大肠杆菌表达系统与蛋白表达纯化
8.大肠杆菌表达系统与蛋白表达纯化
大肠杆菌表达系统遗传背景清楚，目的基因表达水平高，培养周期短，抗污染能力强等特点, 是分子生物学研究和生物技术产业化发展进程中的重要工具。因此熟练掌握并运用大肠杆菌表达系统的基本原理和常规操作是对每一个研究生来说是非常必要
的。本章节介绍了实验室常用的大肠杆菌表达系统的构成特点，归纳了利用大肠杆菌表达系统纯化重组蛋白的基本流程和详细
操作步骤，并且结合笔者的操作经验，总结了初学者在操作过程中可能遇到的问题和解决策略。
8.1大肠杆菌表达系统的选择与构建
8.1.1表达载体的选择
根据启动子的不同这些载体大致可以分为热诱导启动子，如λPL，cspA 等和另外一类就是广泛使用的IPTG诱导的启动子，如lac，trc，tac，T5/lac operator，T5/lac operator等。根据表达蛋白质的类型可分为单纯表达载体和融合表达载体。融合表达是在目标蛋白的N端或C端添加特殊的序列，以提高蛋白的可溶性，促进蛋白的正确折叠，实现目的蛋白的快速亲和纯化，或者实现目标蛋白的表达定位。常用的用于亲和纯化融合标签包括 Poly-Arg，
Poly-His, Strep-Tag Ⅱ，S-tag，MBP等。其中His-Tag 和GST-Tag 是目前使用最多的。His Tag 大多数是连续的六个His 融合于目标蛋白的N端或C端，通过His 与金属离子：Cu2+>Fe2+>Zn2+>Ni2+ 的螯合作用而实现亲和纯化，其中Ni2+是目前使用最广泛的。His 标签具有较小的分子量，融合于目标蛋白的N端和C端不影响目标蛋白的活性，因此纯化过程中大多不需要去除。目前常使用的表达载体主要是由Novagen 提供的pET 系列和Qiagen 公司提供的pQE 系列。
除了His 标签外，还原性谷胱甘肽S-转移酶是另一种实验室常用的融合标签。它可以通过还原性谷胱甘肽琼脂糖亲和层析而快速纯化。此外，与His 相比，GST 很多时候能够促进目标蛋白的正确折叠，提高目标蛋白表达的可溶性，因此，对于那些用his 标签表达易形成包涵体的蛋白，可以尝试用GST融合表达来改进。当然，GST 具有较大的分子量（26kDa），可能对目的蛋白的活性有影响，因此很多时候切除GST是必须的。目前，GST融合表达系统主要是由GE Healthcare （原Amersham）提供。
8.1.2宿主菌的选择
重组质粒的构建一般选择遗传稳定，转化效率高，质粒产量高的菌株作为受体菌，常用的有E.coli DH5α，E.coli JM 109，E.coli DH 10B ，E.coli NovaBlμe等rec A–和end A–型细胞。作为表达宿主菌必须具备几个基本特点：遗传稳定，生长速度快，表达蛋白稳定。具体操作过程中，根据所使用的表达载体的特点，目的基因密码子的组成等选择特定的表达宿主菌。以下是实验室常用的几种表达宿主：
BL2： lon和ompT 蛋白酶缺陷型，避免了宿主对外源蛋白的降解。是经典的使用最广泛的表达受体。适用于Tac，Trc，Lac，λPL，cspA等作为启动子的载体。
BL21（DE3）： DE3噬菌体溶源于BL21 形成的带有染色体T7 RNA 聚合酶基因大肠杆菌。IPTG 诱导的lac ΜV5 启动子控制T7 RNA 聚合酶基因表达T7 RNA 聚合酶，进而控制T7 表达系统表达目的蛋白。
BL21（DE3）衍生系列：在经典的T7表达系统BL21（DE3）的基础上，Novagen 公司开发了一些特殊的表达宿主细胞。比如：Origami （DE3），Origami B（DE3）和Rosetta-gami （DE3）菌株带有 trxB和
gor双突变。拥有trxB和gor突变的菌株比单具，trxB突变的菌株更有可能促进二硫键的形成，使蛋白可溶性更好，活性更高。
Rosetta?系列：是经过修饰，专用于带有大肠杆菌稀有密码子的真核蛋白表达的菌株。经提高稀有tRNA 水平，可以提高一些真核基因表达效率（更多信息可参考相应公司的资料）。
BL21-Codon Plus系列：包括BL21-CodonPlus?（DE3）-RIPL，BL21-CodonPlμs?-RIL，BL21-CodonPlμs?（DE3）-RIL, BL21-CodonPlμs?-RP，BL21- CodonPlus?（DE3）-RP等。这些受体菌添加了大肠杆菌中编码精氨酸（R），亮氨酸（L），异亮氨酸（I）和脯氨酸（P）稀有密码子的tRNA
基因，更多用于表达一些真核生物的基因。其中RIL系列常用于AT 含量高的基因，而RP系列主要用于GC含量高的基因（更多信息参考Stratagene 公司资料）。
M15/SG13009：自身表达T5 RNA polymerase，主要用于pQE系列载体的表达。
另一个需要考虑的是大肠杆菌的密码子及其偏爱性。
表1 大肠杆菌密码子使用频率统计
8.2表达条件的建立
为了方便后续的纯化操作, 保持目标蛋白的活性,提高蛋白的得率，我们在进行蛋白的大量制备之前应该首先确定目标蛋白的最佳表达条件。首先，保证表达蛋白稳定，尽量避免蛋白酶的降解，我们可以通过使用一些蛋白酶缺陷性的表达宿主，其次在
表达的过程中可以在培养体系中添加一些蛋白酶抑制剂等来解决。与实现外源蛋白的稳定表达相比，更多时候保证目标蛋白的
可溶性表达，是建立表达条件的主要工作。很多外源基因在大肠杆菌表达时很容易形成不可容的包涵体，其原因可能有：表达
量过高，研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体；蛋白合成速度太快，以至于没有足够的时间进
行折叠，二硫键不能正确配对；过多蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。目前对包涵体的形成和复性过程中发生聚集的机制尚不清楚, 但已经报道了很多用于优化表达以增加目标蛋白可溶性的方法。
8.2.1确定表达状况
转化构建好的质粒至表达宿主感受细胞，挑取单克隆子至5ml 含有相应抗性的LB 培养基中，37℃，200 rpm，培养至OD600=0.5左右，加入IPTG至终浓度0.2mM，转移至28℃，200 rpm 继续诱导培养，可以在2h，4h，6h 分别取样以分析表达状况。
将取出的1ml 菌液12000 rpm 离心1min，收集菌体，加入1ml PBS 缓冲液重悬沉淀，同样离心1min。再加入300～500ml PBS重悬细胞。
超声破碎细胞（具体见操作细胞破碎）
将破碎液体4℃，12000 rpm 离心10min，分离上清和沉淀。
SDS-PAGE 分析上清和沉淀的蛋白分布（具体操作参考SDS-PAGE）。
若在上清中有明显的目的蛋白的条带，即可以放大培养进而纯化目标蛋白。若目标蛋白的表达主要分布于沉淀，则可以尝试一
下几种方法来改善表达。
改变表达载体下手，像GST，NΜS，MBP, TrxA等融合标签能够提高很多蛋白在大肠杆菌中表达的可溶性，此外一些分泌标签如ompA,Pet-22b上的pelB也能够将目标蛋白运输至细胞的周质空间，从而提高目标蛋白的可溶性。
降低表达速度，可采取低温诱导，如15℃诱导过夜，或者采用弱启动子表达载体。
尝试一些特殊设计的表达宿主Origami：thioredoxin redμctase/glμtathione redμctase 双突变适合带thioredoxin redμctase的融合表达载体，帮助形成更多的二硫键。
对于一些蛋白可能无法实现可溶性表达，这时候溶解包涵体后再纯化是唯一的解决办法。
8.2.2聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
大肠杆菌表达纯化外源蛋白，SDS-PAGE是必不可少的操作。可以用来检测蛋白的表达情况(表达量，表达分布等)，用来分析纯化的目的蛋白的纯度。本小节列出SDS-PAGE 操作中一些试剂的配置及其基本的操作过程。
8.2.2.1主要试剂的配置
（1）30%丙烯酰胺贮存液：29g丙烯酰胺和1g N,N’-亚甲双丙烯酰胺溶于100ml热水中，验证其pH值不大于7.0。置棕色瓶中，4℃保存。
丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可以通过皮肤吸收，其作用具累积性。称量丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺时应戴手套和面具。可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能会含有少量未聚合材料。建议实验室划出专门的台面，设置单独的配置器皿进行SDS-PAGE 的相关实验。
（2）1.5mol/L Tris（pH8.8）溶液。
（3）10% SDS溶液：SDS 10.0g 加入ddH2O ToTo100。
（4）10%过硫酸铵：新鲜配制。
（5）TEMED溶液：4℃保存。
（6）1.0 mol/L Tris（pH6.8）溶液。
（7）2×样品溶解液：2%SDS，5%巯基乙醇，10%甘油，0.02%溴酚蓝，0.01mol/L Tris-HCl（pH8.0）缓冲液。
（8）5×Tris-甘氨酸电极缓冲液： 15.1g Tris，94g甘氨酸和5g SDS定容到1000ml（建议每次电泳用新稀释的缓冲液）。
（9）考马斯亮蓝R染色液：每100ml甲醇、水、冰乙酸混合物（9:9:2）中，溶解0.25g考马斯亮蓝R，搅拌溶解。（10）脱色液：10%冰醋酸（可加如乙醇，建议不要使用甲醇）。
8.2.2.2主要操作步骤
1、凝胶制备
（1）安装洗涤干净的玻璃板、板条，并将玻璃板固定在电泳槽中。
（2）配制10%的分离胶（具体参考表2）：迅速在两玻璃板间隙中灌注分离胶，直至剩余的板宽比梳子长度多1cm。小心在胶上覆盖一薄层异丙醇或水。
（3）在分离胶聚合的过程（可置于37℃，约10min）中，配制5%的积层胶（参考表格3）。
（4）分离胶聚合完全后，倒去异丙醇或水，用滤纸吸干胶面上的残余。
（5）灌注积层胶，立即插入干净的梳子，避免产生气泡。
（6）积层胶聚合完全后，小心拔出梳子，拨去封胶用的塑料条，固定于电泳槽。
（7）在上下电泳槽中加入足够的电泳缓冲液。
2、样品的制备
在蛋白溶液中加入等体积的2×样品溶解液，混合液在沸水浴中加热5min，冷却后即可上样。
3、上样
用微量移液器上样，每加入一种样品，上样量根据根据具体的样品浓度确定，未知浓度一般用10微升。
4、电泳
对于一块胶，在浓缩胶中电流设置在15～20mA, 当染料进入分离胶后可设置电压至电流约为25～30mA，继续电泳直至染料到达离凝胶底部1cm处。
5、后处理
（1）染色：加入染色液（用量同上），室温染色30min～1h。
Tip：染色前可将染色液在微波炉里加热至沸，然后摇床震荡染色约10min即可。
（2）脱色：将染色后的胶块用水洗涤三次去除表面染料，然后加入脱色液脱色，其间更换脱色液3～4次至条带清晰。
Tip：10min快速脱色:将脱色液置于微波炉煮沸，更换三次脱色液。
表2. 配制SDS-PAGE 不同浓度分离胶的配置
不同体积（ml）凝胶液中各成分所需体积（ml）
Gel%组成
所需要各成份体积（ml）
51015202530
6%
水 2.6 5.37.910.613.215.9 30%丙烯酰胺溶液123456 1.5mol/LTris(pH8.8) 1.3 2.5 3.85 6.37.5
10%SDS0.050.10.150.20.250.3 10%过硫酸氨0.050.10.150.20.250.3 TEMED0.0040.0080.0120.0160.020.024
8%
水 2.3 4.6 6.99.311.513.9 30%丙烯酰胺溶液 1.3 2.74 5.3 6.78 1.5mol/LTris(pH8.8) 1.3 2.5 3.85 6.37.5
10%SDS0.050.10.150.20.250.3 10%过硫酸氨0.050.10.150.20.250.3 TEMED0.0030.0060.0090.0120.0150.018
10%
水 1.94 5.97.99.911.9 30%丙烯酰胺溶液 1.7 3.35 6.78.310 1.5mol/LTris(pH8.8) 1.3 2.5 3.85 6.37.5
10%SDS0.050.10.150.20.250.3 10%过硫酸氨0.050.10.150.20.250.3 TEMED0.0020.0040.0060.0080.010.012
12%
水 1.6 3.3 4.9 6.68.29.9 30%丙烯酰胺溶液24681012 1.5mol/LTris(pH8.8) 1.3 2.5 3.85 6.37.5
10%SDS0.050.10.150.20.250.3
10%过硫酸氨0.050.10.150.20.250.3 TEMED0.0020.0040.0060.0080.010.012
15%
水 1.1 2.3 3.4 4.6 5.7 6.9 30%丙烯酰胺溶液 2.557.51012.515 1.5mol/LTris(pH8.8) 1.3 2.5 3.85 6.37.5
10%SDS0.050.10.150.20.250.3 10%过硫酸氨0.050.10.150.20.250.3 TEMED0.0020.0040.0060.0080.010.012
表3.SDS-PAGE 5%浓缩胶的配置
Gel%组成
所需要各成份体积（ml）
1 2 3 4 5 6
5%
水0.68 1.4 2.1 2.7 3.4 4.1 30%丙烯酰胺溶液0.17 0.33 0.5 0.67 0.83 1.0 1.0mol/LTris(pH6.8)0.13 0.25 0.38 0.5 0.63 0.75
10%SDS0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 10%过硫酸氨0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 TEMED0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06
8.3细胞破碎获取蛋白质
大肠杆菌细胞破碎有很多方法，譬如反复冻融法，渗透冲击，超声破碎，压力破碎等。其中超声破碎和压力破碎破碎是我室常用方法。
8.3.1超声破碎
在建立表达条件过程中，小量制备样品可用小型超声细胞粉碎仪。离心1.0～1.5ml 诱导后的菌液收集菌体，然后视菌体的量加入300～500μl的缓冲液重悬细胞，然后置于冰上超声破碎。因很多实验室有自己的小型超声粉碎器,各个操作不尽相同，具体操作参考仪器说明书。常规操作步骤如下（以100ml 培养液为例）：
（1）100 ml 诱导后的菌液（OD600=1.2 左右），12000 rpm，4℃离心2min，收集菌体。
（2）加入预冷的缓冲液50ml，重悬细胞洗涤菌体一次，12000 rpm，4℃离心2min，收集菌体；常规的操作所使用的缓冲液多为PBS 或者 Tris-NaCl，针对不同的载体和纯化方法，选择相应的缓冲液。对于一些蛋白酶敏感的目的蛋白，可以在整个操作过程中加入一些蛋白酶抑制剂。
（3）向沉淀中加入15ml的缓冲液同上（若菌体太浓，可加倍），充分悬浮，将菌悬液装在一个玻璃小烧杯中，置于冰水混合物中。
（4）破碎：将用缓冲液洗涤过的超声探头伸入到菌液中，不要接触烧杯底部，每处理30sec间隔1min使菌液冷却，输出强度为5～6，频率为60～70％。
（5）分离上清和沉淀：12000 rpm，4℃离心20min，分离上清和沉淀。
（6）SDS-PAGE 分析蛋白表达情况。
（7）准备纯化蛋白。
超声破碎注意事项与一些小的改进：
（1）破碎完全的判断：超声前菌悬液是浑浊的，超声完全后变的透明、清澈。
（2）如果超声时出现黑色沉淀，说明超声功率太强。
（3）超声时间太长、功率太高对蛋白活性肯定有影响。
（4）尽量防止泡沫的产生。
（5）大量破碎时将菌液置于一玻璃器皿中，破碎时放在冰水混合物中，以增加散热，减小对蛋白的破坏作用。
（6）破碎前的预处理，在破碎前可用溶菌酶（100μg/ml）处理破环细胞壁（10min，30℃），增加细胞的通透性。
8.3.2压力破碎
高压破碎是大量的破碎提取细胞内成份的首先方法，相对于超声破碎，它具有过程温和，操作迅速等优点，具体使用需要根据具体的仪器使用说明。
FRENCH? PRESS 细胞破碎仪标准操作规程
（1）使用前将高压腔、底座、活塞杆在4℃冰箱中预冷30min。
（2）将三脚固定器置于水平桌面上，将高压腔正放在固定器器上；在活塞杆的O型环、底座的O型环和针形阀的O型环上均匀涂上少量凡士林。
（3）把活塞杆正向插入高压腔至最大加样线，将整个腔体连同活塞杆一起倒转固定在固定器上。
（4）将菌液倒入腔体，最大处理量为35ml，最小为5ml。视样品体积，大致估计并调整活塞杆的位置。
（5）将针形阀和样品喷射管装配于底座上，针形阀拧到轻轻不能拧动为止，并向反方向稍微松动，保证阀门处于开启状态（注意：务必不能用力拧紧，否则会降低其密封性）。把底座倒扣于腔体上，向上调整活塞杆的位置，直至腔内空气完全排出，流
出一滴样品为止，轻轻旋紧针形阀。
（6）双手托起整个高压腔组件，翻转至正向位置，将其置于升降台上（事先要确保操作台足够的低，以容的下整个组件），向后推动底座，使底座固定于三个位置校准针之间，并调整腔体使针形阀朝向正面。将固定夹固定于支持杆上，拧紧固定夹上的
两个螺丝以固定腔体。将活塞杆上的手柄转至与固定夹垂直的方向。
（7）打开电源，将档位手柄转至HIGH档，顺时针旋转压力控制阀至50psi，升降台开始上升，当活塞杆接触上顶台后，继续顺时针旋转压力控制阀，直至压力达到需要的压力（大肠杆菌的破碎压力一半设定为12000psi，芽孢杆菌设定为
2000psi）。
（7）取一冰预冷的离心管（或者将离心管至于冰中）置于样品喷射管出口处，轻轻逆时针转动针形阀，小心控制样品的流出速度，根据破碎程度决定流速（建议在喷射管出口处接一个1cm长的透明的塑料管如输液管，通过观察塑料管流出样品的透明度来判断破碎是否完全）。当活塞杆上的安全指示线（Stop Line）降至腔体上表面时，迅速关紧针形阀（不要过紧），旋转档位手柄至DOWN位置。待升降台完全下降后，继续降低压力至零，关闭电源。
（8）松开固定夹，取出高压腔，重新倒置于三脚固定器上，取出底座。将各部分拆开，彻底清洗。底座及喷射管的内壁要重点冲洗，涂有凡士林处要用洗洁精彻底洗净。
【注意事项】
（1）仪器最大承受压力为4000psi（指示针2500）。
（2）各O形环处（包括样高压腔，底座，活塞杆和针形阀）一定要涂凡士林润滑，以降低磨损，防止损伤。
（3）压力的升高或降低速度要控制在一定范围内。升高压力前务必保证整个组件固定于升降台上,任何的松动可能导致事故。（4）活塞杆的手柄要与固定夹垂直，否则会发生危险。
（5）严禁将出样阀过分拧紧，否则会损坏内部撞针，以不流出液体为准。
（6）严禁使活塞杆下至安全线以下，否则会导致活塞杆与底座损坏。
（7）使用完毕要将压力控制阀转至压力为零。
（8）各部件清洗要彻底，否则底座小孔容易堵死，活塞杆上残留的菌体会在未洗净的凡士林上滋生。
（9）长期不用应保存在干燥的环境中，必要时可涂凡士林防止生锈。
（10）压力腔的空气一定要完全排出，否则当样品完全排出时，造成活塞与压力池底座直接接触，造成损伤，由于压力非常大，有可能导致活塞或压力池底座变形，造成永久性损伤！
（11）在搬动装好的样品池时，一定要双手，一手扶住住高压腔，一手托住底座，防止底座脱落而造成事故。
（12）O型环若老化则及时更换。
（13）操作过程中禁止将液体溅入机箱内部。
（14）仪器使用过程中出现故障应及时与负责人联系。
8.4目的蛋白的纯化
8.4.1 His Tag 纯化操作实例
本实验室中所用的表达载体pET28a（+）中含有一个编码多聚组氨酸的序列，即His-Tag，因此会获得带有His-Tag 的重组目标蛋白。His-Tag可与金属Ni2+离子结合，从而有利于目标蛋白的纯化。加上了His-Tag的蛋白在非变性的条件下可用Ni2+亲和层析柱纯化。纯化蛋白的原理是：当亲和层析柱负载了Ni2+后，可以选择性吸附暴露在蛋白表面具有复杂结构的氨基酸残基（特别是组氨酸残基）。蛋白质中含有的组氨酸越多，与Ni2+结合的特异性就越高，则将其洗脱下来会需要更高的咪唑浓度。含有组氨酸标签的目标蛋白与细胞中的总蛋白相比，具有更高的Ni2+结合特异性。为了得到具有较高纯度的目标蛋白，必须找到一个合适咪唑浓度的洗脱液（结合缓冲液），在此浓度下非特异性的杂蛋白能从柱上洗脱下来，而与Ni2+特异性结合的目标蛋白不会被洗脱。最后用更高咪唑浓度的缓冲液（洗脱缓冲液）将目标蛋白洗脱下来，此时目标蛋白特异性的存在于该咪唑浓度的洗脱液中，从而得到纯化了的目标蛋白质。
8.4.1.1 重组蛋白的诱导
（1）载体构建：本实验采用pET-28a（+）表达载体，克隆受体菌为E.coli DH5α，表达宿主为E.coli BL21(DE3)。具体操作参考基因克隆与转化部分。
（2）挑一个转化重组质粒的单菌落接种于5ml LB液体培养基中（含100μg/m卡那霉素和），于37℃过夜培养。
（3）取1ml过夜培养物，转接于100ml含100μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃培养1.5～2小时至对数生长期。
（4）在培养物中加入异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度为0.2 mM，按照预先建立的最佳表达条件进行诱导表达。（5）1200 rpm，离心2min，收集菌体。
（6）弃上清，向沉淀中加入500ml Starting buffer（20mM磷酸缓冲液（Na2HPO4和NaH2PO4），200mM NaCl，10% 甘油，pH 7.0），充分悬浮洗涤菌体。
（7）12000 rpm，离心2min，收集菌体。
（8）向沉淀中加入15ml的starting buffer，重悬菌体。
（9）冰浴条件下超声波处理3min，每处理30sec间隔1min使菌液冷却，输出强度为5～6，频率为60～70％，处理时以不发生气泡，不过热为准，以菌液变清晰为终止标准。
（10）12000 rpm，4℃离心20min，将上清移到干净灭过菌的50ml离心管。
SDS-PAGE 分析蛋白的表达情况。若目的蛋白分布在上清中，继续进行下面的纯化操作。
8.4.1.2 目标蛋白的体外纯化
（1）灌制好Ni2+-NTA亲和层析柱（Ni-NTA琼脂糖亲和层析柱？），用去离子水进行缓慢洗脱，避免在柱床中引入气泡。
（2）用10倍柱床体积的starting buffer进行预平衡，上样，将细胞破碎后的上清液注入Ni2+-NTA亲和层析柱中。
（3）用10倍ml的starting buffer进行漂洗，收集滤过液。
（4）开始用5倍柱床体积的含20 mM咪唑的starting buffer进行洗脱，并对洗脱液进行收集。
（5）依次用5倍柱床体积的含40 mM，60 mM，80 mM，100 mM，200 mM，300 mM和500 mM咪唑的starting buffer进行洗脱，分别对洗脱液进行收集。
（6）通过SDS-PAGE检测回收的效果，确定咪唑最合适洗脱浓度。
（7）从每管收集的滤出液取出10μl的样品，加入10μl的2X SDS凝胶加样缓冲液，摇匀。
（8）沸水浴处理3min。
（9）取出样品，将10μl样品全部上样于适当浓度的SDS聚丙烯酰胺凝胶上电泳。
【注意事项】
（1）样品可贮存于4℃，以备在聚丙烯酰胺凝胶上加样。
（2）用考马斯亮蓝或银染液进行染色，检测重组蛋白的纯化程度，并找到咪唑最合适洗脱浓度，也就是纯化蛋白含量最多的一管洗脱液所对应的浓度；并将该纯化出来的蛋白质经过PD-10柱子以去掉溶液中的咪唑。
（3）蛋白质被洗脱完成之后，要及时地清洗柱子，使柱子能重复使用。
（4）在下次对同一蛋白的纯化过程中，即可根据胶图所显示的个洗脱液中蛋白浓度的情况来优化整个洗脱过程。
蛋白质溶液的去盐处理（使用PD-10去盐柱）
（1）用10ml的starting buffer平衡PD-10去盐柱。
（2）上样：往PD-10去盐柱中加入2.5ml的蛋白质溶液。
（3）用10ml的starting buffer去洗PD-10去盐柱，开始收集滤出液，每1ml收集一管。离心管应该先在冰上预冷。
（4）电泳检测重组蛋白质的纯化程度。
（5）具体方法和过程与上面步骤一致。
（6）选择合适的纯化蛋白样品，加入1倍体积的预冷甘油。接着将蛋白质样品置于－80℃保存，以备使用。
【注意】PD-10去盐柱可以多次反复使用，但是不能使柱子变干，保存时应该用相应的缓冲液浸泡，并且置于4℃。
图 1：PD-10去盐柱除去盐离子示意图（载自Amersham Biosciences产品说明）
8.4.1.3 His-tag NOTE
（1）若His标签蛋白没有结合，请依次检查：
可能原因1：样品或者是结合缓冲液不正确。策略：检测pH 及样品和结合缓冲液的组成份。确保在溶液中鳌合剂或强还原剂的浓度及咪唑的浓度不是太高。
可能原因2：组氨酸的标签没有完全的暴露。策略：在变性条件下(用4～8 M 脲，或4～6 M盐酸胍)进行纯化。
可能原因3：HIS标签丢失。策略1：WB或者anti-his的抗体检查His是否表达，上游构建，改变his-tag 的位置(C-terminal or N-terminal)，必要时增加his个数(常用6～10个)；策略2：孵育的时间不够，降低流速和增加孵育的时间；策略3：改变螯合的金属离子，寻找到最佳的结合金属离子。
（2）若没有洗脱下来，请依次检查：
可能原因1：洗脱条件太温和（组氨酸标记的蛋白质仍然结合在柱上，结合力较强）。策略：用增加咪唑的梯度洗脱或降低pH来找出最佳的洗脱条件。
可能原因2：降低PH的方法洗脱的，因为若PH低于3.5，会导致镍离子脱落。策略：改变洗脱办法，咪唑竞争性洗脱。
可能原因3：蛋白已沉淀在柱上。策略：减少上样量，或使用咪唑的线性梯度而不是分步洗脱以降低蛋白的浓度。试用去污剂或改变NaCl的浓度，或在变性条件(去折叠)下洗脱(用4～8 M脲，或4～6 M 盐酸胍)。
可能原因4：非特异性疏水或其他相互反应。策略：加非离子去污剂到洗脱缓冲液（如，2%Triton X-100）或增加NaCl的浓度。
（3）HIS标签蛋白洗脱后杂带较多，什么原因? 如何优化?
高纯度的蛋白是纯化工作者的追求，但是由于很多天然的蛋白也会带有HIS，所以经常会出现HIS标签蛋白洗脱后有一些杂带，可能的原因和优化的方法如下：
可能原因1：蛋白酶部分降解了标签蛋白。策略：请添加蛋白酶抑制剂，（慎用EDTA）。
可能原因2：杂质对镍离子有更高的亲和性。策略1：咪唑浓度必须优化，以确保高纯度（宿主细胞蛋白质的低结合）和高产率（组氨酸标记的目标蛋白质的强结合）之间的最佳平衡。分步或者线性洗脱摸索出最优的咪唑结合和清洗浓度；在样
品中加入与结合缓冲液同样浓度的咪唑；咪唑的梯度不大（20个或更多的柱床体积），可能分离出有相似结合强度的蛋白。策略2：筛选最适合的缓冲液条件，NaCl浓度，PH的范围都需要进行筛选，以便决定最适的结合和洗脱条件。对于单一目标蛋白在进行缓冲液筛选时，将缓冲液、盐、甘油和还原剂设计成几个不同的混合配方。
可能原因3：杂质和标签蛋白结合在一起。策略：在超声破碎细胞之前加入去垢剂或者还原剂；增加去垢剂的浓度，（2 % Triton X-100 or 2 % Tween 20）；或者在wash buffer中增加甘油的浓度（50%）减少非特异性的相互反应；考虑增加咪唑的浓度或者改变金属离子
可能原因4：洗涤不充分。策略：增加洗涤的次数,使洗涤充分。
8.4.1.4 NTA树脂的再生
NTA树脂在使用若干次数（3～5次）后，结合效率有所下降，可以用以下方法再生，提高树脂的使用寿命和蛋白质的结合效
率。注意：NTA树脂再生前需要从层析柱下端流干所有溶液，估计出NTA的树脂体积，按下列次序将再生试剂加到层析柱里，在等上一再生溶液流干后，再加下一再生溶解。用户需要自行准备25%，50%，75%，100%（v/v）乙醇和去离子水。
NTA再生步骤：
（1）从层析柱下端流干所有溶液，用2倍NTA树脂体积的0.2M Acetic Acid/6M gμanidine HCl 洗。（2）用2倍体积的去离子水洗。
（3）用3倍体积的2% SDS洗。
（4）用1倍体积的25%乙醇洗。
（5）用1倍体积的50%乙醇洗。
（6）用1倍体积的75%乙醇洗。
（7）用5倍体积的100%乙醇洗。
（8）用1倍体积的75%乙醇洗。
（9）用1倍体积的50%乙醇洗。
（10）用1倍体积的25%乙醇洗。
（11）用1倍体积的去离子水洗。
（12）用5倍体积的0.1M EDTA pH8.0洗。
（13）用3倍体积的去离子水洗。
（14）如果立即使用，用5倍体积的100mM NiSO4.6H2O洗，再用10倍体积的平衡溶液（NTA-0 buffer 或GμNTA-0 buffer）洗。
（15）如果想长期储存，加入1倍体积的20%乙醇，4度保存，使用前需要执行步骤14。
8.4.2 GST 亲和标签的纯化
谷胱甘肽S- 转移酶（GST）是继组氨酸之后的第二个应用最多的重组蛋白标记。GST 融合于目标蛋白的N端，可以通过谷胱甘肽-琼脂糖亲和层析进行纯化。由于GST 对底物还原性谷胱甘肽的亲和力是亚摩尔级的，因此谷胱甘肽固化于琼脂糖形成的亲和层析树脂对GST 及其融合蛋白的纯化效率很高。用1ml 的树脂纯化1L 的大肠杆菌培养物可得到的目的蛋白产率为0.1～6.0 mg。
GST 亲和纯化融合蛋白主要包括结合，洗涤，洗脱三个步骤，全过程只需要一到两种缓冲液，可以大量纯化，也可以小量的实现快速纯化。非常适合实验室小量制备大肠杆菌重组蛋白。下面以克隆到表达载体pGEX-6p-1上的GFP 表达纯化为例，介绍一种小量快速的纯化方法，供大家参考。蛋白的诱导与样品的制备方法基本同上。
8.4.2.1 GST 亲和标签纯化的使用
（1）从4℃冷柜中取出Glμtathione Sepharose 4B（本产品购置GE公司，储存于20%乙醇，树脂的量和20%乙醇1：1），轻柔、充分翻转摇匀树脂悬浊液。
（2）用宽嘴吸头吸取1ml 的脂浆，加入到装有40ml 的PBS(整个操作过程所有的PB均需预冷) V型离心管中，轻柔颠倒数次，洗涤除去残留的20%乙醇，2000 rpm，离心5min，小心倾倒出PBS。
（3）将破碎后的上清加入平衡上一步骤中的树脂中，轻轻混匀，4℃振荡温育，500 rpm ，1h，期间不断混匀，防止树脂沉淀，保GST-GFP 充分结合于树脂上。
（4）2000 rpm，离心5min，小心倾倒出上清。
（5）向沉淀中加入约40ml 的PBS，轻柔混匀，振荡温育10 min，2000 rpm，离心5min，小心倾倒出上清。
（6）重复步骤（5）一次，然后向沉淀中加入5ml 的PBS 悬浮树脂，并将悬浮液转移到一个10ml 的塑料层析柱，并打开阀门放掉PBS。
（7）洗脱收集目的蛋白。根据实验需要不同有两种方法来收集目的蛋白。
方法一：是不切除GST-tag，可以向（6）中的树脂中加入1～2ml 的洗脱缓冲液（50 mM Tris-HCl，10 mM 还原性谷胱甘肽（GSH），pH 8.0），轻轻混匀然后4℃温育10min，收集流出液，即为GST-GFP的纯化产物。
方法二：是纯化不含GST-tag 的蛋白，按照说明书将蛋白酶PreScission Protease（GE公司）用PBS 稀释到到1ml，加入到（6）中的树脂中，轻轻混匀然后4℃温育12h，收集流出液，即为GFP的纯化产物。
（8）SDS-PAGE 分析纯化的蛋白。可以对操作过程中的每一步取样进行SDS-PAGE分析。
8.4.2.2 Glμtathione Sepharose 4B 再生
GST?Bind树脂可以重复使用数次而无需再生。但随着非特异性结合的蛋白的增多和蛋白的聚集，往往会造成流速和结合载
量都下降。为了去除结合在树脂上的蛋白，可以用10倍体积的50mM Tris-HCl，0.5M NaCl，pH8.0洗树脂，接着用10倍体积的100mM醋酸钠pH4.5，0.5M NaCl再洗一次。其它可以选用做去除污染蛋白的缓冲液还包括：
6M尿素，6M盐酸胍或低极性溶剂，如50～70%乙醇或50%乙二醇。任何上述处理后应该立即用10倍柱体积1X GST Bind/Wash buffer平衡。树脂可以在4℃下，20%乙醇/80%水中长时间存放。
8.4.2.3 GST使用过程中可能的问题与对策
（1）目标蛋白结合效率低
结合条件不对：仔细核对各种溶液、缓冲液的成分和pH。低于pH6.5或高于pH8时，融合蛋白与GST?Bind树脂会结合不充分。确保树脂在与细胞裂解液结合前经过pH6.5～8.0缓冲液（如1X GST Bind/Wash buffer，
PBS）的平衡细胞裂解前加入DTT会显著改善某些GST融合蛋白与GSTBind树脂的结合
GST融合蛋白被超声打断降解：过度超声会破坏带标签的蛋白而减少其与树脂的结合。采用温和的超声条件或改用其它的破碎方法。
蛋白的折叠问题：GST 标签不能够正确的折叠难以结合GSH的底物。
（2）蛋白难以洗脱
洗脱体积太少：有时需要使用更多的缓冲液洗脱目的蛋白。
洗脱缓冲液不新鲜： 10XGST洗脱缓冲液－20℃下可以稳定存放6个月，最多耐受5次冻融。每次在临纯化前新鲜配制1X洗脱缓冲液
洗脱缓冲液中谷胱甘肽浓度太低：GST?Bind树脂的还原型谷胱甘肽浓度达到10mM就够了。但是洗脱时需要的还原型谷胱甘肽的浓度需要达到75mM。
（3）纯化的蛋白杂质很多
表达的蛋白不完整：再遇到一些稀有密码子或者特殊的RNA的二级结构时，可能使得目标蛋白截短表达，可采用一些特殊的表达宿主，如Rosetta系列。
洗涤体积不够：增加洗脱量。
洗脱条件：可已在洗脱缓冲液中加入一定量的非离子去污剂，如0.1%的Triton-100 或NP-40等。也可以尝试提高洗脱时NaCl 的浓度，以降低非特一性的结合。
操作过程中目标蛋白降解：控制操作条件，比如严格4℃操作，缓冲液中加入蛋白酶抑制剂，
超声处理过度：减少超声，避免发泡导致蛋白变性。过度超声还会增加宿主内源蛋白与GST融合目的蛋白共纯化
共价共纯化：胶上有些多出来的条带是共纯化的促进蛋白正确折叠的分子伴侣，如：DnaK（70kDa），DnaJ（37kDa），GrpE（40kDa），GroEL（57kDa），和GroES（10kDa），再进行一次纯化可以改善。
8.4.3 MBP 亲和标签的纯化
原理：pMAL?系统是一种高效的蛋白融合表达及纯化系统。pMAL载体含有编码麦芽糖结合蛋白（Maltose Binding Protein, MBP）的大肠杆菌malE基因，其下游的多克隆位点便于目的基因插入，表达N端带有MBP的融合蛋白。通过“tac”强启动子和malE翻译起始信号使克隆基因获得高效表达，并进一步利用MBP对麦芽糖的亲和性达到用Amylose柱对融合蛋白的一步亲和纯化。
此系统的pMAL载体含有LacZα基因，目的基因的插入导致其失活，通过X-gal平板可进行蓝白斑筛选。 pMAL载体都含有一段编码蛋白酶识别位点的序列，融合蛋白纯化后，通过Factor Xa（X），Enterokinase（E）或
GenenaseTM I（G）可将目的蛋白与MBP切割分离。
pMALTM-c2 系列载体缺失malE 信号序列，导致融合蛋白在细胞质中表达。pMAL-p2系列载体含有malE 信号序列，它可引导融合蛋白穿过胞质膜，进入周质。所有这些载体都含有一段编码蛋白酶识别位点的序列，融合蛋白纯化后，通过Factor Xa（X），Enterokinase（E）或GenenaseTM I（G）可将目的蛋白与MBP切割分离。Amylose 树脂预装柱是一亲和基质，用来分离与麦芽糖结合蛋白融合的目的蛋白。
结合容量：每毫升柱床体积可结合3.0 mg MBP-Paramyosin 融合蛋白。
贮存：本品预膨胀在20%的乙醇中，4°C贮存。
过柱缓冲液：20 mM Tris-HCl， pH7.4，200 mM NaCl，1 mM EDTA。
添加剂：1 mM sodiμm azide；10 mM β－mercaptoethanol 或1 mM DTT。
洗脱缓冲液：过柱缓冲液+10 mM 麦芽糖
实验步骤：
（1）重组质粒的构建，转化，融合蛋白的诱导表达和细胞破碎同上。
（2）融合蛋白的亲和纯化：
预装柱用8～12倍柱床体积的双蒸水冲洗；
预装柱用9倍柱床体积过柱缓冲液平衡；
将上述实验步骤三的上清液加入到柱床内，控制流速0.5～1 ml/min（建议每次上样2～4ml）。
用12倍柱床体积的过柱缓冲液淋洗未结合蛋白，每次用6ml，共4次。
用4倍柱床体积的洗脱缓冲液洗脱与Amylose树脂结合的MBP融合蛋白，控制流速约0.5～1 ml/min。收集3～5管样品洗脱液，收集体积为1 ml/每管。通常，含目的蛋白的融合蛋白在一个柱床体积内将被洗脱下来，可以通过波长为280 nm的紫外吸收光或考马斯亮蓝蛋白检测法进行检测。
SDS-PAGE检测洗脱样品*。
再生。每次纯化蛋白完毕后，需要及时对Amylose树脂进行再生。 Amylose树脂可以采用下述清洗步骤进行再生
水3倍柱床体积
0.1% SDS3倍柱床体积
水1倍柱床体积
过柱缓冲液3倍柱床体积
【注意事项】
（1）每次使用时，请先打开顶端的帽子再移去底部的帽子，以避免气泡进入到预装柱内。
（2）在使用本预装柱时，请使用经过脱气后的缓冲液，以避免产生气泡。
（3）预装柱在每次使用完毕后，在柱床上方加入2～4 ml 缓冲液或水，盖上顶端的帽子后，随即盖上底部的帽子，竖立放置于4℃贮存。
（4）长期贮存时应贮存在含0.02％叠氮钠的缓冲液中或20％乙醇中，以避免染菌。
【pMAL系统的优势】
（1）75%的蛋白可获得高效表达，蛋白产量可达100 mg/L
（2）与其他几种常用表达系统研究比较，与MBP融合表达更能提高E. coli表达蛋白的可溶性。
（3）采用麦芽糖温和洗脱：无去污剂或变性剂对蛋白活性的影响。
（4）可在细胞质或周质中表达（pMAL-p2X载体）：周质表达可提高二硫键的形成，促进蛋白折叠的形成。
8.5目的蛋白的后处理
8.5.1目的蛋白的浓缩
蛋白的浓缩液是蛋白纯化过程中常用的操作，常用的方法有：
（1）透析袋浓缩法
利用透析袋浓缩蛋白质溶液是应用最广的一种。将要浓缩的蛋白溶液放入透析袋（无透析袋可用玻璃纸代替），结扎，把高分子（6 000～12 000）聚合物如聚乙二醇（碳蜡）、聚乙烯吡咯、烷酮等或蔗糖撒在透析袋外即可。也可将吸水剂配成30～40％浓度的溶液，将装有蛋白液的透析袋放入即可。吸水剂用过后，可放入温箱中烘干或自然干燥后，仍可再用。
（2）冷冻干燥浓缩法
这是浓缩蛋白质的一种较好的办法，它既使蛋白质不易变性，又保持蛋白质中固有的成分。它是在冰冻状态下直接升华去除水分。具体做法是将蛋白液在低温下冰冻，然后移置干燥器内（干燥器内装有干燥剂，如NaOH、CaCl2和硅胶等）。密闭，迅速抽空，并维持在抽空状态。数小时后即可获得含有蛋白的干燥粉末。干燥后的蛋白质保存方便，应用时可配成任意浓度使用。也可采用冻干机进行冷冻干燥。
（3）超滤膜浓缩法
此法是利用微孔纤维素膜通过高压将水分滤出，而蛋白质存留于膜上达到浓缩目的。有两种方法进行浓缩：一种是用醋酸纤维素膜装入高压过滤器内，在不断搅拌之下过滤。另一种是将蛋白液装入透析袋内置于真空干燥器的通风口上，负压抽气，而使袋内液体渗出。
（4）凝胶浓缩法
选用孔径较小的凝胶，如SephadexG25或G50，将凝胶直接加入蛋白溶液中。根据干胶的吸水量和蛋白液需浓缩的倍数而称取所需的干胶量。放入冰箱内，凝胶粒子吸水后，通过离心除去。
8.5.2蛋白质的定量
定量作为生物实验室的日常工作之一，具有非常重要的意义。在生物学相关的研究中，无论是对蛋白质表达谱的定量比较还是蛋白质理化性质的分析，都建立在准确的定量这一基础之上。蛋白质的快速定量方法主要依靠蛋白质本身的发色基团，或其与其它显色剂反应产生的紫外吸收来进行定量。目前常用的主要有直接紫外吸收法、Bradford法和Lorry法三种。
（1）直接紫外吸收法
由于蛋白质中存在着含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，所以任何一个蛋白质都具有280nm附近的紫外吸收峰，在此波长范围内，蛋白质溶液的光密度OD280nm与其浓度呈正比关系，我们可以对其进行定量。紫外吸收法测定蛋白质含量迅速、简便、不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。因此，已在蛋白质和酶的生化制备中广泛采用，尤其在柱层析分离纯化中，常用280nm 进行紫外检测，来判断蛋白质吸附或洗脱情况。但该法存在无法弥补的缺陷。首先，对于测定那些与标准蛋白质中酪氨酸和色
氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定的误差，故该法适于测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。其次，若样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外光的物质，会出现较大干扰。例如，在制备酶的过程中，层析柱的流出液中有时混杂有核酸，应予以校正。
（2）Bradford法
目前，实验室一般不采用紫外吸收法，而通常采用改良的Bradford法进行测定蛋白质含量。其原理为，蛋白质与染料考马斯亮蓝G-250结合，使得染料最大吸收峰从465nm变为595nm，在一定的线性范围内，反应液595nm处吸光度的变化量与反应蛋白量成正比，测定595nm处吸光度的增加即可进行蛋白定量。测定时一般用牛血清白蛋白作为标准品。该法测定要求样品中不能有能与考马斯亮蓝G-250反应显色的去污剂，比如Triton、NP-400、吐温等。与具体操作可参考相关试剂盒说明书。
（3）Lorry法
其原理是蛋白质与碱性铜溶液中的Cu2+络和使得肽键伸展，从而使暴露出的酪氨酸和色氨酸在碱性铜条件下与福林试剂反应，产生蓝色，在一定浓度范围内，其颜色的深浅与蛋白质中的酪氨酸和色氨酸的含量成正比，由于各种蛋白质中的酪氨酸和色氨
酸的含量各不相同，因此在测定时需使用同种蛋白质作标准。具体操作可参考相关试剂盒说明书。
一般而言，紫外吸收法适合于与色谱柱联用，达到实时监控，然而较不准确。Bradford法适合于大规模测定样品，但是样品中不能含有太高浓度的去污剂，对样品的要求较高。改良的Lorry法不再排斥去污剂，相对的操作就比较复杂。我们需要在试验中按照要求选用不同的定量方法。目前后两种常用的定量方法都有相关的试剂盒采用。
8.5.3蛋白的保存
纯化的蛋白往往需要在一定的保存条件，以保证目标蛋白的稳定，避免活性丧失。
蛋白溶液的保存原则：
（1）缓冲液pH 避免接近蛋白的等电点；
（2）根据每次使用的量分装成多管，这样可避免反复冻融；
（3）加入稳定剂如甘油，DTT, TritonX-100等。具体操作根据实验需要和蛋白特性，多数蛋白都可以加入终浓度为50%的甘油后－80℃保存。
枯草芽孢杆菌的介绍
目录 第一章芽孢杆菌的简要介绍 (1) 第一节芽孢杆菌种类 (1) 第二节芽孢杆菌表达系统发展简史 (2) 第二章枯草芽孢杆菌的转化系统 (3) 第一种方法：电转化 (3) 第二种方法：Spizizen转化 (3) 第三种方法：原生质体法(Takashi) (4) 第四种方法：原生质体转化之二 (4) 第五种转化方法：质粒混合法（BGSC推荐） (5) 第三章芽孢杆菌表达系统发展简史 (6) 第一节芽孢杆菌表达系统的优点（相对于大肠杆菌） (7) 第二节芽孢杆菌的缺点 (7) 第三节助表达系统 (7) 第四节芽孢杆菌基因表达的主要特点 (7) 第四章枯草芽孢杆菌转录翻译系统 (8) 第一节：转录系统 (9) 第二节：翻译系统 (9) 第五章芽孢杆菌常用的宿主和载体 (10) 第六章芽孢杆菌表达系统应用实例 (11) 1 中国 (11) 2 日本 (12) 3 加拿大 (12) 第七章芽孢杆菌其他产品 (13) 第一节核苷类产品 (13) 第二节核黄素 (13) 第三节微生物制剂/益生菌 (13) 第八章结语 (14) 附录一. 芽孢杆菌的相关经典文章 (14) 附录二. 枯草芽孢杆菌相关数据库 (15) 致谢及参考文献 (15)
第一章芽孢杆菌的简要介绍 芽孢杆菌作为一个属，于1872年被首次提出，至今已有一百多年。目前人们对芽孢杆菌的研究几乎涉及到了革兰氏阳性可生孢细菌的各个领域。尤其是在感受态、芽孢形成及其调控、遗传操作、菌种改良、生物技术等领域进行了大量的工作。芽孢杆菌是一个泛泛的概念，而科学研究中应用最多的当属枯草芽孢杆菌，例如168菌株及其大量的衍生菌株。枯草杆菌的研究之所以领先于其他芽孢杆菌的种，主要是由于他的转化、转导方法较完善，以及大量的衍生菌株。 目前应用最多的芽孢杆菌属菌种有枯草芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、球形芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌和耐碱的芽孢杆菌以及病原菌炭疽芽孢杆菌等12种。 第一节芽孢杆菌种类 目前，芽孢杆菌属很多菌株的全基因组序列已经报道，截至2011年10月，在KEGG 上公布全基因组序列的芽孢杆菌属菌种有： 简称菌种名称测序时间测序链接 bsu Bacillus subtilis1997RefSeq bss Bacillus subtilis subsp. spizizenii W232010RefSeq bst Bacillus subtilis subsp. spizizenii TU-B-102011 RefSeq bsn Bacillus subtilis BSn52011RefSeq bha Bacillus halodurans2000RefSeq ban Bacillus anthracis Ames2003RefSeq bar Bacillus anthracis Ames 05812004RefSeq bat Bacillus anthracis Sterne2004 RefSeq bah Bacillus anthracis CDC 6842009 RefSeq bai Bacillus anthracis A02482009 RefSeq bal Bacillus cereus biovar anthracis CI2010RefSeq bce Bacillus cereus ATCC 145792003RefSeq bca Bacillus cereus ATCC 109872004RefSeq bcz Bacillus cereus ZK2004RefSeq bcr Bacillus cereus AH1872008 RefSeq bcb Bacillus cereus B42642008 RefSeq bcu Bacillus cereus AH8202009 RefSeq bcg Bacillus cereus G9******* RefSeq bcq Bacillus cereus Q12009RefSeq
肠毒性大肠杆菌的绿色荧光蛋白转化及表达研究
第45卷 增刊2006年5月 厦门大学学报(自然科学版)Journal of Xia men University (Natural Science ) Vol .45 Sup. M ay 2006 收稿日期:2005212227 基金项目:福建省发展和改革委员会重大产业技术开发专项 (20042427)资助 作者简介:朱红梅(1981-),女,硕士研究生. 3通讯作者:fzliubo@https://www.wendangku.net/doc/fa15716718.html, ;htzhou@jingxian .x mu .edu .cn 肠毒性大肠杆菌的绿色荧光蛋白转化及表达研究 朱红梅1 ,周涵韬 1,23 ,张赛群 1,2 ,曹 宜2,刘 波 23 (1.厦门大学生命科学学院,福建厦门361005;2.福建省农业科学院生物技术中心,福建福州350003) 摘要:通过电击转化法,将带有 gfp 标记基因的pG LO 质粒成功转化到肠毒素型大肠杆菌K 88、K 99中,经过紫外检测及荧 光显微镜检测均发现转化菌株发出绿色的荧光,表明gfp 基因得到稳定、高效的表达.进一步通过PCR 分子鉴定、血清型鉴定、微生物学特性分析均表明,转化菌株与原始菌株是一致的.该转化菌株将为研究肠毒性大肠杆菌的致病机理及益生素的筛选提供有效的手段. 关键词:肠毒性大肠杆菌;绿色荧光蛋白;遗传转化中图分类号:Q 943.2 文献标识码:A 文章编号:043820479(2006)S 20043204 肠毒素性大肠杆菌(Enter ot oxigenic Escherichia co 2li .,ETEC )是一类引起人和幼畜(初生仔猪、犊牛、羔羊及断奶仔猪)腹泻的重要病原菌,初生幼畜被ETEC 感染后,常因剧烈水样腹泻和迅速脱水而死亡,发病率和死亡率均很高,是目前的研究热点之一[1] .猪源产肠毒素性大肠杆菌的黏附素抗原主要有K 88,K 99,987P . 来自多管水母(A equoreavitoria )的绿色荧光蛋白(green fluorescence p r otein,GFP )基因是目前应用广泛的一种报告基因[2] .在各种不同的系统中表达后,重组GFP 均可吸收蓝光,发出明亮的绿色荧光.与其它生物标记基因比较,它的最大优点是不需要任何底物或额外的辅助因子,利用其发出的荧光就可以实现 对生物的活体监测[3] ,为重组子的筛选及诸多生物学、免疫学试验提供了一个直观手段. 本研究利用gfp 基因标记ETEC,希望获得gfp 基因稳定表达、特性稳定的发光标记菌株,为进一步研究ETEC 侵染途径及治病机理奠定基础,同时也方便益生素的筛选及效果评价. 1 材料与方法 1.1 材 料 肠毒性大肠杆菌菌株C83905(K 88ac ),C83529(K 99)由福建省农科院畜牧兽医研究所提供.质粒pG 2 LO 购自B i o 2Rad 公司,有Amp (氨卞青霉素)抗性和 阿拉伯糖调控蛋白和gfp 基因. 蛋白胨为上海生工BB I 公司产品,酵母抽提物为OXO I D 公司.d NTPs 、TaqDNA 聚合酶、购自上海生工;100bp DNA Ladder 购自B i olabs . BECK MAN 冷冻离心机,B i o 2Rad Gene Pulser Ⅱ电穿孔仪,B i o 2Rad 电泳仪,OLY MP US 荧光显微镜. 1.2 实验方法 (1)质粒提取方法 挑取紫外灯下发绿色荧光的质粒宿主菌DH 5 α的单菌落,于10mL 含100μg ?mL -1 Amp 的LB 液体 培养基中,37℃振荡培养过夜.碱裂解法提取质粒[4] .提取的质粒用0.8%琼脂糖电泳检测纯度. (2)感受态细胞的制备 在NA 液体中摇床震荡培养ETEC 至OD 600为0.6,取菌液冰浴10m in,8000r/m in 4℃离心收集菌体.冰预冷的无菌水洗菌体4次,最后将菌体重悬于10%甘油中,-70℃冰箱保存备用. (3)电击转化 2mm 电转化杯冰上预冷后,分别加入100μL 感受态细胞和50ng 质粒,冰浴10m in 后进行电击转化,电击条件为2.5kV ,200Ω,25μF .电击结束立即加入900μL 的NA 培养基,混匀并转入1.5mL 的Eppen 2dorf 管中,于37℃、120r/m in 的摇床上振荡培养2h, 取100μL 菌液涂布在NA +100μg ?mL -1 Amp +6mg ?mL -1 阿拉伯糖(ara )筛选培养基上,并置于37℃培养箱培养16h . (4)转化子的荧光检测 将筛选培养基上长出的菌落,紫外灯照射检测绿色荧光.用接种环挑取稀释后的菌液置于载波片上,常规压片,荧光显微镜观察. (5)标记菌株的PCR 鉴定 细菌基因组DNA 的提取方法参照少量制备
pET-32b(+)大肠杆菌表达载体说明
pET-32b(+) 编号 载体名称 北京华越洋生物VECT5030 pET--‐32b(+) pET32b载体基本信息 别名: pET32b, p et 32b 质粒类型: 大肠杆菌蛋白表达 表达水平: 高 克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: 5899bp 5' 测序引物: T7或者Trx--‐F 5' 测序引物序列: T7: 5'--‐TAATACGACTCACTATAGGG--‐3'; Trx--‐F: 5' T TCCTCGACGCTAACCTG 3' 载体标签: thioredoxin (N端); H is (中间和C端) 载体抗性: Ampicillin 备注: Production of soluble, active target proteins; N--‐term thrombin cleavage s ite; Nterm e nterokinase c leavage s ite; a,b,c v ary b y M CS 稳定性: 瞬时表达 Transient 组成型: 组成型 Constitutive 病毒/非病毒: 非病毒 pET32b载体质粒图谱和多克隆位点信息
pET32b载体简介 The pET--‐32a--‐c series is designed for cloning and high--‐level expression of peptide sequences fused with the 109aa Trx?Tag? thioredoxin protein (1). Cloning sites are available for producing fusion proteins also containing cleavable His?Tag? and S?Tag? sequences for detection and purification. Unique sites are shown on the circle map. Note that t he s equence i s n umbered b y t he p BR322 c onvention, s o t he T7 e xpression r egion i s reversed on the circle map. The cloning/expression region of the coding strand transcribed by T7 RNA polymerase is shown below. The f1 origin is oriented so that infection with helper phage will produce virions containing single--‐stranded DNA that corresponds to the coding strand. Therefore, single--‐stranded sequencing should be performed u sing t he T7 t erminator p rimer . pET32b载体序列 ORIGIN 1 ATCCGGATAT AGTTCCTCCT TTCAGCAAAA AACCCCTCAA GACCCGTTTA GAGGCCCCAA 61 GGGGTTATGC TAGTTATTGC TCAGCGGTGG CAGCAGCCAA CTCAGCTTCC TTTCGGGCTT 121 TGTTAGCAGC CGGATCTCAG TGGTGGTGGT GGTGGTGCTC GAGTGCGGCC GCAAGCTTGT 181 CGACGGAGCT CGAATTCGGA TCCGATATCG CCATGGCCTT GTCGTCGTCG TCGGTACCCA 241 GATCTGGGCT GTCCATGTGC TGGCGTTCGA ATTTAGCAGC AGCGGTTTCT TTCATACCAG 301 AACCGCGTGG CACCAGACCA GAAGAATGAT GATGATGATG GTGCATATGG CCAGAACCAG 361 AACCGGCCAG GTTAGCGTCG AGGAACTCTT TCAACTGACC TTTAGACAGT GCACCCACTT 421 TGGTTGCCGC CACTTCACCG TTTTTGAACA GCAGCAGAGT CGGGATACCA CGGATGCCAT 481 ATTTCGGCGC AGTGCCAGGG TTTTGATCGA TGTTCAGTTT TGCAACGGTC AGTTTGCCCT 541 GATATTCGTC AGCGATTTCA TCCAGAATCG GGGCGATCAT TTTGCACGGA CCGCACCACT 601 CTGCCCAGAA ATCGACGAGG ATCGCCCCGT CCGCTTTGAG TACATCCGTG TCAAAACTGT 661 CGTCAGTCAG GTGAATAATT TTATCGCTCA TATGTATATC TCCTTCTTAA AGTTAAACAA 721 AATTATTTCT AGAGGGGAAT TGTTATCCGC TCACAATTCC CCTATAGTGA GTCGTATTAA 781 TTTCGCGGGA TCGAGATCGA TCTCGATCCT CTACGCCGGA CGCATCGTGG CCGGCATCAC 841 CGGCGCCACA GGTGCGGTTG CTGGCGCCTA TATCGCCGAC ATCACCGATG GGGAAGATCG 901 GGCTCGCCAC TTCGGGCTCA TGAGCGCTTG TTTCGGCGTG GGTATGGTGG CAGGCCCCGT 961 GGCCGGGGGA CTGTTGGGCG CCATCTCCTT GCATGCACCA TTCCTTGCGG CGGCGGTGCT 1021 CAACGGCCTC AACCTACTAC TGGGCTGCTT CCTAATGCAG GAGTCGCATA AGGGAGAGCG 1081 TCGAGATCCC GGACACCATC GAATGGCGCA AAACCTTTCG CGGTATGGCA TGATAGCGCC 1141 CGGAAGAGAG TCAATTCAGG GTGGTGAATG TGAAACCAGT AACGTTATAC GATGTCGCAG 1201 AGTATGCCGG TGTCTCTTAT CAGACCGTTT CCCGCGTGGT GAACCAGGCC AGCCACGTTT 1261 CTGCGAAAAC GCGGGAAAAA GTGGAAGCGG CGATGGCGGA GCTGAATTAC ATTCCCAACC 1321 GCGTGGCACA ACAACTGGCG GGCAAACAGT CGTTGCTGAT TGGCGTTGCC ACCTCCAGTC 1381 TGGCCCTGCA CGCGCCGTCG CAAATTGTCG CGGCGATTAA ATCTCGCGCC GATCAACTGG 1441 GTGCCAGCGT GGTGGTGTCG ATGGTAGAAC GAAGCGGCGT CGAAGCCTGT AAAGCGGCGG 1501 TGCACAATCT TCTCGCGCAA CGCGTCAGTG GGCTGATCAT TAACTATCCG CTGGATGACC 1561 AGGATGCCAT TGCTGTGGAA GCTGCCTGCA CTAATGTTCC GGCGTTATTT CTTGATGTCT 1621 CTGACCAGAC ACCCATCAAC AGTATTATTT TCTCCCATGA AGACGGTACG CGACTGGGCG 1681 TGGAGCATCT GGTCGCATTG GGTCACCAGC AAATCGCGCT GTTAGCGGGC CCATTAAGTT 1741 CTGTCTCGGC GCGTCTGCGT CTGGCTGGCT GGCATAAATA TCTCACTCGC AATCAAATTC
大肠杆菌表达系统的研究进展综述
基因工程制药综述 班级：生技132 ： 学号：
大肠杆菌表达系统的研究进展综述 自上世纪 70 年代以来, 大肠杆菌一直是基因工程中应用最为广泛的表达系统。尽管基因工程表达系统已经从大肠杆菌扩大到酵母、昆虫、植物及哺乳动物细胞,并且近年来出现了很多新型的真核表达系统, 但是大肠杆菌仍然是基因表达的重要工具。尤其是进入后基因组时代以来, 有关蛋白结构以及功能研究的开展 ,对基因表达的要求更高,这时大肠杆菌往往是表达的第一选择。文章综述了近年来有关大肠杆菌表达载体及宿主细胞的改造工作。 1 表达载体 1. 1 表达调控 构建有效的表达载体是表达目的基因的基本要求, 同时也是影响基因表达水平以及蛋白活性的重要因素。标准的大肠杆菌表达载体的主要组成: 启动子、操纵子、核糖体结合位点、翻译起始区、多克隆位点、终止子、复制起点以及抗性筛选因子等。理想的表达载体要求在转录和翻译水平上可以控制目的基因的表达 ,然而目的基因在宿主体过分表达(选用较强的启动子等)会对宿主造成压力, 引起相关的细胞应答反应, 影响蛋白的活性等。基因组、RNA 转录组、蛋白质组、代调控组等领域的研究成果给我们提供了大量关于基因表达调控的信息[ 1]。现已能从基因和细胞的整体水平来方便地选择合适的启动子或合理开发新的载体系统。譬如 Lee 等利用二维凝胶电泳法比较了重组载体和空载体被分别转入宿主细胞后蛋白组学的差异,发现两者都产生了大肠杆菌热休克蛋白并引起了 cAMPCRP 调节蛋白的应答, 其中重组子的影响更为强烈；另外, 还发现外源基因的表达使宿主核糖体合成速率、翻译延长因子和折叠酶表达水平、细胞生长率下降 , 而使细胞呼吸活力上升[ 2]。目前应用的表达载体主要问题是表达过程中出现的全或无的情况, 通常表达的培养物都是非纯种的细胞群, 其中有一些细胞可以最大限度地被诱导,而另一些细胞在诱导后基因的表达被关闭。分离具有合适强度启动子及翻译速率的载体变种可以优化表达水平,说明启动子的选择对于基因的诱导表达非常重要。 Deborahat 提出在芯片上排列具有不同强度级别启动子的载体进行互补分析, 可能有助于筛选最为适合的启动子[3]。开发非 IPTG 或阿拉伯糖诱导的载体也可以提高基因表达水平, Qing 等利用 cspA 基因的独特性开发了一系列冷休克表达载体pCold, 使目的基因在低温下(<15℃) 诱导表达,提高了产物的溶解性和稳定性[4]。 1. 2 融合表达载体 除了表达载体的调控性,为了提高蛋白产物的活性以及简化下游纯化的操作等 ,往往在表达载体上插入其它辅助的基因序列与目的基因构成融合蛋白表达。融合信号肽(PelB、Om pA 、MalE、PhoA 等)表达可以使融合蛋白通过经典的 Sec 途径分泌到周质或胞外表达, 有利于形成二硫键以及避免胞质蛋白酶的水解和 N 端甲硫氨酸的延伸。另外,最近开发的双精氨酸转运体系(Tat)可以有效分泌正确折叠的重组蛋白[5]。常见的纯化标签多根据亲和层
1-大肠杆菌重组蛋白表达提取及纯化实验(最新整理)
第一天 1、配置LB培养基： 酵母粉15g、胰蛋白胨30g、氯化钠30g，定容至3000ml。调节PH至 7.4（2M NaOH），高压蒸汽灭菌20分钟，37℃保存。分装成15瓶（每瓶200ml）。 2、接种（超净台要提前杀菌通风） 取4瓶上述培养基，每瓶加200μlAMP（1:1000）、60μl菌液。37℃过夜。 第二天 1、扩大培养（超净台） 4瓶扩至16瓶，每瓶培养基加200μlAMP，摇床培养1小时左右。 2、诱导（超净台） 加40μlIPTG，加完后去除封口的除牛皮纸，扎口较松。25℃摇床培养4小时。 3、离心获取菌体 4℃，8000rpm离心25分钟。注意配平。 4、超声波破碎菌体 离心后去上清，向沉淀加入（600mlPB裂解液、300μl溶菌酶、3mlPMSF）。将菌液转入2个烧杯中，冰浴超声波破菌，400W，75次，每次6秒，间隔2秒。离心收集上清液。 600mlPB裂解液：20mM/L PB，10mM/L EDTA，5%甘油，1mM/L DTT，调节PH至7.4。 超声波破碎：首先用去离子水清洗探头，再将盛有菌液的小烧杯置于有冰 水混合物的大烧杯中，冰水界面略高于菌液面即可。探头浸没于菌液中，不可伸入过长。注意破菌过程中由于冰的融化导致的液面变化。 5、抽滤（双层滤纸) 洗胶（GST）。将上述上清液抽滤，滤液与GST胶混合，磁力搅拌过夜。 第三天
1、抽滤蛋白-胶混合液，滤液取样20μl，留电泳。 2、洗杂蛋白，用1×PBS+PMSF(1000:1)约400ml，洗脱若干次，用移液枪吸去上层泡沫（杂蛋白），至胶上无泡沫为止。 3、洗脱目的蛋白，洗脱液加50ml，分3次进行（15+15+15），每次加入后间歇搅拌，自然静置洗脱15分钟，抽滤，勿使胶干，合并洗脱液，取样20μl，留电泳。用洗脱液调零，测OD280。（OD值达到1.5为佳） 4、将洗脱液置于透析袋中（透析袋应提前煮好），将透析袋置于2L透析液1中，加入磁珠置于4℃冰箱内磁力搅拌器上，4小时后换为透析液2。胶的回收：用3M氯化钠溶液（用1×PBS溶液溶解）、1×PBS（无沉淀）洗涤，20%乙醇洗脱，装瓶。 洗脱液：50mM/LTRIS-HCL 、10mM/LGSH 透析液1：20mM/L TRIS-HCL、1mM/L EDTA 、0.15mM/L DTT 透析液2：:0.5mM/L EDTA、1×PBS
pET-48b(+)大肠杆菌表达载体说明
pET-48b(+) 编号 载体名称 北京华越洋生物VECT4670 pET--‐48b(+) pET48b载体基本信息 别名: pET48b, p ET 48b 质粒类型: 大肠杆菌蛋白表达 表达水平: 高 克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: 5605 b p 5' 测序引物序列: T7: 5'--‐TAATACGACTCACTATAGGG--‐3'; Trx--‐F: 5'--‐TTCCTCGACGCTAACCTG--‐3' 3' 测序引物序列: T7t: 5'--‐TGCTAGTTATTGCTCAGCGG--‐3' 载体标签: N--‐Trx, N--‐His,N--‐HRV 3C, C--‐S, C--‐Thrombin 载体抗性: Kanamycin (卡那霉素) 备注: Same as pET47 but also has Nterm Trx Tag; contains HRV 3C Protease cleavage site for fusion tag removal at low temperatures; Cterm thrombin c leavage s ite. 稳定性: 瞬时表达 组成型: 组成型 病毒/非病毒: 非病毒 pET48b载体质粒图谱和多克隆位点信息
pET48b载体简介 pET--‐48b载体含有N端Trx和His标签，在标签后面紧跟着的是HRV 3C蛋白酶切位点。HRV 3C蛋白酶能够高特异性的识别LEVLFQ↓GP蛋白序列，能够在低温下高效切割掉融合标签序列。pET--‐48b载体还含有一个可选择的C端Thrombin蛋白酶切位点，紧接着位点后是S标签。 pET48b载体的单一的多克隆位点见上面的环状质粒图谱。注意：载体序列是以pBR322质粒的编码规矩进行编码的，所以T7蛋白表达区在质粒图谱上面是反向的。 T7 RNA聚合酶启动的克隆和表达区域在质粒图谱中也被标注了出来。质粒的F1复制子是被定向的，所以在T7噬菌体聚合酶的作用下，包含有蛋白编码序列的病毒 粒子能够
枯草芽孢杆菌的研究与应用
《微生物学》课程论文论文题目：枯草芽孢杆菌的研究与应用学院：生命与地理科学学院 专业：生物科学 班级：S10A 学号：20101911105 姓名：张成义 成绩：
目录 枯草芽孢杆菌的研究与应用........................................ - 2 - 1.枯草芽孢杆菌在医药方面的应用.................................. - 2 - 1．1纳豆激酶的发现及应用.................................... - 3 - 1．2 脂肪酶................................................. - 3 - 2、枯草芽孢杆菌在农业中的应用................................... - 4 - 2．1 枯草芽孢杆菌在饲料中的应用............................. - 4 - 2．2 枯草芽孢杆菌在生物农药中的应用......................... - 4 - 2．2．1 枯草芽孢杆菌在动物养殖中的作用................... - 4 - 2．2．2 枯草芽孢杆菌在农作物病虫防治中的作用............. - 4 - 3、枯草芽孢杆菌在现代科学研究中的应用........................... - 5 - 3．1 枯草芽孢杆菌表达系统的研究............................. - 5 - 3．2 枯草芽孢杆菌细胞质融合方面的研究....................... - 5 - 4.枯草芽孢杆菌应用中存在的问题.................................. - 6 - 5.枯草芽孢杆菌制剂作用机理及应用效果............................ - 6 - 5．1 枯草芽孢杆菌的作用机理................................ - 6 - 5．1．1 生物夺氧........................................ - 6 - 5．1．1．1拮抗致病微生物，改善体内外生态环境......... - 7 - 5．1．1．2 增强动物体的免疫功能..................... - 7 - 5．1．1．3产生多种消化酶............................. - 7 - 5．1．1．4产生多种营养物质........................... - 8 - 5．2 枯草芽孢杆菌在动物生产上的应用效果.................... - 8 - 5．2．1 禽类养殖中的效果................................ - 8 - 5．2．2 畜类养殖中的效果................................ - 8 - 5．2．3 在水产生产上的应用效果........................... - 9 - 6.展望.......................................................... - 9 - 参考文献....................................................... - 10 -
酵母表达系统的特点 大肠杆菌表达系统是常用的外源基因表达系统
1.酵母表达系统的特点大肠杆菌表达系统是常用的外源基因表达系统，人们已利用该系统表达了多种蛋白。大肠杆菌基因结构简单，易于进行基因操作，而且它生长迅速，周期短，营养需求简单，适于工业化生产。但同时该系统还存在很多缺陷。它是原核表达系统，缺少真核生物的翻译后加工过程，产生的外源基因产物往往无活性，它表达的蛋白多以包含体形式存在，需要经过复性，过程复杂，它产生的杂蛋白较多，不易纯化，所以产物中有可能会含有原核细胞中的有毒蛋白或有抗原性的蛋白。昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统都是真核细胞表达系统，它们可以进行多种蛋白的转录后加工，很适合于真核基因的表达。但是，它们遗传背景复杂，操作困难，易污染，生产成本高，所以并不利于实际应用[2,3] 2.核生物基因和制备有功能的表达蛋白质。某些酵母表达系统具有外分泌信号序列，能够将所表达的外源蛋白质分泌到细胞外，因此很容易纯化[4]。所以近年来，酵母表达系统已广泛应用于工业生产，为社会创造了极大的经济效益 3.酵母一般可分成三大类：(1) 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，又称面包酵母；(2) 粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；(3) 非常规酵母(Nonconventional yeast)，是指除酿酒酵母和粟酒裂殖酵母外的酵母统称 4.酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）又名面包酵母，它是单细胞真核微生物，一直以来酿酒酵母被称为真核生物中的―大肠杆菌‖。它是最早应用于酵母基因克隆和表达的宿主菌。自1981年Hitzemom等用酿酒酵母表达人干扰素获得成功后，人们还用酿酒酵母表达了多种原核和真核蛋白，目前科学家对酿酒酵母表达系统的研究已非常深入。 5.2.1.2 用于基因表达的宿主菌——酿酒酵母在遗传学方面，人们对酿酒酵母进行了广泛的研究，酿酒酵母基因组序列（约1.2×107bp）早在1996年就完成，它有16条染色体，约6000个ORF，仅4%的酵母基因有内含子。由于人们对酿酒酵母的遗传背景十分清楚，因此酿酒酵母是很理想的真核表达宿主菌。
大肠杆菌表达系统与蛋白表达纯化(参考资料)
8.大肠杆菌表达系统与蛋白表达纯化 大肠杆菌表达系统遗传背景清楚，目的基因表达水平高，培养周期短，抗污染能力强等特点, 是分子生物学研究和生物技术产业化发展进程中的重要工具。因此熟练掌握并运用大肠杆菌表达系统的基本原理和常规操作是对每一个研究生来说是非常必要 的。本章节介绍了实验室常用的大肠杆菌表达系统的构成特点，归纳了利用大肠杆菌表达系统纯化重组蛋白的基本流程和详细 操作步骤，并且结合笔者的操作经验，总结了初学者在操作过程中可能遇到的问题和解决策略。 8.1大肠杆菌表达系统的选择与构建 8.1.1表达载体的选择 根据启动子的不同这些载体大致可以分为热诱导启动子，如λPL，cspA 等和另外一类就是广泛使用的IPTG诱导的启动子，如lac，trc，tac，T5/lac operator，T5/lac operator等。根据表达蛋白质的类型可分为单纯表达载体和融合表达载体。融合表达是在目标蛋白的N端或C端添加特殊的序列，以提高蛋白的可溶性，促进蛋白的正确折叠，实现目的蛋白的快速亲和纯化，或者实现目标蛋白的表达定位。常用的用于亲和纯化融合标签包括 Poly-Arg， Poly-His, Strep-Tag Ⅱ，S-tag，MBP等。其中His-Tag 和GST-Tag 是目前使用最多的。His Tag 大多数是连续的六个His 融合于目标蛋白的N端或C端，通过His 与金属离子：Cu2+>Fe2+>Zn2+>Ni2+ 的螯合作用而实现亲和纯化，其中Ni2+是目前使用最广泛的。His 标签具有较小的分子量，融合于目标蛋白的N端和C端不影响目标蛋白的活性，因此纯化过程中大多不需要去除。目前常使用的表达载体主要是由Novagen 提供的pET 系列和Qiagen 公司提供的pQE 系列。 除了His 标签外，还原性谷胱甘肽S-转移酶是另一种实验室常用的融合标签。它可以通过还原性谷胱甘肽琼脂糖亲和层析而快速纯化。此外，与His 相比，GST 很多时候能够促进目标蛋白的正确折叠，提高目标蛋白表达的可溶性，因此，对于那些用his 标签表达易形成包涵体的蛋白，可以尝试用GST融合表达来改进。当然，GST 具有较大的分子量（26kDa），可能对目的蛋白的活性有影响，因此很多时候切除GST是必须的。目前，GST融合表达系统主要是由GE Healthcare （原Amersham）提供。 8.1.2宿主菌的选择 重组质粒的构建一般选择遗传稳定，转化效率高，质粒产量高的菌株作为受体菌，常用的有E.coli DH5α，E.coli JM 109，E.coli DH 10B ，E.coli NovaBlμe等rec A–和end A–型细胞。作为表达宿主菌必须具备几个基本特点：遗传稳定，生长速度快，表达蛋白稳定。具体操作过程中，根据所使用的表达载体的特点，目的基因密码子的组成等选择特定的表达宿主菌。以下是实验室常用的几种表达宿主： BL2： lon和ompT 蛋白酶缺陷型，避免了宿主对外源蛋白的降解。是经典的使用最广泛的表达受体。适用于Tac，Trc，Lac，λPL，cspA等作为启动子的载体。 BL21（DE3）： DE3噬菌体溶源于BL21 形成的带有染色体T7 RNA 聚合酶基因大肠杆菌。IPTG 诱导的lac ΜV5 启动子控制T7 RNA 聚合酶基因表达T7 RNA 聚合酶，进而控制T7 表达系统表达目的蛋白。 BL21（DE3）衍生系列：在经典的T7表达系统BL21（DE3）的基础上，Novagen 公司开发了一些特殊的表达宿主细胞。比如：Origami （DE3），Origami B（DE3）和Rosetta-gami （DE3）菌株带有 trxB和
(完整版)大肠杆菌感受态细胞的制备
大肠杆菌感受态细胞的制备 标签： tr..,Ca..,co.. 分类：细胞技术> 感受态细胞 来源： 实验管理实验概要 大肠杆菌感受态细胞的CaCl2法制备及质粒转化 实验原理 处于对数生长期的细菌经CaCl2 处理后接受外源DNA的能力显著增加。细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。 在自然条件下，很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，但在人工构建的质粒载体中，一般缺乏此种转移所必需的mob基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态，以摄取外源DNA。 转化（Transformation）是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体 （R-,M-），它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法（如电击法，CaCl2 ，RbCl(KCl)等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞（Compenent cells）。进入受体细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子（Transformant，即带有异源DNA 分子的受体细胞）。目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高，但CaCl2法简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油于-70℃保存（半年），因此CaCl2法使用更广泛。 主要试剂 (1)0.1mol/L CaCl2溶液 (2)LB液体培养基
pET-22b(+)大肠杆菌表达载体说明
pET-22b(+) 编号 载体名称 北京华越洋生物VECT5200 pET--‐22b(+) pet22b载体基本信息 别名: pET22b, p et 22b, p ET--‐22b(+) 质粒类型: 大肠杆菌蛋白表达 表达水平: 高 克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: 5500bp 5' 测序引物及序列: T7: 5'--‐TAATACGACTCACTATAGGG--‐3' 3' 测序引物序列: T7t: 5'--‐GCTAGTTATTGCTCAGCGG--‐3' 载体标签: N--‐pelB; C--‐His 载体抗性: 氨苄 备注: pET22b载体含有PelB信号肽序列， 能够将表达的目的蛋白定位在细胞外周质腔。 稳定性: 瞬时表达 Transient 组成型: 组成型 Constitutive 病毒/非病毒: 非病毒 pet22b载体质粒图谱和多克隆位点信息
pet22b载体简介 pET--‐22b(+)载体携带有一个N端的pelB信号肽序列，能够将表达的目的蛋白定位于外周质腔，同时载体含有C端His标签。载体的单一的多克隆位点见上面的环状质粒图谱。注意：载体序列是以pBR322质粒的编码规矩进行编码的，所以T7蛋白表达区在质粒图谱上面是反向的。 T7 RNA聚合酶启动的克隆和表达区域在质粒图谱中也被标注了出来。质粒的F1复制子是被定向的，所以在T7噬菌体聚合酶的作用下，包含有蛋白编码序列的病毒 粒子能够产生，并启动蛋白表达，同时蛋白表达将被T7终止子序列的作用下终止蛋白翻译。 pet22b载体序列 ORIGIN 1 ATCCGGATAT AGTTCCTCCT TTCAGCAAAA AACCCCTCAA GACCCGTTTA GAGGCCCCAA 61 GGGGTTATGC TAGTTATTGC TCAGCGGTGG CAGCAGCCAA CTCAGCTTCC TTTCGGGCTT 121 TGTTAGCAGC CGGATCTCAG TGGTGGTGGT GGTGGTGCTC GAGTGCGGCC GCAAGCTTGT 181 CGACGGAGCT CGAATTCGGA TCCGAATTAA TTCCGATATC CATGGCCATC GCCGGCTGGG 241 CAGCGAGGAG CAGCAGACCA GCAGCAGCGG TCGGCAGCAG GTATTTCATA TGTATATCTC 301 CTTCTTAAAG TTAAACAAAA TTATTTCTAG AGGGGAATTG TTATCCGCTC ACAATTCCCC 361 TATAGTGAGT CGTATTAATT TCGCGGGATC GAGATCTCGA TCCTCTACGC CGGACGCATC 421 GTGGCCGGCA TCACCGGCGC CACAGGTGCG GTTGCTGGCG CCTATATCGC CGACATCACC 481 GATGGGGAAG ATCGGGCTCG CCACTTCGGG CTCATGAGCG CTTGTTTCGG CGTGGGTATG 541 GTGGCAGGCC CCGTGGCCGG GGGACTGTTG GGCGCCATCT CCTTGCATGC ACCATTCCTT 601 GCGGCGGCGG TGCTCAACGG CCTCAACCTA CTACTGGGCT GCTTCCTAAT GCAGGAGTCG
大肠杆菌蛋白表达体系的构建实验报告
大肠杆菌蛋白表达系统的构建与蛋白质的分离纯化 ●实验目的： 1.学会氯化钙制备大肠杆菌DH10B感受态细胞及掌握质粒转化感受态细胞的操作方法 2.转化BL21(DE3)并在合适条件下诱导表达蛋白，掌握蛋白质诱导表达的原理，学习蛋白质诱导表达的方法 3. 学会使用镍柱分离纯化蛋白质，利用PEPC试剂盒测定PEPC的活力。 ●实验原理： 1. 钙转法：Ca2+能与加入的DNA分子结合，形成抗DNA酶(DNase)的羟基-磷酸钙复合物，并黏附在细菌细胞膜的外表面上。当42℃热刺激短暂处理细菌细胞时，细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，并随之出现许多间隙，为DNA分子提供了进入细胞的通道。 2. 诱导BL21(DE3)表达蛋白质的原理：E. coli BL21(DE3)其DE3是整合在细菌基因组上的一种携带T7 RNA聚合酶基因和lacI基因的λ噬菌体，lacI编码的阻遏蛋白与lac操纵基因结合，从而不能进行外源基因的转录和表达，此时宿主菌正常生长。IPTG为乳糖类似物，不能被细胞利用，可以特异结合阻遏蛋白，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，则外源基因大量转录并高效表达。 3. 六聚组氨酸纯化蛋白的原理：亲和层析是一种通过生物分子之间的特异性的相互作用来分离物质的层析方法。 组氨酸是具有杂环的氨基酸，每个组氨基酸含有一个咪唑基团，这个化学结构带有很多额外电子，对于带正电的化学物质有静电引力，亲和层析是利用这个原理来进行吸附的，亲和配体（也就是填料）上的阳离子（一般是镍离子）带正电对组氨酸有亲和作用。组氨酸标签是原核表达载体上6个组氨酸的区段,这个标签在PH8.0时不带电,且无免疫原性,对蛋白质的分泌,折叠,功能基本上无影响.能高度亲和镍离子,用于蛋白质的亲和纯化. 4. 目标蛋白：磷酸烯醇丙酮酸羧化酶（Phosphoenolpyruvate carboxykinase，PEPC. 酸羧化酶的催化下，草酰乙酸转变为磷酸烯醇式丙酮酸和二氧化碳。该反应消耗一分子的三磷酸鸟苷以提供磷酰基。在糖异生作用中，此酶与丙酮酸羧化酶一起构成了从丙酮酸转化为磷酸烯醇式丙酮酸的迂回步骤。
大肠杆菌表达重组蛋白的超声破碎及纯化
大肠杆菌表达重组蛋白的超声破碎及纯化 一可溶性蛋白的纯化 （一）菌体的破碎 1. 仪器与材料：-80℃冰箱；超声波细胞破碎仪；50mM PBS或50mM Tris-HCl pH 7.5；50 ml 离心管；冷冻高速离心机 2.方法 2.1反复冻融 2.1.1收集菌液500ml，等分10份，4000 r/min 4℃离心15min，弃上清。 2.1.2 菌体沉淀中加入相同菌液体积的50mM PBS 或50mM Tris-HCl（选择使蛋白稳定的缓冲液和pH）重悬洗涤一次。 2.1.3 然后按原菌液体积的1/4加入缓冲液重悬菌体，并加入蛋白酶抑制剂PMSF和EDTA(带His标签不加)，PMSF终浓度为100μg/ml, EDTA的终浓度为。取20μl重悬菌液进行电泳，检测蛋白表达的情况（是否表达，是可溶性表达还是包涵体表达）。 2.1.4 将菌液（经检测有表达）在-80度冰冻，室温融解，反复几次（反复冻融三次），由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。 2.2超声波处理 (对超声波及热敏感的蛋白慎用) 2.2.1 将反复冻融的菌液（必要时可加入1mg/ml 溶菌酶，缓冲液pH＞8.0，加入后需静置20min），进行超声破碎，超声条件：400W，工作5秒，间隔5秒，重复一定次数，（根据我们的仪器找出一个比较好的工作条件）。直至菌体溶液变清澈为止，大约花费时间。 2.2.2 取少量经超声破碎后的菌液，10000rpm离心10分钟，分别对上清和沉淀进行检测，并用全菌作为阳性对照，检测菌体破碎程度及目标条带占总蛋白的含量。 注意事项： （1）超声破碎具体条件可根据实验情况而定，要掌握好功率和每次超声时间，降低蛋白被降解的可能。 （2）功率大时，每次超声时间可缩短，不能让温度升高，应保持在4度左右，超声时保持冰浴。 （3）菌体破碎后总蛋白浓度的测定可用Bradford法或者紫外吸收法。 （4）可通过SDS-PAGE 电泳观察菌体破碎程度及目标条带占总蛋白的含量。 二包涵体蛋白的纯化 1菌体的破碎（加溶菌酶处理包涵体效果可能不好，包涵体中总是有残留的溶菌酶，你看看有没有不加溶菌酶的，这个先保留好了） 1.1仪器与材料：超声波细胞破碎仪；20mM PBS或20mM Tris-HCl pH 7.5；裂解液buffer A；溶菌酶10mg/ml；50ml ，15ml离心管；冷冻离心机 1.2 方法 (1) 收集菌液500ml，等分10份，4000 r/min 4℃离心15min，弃上清。