骨碎补提取液对体外分离破骨细胞性骨吸收的作用

?论 著?

骨碎补提取液对体外分离破骨

细胞性骨吸收的作用

樊粤光　黄永明　曾意荣　王海彬　黄　荷

(广州中医大学第一附属院骨科　广东　广州　510405)

摘要　目的:研究骨碎补对体外分离破骨细胞性骨吸收的作用。方法:体外分离出破骨细胞,与牛骨磨片共同培养,通过L eica图像分析仪观察破骨细胞所形成骨吸收陷窝的数目与面积,反映破骨细胞性骨吸收情况。结果用SPSS软件包分析。结果:与空白血清组相比,20%骨碎补提取液使骨磨片上形成的吸收陷窝数和面积从(28.05±2.75)个 片和(1239.45±523.21)Λm2减少到(13.20±1.26)个 片和(683.17±341.38)Λm2,空白血清组与20%骨碎补血清组比较差异具有显著性意义(P<0.01),而10%低浓度骨碎补提取液对破骨细胞在骨磨片上形成的吸收陷窝数和面积从(28.05±2.75)个 片和(1239.45±523.21)Λm2减少到(24.15±

1.12)个 片和(823.52±527.18)Λm2,二者比较无显著性意义(P>0.05)。结论:骨碎补提取液对破骨细胞性

骨吸收有抑制作用,但与浓度有关。

关键词　骨碎补　破骨细胞　体外培养　骨吸收

中图分类号:Q813.1 文献标识码:A 文章编号:1005-0205(2003)06-0004-03

Effects of D rynar i a Rh izo m e on Cultiva ted O steocla sts of Bone Resorption i n V itro

Fan Yueguang,H uang Yongm ing,Zeng Y irong,et al

T he F rist A f f ilia ted H osp ita l Guanz huo U n iversity of T CM,Guanz huo,510405,Ch ina

ABSTRACT　Objective:To study effect of Ch inese traditi onal m edicine-D rynaria rh izom e on cu ltivated o s2 teoclasts of bone reso rp ti on in vitro.M ethods:Cu ltivated o steoclasts from long bones of w istar rats,and even ly inocu lated on24w ell cu ltivaed p lates w h ich pu t cow’s tib ial slices in advance.T he area and num ber of the reso rp ti on p its that reflected effects of D rynaria rh izom e on cu ltu red o steoclasts of bone reso rp ti on in vit2 ro w ere determ ined w ith the L eica Q uan ti m en t500system.T he resu lts w ere analysed by statistical package

养状况。同时又可促进成纤维细胞、成肌细胞增殖,使损伤组织迅速修复,达到愈合。因此,以活血化瘀,消肿止痛为主要功效的复方西红花膏对损伤组织修复作用与碱性成纤维细胞生长因子的活性密切相关。

参考文献

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收稿日期:2003-03-25

作者简介:樊粤光(1954-),男(汉族),山西人,

主任医师,教授。2000,16(6):340

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4Ch inese J T rad M ed T raum&O rthop,D ecem ber2003,V o l11,N o.6

fo r social science(SPSS).Results:Compared w ith non-drug group,the num ber and area of the reso rp ti on p its of20%D rynaria rh izom e group reduced from(28.05±2.75)and(1239.45±523.21)Λm2to(13.20±1.26) and(683.17±341.38)Λm2(P<0.01),the num ber and area of the reso rp ti on p its of10%D rynaria rh izom e group reduced from(28.05±2.75)and(1239.45±523.21)Λm2to(24.15±1.12)and(823.52±527.18)Λm2 (P>0.05).Conclusion:D rynaria rh izom e cou ld inh ib it cu ltu red o steoclas.

KEY WOR D S　D rynaria rh izom e O steoclast Cu ltivated in vitro Bone reso rp ti on

骨碎补是一味骨伤科常用的中药。具有补肾强骨,续伤止痛等功效。最新研究发现骨碎补的提取部位对UM R106成骨样细胞的增殖有促进作用1。但是骨碎补对破骨细胞性骨吸收的作用目前尚不明确。通过骨碎补的提取液喂大鼠,利用大鼠药物血清加入破骨细胞的培养液中,以探讨骨碎补对体外培养的破骨细胞性骨吸收的作用,为中药在骨伤科的应用提供理论依据。

材料与方法

1　材料　主要试剂有M E M(Gibco产品);胎牛血清(Sigm a产品);甲苯胺蓝(Sigm a公司);

H EPES(Sigm a产品);青霉素、链霉素(上海四药股份有限公司产品);骨碎补(广州中医药大学第一附属医院药剂提供)。培养细胞用1月龄左右的清洁级SD大鼠;制备药物血清用成年普通级SD 大鼠20只,体重200±10g,雌或雄不限(广州中医药大学实验中心提供)。

2　方法

2.1　薄骨片制作处理　取新鲜的牛胫骨放入低温冰箱储存,用钢齿锯将其切成薄片,再磨成10Λm 片厚的骨磨片,在蒸馏水中超声清洗10m in×3次,置于双抗液中(青霉素100Λ m l,链霉素100Λ m l)-30℃冻存待用。使用时先将其解冻,70%酒精浸泡30m in,超净台中紫外线照1h,取出加入含M E M的24孔培养板中,每孔5块4mm×4mm骨片,37℃孵育1h,备用。

2.2　药物血清的制备　选用普通级SD大鼠20只,随机分为A、B二组。二组大鼠自由进行饲养,分别用中药骨碎补提取液和蒸馏水灌胃大鼠,每次2m l 200g,每天给药两次,连续给药3天,末次给药后1小时采血。每只大鼠采血约4～6m l,分别装入20只无菌离心管内离心。离心后用长头吸管吸取上清,同组血清混合匀装入无菌瓶内,放入36℃的水浴箱30m in灭活,放入-20℃的冰箱内保存备用。

2.3　破骨细胞的分离与培养　采用Fen ton2等人的方法加以改良,选用出生一月龄SD雄性大鼠2只,拉颈处死,放入75%的酒精浸泡15分钟。无菌条件下分离出四肢长骨骨干,剔除骨干周围的软组织,剪断骨干两端骨骺,在装有纯M E M 的培养液的培养皿中清洗骨干并转移到另外一个盛有纯M E M的培养液的培养皿中,用注射器抽取纯M E M反复冲洗骨髓腔,冲洗不少于3次,将得到有细胞的悬液用200目的筛网过滤两遍后,放入无菌离心管内离心(1000rpm,10m in)。去上清后,用含有M E M培养液稀释离心后沉淀的细胞,并在显微镜下计数,调至细胞数为1×106 m l 后,继续孵育3。

2.4　骨吸收陷窝的测定　将细胞悬液放入盛有牛骨片的24孔培养板中,每孔含5片骨片,倒置显微镜观察见有大量的细胞后,放入体积分数为37°C,5%CO2的培养箱中,24小时后更换培养液,洗去未贴壁的细胞,更换培养液:第一组加含20%中药骨碎补药物血清的培养液;第二组加含10%中药骨碎补药物血清的培养液;第三组加含空白血清的培养液。每24小时换液1m l。6天后,取出骨片,以体积分数为2.5%戊二醛固定30m in,以质量分数为0.1%甲苯胺蓝硼酸盐溶液染色2m in。然后分别置入0.25m o l L的氨水中,超声振荡2m in以上,用上述染液复染5m in4,丙酮脱水。L eica Q uan ti m et500图像分析仪检测骨吸收陷窝面积和记录骨吸收陷窝数目。

2.5　统计学处理　利用SPSS7.5(r)对全部数据进行one-w ay ANOVA分析,结果以均数±标准差表示(x±s)。

结果

1　分离破骨细胞所形成的骨吸收陷窝的形态学动态变化。

分离的破骨细胞与牛骨共同培养利用L eica 倒置显微镜每天进行观察,连续观察6天,24小时后,骨片上出现少量吸收陷窝,多为单个圆形或椭圆形,小数为不规则形,随着时间的增加,对照组骨片上吸收陷窝每天有不同程度的增加,而骨碎补组则骨吸收陷窝不增加或少量增加。

5

中国中医骨伤科杂志2003年12月第11卷第6期

2　各组骨片上的吸收陷窝数

破骨细胞以及其吸收骨质后所形成的骨吸收陷窝经甲苯胺蓝染色后呈深蓝色,在光学显微镜400倍镜下对整个骨片上的吸收陷窝进行拍照和计数,后用图像分析仪对骨片上的吸收陷窝面积进行计算。在镜下清晰可辨,破骨细胞具有数个细胞核,伪足与骨片紧密结合在一起,洗脱破骨细胞后,骨吸收陷窝被深染,形状欠规则。由表1可见,骨片上骨吸收陷窝的数目和面积随着骨碎补的浓度的增高而显著下降,20%骨碎补血清组与空白血清对照组相比差异有显著性意义(P<0.01),而10%骨碎补血清组与空白组相比差异无显著性意义(P>0.05)。

表1　骨碎补提取液对骨吸收陷窝的影响　(x±s)

组别样本数(n1)骨吸收陷窝数目样本数(n2)骨吸收陷窝面积(Λm2)空白血清组1228.05±2.75121239.45±523.21 20%骨碎补血清组1513.20±1.2615683.17±341.38 t值4.1633.333

10%骨碎补血清组1524.15±1.1215823.52±527.18 t值2.15332.0433

注:与对照组相比,3P<0.01,33P>0.05。

讨论

破骨细胞是一个高度分化的多核巨细胞,直接参与骨吸收,是骨组织吸收的主要功能细胞。骨吸收时首先是破骨细胞分泌酸,致使骨组织脱矿,继而通过分泌的多种酶将残留的有机物分解。破骨细胞可以通过细胞膜向细胞外分泌酸,其质子泵相当于一个酸泵,不断的分泌酸,通过分泌酸可直接溶解骨矿中的羟磷灰石,导致骨组织脱钙。脱钙后的残余的骨基质,又被破骨细胞分泌的各种水分解酶消化,降解,破坏5。

骨代谢由骨吸收及骨形成共同完成的,骨质疏松等异常骨吸收疾病的患者一般是骨吸收大于骨形成,即是破骨细胞增埴分化速率大于成骨细胞增埴分化速率,如果同时具有抑制破骨细胞增殖和刺激成骨细胞增殖药物,将是治疗异常骨吸收疾病的最好药物。

骨碎补是一味骨伤科常用的中药。具有补肾强骨,续伤止痛等功效。A rnett等4发现骨吸收陷窝可被甲苯胺蓝深染,骨吸收陷窝的面积与其体积存在正相关关系,可间接地反映破骨细胞对骨质的吸收程度。本实验观察骨碎补提取液对破骨细胞性骨吸收的功能,由实验结果来看,较高浓度骨碎补抑制破骨细胞性骨吸收有显著作用(P <0.01),使破骨细胞在骨片上形成的吸收陷窝数和面积比对空白照组明显小,而低浓度则可部分抑制破骨细胞功能,但它使破骨细胞在骨片上形成的吸收陷窝数和面积与空白对照组相比无显著差别(P>0.05)。目前对药物骨碎补作用于破骨细胞的机理尚不清,但结果显示骨碎补对破骨细胞性骨吸收起抑制作用,且与浓度有关。本实验是从骨髓细胞中诱导培养破骨细胞,同时也有成骨细胞,研究发现骨碎补的提取部位对成骨样细胞的增殖有促进作用,它的增殖分代表着成骨细胞的增殖,即是骨碎补对成骨细胞有促进作用。骨碎补在增强成骨细胞的功能与活性,促进新骨形成,可能同时作用于成骨细胞,抑制其产生或分泌一些破骨细胞促进因子,使破骨细胞生成减少,影响骨的吸收。

参考文献

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6Ch inese J T rad M ed T raum&O rthop,D ecem ber2003,V o l11,N o.6

八体外哺乳动物细胞染色体畸变试验

九、体外哺乳动物细胞染色体畸变试验 In Vitro Mammalian Cells Chromosome Aberration Test 1 范围 本规范规定了体外哺乳动物细胞染色体畸变试验的基本原则、要求和方法。 本规范适用于检测化妆品原料及其产品的致突变性。 2 规范性引用文件 OECD Guidelines for Testing of Chemicals ( No.473, July 1997) 3试验目的 本试验是用于检测培养的哺乳动物细胞染色体畸变，以评价受试物致突变的可能性。 4 定义 染色体型畸变(Chromosome-type aberration)：染色体结构损伤，表现为在两个染色单体相同位点均出现断裂或断裂重组的改变。 染色单体型畸变(Chromatid-type aberration)：染色体结构损伤，表现为染色单体断裂或染色单体断裂重组的损伤。 染色体数目改变(Numerical aberration)：所用细胞株的正常染色体数目的变化。 结构畸变(Structural aberration)：在细胞分裂的中期相阶段，用显微镜检出的染色体结构改变，表现为缺失、断片、互换等。 有丝分裂指数(Mitotic index)：中期相细胞数与所观察的细胞总数之比值；是一项反映细胞增殖程度的指标。 5 试验基本原则 在加入和不加入代谢活化系统的条件下，使培养的哺乳动物细胞暴露于受试物中。用中期分裂相阻断剂（如秋水仙素或秋水仙胺）处理，使细胞停止在中期分裂相，随后收获细胞，制片，染色，分析染色体畸变。 6 试验方法 6.1 试剂和受试物制备 6.1.1 阳性对照物：可根据受试物的性质和结构选择适宜的阳性对照物，阳性对照物应是已知的断裂剂，能引起可检出的、并可重复的阳性结果。当外源性活化系统不存在时，可使用甲磺酸甲酯（methyl methanesulphonate (MMS)）、甲磺酸乙酯（ethyl methanesulphonate(EMS)）、乙基亚硝基脲(ethyl nitrosourea)、丝裂霉素C(mitomycin C)、4-硝基喹啉-N-氧化物（4-nitroquinoline-N-oxide）。当外源性活化系统存在时，可使用苯并（a）芘[benzo(a)pyrene]、环磷酰胺(cyclophosphamide)。 6.1.2 阴性对照物：应设阴性对照，即仅含和受试物组相同的溶剂，不含受试物，其它处理和受试物组完全相同。此外，如未能证实所选溶剂不具有致突变性，溶剂对照与本实验室空白对照背景资料有明显差异，还应设空白对照。 6.1.3 受试物 6.1.3.1 受试物的配制：固体受试物需溶解或悬浮于溶剂中，用前稀释至适合浓度；液体受试物可以直接加入试验系统和/或用前稀释至适合浓度。受试物应在使用前新鲜配制，否则就必

人周血淋巴细胞分离液技术要求

人外周血淋巴细胞分离液产品技术要求 3.1 产品规格及其划分说明 250ml/瓶、500ml/瓶、 3.2 性能指标 3.2.1 外观 乳光或微乳光液体。 3.2.2 澄清度 比重1.077 –1.080 g/mL 3.2.3 pH值（每升标示量/L） pH要求为7.1～7.3，允许偏差范围为±0.30。 3.2.4 渗透压/（m0sm/kgH2O） 渗透压为280～340 m0sm/kgH2O 3.2.5 细菌内毒素/（EU/ml） ﹤0.5 3.2.6 无菌检查 3.2.6.1 细菌数 不得检出 3.2.6.2霉菌数 不得检出 3.2.7 细胞分离实验 3.2.7.1 细胞形态 正常。 3.2.7.2细胞分离数量及存活率 数量：90%-95%；存活率：95%-98% 3.2.8 安全性检验项目 抗生素：不得检出。 3.3 检验方法 3.3.1外观检测方法 肉眼观察为乳光或微乳光液体 3.3.2 澄清度的测定 按中华人民共和国药典2010年版二部附录ⅨB进行。 3.3.3 pH值的测定 按中华人民共和国药典2010年版二部附录ⅥH进行。 3.3.4 渗透压的测定 按中华人民共和国药典2010年版二部附录ⅨG进行。 取两次平行测定结果的算术平均值为测定结果，两次平行测定结果的绝对差值不大于这两个测定值的算术平均值的5℅。 3.3.5 细菌内毒素的测定 按中华人民共和国药典2010年版二部附录ⅪE细菌内毒素检查法中的凝胶法进行。 3.3.6 无菌检查 按中华人民共和国药典2010年版二部附录ⅪH无菌检查法进行，检查项目为细菌数、霉菌数。检测法采用平皿法。

3.3.7 人周边血淋巴细胞分离计数及存活率检测实验 3.3.7.1 人周边血细胞分离实验 3.3.7.1.1方法提要 1）本实验所用容器具及溶液均为无菌，实验操作过程均为无菌操作。 2）分离外周血，并计数分离所得细胞及细胞存活率 3.3.7.1.2 实验试剂和材料 1）人外周血：新鲜血5ml(加肝素抗凝20u/ml) 2）分离液：本产品样品 3）1640无血清培养液 4）10%NCS 5）3%冰醋酸 6）台盼蓝染色细胞存活率检测试剂盒 3.3.7.1.3 仪器 1）医用超级洁净工作台：洁净级别为百级。 2）二氧化碳恒温培养箱：能通二氧化碳气体并且保持二氧化碳体积分数为（5±0.1）℅，能在（37±1）℃恒温。 3）细胞培养瓶：T25型、无菌。 4）玻璃试管 5）血球计数板 6）盖玻片：无水乙醇浸泡并擦干。 7）水平离心机 3.3.7.1.4 实验步骤 1）分离人周血淋巴细胞 A 新鲜血（肝素抗凝20u/ml）＋1640（无血清）培养液按照1：1 稀释 B 在10ml玻璃试管中预先加入淋巴细胞分离液，使分离液：1640：新鲜血=1:1:1(最好用玻璃试管，分离液的量可以增加些） C 小心的将稀释后的血液加到分离液的上面，开始的加入一定一定要慢，要尽量的贴近液面加。 D 离心： 转速：1500/分 温度：20℃－28℃ 时间：20分钟 （注意：不要刹车，这个很重要，不然由于急剧的减速度，会把已经分离的单个核细胞层又弄混了，加速度也最好不要太大) E取出试管，看看是不是分为好几层,顺次为血浆---单个核细胞淋巴细胞层－－分离液－－红细胞 F用毛吸管吸取上面的血浆层，注意无菌，保存好，备用 G用毛吸管，吸出单个核细胞层（白白的那一层），重悬于（2—5倍体积的不完全培养液中）H离心。转速：2000－2300r/min （转速一定要提高，不然淋巴细胞很难与分离液分开) 时间：10分钟 温度：4℃ I震荡后，用培养液重悬至1ml J 取100ul重悬液放于96孔板中留着计数用，然后将剩余细胞悬液在离心机上离心 2）计数细胞：计数细胞用的细胞计数板的结构是四个角有4个大正方形，每个正方形有16

成骨细胞与破骨细胞的研究探讨

成骨細胞與破骨細胞的研究探討 林文彬 林園中醫診所 台北市立聯合醫院中興院區 摘要 成骨細胞是骨形成過程中的重要功能細胞。70年代中期還認爲破骨細胞與成骨細胞爲共同的祖代來源，但自80年代初開始，認識到破骨細胞來源於單核吞噬細胞系統之外的骨髓生血細胞系統，爲獨立於骨髓幹細胞系統的一個細胞系。 成骨細胞的功能是合成、分泌膠原與糖蛋白，形成骨基質；參與破骨細胞性骨吸收的調控作用；維持骨的代謝平衡。而破骨細胞是一個高度分化的多核大細胞，其主要功能爲吸收骨，成骨細胞受下列因數調節：轉化生長因數β(TGF-β)、1，25(OH)2D3、胰島素樣生長因數(IGF)、白細胞介素1(IL-I)、雌激素、腫瘤壞死因數α(TNFα)、骨形成蛋白(BMP)，骨吸收的主要調節因數有：降鈣素(CT)、甲狀旁腺激素(PTH)、前列腺素(PGs)、活性維生素D3(1，25(OH)2D3)、細胞因數、腫瘤壞死因數(TNFα、β)、干擾素(IF)、白細胞介素-18(IL-18)、白細胞介素-17(IL-17)。關鍵詞：成骨細胞破骨細胞

前言 骨質疏鬆症是骨吸收與骨形成之間的平衡被打破，骨吸收佔優勢而使骨量減少，成骨細胞和破骨細胞是骨組織特有的兩種細胞，在激素及細胞因數等作用下作用於骨，是骨代謝過程中的重要核心細胞。故對成骨及破骨細胞的研究，對於理解骨質疏鬆的發病及藥物的療效都具有重要意義。 成骨細胞及破骨細胞的來源 （一）成骨細胞的來源 成骨細胞(Osteoblast OB)是骨形成過程中的重要功能細胞。成骨細胞的主要功能是分泌骨基質(包括膠原與糖蛋白)及進行合成。其分泌的膠原95％爲I型膠原蛋白(1)。此外還有少量的Ⅲ型、IV型及V型膠原，可見於小鼠、雞和人胚的成骨細胞。成骨細胞還參與破骨細胞性骨吸收的調節，兩者是骨代謝過程中的重要核心細胞。 成骨細胞的起源，經大量研究現己公認：成骨細胞來源於末分化的多潛能幹細胞，這種幹細胞具有分化爲多種細胞類型的特徵，在各種調控因數的作用下，通過複雜的分子機制，間充質多潛能幹細胞可以分化爲成骨細胞、成纖維細胞、脂肪細胞以及肌細胞等。當成骨細胞的祖代細胞接近骨表面時，則演化爲具有分泌、合成膠原基質的成骨細胞。當類骨質經過礦化過程以後，成骨細胞己進入分化的終末階段，其本身包埋於礦化的骨基質中成爲骨細胞。成骨細胞本身並不增殖，在體內無增殖能力。但是將成骨細胞進行體外培養，則具有分裂能力。被埋入礦化骨基質後的成骨細胞己成熟爲骨細胞，並成爲終末分化細胞。骨細胞以其身的許多胞漿突起，相互連接，傳遞資訊及進行物質交換。新形成的骨細胞具有一定的活性；逐漸老化的骨細胞則體積縮小，細胞核發生萎縮，失去活性，最終被骨吸收過程中的吞噬細胞消化、吸收。 此外，來源於未分化的間充質中多潛能成骨細胞系中，還有一種類型細胞爲骨內襯細胞被覆於骨的表面，呈扁平狀、橢圓型胞核，無成骨及破骨功能。經研究認爲，這種帖附於骨表面的骨內襯細胞，參與了破骨細胞性骨吸收過程，並對骨代謝過程中的鈣、磷在細胞外液中的流動起了調控作用。 由此可見成骨細胞處於功能活躍狀態時，分泌全盛骨基質，最終包埋於骨基質中；而無成骨功能的細胞，最終以骨內襯細胞形式被覆於骨的表面呈休止態。 （二）破骨細胞的來源 破骨細胞是高度分化的多核巨細胞，直接參與骨吸收，是骨組織吸收的主要功能細胞。 破骨細胞的來源：由於長期以來對於破骨細胞(Osteoclast，OC)的來源問題一直不清楚，給研究工作帶來許多困難，因而對臨床各種骨疾患的診斷及其防治，也不可能進一步深入和提高。對於破骨細胞來源的認識，在二十世紀40-70年代，普遍應用的經典理論爲多潛能的骨源細胞學說，認爲破骨細胞是由骨源細胞融合而成。直至70年代中期還認爲OC與成骨細胞(OB)爲共同的祖代來源。這種觀點多年來一直是個疑問，不能被證實，現已被否定。自80年代初開始，提出了OC來源於骨外生血系統，自此又出現了三種不同觀點： 1. OC源於單核吞噬細胞系統，即由單核細胞融合而成，這一觀點現已被否定。 2. OC與單核吞噬細胞共同來源於骨髓生血系統的同一前身細胞，之後各自向不同方向分化。這一假說也被實驗研究所推翻。研究表明，由骨髓而來的單核細胞經培養之後，可以分化爲破骨細胞，但是末梢血中的單核細胞與腹腔中的單核巨噬細胞，經培養後並不能形成破骨細胞，而且前者與破骨細胞的細胞膜上有不同的表面抗原，這提示了破骨細胞與單核巨噬細胞兩者不是來自共同的祖代。 3. OC來源於單核吞噬細胞系統之外的骨髓生血細胞系統，爲獨立於骨髓幹細胞系統的一個細胞系(2)。Walker曾採用患有硬化病的小鼠及正常小鼠進行了血循聯體實驗，結果患硬化病的小鼠恢復了正常。研究表明，破骨細胞胞漿中碳酸酣酶Ⅱ(CAⅡ)基因突變可以引起骨硬

白细胞分离技术汇总

外周血白细胞的分离：（细胞分离液有市售，有各种型号：白细胞、单核细胞淋巴细胞等分离液） 1> 取3ml正常人的外周血（枸橼酸钠抗凝）与等体积pbs混匀后小心的加于6ml白细胞分离液液面上，1500r/min离心20 min。（或先将抗凝血离心，然后吸取中间白细胞层，再混以等体积pbs然后小心加于等体积细胞分离液液面上，离心同上） 2> 吸取中间云雾状白细胞，加3－4mlPBS后3000 r/min离心10 min。 3> 弃上清，加1ml PBS洗涤沉淀后，将细胞悬液转移至1.5mLEp 管中。 4> 3000r/min离心20 min，弃上清。 即得白细胞 可以试试红细胞裂解液 提供我的配方： 氯化铵82.9克；重碳酸钾10.0克；EDTA0.37克；用三蒸水配成1升 所有的细胞培养都应该坚守无菌操作原则 2.分层后的确有3层，准确说来是4层，最下面是红细胞，上面的一层不应该是稍微混浊的白色，应该也 比较透明，这一层上面就是我们需要的薄细胞层，最上面是血清 3.细节： a.淋巴细胞分离液要避光保存 b.就您的试验看来，淋巴细胞分离液的问题可能是最主要的 c.首先再离心管中加入淋巴细胞分离液，然后把标本缓慢加在淋巴细胞分离液表面上，一定要缓慢小心操作，切不可混匀 d.所有操作都应在无菌环境进行 e.把离心管放入离心机是也应小心，不要太大幅度的摇幌离心管，当然离心后拿出来也要小心 就这么多了吧，这个操作是不是很难的，比较基本 祝您好运了！

.参考方法： 人外周血, 肝素抗凝(100U ?m l) , 等量无血清培养液（或者PBS等缓冲液）稀释。按1∶2 的体积比缓置于比重1. 077 g/m l 的淋巴细胞分离液, 1000 ×g 离心 30 m in, 收集培养液2分离液界面上的单个核细胞。于无血清培养液, 400×g 离心10 m in, 洗涤2次。用培养液重新悬浮细胞并计数 我也是最近要做所以查了一下，仅供分享，呵呵！ 一外周血白细胞的分离 1> 取3ml正常人的外周血（枸橼酸钠抗凝）与等体积pbs混匀后小心的加于6ml白细胞分离液（（33.9%泛影葡胺和9%Ficoll液按1：2.4体积比混合））液面上，1500r/min离心20 min。（或先将抗凝血离心，然后吸取中间白细胞层，再混以等体积pbs然后小心加于等体积细胞分离液液面上，离心同上） 2> 吸取中间云雾状白细胞，加3－4mlPBS后3000 r/min离心10 min。 3> 弃上清，加1ml PBS洗涤沉淀后，将细胞悬液转移至1.5mLEp管中。 4> 3000r/min离心20 min，弃上清。 即得白细胞 二自然沉降法 本法是利用血細胞自然沉降率的分離法，採集血液後應及時抗凝，通常選用肝素抗凝法。肝素能阻止凝血酶原轉化為凝血酶，從而抑制纖維蛋白原形成纖維蛋白而防止血液凝固。操作原則是將含抗凝血的試管直立靜置室溫30～60min後，血液分成明顯三層，上層為淡黃色血漿，底層為紅細胞，緊貼紅細胞層上面的灰白層為白細胞，輕輕吸取即得富含白細胞的細胞群，離心洗滌後加入少量蒸餾水或含氯化銨的Gey溶液，經短時間的低滲處理，使紅細胞裂解，經過反復洗滌可得純度較高的白細胞懸液。

淋巴细胞分离液说明书

Lonza Walkersville, Inc. https://www.wendangku.net/doc/a45402164.html, biotechserv@https://www.wendangku.net/doc/a45402164.html, Tech Service: 800-521-0390 Document # INST-17-829-1 06/07 Walkersville, MD 21793-0127 USA ? 2007 Lonza Walkersville, Inc. Lymphocyte Separation Medium Instruction For Use 17-829E Introduction Lymphocyte Separation Medium (LSM) is a mixture of Ficoll? and sodium diatrizoate (Hypaque) with density adjusted to 1.077 g/ml. This sterile filtered product is intended for laboratory/manufacturing use, and is not for in vitro diagnostic use. It is commonly used to isolate lymphocytes from human blood. One protocol to accomplish this is presented here. Protocol 1. Anticoagulated blood (citrated or heparinized) should be used. Note: Always treat human and other primate source material as potentially infectious and take safety precautions. 2. Dilute blood 1:1 with calcium-magnesium-free PBS and layer 9 ml onto 6 ml LSM. Use a clear plastic centrifuge tube with a cap. For large volumes use a similar ratio of diluted blood to LSM. 3. Centrifuge at 400xg for 15 minutes. 4. Remove plasma-PBS without disturbing the interface. 5. Collect the interface with a cannula and dilute to 20 ml in serum-free medium, such as RPMI 1640. 6. Centrifuge at 70xg for 10 minutes. 7. Discard supernatant fluid and resuspend pellet in 2-3 ml serum-free medium. 8. Count nucleated cells on a hemocytometer or electronic counting device. 9. Lymphocytes will be concentrated at the interface, along with some platelets and monocytes. Granulocytes will be found mostly in the Lymphocyte Separation Medium and erythrocytes will pellet at the bottom of the tube. References 1. Boyum, A. 1968. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Isolation of mononuclear cells by one centrifugation, and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1 g. Scand. J. Clin. Lab. Invest. Suppl. 97:77-89. 2. Boyum, A. 1976. Isolation of lymphocytes, granulocytes and macrophages. Scand. J. Clin. Lab. Invest. Suppl. 5:9-15. 3. Boyum, A. 1977. Separation of lymphocytes, lymphocyte subgroups and monocytes: a review. Lymphology. 10-2:71-6. 4. Boyum, A. 1984. Separation of lymphocytes, granulocytes and monocytes from human blood using iodinated density gradient media. Methods Enzymol. 108:88-102. 5. Boyum, A. et al. 2002. Separation of Human Lymphocytes from Citrated Blood by Density Gradient (NycoPrep) Centrifugation: Monocyte Depletion Depending upon Activation of Membrane Potassium Channels. Scand. J. Immunol. 56-1:76-84. 6. Koistinen, P. 198 7. Human peripheral blood and bone marrow cell separation using density gradient centrifugation on Lymphoprep and Percoll in haematological diseases. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 47-7:709-14. 7. Rola-Pleszczynski, M. and W.H. Churchill. 1978. Purification of human monocytes by continuous gradient sedimentation in ficoll. J. Immunol. Methods. 20:255-62. Product Use Statement THESE PRODUCTS ARE FOR RESEARCH USE ONLY. Not approved for human or veterinary use, for application to humans or animals, or for use in clinical or in vitro procedures. INST-17-829-1 06/07 Ficoll is a trademark of GE Healthcare. All other trademarks herein are marks of Lonza Group or its subsidiaries. 1

破骨细胞与成骨细胞

破骨细胞 (osteoclast，亦称bone-resorbing cells)是骨组织成分的一种，行使骨吸收（bone resorption）的功能。破骨细胞与成骨细胞（osteoblast，亦称bone-forming cells）在功能上相对应。二者协同，在骨骼的发育和形成过程中发挥重要作用。高表达的抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase）和组织蛋白酶K（cathepsin K）是破骨细胞主要标志。 破骨细胞由多核巨细胞(multinuclear giant cell, MNGC)组成，直径100μm，含有2～50个紧密堆积的核，主要分布在骨质表面、骨内血管通道周围。由多个单核细胞融合而成的，胞浆嗜碱性但随着细胞的老化，渐变为嗜酸性。 作用 破骨细胞具有特殊的吸收功能，某些局部炎症病灶吸收中，巨噬细胞也参与骨吸收过程。 在破骨细胞吸收骨基质的有机物和矿质的过程中，造成基质表面不规则，形成近似细胞形状的陷窝，称为Howship 陷窝。在陷窝内对着骨质的

一面，细胞伸出许多毛样突起，很象上皮细胞表面的纵纹缘和刷毛缘。电镜下，贴近骨质的一侧有许多不规则的微绒毛，即细胞突起，称为皱褶缘(ruffled border)。在皱褶缘区的周缘有一环形的胞质区，含多量微丝，但缺乏其它细胞器，称为亮区(clear zone)，此处的细胞膜平整并紧贴在骨质的表面。亮区犹如一道以胞质构成的围墙，将所包围的区域形成一个微环境。破骨细胞向局部释放乳酸及柠檬酸等，在酸性条件下，骨内无机矿物质自皱褶缘吞饮，于皱褶缘基质内形成一些吞饮泡或吞噬泡。于破骨细胞内，无机质被降解，以钙离子的形式排入血流中。无机质的丢失使骨基质内的胶原纤维裸露，破骨细胞分泌多种溶酶体酶，特别是组织蛋白酶K和胶原溶解组织蛋白酶。破骨细胞离开骨表面后，其皱褶缘消失，细胞内发生变化，进入静止期。 成骨细胞 成骨细胞是骨形成的主要功能细胞，负责骨基质的合成、分泌和矿化。骨不断地进行着重建，骨重建过程包括破骨细胞贴附在旧骨区域，分泌

体外细胞实验方法

细胞株在适当的培养基中保持10% FBS。 从Addgene(质粒)购买HA-FLAG-UCHL3。 #22564，然后再克隆到pGEX-4T-2载体(Clontech)中。UCHL3C94A和S75A突变体由位点定向突变层积产生)。抗uchl3抗体购自ProteinTech公司 (12384 - 1 - ap)。抗ub (P4D1)、抗rpa32 (9H8)、抗brca1 (D9)抗体购自Santa Cruz Biotechnology。抗rad51 (N1C2)是从GeneTex购买的。反 γH2AX(05 - 636),anti-BRCA2(OP95)和anti-MDC1(05 - 1572) 从微孔被购买。Anti-BRCA2(推上a303国道- 435 a)和 anti-γH2AX架a300型(- 081 a)从Bethyl购买实验室。抗53bp1 (NB100-304)购自Novus Biologicals。Anti-Flag(m2)、anti-HA anti-β-actin抗体 购买的σ。反磷（血清/thr）atm/atr衬底抗体（2851）是从细胞信号技术中购买的。 CRISPR / Cas9敲除 (sgRNAs)使用:sgUCHL3-1(5′-GCCGCTGGAGGCCAAT CCCGAGG-3′)和sgUCHL3-2(5′-GCCCCGAAGCGCGCCC ACCTCGG-3′)。gRNA序列被克隆到载体中。 LentiCRISPR-V2-puro。细胞被慢病毒感染 sgRNA-puro随后与2μg /毫升嘌呤霉素广泛的选择,和单一的克隆是通过连续稀释和放大。通过免疫印迹鉴定克隆 抗uchl3抗体，并通过DNA测序验证。 重组蛋白表达和下拉试验。 构建表达His-RAD51和GSTUCHL3蛋白的质粒，构建RAD51和UCHL3的编码序列 被亚克隆为pET-32a和pGEX-4T-2。为了产生重组蛋白，每个表达结构都转化为大肠杆菌BL21 (DE3)。总之,在LB培养基培养细菌在37°C到1.2(OD600)和冷却30分钟在冰上。然后细胞连续培养15 h在18°C添加0.8毫米isopropyl-b-D-hiogalactopyranoside之后(IPTG)。细胞 然后用超声波提取和裂解。细胞溶解产物 用16000g离心30min，得到的上清液与他的Mag Sepharose Ni (GE Healthcare)孵育，纯化His- rad51蛋白和GSH珠(Promega)，纯化 分别是GST和GST- uchl3蛋白。 体外GST-UCHL3拉试验,50μg重组GST和GST-UCHL3蛋白质绑定到谷胱甘肽珠子被5% BSA 在4°C 2 h其次是孵化与50μg His-UCHL3额外2 h在4°C。然后用不同盐浓度的NETN缓冲液冲洗5次。结合蛋白被筛选了1×SDSPAGE缓冲与加热10分钟在95°C。用单克隆抗his 抗体检测His-RAD51，用Coomassie blue染色GST-UCHL3 体内变性去泛素化实验和体外脱泛素化实验 对于体内去泛素化实验，控制U2OS细胞，UCHL3敲除U2OS细胞，或UCHL3敲除 U2OS细胞稳定表达HA-UCHL3野生型和突变Cys95阿拉巴马州(CA突变)在120年被细胞溶解μL 62.5毫米Tris-HCl(pH值6.8),2% SDS、10%甘油,20毫米NEM,1

小鼠肿瘤浸润组织淋巴细胞分离液说明书

小鼠肿瘤浸润组织淋巴细胞分离液说明书 【产品规格】200ml/Kit 【产品组成】 为方便广大用户使用，试剂内容如下： 名称 产品编号 规格200ml 200ml 200ml 200ml 1份 A B C D E 小鼠肿瘤浸润组织淋巴细胞分离液样本稀释液（赠品）清洗液（赠品）2010C11192010X1118F2013TBD F 液（赠品）说明书 【实验前准备】A ．适用仪器 最大离心力可达1200g 的水平转子离心机B ．耗材 产品名称产品货号339650339651339652339653 产地15ml 离心管散装美国NUNC 15ml 离心管架装美国NUNC 美国NUNC 美国NUNC 50ml 离心管散装50ml 离心管架装无菌胶头滴管或塑料滴管【检验方法】 全过程样本、试剂及实验环境均需在20±2℃的条件下进行。1.首先制备组织单细胞悬液，制备方法详见“组织单细胞悬液制备技术”。 2.取一支15ml 离心管，加入与组织单细胞悬液等量的分离液（注：分离液最少不得少于 3ml ）。 3.用吸管小心吸取组织单细胞悬液加于分离液液面上，400-500g ，离心20-30min 。（注： 根据组织单细胞悬液量确定离心条件，组织单细胞悬液量越大，离心力越大，离心时间越长，具体离心条件需客户自行摸索，以达到最佳分离效果）。

4.离心后，此时离心管中由上至下分为四层。第一层为稀释液层。第二层为环状乳白色淋 巴细胞层。第三层为透明分离液层。第四层为红细胞层。 5.用吸管小心吸取第二层环状乳白色淋巴细胞层到另一15ml离心管中，向离心管中加入 10ml清洗液（产品编号：2010X1118），混匀细胞。 6.250g，离心10min。 7.弃上清。 8.用吸管以5ml清洗液（产品编号：2010X1118）重悬所得细胞。 9.250g，离心10min。 10.重复7、8、9，弃上清后以0.5ml后续实验所需相应液体重悬细胞。 【注意事项】 1.全过程样本、试剂及实验环境均需在20±2℃的条件下进行。为获得最佳的实验结果，最 好在取样2h内进行实验，样品存放时间越长，细胞分离效果越差。样品放置超过6h后分离效果更差甚至不能达到分离目的。 2.本实验最好不要使用高聚合材质（如聚苯乙烯）的塑料制品，应使用无静电、低静电离 心管及未经碱处理过后的玻璃制品，因为静电作用将导致细胞贴壁、碱处理的玻璃表面会变成毛面，影响细胞分离效果。 3.吸取过多的淋巴细胞层及分离液层会导致分离液交界处的粒细胞被吸出从而使混杂的粒 细胞数量增加。 4.分离液用量大于组织单细胞悬液样本时，分离效果更佳。 5.如实验后细胞得率或活性过低，请联系上海研谨生物以获得技术支持。 【储存条件及有效期】 18-25℃保存，有效期2年。本品易感染细菌，需无菌条件操作。无菌条件下操作，启封后置常温保存。如4℃保存，本分离液易出现白色结晶，影响分离效果。 【参考值（参考范围）】 本实验淋巴细胞提取率及纯度大于80%。 下表为成年人外周血中各种细胞的数量及比例，用户可适当进行参考。 红细胞白细胞血小板 （4.0-10.0）×109 含量（个/L）（4.0-5.5）×1012（1.0-3.0）×1011 中性粒细胞淋巴细胞单核细胞

成骨细胞骨形成机制

浅谈骨不断地进行着重建，骨重建过程包括破骨细胞贴附在旧骨区域，分泌酸性物 质溶解矿物质，分泌蛋白酶消化骨基质，形成骨吸收陷窝；其后，成骨细胞移行至 被吸收部位，分泌骨基质，骨基质矿化而形成新骨。破骨与成骨过程的平衡是维持 正常骨量的关键。成骨细胞是骨形成的主要功能细胞，负责骨基质的合成、分泌和 矿化。目前，随着研究的不断深入，在骨形成过程中，成骨细胞发展及其调控的分 子机制也逐渐得以揭示。 1成骨细胞的起源 成骨细胞起源于多能的骨髓基质的间质细胞，除成骨细胞外，基质细胞还可分 化成软骨细胞，成纤维细胞，脂肪细胞或肌细胞。成骨细胞来源谱系有以下几种：(1)骨髓克隆形成单位(成纤维细胞集落形成单位，cfu-f)；(2)骨祖细胞，可分化 成前成骨细胞和前软骨细胞谱系，常位于骨髓腔中，有很强的自身增殖能力；(3)

前成骨细胞，即最近的成骨前体，能定向分化成成骨细胞，具有合成和增殖能力［ 1，2］。成骨细胞由多能的间质干细胞在体内的各种调控因素的调节下发展而来， 调控因素主要有bmp-2，bmp-2能诱导基质细胞向成骨细胞分化，具体就是诱导间质干细胞分化形成骨祖细胞进而形成前成骨细胞［3］。 2成骨细胞发展阶段及骨形成机制 成骨细胞在骨形成过程中要经历成骨细胞增殖，细胞外基质成熟、细胞外基质 矿化和成骨细胞凋亡四个阶段。很多因素可调节这几个阶段，从而最终调控骨形成 。 成骨细胞增殖期成骨细胞数量增加，以形成多层细胞，并合成、分泌?型胶原 以便最终可以矿化形成骨结节。对成骨细胞增殖的调控具体说来即是对细胞周期的 调控，后者包括细胞在有丝分裂原作用下复制dna和细胞分裂的调节机制，典型的

氨基修饰聚醚醚酮表面及其成骨细胞相容性

工 程 塑 料 应 用 ENGINEERING PLASTICS APPLICATION 第45卷，第6期2017年6月 V ol.45，No.6Jun. 2017 24 doi:10.3969/j.issn.1001-3539.2017.06.005 氨基修饰聚醚醚酮表面及其成骨细胞相容性 * 刘吕花，郑延延，董军 (川北医学院基础医学院，四川南充 637000) 摘要：首先采用硼氢化钠将聚醚醚酮(PEEK)表面的羰基还原为羟基，获得羟基化预处理的PEEK ，再用3-氨基丙基三乙氧基硅烷与其进行反应，将氨基(—NH 2)引入至PEEK 表面以改善其细胞相容性。用X 射线光电子能谱和力学性能测试对表面化学处理的PEEK 进行表征，同时，用MC3T3–E1成骨细胞评价表面氨基修饰的PEEK 的细胞相容性。结果表明，硼氢化钠成功地将PEEK 表面的羰基还原为羟基，—NH 2成功地引入至PEEK 表面；表面化学处理前后PEEK 的拉伸及弯曲强度未发生明显变化；和未修饰的PEEK 表面相比，—NH 2修饰的PEEK 表面能显著促进成骨细胞的粘附、 铺展及增殖。关键词：聚醚醚酮；表面改性；生物活性；氨基；成骨细胞 中图分类号：R318.08 文献标识码：A 文章编号：1001-3539(2017)06-0024-05 Surface Osteoblast Compatibility of Amino-modified Polyetheretherketone Liu Lyuhua ， Zheng Yanyan ， Dong Jun (School of Basic Medical Sciences ， North Sichuan Medical College ， Nanchong 637000， China) Abstract ：Polyetheretherketone (PEEK) surface activation of carbonyl being reduced to hydroxyl was done with sodium boro-hydride. And then treatment of the hydroxylation-pretreated PEEK samples with a substituted 3-aminopropyltriethoxysilane solution endowed PEEK surface with amino (–NH 2) to enhance the cytocompatibility of PEEK surface. X-ray photoelectron spectroscopy and mechanical properties tests were employed to characterize the surface chemical modi ?ed PEEK samples. Meanwhile ，MC3T3–E1 osteoblast was used to evaluate in vitro biocompatibility of amino-modi ?ed PEEK surface. The results show that the carbonyl groups on PEEK surface are successfully reduced to hydroxyl groups by sodium borohydride and —NH 2 is successfully introduced on PEEK surface. Surface modi ?cations do not affect the tensile strength and ?exural strength of PEEK. MC3T3–E1 osteoblast adhesion ，spreading and proliferation on amino-modi ?ed PEEK surface are remarkably improved compared to intact PEEK. Keywords ：polyetheretherketone ；surface modi ?cation ；bioactivity ；amino ；osteoblast 特种工程塑料聚醚醚酮(PEEK)由于其拉伸 弹性模量(3~4 GPa)与皮质骨的拉伸弹性模量(6~23 GPa)接近，可透过X 射线，CT 或MRI 扫描时不产生伪影，并具有易加工、耐疲劳、耐磨损、耐腐蚀、耐消毒灭菌等优异性能[1–2]，有望替代医用钛及其合金用作硬组织(骨和牙齿)植入体。近年来，PEEK 受到材料学研究者和骨科学研究者越来越高的重视，并且被美国食品药品监督管理局(FDA)批准作为植入级的生物材料。但PEEK 本身是一种生物惰性材料，其表面不利于成骨细胞粘附，这在一定程度上限制了其在生物医用领域的应用。因此对其进行表面改性成为目前相关学者的研究重点之一。 PEEK 是由苯环通过酮键和醚键在对位连接而成，其共振稳定的化学结构使轨道电子离域于整条分子链之中，因而PEEK 具有极强的化学稳定性。但O. Noiset 等[3]发现其分子链上二苯甲酮中 的羰基在强还原剂的作用下可被还原为羟基，通过此羟基可进一步对PEEK 表面进行化学修饰。B. Yameen 等[4]利用此羟基将聚改性多苯乙烯，聚单甲氧基封端的低聚乙二醇甲基丙烯酸和聚N -异丙基丙烯酰胺接枝聚合于PEEK 表面，改善了其表面的选择性静电作用、抗菌作用和温度敏感特性。有研究表明：在材料表面引入某些化学基团[如羧基(—COOH)[5–6]、羟基(—OH)[7]、氨基(—NH 2)[8]、磺酸基(—SO 3H)[9]等]可促进细胞的粘附、铺展与增殖。在这些基团中，—NH 2修饰的表面更能刺激细胞成骨分化，因而，笔者利用末端带氨基的硅烷偶联剂与PEEK 上被还原后生成的羟基反应，以期在PEEK *川北医学院博士基金项目(CBY16-QD-02)，川北医学院科研发展计划项目(CBY16-A-ZD02) 联系人：郑延延，博士，讲师，主要从事生物医用材料研究收稿日期：2017-02-23

动物组织淋巴细胞分离液使用说明

动物组织淋巴细胞分离液使用说明 规格：4×200mL/kit 保存：18-25℃保存，有效期2年。动物组织淋巴细胞分离液易感染细菌，需无菌条件下操作。无菌条件下操作，启封后置于常温保存。如4℃保存，本分离液易出现白色结晶，影响分离效果。 试剂盒内容： 样本稀释液200mL 清洗液200mL 动物组织淋巴细胞分离液200mL F液200mL 操作步骤： 全过程样本、试剂及实验环境均需在20±2℃的条件下进行。 1.首先制备组织单细胞悬液。 2.取一支15ml离心管，加入与组织单细胞悬液等量的分离液（注：分离液最少不得少于3ml）。 3.用吸管小心吸取组织单细胞悬液加于分离液液面上，400-500g，离心20-30min。（注：根据组织单细胞悬液量确定离心条件，组织单细胞悬液量越大，离心力越大，离心时间越长，具体离心条件需客户自行摸索，以达到最佳分离效果）。 4.离心后，此时离心管中由上至下分为四层。第一层为稀释液层。第二层为环状乳白色淋巴细胞层。第三层为透明分离液层。第四层为红细胞层。 5.用吸管小心吸取第二层环状乳白色淋巴细胞层到另一15ml离心管中，向离心管中加入 10ml清洗液，混匀细胞。 6.250g，离心10min。

7.弃上清。 8.用吸管以5ml清洗液重悬所得细胞。 9.250g，离心10min。 10.重复7、8、9，弃上清后以0.5ml后续实验所需相应液体重悬细胞。 注意事项： 1.全过程样本、试剂及实验环境均需在20±2℃的条件下进行。为获得最佳的实验结果，最好在取样2h内进行实验，样品存放时间越长，细胞分离效果越差。样品放置超过6h后分离效果更差甚至不能达到分离目的。 2.本实验最好不要使用高聚合材质（如聚苯乙烯）的塑料制品，应使用无静电、低静电离心管及未经碱处理过后的玻璃制品，因为静电作用将导致细胞贴壁、碱处理的玻璃表面会变成毛面，影响细胞分离效果。 3.吸取过多的淋巴细胞层及分离液层会导致分离液交界处的粒细胞被吸出从而使混杂的粒细胞数量增加。 4.分离液用量大于组织单细胞悬液样本时，分离效果更佳。

神奇的骨细胞

神奇的骨细胞 摘要：在过去的十多年里，关于骨细胞的分子生物学和功能的研究数据产生了井喷式的爆发。远不是所谓的在骨中尸位素餐，骨细胞已经被发现具有多种功能，如其在破骨细胞和成骨细胞活性的调节中起作用，而且骨细胞还是一种内分泌细胞。骨细胞不仅是靶点在骨表面的可溶性因子的来源；而且有的可溶性因子的靶点在别的器官，如肾脏、肌肉和其他组织。这种细胞发挥两个磷代谢和钙有效性的作用，还参与到骨基质重塑。骨细胞90％到95％由成熟的骨细胞构成，并且这些细胞是存活时间最长的骨细胞，可以在矿化环境下最在十年以上的时间。随着年龄的增长，这些细胞就会死亡，留下空骨陷窝经常微孔（micropetrose）。老年骨等骨骨坏死就与空骨陷窝与骨重塑能力降低有关。炎症因子如肿瘤坏死因子和用于治疗炎性疾病诱发骨细胞的细胞死亡的糖皮质激素，但具有潜在不同的结果不同的机制。因此，健康的，有活力的骨细胞是骨骼等器官行使正常功能的必要条件。 骨细胞研究的先驱 在被引入到PubMed中或者发表成论文之前，很多关于骨细胞的最早的研究发现就像细胞本身一样，被湮没并且难以觅其踪迹。和其他人一样，我和我的同事都会认为自己的一些假设是很新颖的，知道相关出版物可以很容易得到，才意识到并不如愿。例如，一百多年前，改造骨细胞的排列还只是假设。40多年前，都认为骨细胞对于甲状腺素敏感，并影响骨结构，而且甲状腺素可以促进酒石酸盐酸性磷酸酶的表达；20多年前，骨细胞被定义为机械传感细胞。Marotti和Palumbo为他们关于骨细胞的功能和信号传导作用绘制了一张漂亮的图表。组织学被这些先驱者广泛应用于阐述他们的观点。Peter Nijweide是第一个单独研究（鸟）骨细胞的人。Kumegawa和他的同事最早发表了包括骨细胞在内很多骨组织细胞的视频。随着诸如分子生物学、转基因、成像技术、细胞系、系统生物学、先进的仪器等先进科技的发展，近十年内骨生物学相关信息的发现迎来了高潮，开始验证旧观点，提出新概念。这都将在本综述中着重提及。 骨细胞由成骨细胞形成 骨细胞，在骨组织中含量最高的细胞，由间充质干细胞形成的成骨细胞分化而成。Manolagas认为成骨细胞不仅可以变成骨细胞、内皮细胞，也可以控制细胞凋亡。他的观点是基于一个更早的先驱-Michael Parfitt，他认为成骨细胞的死亡原因一定是细胞凋亡。骨细胞的形成一直被认为是一个被动过程，在过程中成骨细胞被动吸收一些类似骨成分的矿物质。但是，有很多反例导致骨形成是一被动过程充满争议。 第一个变化在嵌入细胞的树突形成过程中发现。这种细胞在从一个多边形细胞转化成有伸长的树突过程中发生了不可思议的变化，树突不仅仅伸长到血管中同时也伸长到骨表面。这种细胞一旦嵌入骨，特别是皮质骨，就会特别与矿化方向相关产生一种极性。这种骨样骨细胞一定同时有两种作用：调节矿化和形成枝状信号连接通路。这种骨样骨细胞可以控制并调节矿化过程，Holmbeck和他的同事们展示了先骨细胞的嵌入需要分解胶原蛋白或其他基质分子。金属蛋白酶MT1-MMP缺陷小鼠体内骨细胞的可以导致树突形成的长度和数量的减少。破膜蛋白酶MT1-MMP可以裂解I,II,III型胶原蛋白,纤维蛋白、纤连蛋白和其他基质分子。在老鼠模型中，与赵和其同事发现的用蛋白酶抑制剂抑制一型胶原蛋白可促进细胞凋亡相比，树突的几乎完全缺失并没有对骨细胞的密度和生理活性构成明显影响。但是不能确定缺乏树突的形成是否对骨细胞的作用或骨架的作用构成影响，因为MT1-MMP缺陷小鼠由于其他骨架组织缺乏MT1-MMP都个头比较小。 骨细胞形态是由E11/gp38/平足蛋白等嵌入型基质骨细胞的标记分子控制。E11也叫平足蛋白、OTS-8，gp38或者PA2.25，它最早是在大鼠骨骼骨细胞和大鼠成牙质细胞表面发现的。他也在大鼠的肺或者脑、肾、淋巴系统或皮肤等组织表达。在用小干扰RNA抑制了E11