05-大肠杆菌表达系统的研究进展

药　物　生　物　技　术

大肠杆菌表达系统的研究进展3

戎晶晶1,刁振宇2,周国华1,23

(1.中国药科大学生命科学与技术学院,江苏南京210009;2.华东医学生物技术研究所,江苏南京210002)

摘　要　近年来利用基因调控、融合表达、共表达以及代谢工程、定向进化等策略对大肠杆菌系统的载体和宿主进行了合理的改进,使目的基因的表达水平以及产物蛋白的活性大大提高,尤其是对长期以来有关真核基因在原核细胞中表达所存在的糖基化、二硫键形成等翻译后加工问题的研究取得了突破,使得大肠杆菌表达系统在研究和生产中的应用范围得到进一步拓宽。文章从表达载体和宿主细胞两个方面对大肠杆菌表达系统的研究进展进行了综述。

关键词　大肠杆菌表达系统;表达载体;宿主细胞;重组蛋白

中图分类号:Q93 文献标识码:A 文章编号:100528915(2005)0620416205

自上世纪70年代以来,大肠杆菌一直是基因工程中应用最为广泛的表达系统。尽管基因工程表达系统已经从大肠杆菌扩大到酵母、昆虫、植物及哺乳动物细胞,并且近年来出现了很多新型的真核表达系统,但是大肠杆菌仍然是基因表达的重要工具。尤其是进入后基因组时代以来,有关蛋白结构以及功能研究的开展,对基因表达的要求更高,这时大肠杆菌往往是表达的第一选择。文章综述了近年来有关大肠杆菌表达载体及宿主细胞的改造工作。

1　表达载体

1.1　表达调控

构建有效的表达载体是表达目的基因的基本要求,同时也是影响基因表达水平以及蛋白活性的重要因素。标准的大肠杆菌表达载体的主要组成:启动子、操纵子、核糖体结合位点、翻译起始区、多克隆位点、终止子、复制起点以及抗性筛选因子等。理想的表达载体要求在转录和翻译水平上可以控制目的基因的表达,然而目的基因在宿主体内过分表达(选用较强的启动子等)会对宿主造成压力,引起相关的细胞应答反应,影响蛋白的活性等。基因组、RNA转录组、蛋白质组、代谢调控组等领域的研究成果给我们提供了大量关于基因表达调控的信息[1]。现已能从基因和细胞的整体水平来方便地选择合适的启动子或合理开发新的载体系统。譬如Lee等利用二维凝胶电泳法比较了重组载体和空载体被分别转入宿主细胞后蛋白组学的差异,发现两者都产生了大肠杆菌热休克蛋白并引起了cAMP2CRP调节蛋白的应答,其中重组子的影响更为强烈;另外,还发现外源基因的表达使宿主核糖体合成速率、翻译延长因子和折叠酶表达水平、细胞生长率下降,而使细胞呼吸活力上升[2]。目前应用的表达载体主要问题是表达过程中出现的全或无的情况,通常表达的培养物都是非纯种的细胞群,其中有一些细胞可以最大限度地被诱导,而另一些细胞在诱导后基因的表达被关闭。分离具有合适强度启动子及翻译速率的载体变种可以优化表达水平,说明启动子的选择对于基因的诱导表达非常重要。Deborahat提出在芯片上排列具有不同强度级别启动子的载体进行互补分析,可能有助于筛选最为适合的启动子[3]。开发非IPT G或阿拉伯糖诱导的载体也可以提高基因表达水平,Qing等利用cs pA基因的独特性开发了一系列冷休克表达载体pCold,使目的基因在低温下(<15℃)诱导表达,提高了产物的溶解性和稳定性[4]。

1.2　融合表达载体

除了表达载体的调控性,为了提高蛋白产物的活性以及简化下游纯化的操作等,往往在表达载体上插入其它辅助的基因序列与目的基因构成融合蛋白表达。融合信号肽(PelB、OmpA、Mal E、PhoA等)表达可以使融合蛋白通过经典的Sec途径分泌到周质或胞外表达,有利于形成二硫键以及避免胞质蛋白酶的水解和N端甲硫氨酸的延伸。另外,最近开发的双精氨酸转运体系(Tat)可以有效分泌正确折叠的重组蛋白[5]。常见的纯化标签多根据亲和层析的配体来选择,如62His、GST、CA T、MBP等经过一步亲和纯化可以得到均一性较高的产物,但化学洗脱会对产物的活性产生一定的影响。Ca2+依赖的钙调蛋白结合肽(CBP)

3收稿日期:2005202204　修回日期:2005205224

基金项目:国家自然科学基金资助项目(No.30470454)

作者简介:戎晶晶,1982年生,女,汉族,山西省晋中市人,在读硕士,研究方向:微生物与生化药学　3通讯作者:周国华,Tel:025*********,Fax:025*********,E2mail:ghzhou@https://www.wendangku.net/doc/a73668390.html,

和链球菌亲和素结合肽(SBP)作为纯化标签时,只需要在洗脱液中移去标签依赖的离子或小分子就能实现温和的特异性洗脱[6,7]。再者,应用一些非层析的纯化标签在纯化操作中非常经济实用,如热敏型的类弹性蛋白多肽(EL Ps)可以使蛋白产物在溶解态和非溶解态之间转变,后续应用逆转循环的纯化方法可以达到亲和纯化的回收率[8]。另外,在纯化标签与目的蛋白之间插入一些特殊的短肽,同时融合剪切酶可以在纯化操作中利用标签的自剪切直接得到产物蛋白。例如SrtAc酶所识别的短肽序列GTEPL,在蛋白N端依次连接短肽、剪切酶、62His融合表达,亲和上柱后剪切酶发挥作用使N端带有G ly的目的蛋白从融合状态中释放出来[9]。噬菌体展示库是表达抗体或其它蛋白库的重要克隆技术,与之相似将目的基因同适合的锚定序列融合可以使产物蛋白表达到大肠杆菌的表面。大肠杆菌展示所用的融合配体一般为细菌的膜蛋白或跨膜转运体,如PadL是大肠杆菌长链脂肪酸的一种外膜转运体蛋白,N端融合PadL表达胞内酶,以全细胞的形式催化反应表现出非常高的稳定性[10];Yang等利用恶臭假单胞菌Pseudomonas puti da外膜酯酶EstA的转运结构域作为表达胞内β2内酰胺酶的锚定基序,结果表明蛋白展示在细胞膜外并没有影响细胞的活力[11]。

1.3　共表达载体

很多真核基因表达的产物都必须以多聚复合体的形式组合才能表现出相应的活性,因此在表达这一类目的基因的时候常构建共表达载体,另外共表达的策略在辅助新生蛋白质的折叠和分泌中也很有意义。Dzinenu等针对表达异源二聚体构建了可以同p ET载体共表达的载体pO KD,这种载体含有p15A复制起点,所以可以和大多数大肠杆菌表达载体共存于细胞中[12]。细菌释放素蛋白(BRP)属于细菌中的一类分泌蛋白,共表达目的蛋白与BRP可以促进产物直接释放到培养基中[13]。另外,共表达分子伴侣也是促进蛋白正确折叠的手段。目前对于分子伴侣构成的网络模式还处于探索阶段,研究发现大肠杆菌中常见的分子伴侣Gro EL、Hsp同系物Dna K并非细胞内所有蛋白折叠所必需的,只有同核糖体结合的触发因子协调作用才能促进蛋白的适当折叠[13]。但是,合理选择个别的分子伴侣共表达可以避免产物在细胞内错误的折叠以及沉积。Marco等设计了共表达分子伴侣的3载体系统,其中两种载体分别携带不同的分子伴侣,另外一种载体携带目的基因,分子伴侣与目的基因被分别独立诱导[14]。Cpn60和Cpn10是从嗜冷菌中分离的一类分子伴侣,共表达后可以使大肠杆菌在4℃低温下生长,有利于蛋白的正确折叠[15]。与分子伴侣类似,共表达DsbA或Dsbc等二硫键相关蛋白可以辅助形成正确的二硫键。

1.4　双杂交系统

融合表达和共表达的另一个应用是利用双杂交系统研究蛋白质的相互作用。大肠杆菌双杂交系统也是有3种载体构成,诱饵蛋白融合表达载体、捕获蛋白融合表达载体和报告基因表达载体[16]。以AraC/LexA双杂交系统为例,诱饵载体的启动子选用IPT G诱导的p Trc,诱饵蛋白融合在转录激活因子ArcC的N端表达,带有卡那霉素的抗性基因;捕获载体的启动子选择非IPT G诱导的p Tet,可以在去水四环素的诱导下转录,捕获蛋白融合在L ux A操纵子效应物L uxA的N端,带有氨苄青霉素的抗性基因;报告基因LacZ的启动子选用大肠杆菌的araBAD启动子,其活性依赖于上游的A raC操纵子,同时在启动子下游安置3个定向重复的LexA操纵子半位点,载体带有大观霉素的抗性基因,另外在AraC上游插入4个串联的rrnB终止子,减小转录通读对报告基因活性的背景影响。此3载体共表达系统的特点是诱饵蛋白同捕获蛋白分别独立诱导,可以通过控制诱导物的浓度逐步放大杂交蛋白相互作用对报告基因表达的抑制效应。诱饵蛋白与捕获蛋白分别结合在上游和下游的2个操纵子上,如果二者可以发生杂交作用,则在报告基因的DNA链上形成突环,使AraC 转录激活效应发生逆转,所以通过菌落的蓝白斑差异可以筛选出发生相互作用的蛋白质。

1.5　Univector系统

通常在构建重组子表达时需要依赖限制性内切酶和连接酶的作有,进行亚克隆,而利用同源重组开发的载体可以实现基因的一次性克隆。Univector表达系统(U PS)就是这方面较为成功的实例[16]。Univector系统由两类载体组成(图1):一种称为万能的进入载体pUN1,具有特殊的lox P重组序列,通过重组酶Cre可以方便地穿梭进入表达载体;另一种即表达载体p HOST,同样具有lox P序列, p HOST是由不同的启动子与融合标签组成的载体系列,便于高通量筛选蛋白产物。Univector系统的特点是平行独立克隆到多载体中,使之在不同的诱导条件下表达,大大提高了表达的成功率,尤其在蛋白组的研究中具有很大的应用潜力[3]。

2　宿主细胞

在大肠杆菌细胞内表达目的基因的主要优势:一个是宿主的遗传背景比较清楚,易于控制基因的表达;另一个是大肠杆菌容易培养,可以获得较高产量的目的蛋白。但是在商业应用中很多的蛋白产物是真核基因编码,并且具有高级的三、四级结构,要求翻译后加工为正确的折叠形式或者糖基化蛋白等。由于大肠杆菌细胞的分子环境和折叠机制等与真核细胞具有很大的差异,所以在应用大肠杆菌系统表达真核基因时有必要利用代谢工程或进化的方法改造细胞,解决大肠杆菌表达系统的局限性,提高产物的活性。

2.1　代谢工程

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戎晶晶等:大肠杆菌表达系统的研究进展

Process of t he recombination between t he pUNI entry vector and t he p HOST to form a recombinant expression plasmid.The pUNI plasmid has an origin of replication t hat requires use of a pi r2con2 taining strain of E.coli.The pUNI and p HOST plasmids are mixed wit h Cre2recombinase,incubated,and t he mixture is trans2 formed into a strain of E.coli t hat lacks pi r.Selection for recom2 binant s on kanamycin precludes replication of t he unrecombined p HOST vector,and no unrecombined pUNI plasmids will form via2 ble colonies as using pi r2E.coli strain.

Fig1　Univector system diagram[18]

载体携带目的基因进入宿主表达会给宿主本身造成代谢上的负担,影响细胞的生长速率等,推测可能是因为宿主不能提供足够外源基因表达所需的原料及能量。减轻表达对于宿主的压力可以通过控制质粒的拷贝数或者改变载体的抗性基因,还可以将目的基因直接插入染色体中表达。Flores等则是将磷酸戊糖途径的代谢关键酶—62磷酸葡萄糖脱氢酶的基因克隆到多拷贝质粒中,转化大肠杆菌使细胞的生长速率在诱导后得到恢复[17]。除了利用大肠杆菌的代谢机制改进表达系统,另外还可以人为地在大肠杆菌中设计代谢途径,例如Masip等设计的二硫键合成途径。在大肠杆菌中催化二硫键形成的是周质蛋白Ds2 bA,此蛋白通过膜蛋白DsbB得到循环利用。Masip等选择硫氧化还原蛋白TrxA作为二硫键的供体,使之在氧化态的胞质内形成二硫键,通过融合Tat特异性前导肽从细胞质转运到周质,使重组蛋白在周质获得二硫键。因此这一途径不依赖DsbA2DsbS体系,仅通过胞内的硫氧化还原蛋白就能形成二硫键,所以可以修复缺失DsbA2DsbB体系的宿主[18]。2.2　定向进化

通常重组蛋白对于细胞内的蛋白酶都很敏感,为了避免蛋白酶的作用除了分泌表达外还可以对相关的蛋白酶进行突变,例如筛选缺乏A TP依赖的胞内蛋白酶的菌株,但是对于是否细胞因此而上调其它的蛋白酶浓度还不清楚。另外在周质中的蛋白酶也会降解产物蛋白,DegP蛋白是存在于细胞周质中的主要蛋白酶,所以可以应用deg P 失活的宿主表达蛋白。同时,C端为非极性的蛋白应该在p rc突变的宿主中表达(Prc蛋白酶作用于C端非极性的蛋白),或者以N端融合形式表达[19]。前文已经提到过选择分子伴侣的问题,利用定向进化的方法分离分子伴侣或折叠因子的变异体,可以针对重组蛋白进行高效的特异性折叠。Weissman等对大肠杆菌进行多轮的DNA改组和筛选,分离出的Gro EL突变体提高了对绿色荧光蛋白的折叠效率[20]。另外,定向进化的方法还可以扩大大肠杆菌的遗传密码,在蛋白中添加非天然的氨基酸。决定氨酰t RNA 合酶催化t RNA携带正确氨基酸的因素是不同于氨酰化位点的一个编辑位点。通过对染色体的随机诱变,筛选出一类突变体可以催化t RNA Val结合Ser,并且20%细胞内的Val都被类似于Ser的氨基丁酸取代[21]。Schultz等向大肠杆菌中引入一对特殊的tRNA/氨酰t RNA合酶,掺入对琥珀密码子应答的甲基化酪氨酸,在表达二氢叶酸还原酶的实验中发现,由于非天然氨基酸的存在使基因翻译的保真度达到99%[22]。

2.3　蛋白质的糖基化

很长时间以来,大肠杆菌被认为不能表达糖基化蛋白,因为原核细胞普遍缺乏糖基化功能。而在真核细胞中,大多数分泌蛋白都在翻译后加工过程中获得N端的寡糖链。寡糖(G lc3Man9G lcAc2)被类脂运载体转运到蛋白的N端,由寡糖转运酶催化寡糖与天冬酰氨或丝氨酸/苏氨酸残基形成N连接或O连接。空肠弯曲杆菌(Cam p y2 lobacter jej uni)是目前发现的唯一具有类似真核糖基化代谢功能的原核生物,其基因组中的p gl基因簇编码的蛋白类似于真核细胞中的糖基转移酶。Wacker等将空肠弯曲杆菌的糖基化基因克隆到大肠杆菌中表达,结果p gl编码的蛋白PglB可以指导质粒编码的AcrA蛋白的糖基化。通过对表达产物的分析发现,大肠杆菌与真核细胞表达的糖蛋白在寡糖链组成上没有相似性,但是同样与Asn2Xaa2 Ser/Thr的氨基酸残基结合[23]。Schultz等将进化突变的方法应用于蛋白的翻译后加工中,结果获得了高产率的糖基化的肌红蛋白。他们从甲烷球菌中分离出酪氨酸t RNA 合酶TyrRSs基因,在活性位点进行随机突变,经过几轮阳性和阴性筛选后得到对β2乙酰氨基葡萄糖2丝氨酸具有特异性的TyrRSs。这种氨酰t RNA合酶可以对琥珀密码子TA G应答催化形成tRNA Tyr2β2G lcNAc对;β2G lcNAc的掺入为蛋白的糖基化提供了初级的糖基化位点,可以被糖基

转运酶识别进一步合成复杂的糖链。这种方法也可以应用于其它的翻译后加工中,包括蛋白的甲基化、磷酸化、乙酰化等[24]。

基因的表达过程是一个复杂的过程,涉及基因的转录、翻译、翻译后加工、细胞的代谢以及细胞内基因与蛋白、蛋白与蛋白之间的相互作用。进入后基因时代之后,大肠杆菌首先被选作研究蛋白组学、基因功能、蛋白质网络等新课题的模型,揭示了很多基因表达的未知领域,同时提供了更多发展大肠杆菌表达系统的依据。伴随分子生物学新技术的涌现,大肠杆菌势必在实验研究及工业生产重组蛋白的应用中发挥出更大的作用。

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914

戎晶晶等:大肠杆菌表达系统的研究进展

024药物生物技术第12卷第6期　R esearch Progress on E.coli Expression System

RON G Jing2jing1,DIAO Zhen2yu2,ZHOU Guo2hua1,23

(1.S chool of L i f e S cience and Technolog y,Chi na Pharm aceutical Uni versit y,N anj i ng210009,Chi2 na;2.East2Chi na M edical B iotechnolog y I nstit ute,N anj i ng210002,Chi na)

Abstract　Escherichi a coli exp ression system has been used so widely t hat it co nt ributes much to t he de2 velop ment of molecular biology and in t urn it has been improved wit h t he emerging of novel t heory and technology.Over t hese years,various st rategies including gene regulation,f use exp ression,metabolic engineering and directional evolution have been utilized in E.coli exp ression system to increase t he level of gene expression and t he activity of a recombinant protein.And t he anot her t hing which is wort h con2 cern is t he breakt hrough on t he p roblem of po stt ranslational p rocessing of eukaryotic gene in E.coli such as glyco sylatio n and disulfide bond formation.U ndoubtedly,t hese advances will f urt her enlarge t he application areas of E.coli exp ression system in bot h t he research and t he industrial p roduction.This re2 view is mainly focused on t he modification of expression vectors and ho st cells of E.coli expression sys2 tem bot h from t he aspect s of exp ression vectors and host cells.

K ey w ords　E.coli exp ression system,Exp ression vector,Ho st cell,Recombinant protein

热烈祝贺《药物生物技术》常务副主编王友同教授

荣获中国科技期刊金牛奖

2005年8月中国科技期刊编辑学会常务理事会在京评选出中国科技期刊第

三届优秀编辑奖———“金牛奖”,我刊王友同教授以其在创办编辑《药物生物技术》

十年来取得的优异成绩在全国众多参选者中脱颖而出,荣获“金牛奖”。科技期刊

在科技创新工作中占据重要地位,为发展科技期刊编辑事业,中国科学技术期刊

编辑学会设立了四年评选一次的金牛奖。金牛奖是为连续编龄25年以上,长期

从事科技期刊编辑工作,有卓越成就和突出贡献的优秀编辑而设立,王友同教授

是《药物生物技术》的创办人之一,在科技期刊编辑岗位上工作30多年,长期辛勤

耕耘、默默奉献,是一位兢兢业业的优秀编辑工作者。金牛奖组委会将在北京召

开隆重的金牛奖颁奖大会。

《药物生物技术》编辑部

大肠杆菌的研究与应用

大肠杆菌的研究与应用 中文摘要：大肠埃希氏菌(E.coli)通常称为大肠杆菌，是Escherich在1885年发现的，在相当长的一段时间内，一直被当作正常肠道菌群的组成部分，认为是非致病菌。直到20世纪中叶，才认识到一些特殊血清型的大肠杆菌对人和动物有病原性，尤其对婴儿和幼畜（禽），常引起严重腹泻和败血症。本文通过对大肠杆菌的结构及其致病机理等进行分析描述，以供大家参考学习。 关键词：大肠杆菌；致病性；危害；预防 The English abstract：Escherichia coli (E.c oli) are usually called escherichia coli, Escherich is found in 1885, in a long period of time, has been regarded as the normal bowel flora, that is part of the pathogen. Until the 20th century, realized some special type of escherichia coli serum of people and animals, especially for the infants and young (birds), often cause severe diarrhea and sepsis. Based on the structure and pathogenic escherichia coli mechanism analysis of reference, the study. Keywords：escherichia coli；The pathogenicity；Hazards；prevent 一、结构特征 大肠杆菌是人和许多动物肠道中最主要且数量最多的一种细菌，周身鞭毛，能运动，无芽孢。主要生活在大肠内。能发酵多种糖类产酸、产气，是人和动物肠道中的正常栖居菌，婴儿出生后即随哺乳进入肠道，与人终身相伴，其代谢活动能抑制肠道内分解蛋白质的微生物生长，减少蛋白质分解产物对人体的危害，还能合成维生素b和k，以及有杀菌作用的大肠杆菌素。正常栖居条件下不致病。它侵入人体一些部位时，可引起感染，如腹膜炎、胆囊炎、膀胱炎及腹泻等。人在感染大肠杆菌后的症状为胃痛、呕吐、腹泻和发热。感染可能是致命性的，尤其是对孩子及老人。其主要具有以下一些特征： 1、大肠杆菌是细菌，属于原核生物；具有由肽聚糖组成的细胞壁，只含有核糖体简单的细胞器，没有细胞核有拟核；细胞质中的质粒常用作基因工程中的运载体。 2、大肠杆菌的代谢类型是异养兼性厌氧型。 3、人体与大肠杆菌的关系：在不致病的情况下（正常状况下），可认为是互利共生（一般高中阶段认为是这种关系）；在致病的情况下，可认为是寄生。 4、培养基中加入伊红美蓝遇大肠杆菌，菌落呈深紫色，并有金属光泽，可鉴别大肠杆菌是否存在。 5、大肠杆菌在生物技术中的应用：大肠杆菌作为外源基因表达的宿主，遗传背景清楚，技术操作简单，培养条件简单，大规模发酵经济,倍受遗传工程专家的重视。目前大肠杆菌是应用最广泛，最成功的表达体系，常做高效表达的首选体系。 6、大肠杆菌在生态系统中的地位，假如它生活在大肠内，属于消费者，假如生活在体外则属于分解者。[1]

pET-32b(+)大肠杆菌表达载体说明

pET-32b(+) 编号 载体名称 北京华越洋生物VECT5030 pET--‐32b(+) pET32b载体基本信息 别名: pET32b, p et 32b 质粒类型: 大肠杆菌蛋白表达 表达水平: 高 克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: 5899bp 5' 测序引物: T7或者Trx--‐F 5' 测序引物序列: T7: 5'--‐TAATACGACTCACTATAGGG--‐3'; Trx--‐F: 5' T TCCTCGACGCTAACCTG 3' 载体标签: thioredoxin (N端); H is (中间和C端) 载体抗性: Ampicillin 备注: Production of soluble, active target proteins; N--‐term thrombin cleavage s ite; Nterm e nterokinase c leavage s ite; a,b,c v ary b y M CS 稳定性: 瞬时表达 Transient 组成型: 组成型 Constitutive 病毒/非病毒: 非病毒 pET32b载体质粒图谱和多克隆位点信息

pET32b载体简介 The pET--‐32a--‐c series is designed for cloning and high--‐level expression of peptide sequences fused with the 109aa Trx?Tag? thioredoxin protein (1). Cloning sites are available for producing fusion proteins also containing cleavable His?Tag? and S?Tag? sequences for detection and purification. Unique sites are shown on the circle map. Note that t he s equence i s n umbered b y t he p BR322 c onvention, s o t he T7 e xpression r egion i s reversed on the circle map. The cloning/expression region of the coding strand transcribed by T7 RNA polymerase is shown below. The f1 origin is oriented so that infection with helper phage will produce virions containing single--‐stranded DNA that corresponds to the coding strand. Therefore, single--‐stranded sequencing should be performed u sing t he T7 t erminator p rimer . pET32b载体序列 ORIGIN 1 ATCCGGATAT AGTTCCTCCT TTCAGCAAAA AACCCCTCAA GACCCGTTTA GAGGCCCCAA 61 GGGGTTATGC TAGTTATTGC TCAGCGGTGG CAGCAGCCAA CTCAGCTTCC TTTCGGGCTT 121 TGTTAGCAGC CGGATCTCAG TGGTGGTGGT GGTGGTGCTC GAGTGCGGCC GCAAGCTTGT 181 CGACGGAGCT CGAATTCGGA TCCGATATCG CCATGGCCTT GTCGTCGTCG TCGGTACCCA 241 GATCTGGGCT GTCCATGTGC TGGCGTTCGA ATTTAGCAGC AGCGGTTTCT TTCATACCAG 301 AACCGCGTGG CACCAGACCA GAAGAATGAT GATGATGATG GTGCATATGG CCAGAACCAG 361 AACCGGCCAG GTTAGCGTCG AGGAACTCTT TCAACTGACC TTTAGACAGT GCACCCACTT 421 TGGTTGCCGC CACTTCACCG TTTTTGAACA GCAGCAGAGT CGGGATACCA CGGATGCCAT 481 ATTTCGGCGC AGTGCCAGGG TTTTGATCGA TGTTCAGTTT TGCAACGGTC AGTTTGCCCT 541 GATATTCGTC AGCGATTTCA TCCAGAATCG GGGCGATCAT TTTGCACGGA CCGCACCACT 601 CTGCCCAGAA ATCGACGAGG ATCGCCCCGT CCGCTTTGAG TACATCCGTG TCAAAACTGT 661 CGTCAGTCAG GTGAATAATT TTATCGCTCA TATGTATATC TCCTTCTTAA AGTTAAACAA 721 AATTATTTCT AGAGGGGAAT TGTTATCCGC TCACAATTCC CCTATAGTGA GTCGTATTAA 781 TTTCGCGGGA TCGAGATCGA TCTCGATCCT CTACGCCGGA CGCATCGTGG CCGGCATCAC 841 CGGCGCCACA GGTGCGGTTG CTGGCGCCTA TATCGCCGAC ATCACCGATG GGGAAGATCG 901 GGCTCGCCAC TTCGGGCTCA TGAGCGCTTG TTTCGGCGTG GGTATGGTGG CAGGCCCCGT 961 GGCCGGGGGA CTGTTGGGCG CCATCTCCTT GCATGCACCA TTCCTTGCGG CGGCGGTGCT 1021 CAACGGCCTC AACCTACTAC TGGGCTGCTT CCTAATGCAG GAGTCGCATA AGGGAGAGCG 1081 TCGAGATCCC GGACACCATC GAATGGCGCA AAACCTTTCG CGGTATGGCA TGATAGCGCC 1141 CGGAAGAGAG TCAATTCAGG GTGGTGAATG TGAAACCAGT AACGTTATAC GATGTCGCAG 1201 AGTATGCCGG TGTCTCTTAT CAGACCGTTT CCCGCGTGGT GAACCAGGCC AGCCACGTTT 1261 CTGCGAAAAC GCGGGAAAAA GTGGAAGCGG CGATGGCGGA GCTGAATTAC ATTCCCAACC 1321 GCGTGGCACA ACAACTGGCG GGCAAACAGT CGTTGCTGAT TGGCGTTGCC ACCTCCAGTC 1381 TGGCCCTGCA CGCGCCGTCG CAAATTGTCG CGGCGATTAA ATCTCGCGCC GATCAACTGG 1441 GTGCCAGCGT GGTGGTGTCG ATGGTAGAAC GAAGCGGCGT CGAAGCCTGT AAAGCGGCGG 1501 TGCACAATCT TCTCGCGCAA CGCGTCAGTG GGCTGATCAT TAACTATCCG CTGGATGACC 1561 AGGATGCCAT TGCTGTGGAA GCTGCCTGCA CTAATGTTCC GGCGTTATTT CTTGATGTCT 1621 CTGACCAGAC ACCCATCAAC AGTATTATTT TCTCCCATGA AGACGGTACG CGACTGGGCG 1681 TGGAGCATCT GGTCGCATTG GGTCACCAGC AAATCGCGCT GTTAGCGGGC CCATTAAGTT 1741 CTGTCTCGGC GCGTCTGCGT CTGGCTGGCT GGCATAAATA TCTCACTCGC AATCAAATTC

大肠杆菌表达系统的研究进展综述

基因工程制药综述 班级：生技132 ： 学号：

大肠杆菌表达系统的研究进展综述 自上世纪 70 年代以来, 大肠杆菌一直是基因工程中应用最为广泛的表达系统。尽管基因工程表达系统已经从大肠杆菌扩大到酵母、昆虫、植物及哺乳动物细胞,并且近年来出现了很多新型的真核表达系统, 但是大肠杆菌仍然是基因表达的重要工具。尤其是进入后基因组时代以来, 有关蛋白结构以及功能研究的开展 ,对基因表达的要求更高,这时大肠杆菌往往是表达的第一选择。文章综述了近年来有关大肠杆菌表达载体及宿主细胞的改造工作。 1 表达载体 1. 1 表达调控 构建有效的表达载体是表达目的基因的基本要求, 同时也是影响基因表达水平以及蛋白活性的重要因素。标准的大肠杆菌表达载体的主要组成: 启动子、操纵子、核糖体结合位点、翻译起始区、多克隆位点、终止子、复制起点以及抗性筛选因子等。理想的表达载体要求在转录和翻译水平上可以控制目的基因的表达 ,然而目的基因在宿主体过分表达(选用较强的启动子等)会对宿主造成压力, 引起相关的细胞应答反应, 影响蛋白的活性等。基因组、RNA 转录组、蛋白质组、代调控组等领域的研究成果给我们提供了大量关于基因表达调控的信息[ 1]。现已能从基因和细胞的整体水平来方便地选择合适的启动子或合理开发新的载体系统。譬如 Lee 等利用二维凝胶电泳法比较了重组载体和空载体被分别转入宿主细胞后蛋白组学的差异,发现两者都产生了大肠杆菌热休克蛋白并引起了 cAMPCRP 调节蛋白的应答, 其中重组子的影响更为强烈；另外, 还发现外源基因的表达使宿主核糖体合成速率、翻译延长因子和折叠酶表达水平、细胞生长率下降 , 而使细胞呼吸活力上升[ 2]。目前应用的表达载体主要问题是表达过程中出现的全或无的情况, 通常表达的培养物都是非纯种的细胞群, 其中有一些细胞可以最大限度地被诱导,而另一些细胞在诱导后基因的表达被关闭。分离具有合适强度启动子及翻译速率的载体变种可以优化表达水平,说明启动子的选择对于基因的诱导表达非常重要。 Deborahat 提出在芯片上排列具有不同强度级别启动子的载体进行互补分析, 可能有助于筛选最为适合的启动子[3]。开发非 IPTG 或阿拉伯糖诱导的载体也可以提高基因表达水平, Qing 等利用 cspA 基因的独特性开发了一系列冷休克表达载体pCold, 使目的基因在低温下(<15℃) 诱导表达,提高了产物的溶解性和稳定性[4]。 1. 2 融合表达载体 除了表达载体的调控性,为了提高蛋白产物的活性以及简化下游纯化的操作等 ,往往在表达载体上插入其它辅助的基因序列与目的基因构成融合蛋白表达。融合信号肽(PelB、Om pA 、MalE、PhoA 等)表达可以使融合蛋白通过经典的 Sec 途径分泌到周质或胞外表达, 有利于形成二硫键以及避免胞质蛋白酶的水解和 N 端甲硫氨酸的延伸。另外,最近开发的双精氨酸转运体系(Tat)可以有效分泌正确折叠的重组蛋白[5]。常见的纯化标签多根据亲和层

大肠杆菌文献综述

文献综述 禽大肠杆菌病的研究进展 郑琳红 西南大学荣昌校区动物医学系，重庆荣昌402460 摘要：禽大肠杆菌病是由致病性大肠杆菌引起各种禽类的一种急性或慢性传染病，主要侵害鸡、鸭、鹅，以及各类珍、特禽，临床上有多种表现形式，其中以急性败血型、卵黄性腹膜炎和生殖器官损害较常见，危害性也最为严重。本文主要在病原学、流行病学、临床症状、病理变化和诊断与防治等方面对禽大肠杆菌病进行了综述。 关键词：禽大肠杆菌；流行特点；疫病防治；研究进展 禽大肠杆菌病（colibacillosis）是由致病性大肠埃希氏菌( E. coli )引起禽类的一种急性、慢性传染病的总称。其病型和病变复杂多样。本菌抗原结构复杂，血清型多，变异菌株不断出现，分布极广，不同地区有不同血清型，同一地区不同养殖场甚至同一养殖场同一种群也可能有多个血清型。本病的普遍性，给养禽业造成严重威胁和重大经济损失[1,2]。 禽大肠杆菌病常继发于其他致病因子或与其他致病因子一同作用，使其表现得复杂多变，往往使真正的罪魁祸首得以掩盖。禽大肠杆菌病发病频繁，容易反复发作，加上用药较乱，病原菌血清型多、抗原结构复杂，极易产生耐药性，使其防不胜防。1976年Smits等发现新城疫疫苗、传染性支气管炎疫苗免疫，支原体感染与大肠杆菌感染之间的关系，气雾免疫法及支原体感染大幅提高大肠杆菌感染率[3]。 1．病原学 大肠杆菌是人和动物肠道中的常见菌，多为条件性致病菌，当机体健康，抵抗力强时，这些菌株不表现致病性，当机体健康状况下降，特别是在应激情况下，其致病性增强，引起发病。致病性大肠杆菌在自然界中广泛存在，凡有哺乳动物和禽类活动的环境空气、水源和土壤中均有本菌存在。当禽舍通风不良、饲养密度大、卫生条件差、饲料质量不好、禽舍污染严重时，该病传播途径可经过消化道、呼吸道、交配等途径水平传播，还可通过其它多种途径，使种蛋被污染而进行垂直传播[1]。 禽大肠杆菌病病原是革兰氏阴性、非抗酸性、染色均一，不形成芽孢，两端钝圆的短杆菌，需氧或兼性厌氧。有时大小和形态可能是多变的，许多菌株有运动性，有周身

pET-48b(+)大肠杆菌表达载体说明

pET-48b(+) 编号 载体名称 北京华越洋生物VECT4670 pET--‐48b(+) pET48b载体基本信息 别名: pET48b, p ET 48b 质粒类型: 大肠杆菌蛋白表达 表达水平: 高 克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: 5605 b p 5' 测序引物序列: T7: 5'--‐TAATACGACTCACTATAGGG--‐3'; Trx--‐F: 5'--‐TTCCTCGACGCTAACCTG--‐3' 3' 测序引物序列: T7t: 5'--‐TGCTAGTTATTGCTCAGCGG--‐3' 载体标签: N--‐Trx, N--‐His,N--‐HRV 3C, C--‐S, C--‐Thrombin 载体抗性: Kanamycin (卡那霉素) 备注: Same as pET47 but also has Nterm Trx Tag; contains HRV 3C Protease cleavage site for fusion tag removal at low temperatures; Cterm thrombin c leavage s ite. 稳定性: 瞬时表达 组成型: 组成型 病毒/非病毒: 非病毒 pET48b载体质粒图谱和多克隆位点信息

pET48b载体简介 pET--‐48b载体含有N端Trx和His标签，在标签后面紧跟着的是HRV 3C蛋白酶切位点。HRV 3C蛋白酶能够高特异性的识别LEVLFQ↓GP蛋白序列，能够在低温下高效切割掉融合标签序列。pET--‐48b载体还含有一个可选择的C端Thrombin蛋白酶切位点，紧接着位点后是S标签。 pET48b载体的单一的多克隆位点见上面的环状质粒图谱。注意：载体序列是以pBR322质粒的编码规矩进行编码的，所以T7蛋白表达区在质粒图谱上面是反向的。 T7 RNA聚合酶启动的克隆和表达区域在质粒图谱中也被标注了出来。质粒的F1复制子是被定向的，所以在T7噬菌体聚合酶的作用下，包含有蛋白编码序列的病毒 粒子能够

酵母表达系统的特点 大肠杆菌表达系统是常用的外源基因表达系统

1.酵母表达系统的特点大肠杆菌表达系统是常用的外源基因表达系统，人们已利用该系统表达了多种蛋白。大肠杆菌基因结构简单，易于进行基因操作，而且它生长迅速，周期短，营养需求简单，适于工业化生产。但同时该系统还存在很多缺陷。它是原核表达系统，缺少真核生物的翻译后加工过程，产生的外源基因产物往往无活性，它表达的蛋白多以包含体形式存在，需要经过复性，过程复杂，它产生的杂蛋白较多，不易纯化，所以产物中有可能会含有原核细胞中的有毒蛋白或有抗原性的蛋白。昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统都是真核细胞表达系统，它们可以进行多种蛋白的转录后加工，很适合于真核基因的表达。但是，它们遗传背景复杂，操作困难，易污染，生产成本高，所以并不利于实际应用[2,3] 2.核生物基因和制备有功能的表达蛋白质。某些酵母表达系统具有外分泌信号序列，能够将所表达的外源蛋白质分泌到细胞外，因此很容易纯化[4]。所以近年来，酵母表达系统已广泛应用于工业生产，为社会创造了极大的经济效益 3.酵母一般可分成三大类：(1) 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，又称面包酵母；(2) 粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；(3) 非常规酵母(Nonconventional yeast)，是指除酿酒酵母和粟酒裂殖酵母外的酵母统称 4.酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）又名面包酵母，它是单细胞真核微生物，一直以来酿酒酵母被称为真核生物中的―大肠杆菌‖。它是最早应用于酵母基因克隆和表达的宿主菌。自1981年Hitzemom等用酿酒酵母表达人干扰素获得成功后，人们还用酿酒酵母表达了多种原核和真核蛋白，目前科学家对酿酒酵母表达系统的研究已非常深入。 5.2.1.2 用于基因表达的宿主菌——酿酒酵母在遗传学方面，人们对酿酒酵母进行了广泛的研究，酿酒酵母基因组序列（约1.2×107bp）早在1996年就完成，它有16条染色体，约6000个ORF，仅4%的酵母基因有内含子。由于人们对酿酒酵母的遗传背景十分清楚，因此酿酒酵母是很理想的真核表达宿主菌。

pET-22b(+)大肠杆菌表达载体说明

pET-22b(+) 编号 载体名称 北京华越洋生物VECT5200 pET--‐22b(+) pet22b载体基本信息 别名: pET22b, p et 22b, p ET--‐22b(+) 质粒类型: 大肠杆菌蛋白表达 表达水平: 高 克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: 5500bp 5' 测序引物及序列: T7: 5'--‐TAATACGACTCACTATAGGG--‐3' 3' 测序引物序列: T7t: 5'--‐GCTAGTTATTGCTCAGCGG--‐3' 载体标签: N--‐pelB; C--‐His 载体抗性: 氨苄 备注: pET22b载体含有PelB信号肽序列， 能够将表达的目的蛋白定位在细胞外周质腔。 稳定性: 瞬时表达 Transient 组成型: 组成型 Constitutive 病毒/非病毒: 非病毒 pet22b载体质粒图谱和多克隆位点信息

pet22b载体简介 pET--‐22b(+)载体携带有一个N端的pelB信号肽序列，能够将表达的目的蛋白定位于外周质腔，同时载体含有C端His标签。载体的单一的多克隆位点见上面的环状质粒图谱。注意：载体序列是以pBR322质粒的编码规矩进行编码的，所以T7蛋白表达区在质粒图谱上面是反向的。 T7 RNA聚合酶启动的克隆和表达区域在质粒图谱中也被标注了出来。质粒的F1复制子是被定向的，所以在T7噬菌体聚合酶的作用下，包含有蛋白编码序列的病毒 粒子能够产生，并启动蛋白表达，同时蛋白表达将被T7终止子序列的作用下终止蛋白翻译。 pet22b载体序列 ORIGIN 1 ATCCGGATAT AGTTCCTCCT TTCAGCAAAA AACCCCTCAA GACCCGTTTA GAGGCCCCAA 61 GGGGTTATGC TAGTTATTGC TCAGCGGTGG CAGCAGCCAA CTCAGCTTCC TTTCGGGCTT 121 TGTTAGCAGC CGGATCTCAG TGGTGGTGGT GGTGGTGCTC GAGTGCGGCC GCAAGCTTGT 181 CGACGGAGCT CGAATTCGGA TCCGAATTAA TTCCGATATC CATGGCCATC GCCGGCTGGG 241 CAGCGAGGAG CAGCAGACCA GCAGCAGCGG TCGGCAGCAG GTATTTCATA TGTATATCTC 301 CTTCTTAAAG TTAAACAAAA TTATTTCTAG AGGGGAATTG TTATCCGCTC ACAATTCCCC 361 TATAGTGAGT CGTATTAATT TCGCGGGATC GAGATCTCGA TCCTCTACGC CGGACGCATC 421 GTGGCCGGCA TCACCGGCGC CACAGGTGCG GTTGCTGGCG CCTATATCGC CGACATCACC 481 GATGGGGAAG ATCGGGCTCG CCACTTCGGG CTCATGAGCG CTTGTTTCGG CGTGGGTATG 541 GTGGCAGGCC CCGTGGCCGG GGGACTGTTG GGCGCCATCT CCTTGCATGC ACCATTCCTT 601 GCGGCGGCGG TGCTCAACGG CCTCAACCTA CTACTGGGCT GCTTCCTAAT GCAGGAGTCG

大肠杆菌表达系统与蛋白表达纯化(参考资料)

8.大肠杆菌表达系统与蛋白表达纯化 大肠杆菌表达系统遗传背景清楚，目的基因表达水平高，培养周期短，抗污染能力强等特点, 是分子生物学研究和生物技术产业化发展进程中的重要工具。因此熟练掌握并运用大肠杆菌表达系统的基本原理和常规操作是对每一个研究生来说是非常必要 的。本章节介绍了实验室常用的大肠杆菌表达系统的构成特点，归纳了利用大肠杆菌表达系统纯化重组蛋白的基本流程和详细 操作步骤，并且结合笔者的操作经验，总结了初学者在操作过程中可能遇到的问题和解决策略。 8.1大肠杆菌表达系统的选择与构建 8.1.1表达载体的选择 根据启动子的不同这些载体大致可以分为热诱导启动子，如λPL，cspA 等和另外一类就是广泛使用的IPTG诱导的启动子，如lac，trc，tac，T5/lac operator，T5/lac operator等。根据表达蛋白质的类型可分为单纯表达载体和融合表达载体。融合表达是在目标蛋白的N端或C端添加特殊的序列，以提高蛋白的可溶性，促进蛋白的正确折叠，实现目的蛋白的快速亲和纯化，或者实现目标蛋白的表达定位。常用的用于亲和纯化融合标签包括 Poly-Arg， Poly-His, Strep-Tag Ⅱ，S-tag，MBP等。其中His-Tag 和GST-Tag 是目前使用最多的。His Tag 大多数是连续的六个His 融合于目标蛋白的N端或C端，通过His 与金属离子：Cu2+>Fe2+>Zn2+>Ni2+ 的螯合作用而实现亲和纯化，其中Ni2+是目前使用最广泛的。His 标签具有较小的分子量，融合于目标蛋白的N端和C端不影响目标蛋白的活性，因此纯化过程中大多不需要去除。目前常使用的表达载体主要是由Novagen 提供的pET 系列和Qiagen 公司提供的pQE 系列。 除了His 标签外，还原性谷胱甘肽S-转移酶是另一种实验室常用的融合标签。它可以通过还原性谷胱甘肽琼脂糖亲和层析而快速纯化。此外，与His 相比，GST 很多时候能够促进目标蛋白的正确折叠，提高目标蛋白表达的可溶性，因此，对于那些用his 标签表达易形成包涵体的蛋白，可以尝试用GST融合表达来改进。当然，GST 具有较大的分子量（26kDa），可能对目的蛋白的活性有影响，因此很多时候切除GST是必须的。目前，GST融合表达系统主要是由GE Healthcare （原Amersham）提供。 8.1.2宿主菌的选择 重组质粒的构建一般选择遗传稳定，转化效率高，质粒产量高的菌株作为受体菌，常用的有E.coli DH5α，E.coli JM 109，E.coli DH 10B ，E.coli NovaBlμe等rec A–和end A–型细胞。作为表达宿主菌必须具备几个基本特点：遗传稳定，生长速度快，表达蛋白稳定。具体操作过程中，根据所使用的表达载体的特点，目的基因密码子的组成等选择特定的表达宿主菌。以下是实验室常用的几种表达宿主： BL2： lon和ompT 蛋白酶缺陷型，避免了宿主对外源蛋白的降解。是经典的使用最广泛的表达受体。适用于Tac，Trc，Lac，λPL，cspA等作为启动子的载体。 BL21（DE3）： DE3噬菌体溶源于BL21 形成的带有染色体T7 RNA 聚合酶基因大肠杆菌。IPTG 诱导的lac ΜV5 启动子控制T7 RNA 聚合酶基因表达T7 RNA 聚合酶，进而控制T7 表达系统表达目的蛋白。 BL21（DE3）衍生系列：在经典的T7表达系统BL21（DE3）的基础上，Novagen 公司开发了一些特殊的表达宿主细胞。比如：Origami （DE3），Origami B（DE3）和Rosetta-gami （DE3）菌株带有 trxB和

CHO细胞表达系统研究进展

CHO细胞表达系统研究进展 影响外源基因在哺乳动物细胞中表达水平的因素很多，层次也很广泛，涉及复制、转录和转录后、翻译和翻译后等各级水平，其中mRNA的转录是真核基因表达谓节的基本控制点，它的翻译对表达水平也有一定作用。研究表明，所有提高转录水平的策略均与蛋白质编码序列无关，主要是通过载体构建基因转染方法和选择不同标记来调控。而提高翻译水平则主要是通过增强与核糖体结合能力和改造编码基因的结构来实现。 转录水平的调控可以概括为顺式作用元件(cis acting element)与反式作用因子(trans-acting factor)的相互作用。它们分别由表达载体和宿主细胞提供。因此，表达载体的元件组成及结构是ClIO细胞高效表达外源基因的关键因素之一。借助真核基因表达调控的理论，可以将较强的顺式作用元件集中到一个载体中，使其方便而高效地用于外源基因的表达。目前在这一理论指导下，已经构建了许多来源于细菌质粒的表达载体，它们包含着适当的顺式作用元件和选择标记。顺式作用元件主要有启动子一增强子元件、转录剪切和Poly A信号等。 1、启动子 启动于是影响外源基因表达效率的关键因素因为细菌的主要启动子和增强子在动物细胞中不起作用，所以这些调控元件大多从启动效率高而且生物背景清楚的病毒基因组中分离。各种启动子效率可用报告基因在细胞中测定。SV40、AdMLP、LTR和CMV启动子在CHO细胞中效果良好。刘文军等比较了SV40、L TR和CMV在ClIO细胞中的表达活性，认为三种启动子的转录活性依次为CMV启动子>SV40启动子> LTR启动子，前者分别是后两者的l0倍和30倍左右。 来源于噬菌体的一些启动子，如17启动子也可用于动物细胞。17启动子能被T7RNA聚合酶特异识别，依此建立起来的偶联系统具有常规表达系统不能实现的高效表达特性。除了这些常用的启动子之外，还有多种强的启动子被用于CHO细胞表达载体中。如肽链延长因子基因的启动子，金属硫蛋白(MT)基因的启动子等。在启动子周围其它核苷酸序列对其转录活性也有影响。改变CMV和AdMLP之后EPO基因的前

大肠杆菌耐药性研究进展

大肠杆菌耐药性研究进展 教郁，高维凡，胡彩光 (沈阳农业大学，辽宁省沈阳市，110000) 摘要：大肠杆菌是典型的革兰氏阴性杆菌，其引起的大肠杆菌病是一种常见疾病，在治疗过程中 容易产生耐药性，且耐药谱广，耐药机制复杂，给养鸡业预防和治疗该病带来很大困难。大肠杆茵对抗生素的耐药问题是当前国内外研究的热点。本文对大肠杆菌耐药的现状以及产生耐药性机制的研究进行了综述，以便正确理解大肠杆菌耐药性的特点及其规律，从而为防治大肠杆菌耐药性的产生及合理用药提供理论依据。 关键词：大肠杆菌；耐药性；作用机制 The research progress on mechanism of Drg-resistance of Escherichia coli Abstract: E.coli is gram-negative bacteria, colibacillosis is a kind of common disease. Escherichia coli strains showed high levels of resistance, resistance spectrum to expand, and multiple drug resistance. The drug resistant gene is complex and diverse. So the prevention and treatment of the disease bring a lot of difficulties. Antibiotic resistance is the current domestic and international research hot spot. The advances on mechanism of resistance and the present situation of E coli resistance are summarized．Thus the trend of the drug-resistance on the E coli resistance can be understood better and the basis for preventing the production of the resistant stains and using drugs reasonablely can be furtherly provided． Keywords: Eescherichia coli; resistance; resistance mechanism 致病性大肠杆菌为医学和兽医学临床感染中最常见的病原菌之一。从发病情况看，大肠杆菌病发病率在细菌病引发的疾病中居世界首位。兽医临床上大肠杆菌造成的危害十分严重，它一年四季均可致病，一直是困扰养殖业发展的常见病、多发病，给养禽业造成了严重的经济损失；大肠杆菌病的主要防治措施是应用疫苗及抗生素。国内外已研制出多种疫苗对大肠杆菌病进行预防，但因大肠杆菌具有多种血清型，仅国内报导就有80余种，应用疫苗对大肠杆菌病进行防治尚不能满足对该病的防治要求。抗生素在大肠杆菌病预防及治疗方面有着不可替代的作用，但是随着抗生素的广泛、持续及不当使用，大肠杆菌耐药谱不断扩大和耐药水平不断提高，大肠杆菌耐药及多重耐药现象已十分严重。虽然新型抗生素不断问世，但抗生素的研制速度远远低于耐药菌的产生速度。因此了解大肠杆菌耐药状况，掌握大肠杆菌耐药趋势，研究大肠杆菌耐药机理，对控制耐药菌株的蔓延具有十分重要的意义。 1.大肠杆菌耐药性现状 近年来，随着抗生素及各种化学合成药物在我国畜牧业生产中的广泛应用，大量的抗生素、消毒剂等不断进入水、土壤、河流、沉积物等各种环境中。使得大肠杆菌耐药谱不断扩大和耐药水平不断提高，给我国畜牧业的持续发展和人类健康带来潜在的危害。国内外各地均分离得到耐药家畜源性大肠杆菌，并对这些病原菌进行了耐药谱系的检测。梅姝等[1]报道分离得到的长春地区127株鹿源大肠杆菌对5种抗菌药物呈现不同

大肠杆菌噬菌体的研究进展

龙源期刊网 https://www.wendangku.net/doc/a73668390.html, 大肠杆菌噬菌体的研究进展 作者：吴伟胜李玉保王守荣等 来源：《江苏农业科学》2015年第08期 摘要：大肠杆菌病为畜牧养殖业常见疾病之一，目前临床上主要依赖于抗生素进行控 制。随着大肠杆菌耐药性增强以及人们对食品安全意识的提高，急需寻找安全、高效的抗生素替代品。噬菌体是能够感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒总称，具有巨大的潜在应用价值。对近几年国内外有关大肠杆菌噬菌体的分布、分离纯化方法、保存方法、形态、pH值稳定性、温度稳定性、分子生物学以及应用方面作了简要概述，并对以后的科研和应用进行了思考和展望。 关键词：大肠杆菌；噬菌体；研究进展 中图分类号：S852.61+2 文献标志码： A[HK] 文章编号：1002-1302（2015）08-0008-03 近年来，由于畜牧养殖业大量使用抗生素，导致病原微生物的耐药性升高 [1]，同时，抗生素的使用对食品安全构成威胁。噬菌体作为一类能够感染和裂解大肠杆菌等微生物的病毒，具有宿主专一、不产生耐药性 [2]、使用安全 [3-4]等优势，在美国已应用于儿童腹泻疾病的治疗 [5]。因此，噬菌体有望在防控畜牧业肠道性疾病中替代抗生素。本文对近几年国内外关于大肠杆菌噬菌体的分离和保存方法、生物学特性等进行综述，希望能够对大肠杆菌噬菌体更深入的研究和应用提供思路和方法。 1 大肠杆菌噬菌体的分布 目前研究发现的病毒种类数量庞大，其中大部分是噬菌体 [6]。大肠杆菌噬菌体在我们生活的周围环境中普遍存在。到目前为止，学者们已经从不同的样品中分离出来多种大肠杆菌噬菌体，并对所分离的噬菌体进行了分类和命名。在养殖场的鸡粪 [7-8]和污水中 [9]，以不同的大肠杆菌为宿主菌分离到不同种类的大肠杆菌噬菌体；在养猪场的粪便中，以产肠毒素性大肠杆菌K88 为宿主菌分离并纯化了1株噬菌体PK88-4 [10]；在城市的污水中，以肠出血性大肠杆菌O157 ∶ H7为宿主菌分离出裂性噬菌体 [11]。此外，在医院的污水中，用大肠杆菌E1～E17共17种细菌做指示菌分离出1种广谱噬菌体IME11 [12]。 2 大肠杆菌噬菌体的分离纯化方法 对于噬菌体的分离纯化，大致可以分为采样、富集、分离、纯化4个步骤。每个步骤又包含1种或多种不同的方法，可以根据自身的试验条件和试验状况将不同方法组合，进而得到最佳的分离纯化方法。

pMal c X大肠杆菌表达载体说明

pMal-c2X 编号 名称 北京华越洋VECT--‐570 pMal--‐c2X pMalc2x载体基本信息 载体名称: pMal--‐c2X, p Malc2X, p Mal c2X 质粒类型: 大肠杆菌蛋白表达载体 表达水平: 高 启动子: Tac 克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: 6646 b p 5' 测序引物及序列: MalE引物: 5'--‐GGTCGTCAGACTGTCGATGAAGCC--‐3'; MBP--‐F: 5'--‐gatgaagccctgaaagacgcgcag--‐3' 3' 测序引物及序列: pBad--‐R: 5'--‐gatttaatctgtatcagg--‐3'; M13--‐F: 5'--‐TGTAAAACGACGGCCAGT--‐3' 载体标签: N--‐MBP, N--‐Factor X a 载体抗性: Ampicillin 氨苄 备注: 融合表达麦芽糖结合蛋白MBP，蛋白定位于细胞周质。 稳定性: 瞬时表达 Transient 组成型: 诱导表达 病毒/非病毒: 非病毒 pMalc2x载体质粒图谱和多克隆位点信息

pMalc2x载体简介 pMAL?系统是一种高效的蛋白融合表达及纯化系统。pMAL载体含有编码麦芽糖结合蛋白（Maltose B inding P rotein, M BP）的大肠杆菌malE基因，其下游的多克隆位点便于目的基因插入，表达N端带有MBP的融合蛋白。通过"tac"强启动子和malE翻译起始信号使克隆基因获得高效表达，并进一步利用MBP对麦芽糖的亲和性达到用Amylose柱对融合蛋白的一步亲和纯化。 The s ystem u ses t he p MAL v ectors w hich a re d esigned s o t hat i nsertion i nterrupts a l acZα gene allowing a blue--‐to--‐white screen for inserts on X--‐gal (5). pMAL--‐c2 series has an exact deletion of the malE signal sequence, resulting in cytoplasmic expression of the fusion protein. pMAL--‐p2 series contains the normal malE signal sequence, which directs the fusion protein through the cytoplasmic m embrane. p MAL--‐p2 f usion p roteins c apable o f b eing e xported c an b e p urified f rom the p eriplasm. B etween t he m alE s equence a nd t he p olylinker t here i s a s pacer s equence c oding for 10 a sparagine r esidues. T his s pacer i nsulates M BP f rom t he p rotein o f i nterest, i ncreasing t he chances that a particular fusion will bind tightly to the amylose resin. The vectors also include a sequence c oding f or t he r ecognition s ite o f a s pecific p rotease. T his a llows t he p rotein o f i nterest to be cleaved from MBP after purification, without adding any vector--‐derived residues to the protein (6). For this purpose, the polylinker includes a restriction site superimposed on the sequence coding for the site of the specific protease. This is where the gene of interest is inserted. An EcoR I site in the same reading frame as that of λgt11 and a number of other useful sites are present directly downstream. The vectors also include the M13 origin of DNA replication which allows the production of single--‐stranded DNA for sequencing and mutagenesis by i nfecting w ith M13KO7 h elper p hage. pMalc2x载体序列 ORIGIN 1 CCGACACCAT CGAATGGTGC AAAACCTTTC GCGGTATGGC ATGATAGCGC CCGGAAGAGA 61 GTCAATTCAG GGTGGTGAAT GTGAAACCAG TAACGTTATA CGATGTCGCA GAGTATGCCG 121 GTGTCTCTTA TCAGACCGTT TCCCGCGTGG TGAACCAGGC CAGCCACGTT TCTGCGAAAA 181 CGCGGGAAAA AGTGGAAGCG GCGATGGCGG AGCTGAATTA CATTCCCAAC CGCGTGGCAC 241 AACAACTGGC GGGCAAACAG TCGTTGCTGA TTGGCGTTGC CACCTCCAGT CTGGCCCTGC 301 ACGCGCCGTC GCAAATTGTC GCGGCGATTA AATCTCGCGC CGATCAACTG GGTGCCAGCG 361 TGGTGGTGTC GATGGTAGAA CGAAGCGGCG TCGAAGCCTG TAAAGCGGCG GTGCACAATC 421 TTCTCGCGCA ACGCGTCAGT GGGCTGATCA TTAACTATCC GCTGGATGAC CAGGATGCCA 481 TTGCTGTGGA AGCTGCCTGC ACTAATGTTC CGGCGTTATT TCTTGATGTC TCTGACCAGA 541 CACCCATCAA CAGTATTATT TTCTCCCATG AAGACGGTAC GCGACTGGGC GTGGAGCATC 601 TGGTCGCATT GGGTCACCAG CAAATCGCGC TGTTAGCGGG CCCATTAAGT TCTGTCTCGG 661 CGCGTCTGCG TCTGGCTGGC TGGCATAAAT ATCTCACTCG CAATCAAATT CAGCCGATAG 721 CGGAACGGGA AGGCGACTGG AGTGCCATGT CCGGTTTTCA ACAAACCATG CAAATGCTGA 781 ATGAGGGCAT CGTTCCCACT GCGATGCTGG TTGCCAACGA TCAGATGGCG CTGGGCGCAA 841 TGCGCGCCAT TACCGAGTCC GGGCTGCGCG TTGGTGCGGA TATCTCGGTA GTGGGATACG 901 ACGATACCGA AGACAGCTCA TGTTATATCC CGCCGTTAAC CACCATCAAA CAGGATTTTC 961 GCCTGCTGGG GCAAACCAGC GTGGACCGCT TGCTGCAACT CTCTCAGGGC CAGGCGGTGA 1021 AGGGCAATCA GCTGTTGCCC GTCTCACTGG TGAAAAGAAA AACCACCCTG GCGCCCAATA