构的构建及其对防污性能的影响。 本文首先通过原位聚合法制备了与纳米粒子结合良好的有机氟 改性聚丙烯酸酯NP-FPA，并与异氰酸根封端的有机硅改性聚氨酯SPU 交联，在涂膜交联的同时，自动形成表面微结构。分别采用FT-IR，GPC和旋转粘度计对两组分进行了结构、分子量以及粘度的分析表征。精确测定了NP-FPA中的羟基含量和SPU中的异氰酸根含量。在此基础上，选择NCO : OH（当量比）=1.10 : 1将SPU与NP-FPA混合，通 过交联反应得到了兼具有机硅和有机氟优点的新型聚合物，并对其进

行了结构表征。 其次，重点研究了表面微结构设计、构建和表征。采用不同的纳米粒子如SiO2、Fe3O4、TiO2等，和不同的比例1%~7%在低表面能涂层表面构建表面微结构，研究了纳米粒子的加入种类和比例对表面微结构的影响；采用化学腐蚀法在铜基片表面形成了微结构，对其进行低表面能修饰同样得到了具有微结构的低表面能涂层，用以对比考察表面微结构对防污性能的影响。为了使纳米粒子在涂层中具有较好的分散性，分别利用硅烷偶联剂和表面活性剂对纳米粒子进行了表面改性，并对改性效果进行了粒径和表面形貌观察。通过改变纳米粒子种类和添加量对微结构进行调控，利用SEM和AFM对构建的微结构进行表面形貌观察，结果发现纳米粒子种类和添加量都对微结构有很大影响。 最后，对制备的具有微结构的低表面能防污涂层进行了性能研究。以与水的接触角和与模拟胶的剥离强度为考察指标，采用正交实验的方法筛选出了最优化的纳米粒子种类和添加量：添加量为5%的纳米Fe3O4复合涂层具有最优的防污性能，与水接触角最大达121°，剥离强度最小为6.0 N/m。并对添加Fe3O4纳米粒子的复合涂层进行了常规力学性能的研究，结果表明制备的含Fe3O4纳米粒子的防污涂层各项指标均达到或高于国家标准。 本文的研究结果表明，在低表面能聚合物基础上，表面的微结构可以显著改变其疏水性，进而影响到防污性能，本文的接触角试验和模拟胶剥离试验以及铜片腐蚀构造的微结构表面对比试验等证实了

ORAC法测定虾青素抗氧化能力实验

ORAC法测定虾青素抗氧化能力实验 1.实验目的 1.1 了解多功能酶标仪的应用范围和基本结构及其操作方法 1.2 掌握ORAC法测定虾青素抗氧化能力实验原理 2 实验原理： 2.1 仪器基本原理 酶标仪实际上就是一台变相的专用光电比色计或分光光度计。光源灯发出的光波经过滤光片或单色器变成一束单色光，进入塑料微孔极中的待测标本，该单色光一部分被标本吸收，另一部分则透过标本照射到光电检测器上。光电检测器将透射过待测标本后强弱不同的光信号转换成相应的电信号，电信号经前置放大、对数放大、模数转换等处理后，送入微处理器进行数据处理，转换成相应的浓度，最后由显示器和打印机输出结果。 2.2 ORAC实验原理 ORAC是氧自由基吸收能力（oxygen radical absorbance capacity）的缩写，也被称为抗氧化能力指数，ORAC分析法中的自由基主要来源于偶氮化合物2，2'-偶氮-双-（2-脒基丙烷）氯化二氢[2，2'-azobis（2-amidinopropane）dihydrochloride，AAPH]热分解产生的过氧化氢自由基，也可以是芬顿( Fenton) 反应过程中产生的羟自由基，以荧光素钠（sodium flourescein，FL）为荧光探针，观察自由基与荧光探针作用后，探针荧光强度的衰退过程，以水溶性维生素E类似物( 6-hydro-2，5，7，8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid，Trolox) 作为抗氧化标准物质，检测体系中各种抗氧化剂延缓探针荧光强度衰退的能力，以此评价抗氧化剂的抗氧化能力。 3 仪器及试剂 3.1 仪器及配件 Enspire 多功能酶标仪，96孔荧光板 3.2 试剂 3.2.1 磷酸盐缓冲液的制备：精密量取适量磷酸，以高纯水稀释得到75 mmol/L 磷酸溶液；称取8.56 g磷酸氢二钾以高纯水500mL溶解，以磷酸溶液调pH 7.4，即得75 mmol/L pH 7.4的磷酸盐缓冲液。 3.2.2 AAPH溶液的制备：精密称取AAPH 207mg，以磷酸盐缓冲液溶解并定容至5 mL量瓶，即得浓度为153 mmol/L的AAPH溶液。 3.2.3 FL溶液的制备：精密称取FL 40 mg，以磷酸盐缓冲液溶解，制成4125 mmol/L的FL 溶液，记为FL母液a。精密吸取FL母液a 50uL置50 mL量瓶中，以上述缓冲液定容至刻度，记为FL母液b；FL母液a，b均于4℃冷藏。实验时精密吸取FL母液b500uL置25 mL 量瓶中，以上述缓冲液定容至刻度，即得8*10-5mmol/L的稀释液。 3.2.4 样品溶液的制备：精密称取虾青素样品适量，以甲醇溶解，配制成1mg/mL的化合物母液，继而以缓冲液稀释制成10，50，100ug/mL的化合物溶液。 4 实验内容 4.1 样品量效曲线的确定：精密吸取FL稀释液100uL于96孔荧光板中，随后加入不同浓度样品溶液50uL振荡5 min，37℃温育10min后迅速加入AAPH液50uL启动反应。以激发波长485 nm，发射波长535 nm进行测定并记录荧光值，反应过程中每隔1.5min测定一次荧光值（记为Fn）。以测定时间为横坐标，荧光值为纵坐标绘制不同浓度虾青素荧光衰变曲线。

抗氧化功能评价方法

附件1： 抗氧化功能评价方法 试验项目、试验原则及结果判定 Items, Principles and Result Assessment 1 试验项目 1.1 动物实验 1.1.1 体重 1.1.2 脂质氧化产物：丙二醛或血清8-表氢氧异前列腺素（8-Isoprostane） 1.1.3 蛋白质氧化产物：蛋白质羰基 1.1.4 抗氧化酶：超氧化物歧化酶或谷胱甘肽过氧化物酶 1.1.5 抗氧化物质：还原性谷胱甘肽 1.2 人体试食试验 1.2.1 脂质氧化产物：丙二醛或血清8-表氢氧异前列腺素（8-Isoprostane） 1.2.2 超氧化物歧化酶 1.2.3 谷胱甘肽过氧化物酶 2 试验原则 2.1 动物实验和人体试食试验所列的指标均为必测项目。 2.2 脂质氧化产物指标中丙二醛和血清8-表氢氧异前列腺素任选其一进行指标测定，动物实验抗氧化酶指标中超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶任选其一进行指标测定。 2.3 氧化损伤模型动物和老龄动物任选其一进行生化指标测定。 2.4 在进行人体试食试验时，应对受试样品的食用安全性作进一步的观察。 3 结果判定 3.1 动物实验：脂质氧化产物、蛋白质氧化产物、抗氧化酶、抗氧化物质四项指标中三项阳性，可判定该受试样品抗氧化功能动物实验结果阳性。 3.2 人体试食试验：脂质氧化产物、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶三项指标中二项阳性，且对机体健康无影响，可判定该受试样品具有抗氧化功能的作用。

抗氧化功能检验方法 Method for the Assessment of Antioxidative Function 1 动物实验 1.1 实验动物 选用10月龄以上老龄大鼠或8月龄以上老龄小鼠，也可用氧化损伤模型鼠。单一性别，小鼠每组10－15只，大鼠8－12只。 1.2 剂量分组及受试样品给予时间 实验设三个剂量组和一个溶剂对照组，以人体推荐量的10倍（小鼠）或5倍（大鼠）为其中的一个剂量组，另设两个剂量组，高剂量一般不超过30倍，必要时设阳性对照组、空白对照组。受试样品给予时间30天，必要时可延长至45天。 1.3 实验方法 1.3.1 老龄动物 选用10月龄以上大鼠或8月龄以上小鼠，按血中MDA水平分组，随机分为1个溶剂对照组和3个受试样品剂量组。3个剂量组给予不同浓度受试样品，对照组给予同体积溶剂，实验结束时处死动物测脂质氧化产物含量、蛋白质羰基含量、还原性谷胱甘肽含量、抗氧化酶活力。 1.3.2 D－半乳糖氧化损伤模型 1.3. 2.1原理 D-半乳糖供给过量，超常产生活性氧，打破了受控于遗传模式的活性氧产生与消除的平衡状态，引起过氧化效应。 1.3. 2.2造模方法 选25-30g健康成年小鼠，除空白对照组外，其余动物用D-半乳糖40mg－1.2g/kg BW 颈背部皮下注射或腹腔注射造模，注射量为0.1mL/10g，每日1次，连续造模6周，取血测MDA，按MDA水平分组。随机分为1个模型对照组和3个受试样品剂量组，3个剂量组经口给予不同浓度受试样品，模型对照组给予同体积溶剂，在给受试样品的同时，模型对照组和各剂量组继续给予相同剂量D-半乳糖颈背部皮下或腹腔注射，实验结束处死动物测脂质氧化产物含量、蛋白质羰基含量、还原性谷胱甘肽含量、抗氧化酶活力。 1.3.3 乙醇氧化损伤模型 1.3.3.1原理

纺织品 防污性能的检测和评价 第1部分：耐沾污性(标准状态：现行)

I C S59.080.30 W04 中华人民共和国国家标准 G B/T30159.1 2013 纺织品防污性能的检测和评价 第1部分:耐沾污性 T e x t i l e s T e s t i n g a n d e v a l u a t i o n f o r a n t i-s o i l p r o p e r t i e s P a r t1:S t a i n r e s i s t a n c e 2013-12-17发布2014-10-15实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局

前言 G B/T30159‘纺织品防污性能的检测和评价“包括以下2个部分: 第1部分:耐沾污性; 第2部分:易去污性三 本部分为G B/T30159的第1部分三 本部分按照G B/T1.1 2009给出的规则起草三 本部分由中国纺织工业联合会提出三 本部分由全国纺织品标准化技术委员会基础标准分技术委员会(S A C/T C209/S C1)归口三 本标准主要起草单位:中纺标(北京)检验认证中心有限公司二国家纺织制品质量监督检验中心二雅戈尔集团股份有限公司三 本部分标准主要起草人:斯颖二刘飞飞二徐路三

纺织品防污性能的检测和评价 第1部分:耐沾污性 1范围 G B/T30159的本部分规定两种测定纺织品耐沾污性的试验方法,即液态沾污法和固态沾污法,并给出了耐沾污性的评价指标三 本部分适用于各类纺织织物及其制品三根据产品种类和用途,可选择一种或两种方法三使用不同的污物和方法所得试验结果不具可比性三 本部分不适用于膜结构用涂层织物三试样与固态污物的颜色相近时,不宜采用固态沾污法评价三2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的三凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件三凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件三 G B/T250纺织品色牢度试验评定变色用灰色样卡 G B1534 2003花生油 G B/T4802.3 2008纺织品织物起毛起球性能的测定第3部分:起球箱法 G B/T6529纺织品调湿和试验用标准大气 G B/T7044 2003色素炭黑 G B/T8629 2001纺织品试验用家庭洗涤和干燥程序 G B18186 2000酿造酱油 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件三 3.1 防污性能a n t i-s o i l p r o p e r t i e s 材料抵抗沾污的性能,即材料具有不易沾附污物,或即使沾污也易去除的性能,以耐沾污性和易去污性表征三 3.2 耐沾污性s t a i n r e s i s t a n c e 材料与液态或固态污物接触后,不易沾附污物的性能三 4原理 在纺织试样表面施加一定量的液态或固态污物,根据污物对试样的沾附程度来评价试样的耐沾污性三 液态沾污法是将规定的液态污物滴加在水平放置的试样表面,观察液滴在试样表面的润湿二芯吸和接触角的情况,评定试样耐液态污物的沾污程度三

抗氧化活性测定方法的比较

抗氧化活性测定方法的比较 人体衰老和多种疾病均与自由基有关，寻找天然抗氧化剂具有重要意义。黄酮、多糖、多肽、酚类等生物活性成分均具有抗氧化活性，抗氧化活性的筛选方法可分为体外和体内2种测试体系。 体外：抗氧化活性可以用在特定条件下，样品对检测体系中自由基的清除能力、抗油脂过氧化能力及样品的还原能力、总抗氧化能力等来衡量和表征。常用的方法有羟基自由基（·OH）清除能力法、1,1-二苯基苦基苯肼（DPPH法）、2,2-联氮基-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨盐（ABTS 法）、超氧阴离子自由基法（O2-·）、邻苯三酚自氧化法、β-胡萝卜素漂白法、硫代巴比妥酸法、铁离子还原能力测定（FRAP法）、总酚测定法、ORAC法等方法。体内：主要有DNA氧化损伤法、蛋白质氧化损伤法、线粒体氧化损伤法。 其中DPPH法和ABTS法操作较简单便捷，不需要特殊的检测设备，只在需固定时间下记下其紫外分光光度测量值后计算其自由基清除率，缺点是不同物质具有组成和结构的差异，与DPPH·、ABTS+·的反应速率不同，反应到达平衡的时间不同，将反应时间固定在某一值时，可能对抗氧化剂的抗氧化性评价带来错误的判断，且DPPH自由基会和其他自由基发生反应。邻苯三酚自氧化法缺点是检测波长、缓冲液的组成及ｐＨ值、邻苯三酚浓度等关键测定条件存在

着较大差异。β-胡萝卜素漂白法的缺点是β-胡萝卜素本身有抗氧化活性，对样品活性的测定结果有影响。FRAP法主要用于食品业，优点是简单易操作、可以重复，缺点是无法测定硫醇化合物的还原能力。ORAC法是国际上通用的评价食品氧化的标准方法，缺点是仪器成分较复杂，检测成本较高。 目前普遍使用的体外抗氧化活性指标一般都采用分光光度法，使用分光光度计测量各种颜色成分含量的变化。分光光度法操作较简单、便捷，不需要特殊的检测设备，只在需固定时间下记下其紫外-可见分光光度测量值后计算其活性大小，具有成本低、效率高、样品量少等优点。分光光度法缺点是会受到样本自身颜色和浑浊度的影响和限制，颜色深的样品测得的数据误差大，甚至得到错误的结果；不同物质组成和结构存在差异，与各种自由基的反应速率不同，反应到达平衡的时间不同，将反应时间固定在某一值时，可能对抗氧化剂的抗氧化性评价带来错误的判断。外界环境因素对实验结果也存在一定程度的影响，有些抗氧化活性实验在冬天低温时不易成功，测得的数据往往没有规律。 我觉得在测定样品的抗氧化活性时，各种方法都有自己的优缺点，要根据需测物质来决定用什么方法，比如DPPH 法的自由基选择性强，不和只有一个羟基的芳香酸、无羟基的类黄酮反应，这类物质需用其他方法测定。若对检测结果

保健功能评价方法功能评价方法

附件8： 减肥功能评价方法 试验项目、试验原则及结果判定 Items, Principles and Result Assessment 1 试验项目 1.1 动物实验 1.1.1 体重、体重增重 1.1.2 摄食量、摄入总热量 1.1.3 体内脂肪重量（睾丸周围脂肪垫、肾周围脂肪垫） 1.1.4 脂/体比 1.2 人体试食试验 1.2.1 体重 1.2.2 腰围、臀围 1.2.3 体内脂肪含量 2 试验原则 2.1 动物实验和人体试食试验所列指标均为必做项目。 2.2 动物实验中大鼠肥胖模型法和预防大鼠肥胖模型法任选其一。 2.3 减少体内多余脂肪，不单纯以减轻体重为目标。 2.4 引起腹泻或抑制食欲的受试样品不能作为减肥功能食品。 2.5 每日营养素摄入量应基本保证机体正常生命活动的需要。 2.6 对机体健康无明显损害。 2.7 实验前应对同批受试样品进行违禁药物的检测。 2.8 以各种营养素为主要成分替代主食的减肥功能受试样品可以不进行动物实验，仅进行人体试食试验。 2.9 不替代主食的减肥功能试验，应对试食前后的受试者膳食和运动状况进行观察。 2.10 替代主食的减肥功能试验，除开展不替代主食的设计指标外，还应设立身体活动、情绪、工作能力等测量表格，排除服用受试样品后无相应的负面影响产生。结合替代主食的受试样品配方，对每日膳食进行营养学评估。 2.11 在进行人体试食试验时，应对受试样品的食用安全性作进一步的观察。 3 结果判定 3.1 动物实验： 实验组的体重或体重增重低于模型对照组，体内脂肪重量或脂/体比低于模型对照组，差异有显著性，摄食量不显著低于模型对照组，可判定该受试样品动物减肥功能实验结果阳性。

抗氧化剂抗氧化活性的测定方法

1.抗氧化剂是指在低浓度下能有效延缓或阻止底物氧化的物质。被氧化的底物包括蛋白质、脂质、糖和DNA。 2.初始型抗氧化剂(AH)可通过与脂质自由基L.、过氧自由基LOO.或烷氧自由基LO.反应抑制脂质氧化链反应。 L.+ AH--- LH + A. LOO.+ AH--- LOOH + A. LO.+ AH--- LOH + A. 抗氧化剂自由基A.也能与过氧自由基、烷氧自由基反应从而终止脂质氧化反应。 LOO.+ A.---LOOA LO.+ A.---LOA 次级型抗氧化剂可通过各种机理延缓脂质氧化,如螯合过渡金属、给初始型抗氧化剂补充氢、清除氧以及使活性物质失活等。 抗氧化剂的活性分为在生物体外(如食品中)的活性和在生物体内的活性。本文综述了体外测定抗氧化剂抗氧化活性的方法,不包括在生物体中测定生物活性的方法。 3.评价或表征抗氧化活性的方法为了说明在特定条件下被测物抑制底物氧化的效力或清除自由基的能力 实际测定时至少要说明在测试条件下被测物是抗氧化剂还是促氧化剂;在指定浓度下比较不同测试材料(如被测物与标准抗氧化剂或添加有被测物的测试体系与空白体系)对底物的作用。 评价或表征抗氧化活性的方法有: (1)在指定的时间测量氧化产物或官能团的浓度或吸光度值;( 2)测量反应的速率;

( 3)测量诱导期(延滞期)或氧化达到一定程度所需的时间;( 4)测量速度的积分(即动力学曲线下的面积) ; ( 5)测量被测物产生与标准抗氧化剂相当作用的浓度。4.参数 4.1诱导期( induction period) 诱导期tIND(也叫延滞期, lag period)常定义为化学反应的速度。诱导期是一个相当不确定的值,受检测方法、使用仪器的灵敏性以及一些其他因素的影响。对于脂质氧化,诱导期通常是指链增长阶段动力学曲线的切线和时间轴的交点。 4.2抑制率( percentag e of inhibition)和IC50 抑制率和IC50 (抗氧化剂提供50%抑制作用时的浓度,也可用EC50表示的)常用来表征抗氧化能力。它们不仅与被测抗氧化剂的反应性能和氧化的底物有关,而且受其他因素的影响,如脂质氧化链反应的长度和抑制速率等。此外,用IC50表征抗氧化剂 的活性与比较活性的时间点有关。只有在其他参数相同的情况下,在某一研究中测得的抑制率和IC50才可以与另一研究中测得的值进行直接比较。TEC50是指抗氧化剂提供50%抑制作用所需的时间,也常用来表征抗氧化活性 5.对测定方法的要求 测定抗氧化剂抗氧化活性的方法应满足如下要 求: ( 1)能说明测试体系中发生的反应,并能用明确的动力学图解描述;( 2)测试要有再现性; ( 3)测试效率要足够高; ( 4)方法要相对简单; ( 5)能连续检测; ( 6)应使用与体内或食品有关的活性自由基;

定量分析方法 重点整理

1、公共管理：是一门研究公共组织尤其是政府组织的管理活动及其规律的学科。公共管理研究的内容：①公共组织的结构、功能、环境和运行机制；②行政管理体制改革、中央与地方的关系；③市场经济条件下政府的职能与作用、政府与市场、政府与企业、政府与社会的关系；④公共人力资源的开发与利用；⑤公共管理中的规划、计划与决策、监督与控制，公共项目评估，行政立法、司法和执法；⑥公共信息管理和咨询服务；⑦财政管理、教育管理、科技管理和文化管理。 2、定量分析方法的主要内容 系统模型与系统分析、线性回归预测分析、社会调查程序与方法、统计分析方法、线性回归预测分析、马尔可夫预测方法、投入产出分析方法、最优化方法（线性规划、运输问题、动态规划、资源分配问题）、评价分析方法、层次分析法、对策论、风险型决策与多目标决策、管理系统模拟、排队论、系统动力学方法、网络计划方法 3、为什么在系统分析中广泛使用系统模型而不是真实系统进行分析？人类认识和改造客观世界的研究方法，一般有实验法和模型法。实验法是通过对客观事物本身直接进行科学实验来进行研究的，因此局限性比较大。公共管理问题大多是难以通过实验法直接进行研究，广泛使用系统模型还基于以下五个方面的考虑：①系统开发的需要只能通过建造模型来对系统或体制的性能进行预测；②经济上的考虑对复杂的社会经济系统直接进行实验，成本十分昂贵；③安全性、稳定性上的考虑对有些问题通过直接实验进行分析，往往缺乏安全性和稳定性，甚至根本不允许；④时间上的考虑使用系统模型很快就可得到分析结果；⑤系统模型容易操作，分析结果易于理解 4、系统分析的要点和步骤 要点(1)任务的对象是什么?即要干什么(what)；(2)这个任务何以需要?即为什么这样干(why)；(3)它在什么时候和什么样的情况下使用?即何时干(when)；(4)使用的场所在哪里?即在何处干(where)；(5)是以谁为对象的系统?即谁来干(who)；(6)怎样才能解决问题?即如何干(how)。步骤(1)明确问题与确定目标。当一个有待研究分析的问题确定以后，首先要对问题进行系统的合乎逻辑的阐述，其目的在于确定目标，说明问题的重点与范围，以便进行分析研究。(2)搜集资料，探索可行方案。在问题明确以后，就要拟定解决问题的大纲和决定分析方法，然后依据已搜集的有关资料找出其中的相互关系，寻求解决问题的各种可行方案。(3)建立模型。为便于对各种可行方案进行分析，应建立各种模型，借助模型预测每一方案可能产生的结果，并根据其结果定性或定量分析各方案的优劣与价值。(4)综合评价。利用模型和其他资料所获得的结果，对各种方案进行定性与定量相结合的综合分析，显示出每一种方案的利弊得失和效益成本，同时考虑到各种有关因素，如政治、经济、军事、科技、环境等，以获得对所有可行方案的综合评价和结论。（5）检验与核实。 5、简述霍尔三维结构与切克兰德“调查学习”模式之间的区别。 1）霍尔三维结构将系统的整个管理过程分为前后紧密相连的六个阶段和七个步骤，并同时考虑到为完成这些阶段和步骤的工作所需的各种专业管理知识。三维结构由时间维、逻辑维、知识维组成。霍尔三维结构适用于良结构系统，即偏重工程、机理明显的物理型的硬系统。2）切克兰德“调查学习”模式的核心不是寻求“最优化”，而是“调查、比较”或者说是“学习”，从模型和现状比较中，学习改善现存系统的途径，其目的是求得可行的满意解。适用于不良结构系统，偏重社会、机理尚不清楚的生物型的软系统。3）处理对象不同：前者为技术系统、人造系统，后者为有人参与的系统；4）处理的问题不同：前者为明确、良结构，后者为不明确，不良结构；5）处理的方法不同：前者为定量模型，定量方法，后者采用概念模型，定性方法；6）价值观不同：前者为一元的，要求优化，有明确的好结果（系统）出现，后者为多元的，满意解，系统有好的变化或者从中学到了某些东西。 6、定性分析的方法：目标--手段分析法、因果分析法、KJ 分析法 7、社会调查的含义：是人们有意识、有目的地通过对社会现象的考察、了解和分析，来认识社会生活的本质机器发展规律的实践活动和认识活动。 基本原则①客观性原则，核心是实事求是，这是社会调查的立足点和出发点；②实证性原则，要求社会调查的结论以及与此相关的各种观点，都必须有真实、可靠的疏忽和资料做支持；③系统性原则，要求对社会现象要进行系统、综合的分析和研究。 8、预测分析的一般步骤①明确预测目标；②收集、整理资料和数据；③建立预测模型；④模型参数估计；⑤模型

缓解视疲劳功能评价方法-中国保健协会

缓解视疲劳功能评价方法 （征求意见稿） 保健食品评价试验项目、试验原则及结果判定 Items, Principles and Result Assessment 缓解视疲劳功能 1 人体试食试验项目 1.1 分别于试食前后进行眼部症状及眼底检查，血、尿常规检查，肝、肾功能检查，症状询问、用眼情况调查；于试验前进行一次胸透、心电图、腹部B超检查；。 1.2 明视持久度 1.3 视力 2 试验原则 2.1 受试样品试食时间为60d。 2.2 所列指标均为必做项目。 2.3 在进行人体试食试验时，应对受试样品的食用安全性作进一步的观察。 3 结果判定 3.1试验组自身比较或试验组与对照组组间比较，症状改善且症状总积分差异有显著性（p<0.05）。 3.2试验组自身比较或试验组与对照组组间比较，明视持久度差异有显著性（p<0.05），且平均明视持久度提高大于等于10%。 具备3.1及3.2可判定该受试物具有缓解视疲劳功能。

缓解视疲劳功能检验方法 Method for the Assessment of Alleviating Eye Fatigue Function 1受试者纳入标准 1.1 18岁~65岁的成人。 1.2长期用眼，视力易疲劳者。 2受试者排除标准 2.1患有感染性、外伤性眼部疾患者。进行眼部手术不足3个月者。 2.2患有角膜、晶体、玻璃体、眼底病变等内外眼疾患者。 2.3患有心血管、脑血管、肝、肾、造血系统等疾病者。 2.4妊娠或哺乳期妇女、过敏体质患者。 2.5 短期内服用与受试功能有关的物品，影响到对结果的判定者。 2.6.长期服用有关治疗视力的药物，保健品或使用其他治疗方法未能终止者。 2.7不符合纳入标准，未按规定食用受试物者，或资料不全等影响功效或安全性判断者。 3 试验设计及分组要求 采用自身和组间两种对照设计。根据随机、双盲的要求进行分组，分组时根据症状及视力检查情况，使试食组和对照组的症状及视力水平均衡。同时要考虑年龄、性别等因素，使两组具有可比性。试食试验结束时每组受试者人数不少于50例。 4 受试物的剂量和使用方法 试食组按推荐方法和推荐量服用受试物，对照组服用安慰剂。受试物服用时间为连续60天。 5 观察指标 5.1 安全性指标： 5.1.1血、尿常规检查，体格检查。 5.1.2肝、肾功能检查。 5.1.3 胸透或X光片、心电图、腹部B超检查（于试食前检查一次）。 5.2 功效性指标：于试食开始及结束时检查。 5.2.1问卷调查：症状询问、用眼情况。 5.2.2眼科检查：包括眼底检查、视力检查（近视、远视、散光等）。 5.2.3明视持久度（测定方法见附录）。 6功效判定标准 6.1症状改善有效率：眼酸痛、眼胀、畏光、视物模糊、眼干涩、异物感、流泪，全身不适8种症状中有3种改善，且其他症状无恶化即判定症状改善。计算两组症状改善例数和两组症状改善有效率。症状改善有效率（%）计算方法为症状改善例数/试食例数×100。将两组症状改善有效率进行统计学检验。 6.2症状平均积分：计算每位试食者试食前后的症状积分，分别计算两组的平均积分值，并进行统计学检验。

抗氧化活性测定方法

抗氧化方法 一、Determination of Superoxide Anion Scavenging Ability（超氧阴离子清除能 力） 1、determined by a CL method in the pyrogallol-luminol system on a BPCL Ultra-weak luminescence analyzer。（焦性没食子酸-发光胺，荧光检 测） 2、步骤：10μL sample (不同浓度) + 50 μL焦棓酸(6.25*10-4 mol/L) + 0.94 mL of a mixture containing luminol (0.05 mol/L) and carbonate buffer (pH 10.2) （发光胺用pH 10.2碳酸盐缓冲液配成0.05 mol/L） 3、Hi-V, 800; Kv, -1; the spectral range of CL（波长范围）180-800 nm; 温 度：30 ° C.总时间：300S，每2S读数一次。 4、对照：不加样品（样品用水代替）。空白不加焦棓酸（用来调零）。 二、Determination of Scavenging Ability on Hydroxide Radicals（羟基自由基清除能力） 1、CuSO4-Phen-Vc-H2O2 CL system（1 mL体系） 2、50 μL of sample solution （样品液）+ 50 μL of a 1.0 mmol/L CuSO4 solution （CuSO4 溶液）+ 50 μL of a 1 mmol/L 1,10-phenanthroline solution（邻二氮菲溶液）+ 700 μL of a 0.05mol/L borate buffer (pH 9.0) （硼酸缓冲液）+ 100 μL of a 1 mmol/L ascorbate solution + 50 μL of a 0.15% H2O2 solution 3、总时间400S，间隔3S。Hi-V, 800; Kv, -1; the spectral range of CL（波长范围）180-800 nm; 温度：30 ° C. 4、阳性对照：不加样品（样品用水代替）。空白不加H2O2（用来调零）。 三、Determination of Scavenging Effect on Hydrogen Peroxide（过氧化氢清除 能力） 1、luminol-H2O2 system

定量测定方法的不精密度性能评估

定量测量方法的不精密度性能评估方案 1.适用范围 参照EP5A2（Evaluation of Precision Performance of Quantitative Measurement Methods; Approved Guideline —Second Edition ），本方案给出了本次临床验证对定量测量方法的精密度性能进行系统评估的方法。 2.实验操作 2.1.质控血清样品的制备 复溶两个浓度水平的质控血清，血清量足够实验评价用。分装于1ml Eppendorf 管里，-20℃贮存。每次实验前1小时取出，置于室温，待其融化。反复倒置Eppendorf 管后，将质控血清吸出，加入到样品杯中，进行测定。 2.2.测定系统 测定系统由中生试剂、试剂配套校准品和临床全自动生化分析仪HITACHI 机器，或中生试剂、试剂配套校准品和临床全自动生化分析仪OLYMPUS AU 机器组成。 2.3.系统的质量控制 在正式评价实验之前，使操作人员熟悉方案操作及试剂的操作，整个系统在质量控制内。 2.4.操作 2.4.1.批内不精密度评价的操作 对两个浓度水平血清样品进行测定，连续测定21次。计算测定值的平均值（x ）和标准差（S 批内）。按以下公式计算变异系数(CV 批内)，应CV 批内≤10%。在CV 批内≤10%得到满足的条件下，再进行2.4.2的操作。 %100?=X S CV 批内 批内 2.4.2.室内不精密度评价的操作 选择两个浓度水平的质控血清，每天测定两批（run ），一批平行测定两次(replicate)，持续20天（day ），实验结束时，每个浓度水平，应收集80个数据。进行数据处理，进行以下计算步骤。 3.收集数据 每个浓度水平收集到足够有效数据(至少为80个数据)。除补充由于质控失控而增加的测试外，应在进行数据分析前，检查数据中有无由于偶然差错引起的离群值(outlier)，可用下述剔除值的标准： 从实施段已收集的40对均值的数据计算出总均值和标准差，出现下列任何一种情况都可认为是离群值： 1) 任何一对均值和总均值的差超过4倍标准差； 2) 任何一对中二个结果的绝对差值超过4倍标准差。 离群值不用于精密度的计算。在剔除后应再增加检验次数，以保证至少有40批次，80个数据进行计算。任何一次实验的剔除值不能超过总测量数的2.5%。当超过时，应怀疑是否为方法不稳定或操作者不熟悉所致。此时应不用此次试验数据，重新开始新的试验。 必须保留任何剔除者和室内质控失控的记录。 4.数据处理 收集到符合要求的数据后，按照下面步骤，依次进行计算。

促进消化功能评价与衡量与衡量与衡量方法(征求意见稿子)及修订说明书

附件9： 促进消化功能评价方法（征求意见稿） 保健食品评价试验项目、试验原则及结果判定 Items, Principles and Result Assessment 1 试验项目 1.1 动物实验 1.1.1 体重、体重增重、摄食量和食物利用率 1.1.2 小肠运动实验 1.1.3 消化酶测定 1.2 人体试食试验 1. 2.1 临床症状观察 1. 2.2 胃/肠运动实验 2 试验原则 2.1 动物实验和人体试食试验所列指标均为必做项目。 2.2 在进行人体试食试验时，应对受试样品的食用安全性作进一步的观察。 3 结果判定 3.1 动物实验：动物体重、体重增重、摄食量、食物利用率，小肠运动实验和消化酶测定三方面中任二方面实验结果阳性，可判定该受试样品有助于促进消化功能动物实验结果阳性。 3.2 人体试食试验：临床症状积分结果和胃/肠运动实验结果阳性，可判定该受试样品有助于促进消化功能人体试食试验结果阳性。 3.3动物实验和人体试食试验均为阳性结果，可判断受试样品具有有助于促进消化功能的作用。

促进消化功能检验方法 Method for the Assessment of Facilitating Digestion Function 1 动物实验 1.1 实验原理 胃肠道是营养物质的摄取、消化与吸收的器官，对食物的消化作用主要是依靠其运动、消化酶的分泌来完成的。如果某一保健食品能对这一环节或几环节有调节作用，那它就有可能有促进消化功能的作用。 1.2 实验项目 促进消化功能动物实验包括大鼠体重、体重增重、摄食量和食物利用率实验；小肠运动实验；消化酶的测定等三部分。 1.3 实验动物 根据实验项目可选用单一性别成年小鼠或大鼠。小鼠18g~22g，每组10只~15只，大鼠120g~150g，每组8只~12只。 1.4 剂量分组及受试样品给予时间 实验设三个剂量组和一个阴性对照组，以人体推荐量的10倍（小鼠）或5倍（大鼠）为其中的一个剂量组，另设二个剂量组，必要时设阳性对照组和模型对照组。受试样品给予时间30d（小肠运动实验受试样品给予时间7d~15d），必要时可延长至45d。 1.5 实验容 1.5.1 体重、体重增重、摄食量和食物利用率 选用同一性别的大鼠。实验开始时动物体重的差异应不超过平均体重的10％。分不同剂量实验组和阴性对照组，经口给予受试样品，每周测2次体重和食物摄入量。实验结束时计算体重、体重增重、摄食量和食物利用率。 1.5.2 小肠运动实验 选用同一性别的小鼠，分不同剂量实验组、空白对照组和模型对照组，模型对照组用复方地芬诺酯或洛哌丁胺造模。可用墨汁或炭末加阿拉伯树胶作为指示剂。经口给予受试样品。实验结束前禁食不禁水20h，于测定当天各实验组和空白及模型对照组再给予一次受试样品或蒸馏水，30min后各实验组和模型对照组给予复方地芬诺酯5mg/kgbw ~6mg/kgbw或洛哌丁胺5mg/kgbw ~6mg/kgbw(依据复方地芬诺酯或洛哌丁胺的实用剂量取用，用研钵研碎呈粉末后按实验所需浓度配制，注意要待溶质完全溶解、充分摇匀后使用。)，空白对照组给予蒸馏水，30min后各组再给予指示剂(精确称取阿拉伯树胶100g，加水

植物总抗氧化能力(TAC)比色法(ABTS)定量检测试剂盒

植物总抗氧化能力（TAC）比色法（ABTS）定量检测试剂盒产品说明书（中文版）
主要用途
植物总抗氧化能力 （TAC） 比色法 （ABTS） 定量检测试剂盒是一种旨在通过过硫酸钾的参与， 使染料 ABTS 氧化，在抗氧化剂的存在下，通过分光光度仪，观察其峰值下降的变化，来定量检测对应于标准水溶性生 育酚 Trolox 的总抗氧化能力，即抑制氧化等值浓度的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功 实验证明的。适用于各种体液包括血浆、血清、尿液、脑脊液、唾液、精液等各种体液的总抗氧化能力检 测。产品严格无菌，即到即用，操作简易，性能稳定。b5E2RGbCb5E2RGbC
技术背景
超氧自由基阴离子（superoxide radical；O2-） 、过氧化氢（hydrogen peroxide；H2O2） 、羟自由基或氢氧基 （hydroxyl radical；OH-） 、过氧化基（peroxyl radical；ROO-） 、氢过氧自由基（hydroperoxyl；HOO） 、烷 氧自由基（alcoxyl radical） 、氮氧基（nitric Oxide；NO-） 、过氧亚硝基阴离子（peroxynitrite anion；ONOO-） 次氯酸（hypochlorous acid；HOCl） 、半醌自由基（semiquinone radical） 、单线态氧气（singlet oxygen）等 细胞内活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的产生和增多，将导致细胞衰老或凋亡，甚而导致诸如 冠心病、风湿性关节炎、肿瘤、退行性病变等各种病理状况。在生物系统内，通过抗氧化酶例如超氧化物 歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶等，大分子，例如白蛋白、铜蓝蛋白（ceruloplasmin；CER） 、 铁蛋白（ferritin）和抗氧化因子，例如生育醇、类胡萝卜素、抗坏血酸、还原性谷胱甘肽和尿酸胆红素 （bilirubin）等，产生抗氧化能力，即捕获自由基的能力，达到消除或降低ROS的损害。通过过硫酸钾 （potassium persulfate）氧化2,2’-连氮-双（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸） （2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzthiazoline6-sulfonic acid)，diammonium salt；ABTS）产生的ABTS自由基，衡量体系中抗氧化剂捕获自由基或者消耗 抗氧化剂的能力，在分光光度仪（730nm波长）的帮助下，观察其峰值下降的变化，并与标准化抗氧化剂 水溶性生育酚Trolox对照。p1EanqFDp1EanqFD
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