宏基因组学

宏基因组( Metagenome)(也称微生物环境基因组Microbial Environmental Gen ome, 或元基因组) 。是由Handelsman等1998 年提出的新名词, 其定义为“the genomes of the total microbiota found in nature”, 即生境中全部微小生物遗传物质的总和。它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因, 目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。而所谓宏基因组学(或元基因组学, metage nomics) 就是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象, 以功能基因筛选和/或测序分析为研究手段, 以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的的新的微生物研究方法。

宏基因组De Novo拼接

由于宏基因组测序的覆盖率通常是不完全的，所以组装所需要的序列并不是很完整。并且组装的时候，可能会把来自不同分类单元（OTU）的序列组装在一起，产生嵌合体基因组。Phrap,Forge,Arachne,JAZZ和Celera Assembler等可用来组装由sanger法产生的宏基因组序列。这些算法大部分都利用mate-pair信息来参与组装。这些算法用顶点来代表每条read,互相重叠的read之间用边连起来，它们的组装问题可以转换成“哈密尔顿路径”搜索问题，即找到一条路径走过所有顶点，且每个顶点只走一次。

菌群间差异分析

有几种基于序列特征的比较，包括样品间GC含量的比较，微生物基因组大小的比较，系统发育关系树的比较和功能组分的比较。许多比较分析都用到了关联统计学的方法，通常假设有几种元数据影响观测到的宏基因组群体的组分。主成分分析（PCA）和非度量多维标度（NM-MDS）用来图形化展示数据并揭示有哪些因素最影响数据。

有几种进行宏基因组比较分析的软件。第一个是MEGAN，可以比较两个或几个标准化后的样品的GC含量。第二种是MG-RAST，提供了一种比较功能和基于序列的分析来上传样本。第三种是CAMERA，提供了BLAST接口让客户可以比对40多种现有的宏基因组数据。

预测编码基因

目前发现编码基因的方法有两种。一种是基于BLAST比对的方法，这种方法通过比对已有的数据库，可以发现宏基因组数据中有哪些已知基因的同源基因的存在，但缺陷是找不到哪些和已经基因没有同源关系的新基因。第二方法是重新预测基因的方法，这些方法大部分是基于有指导学习和统计模式识别的方法，包括隐马尔科夫模型。GeneMark.hmm就是基于单密码子频率的非均一马尔科夫模型

来预测基因的软件，当这些软件用到宏基因组数据上时，这些软件通常无法确定部分的ORF,即使这些ORF是真实基因的一部分。

代谢通路分析（pathway analysis）

代谢通路分析是为了研究某一个环境中各种代谢途径的富集程度。一般需要根据统计检验方法（如P-value）来筛选。常用的代谢通路数据库有KEGG、Reacto me、BioCyc、RegulonDB、WikiPathwans等。KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）是系统分析基因功能、基因组信息数据库，它有助于研究者把基因及表达信息作为一个整体网络进行研究。基因组信息存储在GENES数据库中，包括完整和部分测序的基因组序列；更高级的功能信息存储在Pathway 数据库里，包括图解的细胞生化过程如代谢、膜转运、信号传递、细胞周期，还包括同系保守的子通路等信息。KEGG的另一个数据库是LIGAND，包括关于化学物质、酶分子、酶反应等信息，可以免费获取。KEGG提供的整合代谢途径（Pathway）查询十分出色，包括碳水化合物、核苷、氨基酸等的代谢及有机物的生物降解，不仅提供了所有可能的代谢途径，而且对催化各步反应的酶进行了全面的注解，包含有氨基酸序列、PDB的链接等。

应用领域：

肠道、口腔、呼吸道、皮肤、食品微生态，寻找微生物感染问题的原因，以肠道方面的应用为例：

饮食、能量摄取、肥胖与肠道菌群之间的关系

肠道菌群与疾病发生之间的关联

比如未明确感染源的炎症性肠病，

抗生素治疗对肠道菌群的影响

比如说大剂量抗生素治疗后，医生需要观察是否影响到肠道菌群的比例。

不同个体肠道微生物群落结构及其受其他外界因素（压力、致病菌感染、手术）的影响等。

宏基因组学的研究进展

宏基因组学的研究状况及其发展 摘要：宏基因组学是近年来发展起来的一门新兴学科，主要技术包括从环境样品中提取微生物混合基因组DNA、利用可培养的宿主菌建立宏基因组文库及筛 选目的基因。该技术可以克服传统培养技术的不足，是研究未培养微生物、寻找新功能基因和开发获得新资源的重要新途径。目前宏基因组学已广泛应用于各个领域，并在医药、农业、能源开发、环境修复、生物技术、生物防御等方面有了较深入的研究。 关键词：宏基因组学、宏基因组、基因组文库构建、文库筛选、未培养微生物、研究进展 随着微生物学的发展，微生物基因组全序列测定计划正在全球被快速地推行，但现有技术条件下，自然界存在的可培养微生物不到总数的1％，阻碍了该计划 的发展，使得绝大多数的微生物资源不能被开发和利用。21世纪初，随着测序能力的提高和基因组学的发展，科学家提出了一种研究不可培养微生物基因组的新思路——直接对含有各种不可培养的微生物的群体进行基因组序列的测定。这类研究称为Metagenomics，前缀“Meta”源于希腊语。意思是“超越”。科学家选择它来表示这种基因组研究超越了传统意义上分析单一物种的基因组学，将研究对象定为由种类众多的微生物组成的整个菌落。国内的研究者也据此将该术语翻译为“宏基因组学”。 1 宏基因组的概念 宏基因组 (也称微生物环境基因组、宏基因组学、元基因组学、生态基因组学) 是由Handelsman等1998年提出的新名词, 其定义为“the genomes of the total microbiota found in nature”，即生境中全部微小生物遗传物质的总和。它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因, 目前主要指环境样品中的细菌 和真菌的基因组总和。而所谓宏基因组学就是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象, 以功能基因筛选和测序分析为研究手段, 以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的的新的微生物研究方法。一般包括从环境样品中提取基因组 DNA, 克隆DNA到合适 的载体,导入宿主菌体,筛选目的转化子等工作。宏基因组文库既包含了可培养的又包含了不能培养的微生物基因，避开了微生物分离培养的问题，极大地扩展了微生物资源的利用空间，增加了获得新的生物活性物质的机会，为新的医药产业和发现新的生物技术提供丰富的基因文库，并利于环境微生物有机群体的分布和功能的研究。 2 宏基因组学的研究过程 2．1 宏基因组文库的构建 宏基因组文库的构建沿用了分子克隆的基本原理和技术方法，并根据具体环境样品的特点和建库目的采用了一些特殊的步骤和策略。一般包括样品总DNA的 提取、与载体连接和克隆到宿主中。 2．1．1样品总DNA的提取 宏基因组文库构建的关键之一是获得高质量的目的样品的总DNA。目的样品 的采集是第一步，除了需严格遵循取样规则外，取样中应尽量避免对样品的干扰，缩短保存和运输的时间，使样品能更好地代表自然状态下的微生物原貌。 根据提取样品总DNA前是否分离细胞，提取方法可以分为原位裂解法和异位 裂解法。原位裂解法主要是通过去污剂处理(如SDS)、酶解法(如蛋白酶K)、机械

宏基因组学概述

宏基因组学概述

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宏基因组学概述 王莹，马伊鸣 （北京交通大学土木建筑工程学院环境140２班） 摘要:随着分子生物学技术的快速发展及其在微生物生态学和环境微生物学研究中的广泛应用，促进了以环境中未培养微生物为研究对象的新兴学科——微生物环境基因组学(又叫宏基因组学、元基因组学，英文名Mｅｔａｇenomics)的产生和快速发展。宏基因组学通过直接从环境样品中提取全部微生物的DNＡ,构建宏基因组文库，利用基因组学的研究策略研究环境样品所包含的全部微生物的遗传组成及其群落功能．在短短几年内,宏基因组学研究已渗透到各个领域，包括海洋、土壤、热液口、热泉、人体口腔及胃肠道等,并在医药、替代能源、环境修复、生物技术，农业、生物防御及伦理学等各方面显示了重要的价值。本文对宏基因组学的主要研究方法、热点内容及发展趋势进行了综述 关键词:宏基因组宏基因组学环境基因组学基因文库的构建 Mａcｒo summary of Ｍetagenｏｍｉcs WanｇＹｉng，Ma Ｙi-Mｉｎｇ (BeｉjinｇＪiaoｔｏngUniｖeｒsiｔy, Inｓtitute of civiｌ enｇｉneerｉｎｇ,）Key ｗords:Metａgenｏmｅ; Ｍetagenoｍiｃs;The eｎviｒｏｎｍental genｏmics 宏基因组学（Meｔａgeｎomｉｃｓ)又叫微生物环境基因组学、元基因组学。它通过直接从环境样品中提取全部微生物的DNＡ,构建宏基因组文库,利用基因组学的研究策略研究环境样品所包含的全部微生物的遗传组成及其群落功能。它是在微生物基因组学的基础上发展起来的一种研究微生物多样性、开发新的生理活性物质（或获得新基因）的新理念和新方法。其主要含义是:对特定环境中全部微生物的总DNA(也称宏基因组，metａgeｎomｉc)进行克隆,并通过构建宏基因组文库和筛选等手段获得新的生理活性物质；或者根据ｒDNA数据库设计引物,通过系统学分析获得该环境中微生物的遗传多样性和分子生态学信息。 1.起源 宏基因组学这一概念最早是在19９８年由威斯康辛大学植物病理学部门的Jo Haｎｄelsman等提出的,是源于将来自环境中基因集可以在某种程度上当成一个单个基因组研究分析的想法，而宏的英文是"meta－"，具有更高层组织结构和动态变化的含义。后来伯克利分校的研究人员Kevin Chen和LｉoｒPaｃｈｔer将宏基因组定义为"应用现代基因组学的技术直接研究自然状态下的微生物的有机群落,而不需要在实验室中分离单一的菌株"的科学。 2 研究对象 宏基因组学(Ｍeｔagenｏｍics)是将环境中全部微生物的遗传信息看作一个整体自上而下地研究微生物与自然环境或生物体之间的关系。宏基因组学不仅克服了微生物难以培养的困难, 而且还可以结合生物信息学的方法, 揭示微生物之间、微生物与环境之间相互作用的规律, 大大拓展了微生物学的研究思路与方法, 为从群落结构水平上全面认识微生物的生态特征和功能开辟了新的途径。目前, 微生物宏基因组学已经成为微生物研究的热点和前沿, 广泛应用于气候变化、水处理工程系统、极端环境、人体肠道、石油污染、生物冶金等领域, 取得了一系列引人瞩目的重要成果。 3 研究方法

宏基因组分析和诊断技术在急危重症感染应用的专家共识

宏基因组分析和诊断技术在急危重症感染应用的专家共识 感染是急危重症患者死亡的主要原因之一。近年来，随着新发病原微生物的出现、耐药病原微生物的增多以及免疫抑制宿主的增加，感染的发病率和死亡率仍居高不下，脓毒症(严重感染)患者病死率高达50%[1-3]。最新调查研究发现，中国脓毒症相关性标化死亡率为66.7例/10万人口，全国每年共有脓毒症相关性死亡病例近103万例[3]。重症感染起病急、进展快、病原体复杂，短时间内能否明确致病病原微生物至关重要。 传统的病原微生物检测方法主要包括形态学检测、培养分离、生化检测、免疫学和核酸检测。因操作简单、快速、技术要求不高，同时具有一定的诊断敏感性和特异性，目前仍在临床上广泛使用。但传统的检测方法在敏感性、特异性、时效性、信息量等方面存在局限，而且对于未知或者罕见的病原微生物，无法快速识别。 基于宏基因组新一代测序技术(metagenomics next-generation sequencing，mNGS)不依赖于传统的微生物培养，直接对临床样本中的核酸进行高通量测序，然后与数据库进行比对分析，根据比对到的序列信息来判断样本包含的病原微生物种类，能够快速、客观地检测临床样本中的较多病原微生物(包括病毒、细菌、真菌、寄生虫)，且无需特异性扩增[4-8]，尤其适用于急危重症和疑难感染的诊断。 为了规范运用mNGS进行病原微生物的诊断、正确解读检测结果和指导治疗，我们组织了急危重病、感染病学和病原微生物学相关领域的专家，制定了本共识。 1 mNGS分析和诊断技术是急危重症感染快速、精准诊疗的发展方向 新一代测序技术是一个开放的分析和诊断系统，目前已经纳入的病原体有8000多种，其中包括3000余种细菌、4000余种病毒、200余种真菌和140种寄生虫，为疑难危重症及罕见病原微生物感染的诊断提供了有效的技术手段。 自2008年成功应用于临床诊断新发病原体感染以来[9-10]，目前mNGS技术已经逐步用于临床疑难感染诊断，如华山医院张文宏团队[11]用mNGS协助确诊猪疱疹病毒的跨物种传播，并给予针对性治疗使患者痊愈，深圳市第三人民医院用mNGS确诊了一例罕见阿米巴脑炎[11-12]。 mNGS对脓毒症、免疫抑制宿主并发严重感染、重症肺部感染等疾病具有较高的临床应用价值，能够快速、精准地找到病原体；另外对于抗菌药物治疗方案的制定和治疗效果的评估具有一定的指导作用[9-16]。Long等[17]研究发现血培养联合mNGS诊断细菌或真菌感染，阳性率较单用血培养显著升高。以健康人群为基线，建立每种微生物在正常人群中的分布情况模型，进而计算脓毒症指数来评估检出微生物的核酸数量，Crumaz等[18]发现在脓毒症患者血液标本中病原菌的脓毒症指数绝对值、丰度显著升高，而且其变化与临床治疗效

宏基因组测序在感染性疾病病原学诊断中的应用

宏基因组测序在感染性疾病病原学诊断中的应用 感染性疾病一直是世界范围内疾病主要致死原因之一。WHO监测统计数据显示，在2016年全球约5690万例死亡患者中，有3项感染性疾病（下呼吸道感染、腹泻病、结核病）位列前10大死因，共造成的死亡数约占总死亡数的10%，其中下呼吸道感染造成约300万例患者死亡，腹泻病造成约140万例患者死亡，结核病造成约130万例患者死亡。感染性疾病的病原体十分复杂，包括细菌、病毒、真菌及寄生虫等，而在目前的临床微生物检测工作中，微生物实验室对病原体的诊断主要还是依赖自19世纪即开展的培养、染色镜检等传统检测方法，以及后续发展的核酸扩增检测（例如PCR）、分子免疫学检查（例如ELISA）等检测手段，这使得临床医生对感染性疾病的病原学诊断、病情评估及治疗方案制定等存在许多困难。目前仍有约60%的感染性疾病病例的病原体是诊断不明的。由于宏基因组测序（mNGS）对病原学诊断具有无偏移、全覆盖、高效率等优势，越来越多的学者尝试将其应用于临床病原学诊断之中。在此，我们回顾了近些年宏基因组测序在病原学诊断中的临床应用进展情况。 １．临床宏基因组学 宏基因组的概念最早在1998年被学者提出，指在一份独立的土壤标本中，所有微生物的基因组信息的总和，包括那些无法培养的生物体的基因组信息。后来，宏基因组的概念不仅仅局限于描述环境来源的标本，还被逐渐沿用于描述临床来源标本中的生物遗传信息特征。临床宏基因组学指为获取临床相关的微生物信息而对临床来源的标本中所有的核酸序列进行测序分析的一门学科间。宏基因组测序主要是通过以新一代测序为代表的高通量测序技术，对临床来源的标本进行宏基因组学分析，以获取病原体的物种分类、血清型、耐药性、毒力等一系列生物信息。由于宏基因组测序不依赖病原体培养结果且可以不对可疑病原体的标志核酸序列进行靶向扩增，这使得检测结果更具客观性和全面性，且更迅捷，这是对传统实验室检测手段的有效补充。《中国成人医院获得性肺炎与呼吸机相关性肺炎诊断和治疗指南（2018年版）》也指出临床宏基因组学能明显提高病原体诊断的敏感性，部分病原体检测花费的时间更短，尤其对罕见病原体的诊断具有优势，可审慎地应用于临床实践之中。正是得益于测序技术的不断进步与发展，

宏基因组测序技术检测方法

宏基因组测序技术检测标准 简介： 宏基因组测序介绍 宏基因组学是以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，通过现代基因组技术手段包括功能基因的筛选和测序分析，对环境中微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系以及环境之间的关系进行研究的新的微生物研究方法。随着高通量测序技术的发展，为宏基因组学研究提供了新的理想研究方法。高通量测序的方法无需分离环境中各种微生物，也无需构建克隆文库就可以直接对环境中所有微生物进行测序。可以真实客观的反映环境中微生物的多样性、种群结构、进化关系等。目前又可以分为针对16s DNA/18sDNA/ITS测序和针对宏基因组全序列的测序研究。下面就是对这两者的具体介绍。 一、16s DNA/18s DNA/ITS测序 16sDNA是最常用的微生物物种分子鉴定的标签，，通过对样品中16sDNA测序可以鉴定其中微生物物种的丰度和分布情况。目前，普遍使用Roche 454平台来对环境样品进行16s DNA测序。因为16s DNA序列比较相似，读长短的话，难以进行有效的比对，而454平台的平均读长在400bp左右，可以很好的避免此类问题。 二、宏基因组全测序 在这种测序方式中，我们可以假定一个环境中的所有微生物就是一个整体，然后对其中所有的微生物进行测序。这样我们就可以研究样品中的功能基因以及其在环境中所起的作用而不用关心其来自哪个微生物。可以发现新的基因，可以进行基因的预测，甚至有可能得到某个细菌基因组的全序列。此外，该项测序不单可以针对DNA水平，也可以针对全RNA进行基因表达水平的研究。 样品处理：

宏基因组样品收集主要有口腔，下呼吸道痰液，下呼吸道灌洗液，皮肤和粪便。样品采集遵照样品采集规范（人）所规定的操作来进行。尽量留足备份样品。核酸提取： 宏基因组核酸提取主要有两种方法：膜过滤法和直接裂解提取。对于液体样品如痰液，灌洗液两种方法都适用，对于固体样品如粪便宜采用直接裂解的方法。核酸提取后用NanoDrop ND-1000测定，260/280 = ， 260/230 = ，电泳检测DNA 应是完整的一条带。 测序Sequencing 1)16S/18S测序： Sanger测序： 用于低通量的16S/18S DNA测序，提取宏基因组后，首先通过PCR将16S/18S 序列扩增出来，再将其连接到克隆载体上，导入感受态细胞，涂平板做蓝白斑筛选，选出阳性克隆提质粒，对质粒进行测序反应，测序反应后纯化后用ABI 3130或ABI 3730进行毛细管电泳测序。 由于其测序准确率比较高，而通量非常低，现通常用做二代测序结果的验证。454 Platform： 454平台主要包括两种测序系统：454 GS FLX+ System和454 GS Junior System。454 GS FLX+ System测序读长可以达到600-1000bp，通量450-700M，GS Junior System测序读长在400bp左右，通量在35M。

利用病毒宏基因组学寻找在瓜德罗普不同蚊种中稳定独特的核心真核病毒

利用病毒宏基因组学寻找在瓜德罗普不同蚊种中稳定独特的核心真核病毒 Stable distinct core eukaryotic viromes in different mosquito species from Guadeloupe, using single mosquito viral metagenomics 利用病毒宏基因组学寻找在瓜德罗普不同蚊种中稳定独特的核心真核病毒 作者：Chenyan Shi 等 期刊：Microbiome 时间：2019.8 影响因子: 10.465 DOI：10.1186/s40168-019-0734-2 一、研究背景 对人类来说，蚊子这种无脊椎动物是一种非常重要的病毒载体，近年来的研究证明其身上携带着大量未被研究的病毒。以往的研究通常对大量的蚊子进行宏基因组测序，而不评估单个蚊子的病毒多样性。为了解决这个问题，作者使用优化的病毒宏基因组学实验操作流程(NetoVIR)来比较2016年和2017年从瓜德罗普岛不同地点收集的埃及伊蚊和埃及库蚊的病毒量。（注：瓜德罗普是法国的海外省，位于加勒比海小安的列斯群岛中部。属热带雨林气候，平均气温26℃。） 二、实验结果 1.利用单只蚊子进行病毒宏基因组的可行性 作者将单只蚊子和混合蚊（5只蚊子）分别测序组装成contigs，然后比对注释分类为真核生物，细菌，古生菌，真核病毒，噬菌体，待确认噬菌体(噬菌体TBC)，未归类病毒和暗物质（未被比对软件识别的contigs）共8个分类。通过比较单只蚊子与混合蚊在每个分类下reads数量占比、映射到nr contigs 数目、病毒读数比例(真核病毒、噬菌体和未分配病毒)，发现单只蚊子样本的总读数和病毒读数比例与混合蚊样本相比无显著差异，证明了单只蚊子进行病毒宏基因组学研究的可行性。

病毒宏基因组学方法优缺点及意义

病毒宏基因组学方法优缺点及意义 病毒宏基因组学方法优缺点及意义 随着时代的发展和生物科学技术的进步，新兴的病毒宏基因组学为解决这些问题提供了契机，以下是一篇关于病毒宏基因组学探究的论文范文，供大家阅读参考。 病毒个体微小，多数病毒直径在100nm(20~200nm)，较大的病毒直径300~450nm,较小仅为18~22nm,结构简单，不能独立复制需要依赖于宿主细胞复制繁殖，被许多生物学家认为是处于生命和非生命交叉区域的存在物。据估计目前对病毒的发掘还不到1%[1],对病毒的研究具有广阔的前景和现实意义。病毒独特的结构和特性给病毒的研究和鉴别带来许多困难，主要体现在两个方面：第一，病毒没有专门的宿主细胞系，60%以上的病毒无法成功的进行离体培养[2]或在培养中不能表达致病性;第二，病毒基因本身变异率高，通过与宿主间的相互作用进化，增加核酸多样性，产生新病毒，导致宿主范围扩大、跨物种传播[3].对细菌的研究可以通过保守的16sRNA的分析来定位分类信息、进化关系和种群多样性等。对于真菌有18sRNA及ITS序列。然而病毒不像细菌真菌，没有固定保守的进化标记基因。 所以一些传统研究方法的应用受到限制，不能完全满足病毒研究的需要。如电镜观察病毒的灵敏性不高，细胞培养病毒可能观察不到细胞病变，血清学反应中不但难以获得高价抗体而且容易出现交叉反应导致错误结果，传统PCR方法对未知序列及高变异的病毒研究难以发挥作用。加之近年来病毒流行病的频繁发生及其可怕的传染性，对人类及动植物的健康产生严重威胁，如HIV病毒、SARS病毒、禽流感病毒和在西非等地肆虐的埃博拉病毒[4]等，给人们造成了巨大的恐慌和经济损失。因此，对病毒基因组的研究、致病源的探索、病毒在生物体和环境中如何存在及传播、病毒病防治的研究已迫在眉睫。 随着时代的发展和生物科学技术的进步，新兴的病毒宏基因组学为解决这些问题提供了契机，宏基因组学(Metagenomics)的概念是1998年由Handelsman[5]首次提出，对特定环境中基因组的总和进行研究，包括培养的和未培养的.微生物。病毒宏基因组学(Viral metagenomics)就是宏基因组学在病毒领域的应用，即从环境或生物组织中浓缩病毒粒子的遗传物质进行生物学信息分析的技术。它的应用需要一些交叉学科的创新技术的支持，随机

宏基因组学的一般研究策略

宏基因组学的一般研究策略 摘要: 宏基因组学是目前微生物基因工程的一个重要方向与热点。它把微生物的总群体特性与基因组学实验手段结合了起来，包括从环境样品中提取总DNA、再用可培养的宿主微生物建立文库及筛选目的克隆和基因。该法是研究不可培养微生物、寻找新的基因和开发新活性产物的重要新途径。它避开了微生物分离、纯化和培养的步骤,大大扩展了微生物资源的利用范围。本文旨在介绍宏基因组学的一般研究方法并结合我们的实验情况,对这一崭新领域中的最新研究策略进行了简要综述。 关键词: 宏基因组学, 不可培养微生物, 文库构建, 文库筛选，研究策略 Strategies for accessing metagenomics for desired applications Abstract: Metagenomics is a new field of microbial genetic engineering. It has the characteristics of microbial ecology and the methodology of genomics. Metagenomics includes genomic DNA isolation, library construction and screening strategies, and can be used in the discovery of new gene and biocatalysts and in the study of uncultured microorganism. Metagenomics can overcome the advantages of isolation and cultivation procedures in traditional microbial method, and thus greatly broaden the space of microbial resource utilization. In this paper, we mainly reviewed the metagenomic methodology, together with the latest advances and novel strategy in this research field. Keywords：Metagenomics; Uncultured microorganism；Library construction；Library screening Research strategies 大自然中蕴藏着无数具有重要价值的微生物及其活性产物,也是新基因及生物学资源的重要源泉，对其进行研究成为微生物学和分子生物学研究的一个重要方向。然而人们现在能够培养与利用的不到环境中总微生物的1%[1]。宏基因组学(metagenomics)是直接从环境样品中提取全部微生物的总DNA, 避开了分离、纯化和培养微生物的过程来构建宏基因组文库,用基因组学的研究策略来研究环境样品中的总微生物的组成及其在群落中的功能等。现在,宏基因组学技术方法已在微生物多样性,微生物细胞间的相互作用,新基因和新型生物催化剂的开发，新的抗生素的开发及环境生态等方面得到了广泛应用[2]。本文旨在介绍宏基因组学的一般实验方法并结合我们的研究情况,对这一崭新领域中的最新研究策略进行了简要综述。深化了我们对这一学科的认识,促进了该学科的进步。 1 宏基因组学研究策略 1.1宏基因组学概要 宏基因组学是Handelsman等于1998年提出的[3], 可见是一门很新的学科，其随着基因组实验手段，生物信息学和测序技术等的日新月异也迅猛发展了起来，这个新学科是以环境样品的总微生物基因组为实验对象，通过测序分析、文库评价、产活性物质及其基因的克隆的获取和基因功能的鉴别，对微生物种群组成与生物量、生态学关系、生物化学关系与环境关系以及功能活性进行研究[4]。其主要过程包括样品和基因的富集和提取; 宏基因组文库的构建; 目的基因的筛选; 目的基因活性产物的表达(图1)。 1.2 微生物及其基因的富集 在文库筛选过程中由于目的基因比例较小, 对环境中微生物的富集不但可提高基因总量，有利于基因的提取，还可增加目的基因的比例，如Kouker 等用橄榄油富集产脂肪酶的微生物收到了很好的效果[5 ]，橄榄油不仅可作为底物，还可诱导脂肪酶的合成。目前富集技术主要分为细胞水平和基因水平。其中细胞水平主要是用选择培养基来富集某些微生物, 常

宏基因组测序技术检测方法模板

宏基因组测序技术 检测方法

宏基因组测序技术检测标准 简介： 宏基因组测序介绍 宏基因组学是以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，经过现代基因组技术手段包括功能基因的筛选和测序分析，对环境中微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系以及环境之间的关系进行研究的新的微生物研究方法。随着高通量测序技术的发展，为宏基因组学研究提供了新的理想研究方法。高通量测序的方法无需分离环境中各种微生物，也无需构建克隆文库就能够直接对环境中所有微生物进行测序。能够真实客观的反映环境中微生物的多样性、种群结构、进化关系等。当前又能够分为针对16s DNA/18sDNA/ITS测序和针对宏基因组全序列的测序研究。下面就是对这两者的具体介绍。 一、16s DNA/18s DNA/ITS测序 16sDNA是最常见的微生物物种分子鉴定的标签，，经过对样品中16sDNA测序能够鉴定其中微生物物种的丰度和分布情况。当前，普遍使用Roche 454平台来对环境样品进行16s DNA测序。因为16s DNA序列比较相似，读长短的话，难以进行有效的比对，而454平台的平均读长在400bp左右，能够很好的避免此类问题。 二、宏基因组全测序

在这种测序方式中，我们能够假定一个环境中的所有微生物就是一个整体，然后对其中所有的微生物进行测序。这样我们就能够研究样品中的功能基因以及其在环境中所起的作用而不用关心其来自哪个微生物。能够发现新的基因，能够进行基因的预测，甚至有可能得到某个细菌基因组的全序列。另外，该项测序不单能够针对DNA水平，也能够针对全RNA进行基因表示水平的研究。 样品处理： 宏基因组样品收集主要有口腔，下呼吸道痰液，下呼吸道灌洗液，皮肤和粪便。样品采集遵照样品采集规范（人）所规定的操作来进行。尽量留足备份样品。 核酸提取： 宏基因组核酸提取主要有两种方法：膜过滤法和直接裂解提取。对于液体样品如痰液，灌洗液两种方法都适用，对于固体样品如粪便宜采用直接裂解的方法。核酸提取后用NanoDrop ND-1000测定，260/280 = 1.8-2.0， 260/230 = 1.8-2.0，电泳检测DNA应是完整的一条带。 测序Sequencing 1)16S/18S测序： Sanger测序： 用于低通量的16S/18S DNA测序，提取宏基因组后，首先经过PCR将16S/18S序列扩增出来，再将其连接到克隆载体上，导

病毒宏基因组学方法优缺点及意义【可编辑版】

病毒宏基因组学方法优缺点及意义【可编辑版】病毒宏基因组学方法优缺点及意义病毒宏基因组学方法优缺点及意义 病毒个体微小，多数病毒直径在100nm，较大的病毒直径300~450nm,较小仅为18~22nm,结构简单，不能独立复制需要依赖于宿主细胞复制繁殖，被许多生物学家认为是处于生命和非生命交叉区域的存在物。据估计目前对病毒的发掘还不到1%,对病毒的研究具有广阔的前景和现实意义。病毒独特的结构和特性给病毒的研究和鉴别带来许多困难，主要体现在两个方面: 第一，病毒没有专门的宿主细胞系，60%以上的病毒无法成功的进行离体培养或在培养中不能表达致病性;第 二，病毒基因本身变异率高，通过与宿主间的相互作用进化，增加核酸多样性，产生新病毒，导致宿主范围扩大、跨物种传播.对细菌的研究可以通过保守的16sRNA的分析来定位分类信息、进化关系和种群多样性等。对于真菌有18sRNA及ITS序列。然而病毒不像细菌真菌，没有固定保守的进化标记基因。 所以一些传统研究方法的应用受到限制，不能完全满足病毒研究的需要。如电镜观察病毒的灵敏性不高，细胞培养病毒可能观察不到细胞病变，血清学反应中不但难以获得高价抗体而且容易出现交叉反应 导致错误结果，传统PCR方法对未知序列及高变异的病毒研究难以发挥作用。加之近年来病毒流行病的频繁发生及其可怕的传染性，对人类及动植物的健康产生严重威胁，如HIV病毒、SARS病毒、禽流感病毒和在西非等地肆虐的埃博拉病毒等，给人们造成了巨大的恐慌和经济损失。因此，对病毒基因组的研究、致病源的探索、病毒在生物体和环境中如何存在及传播、病毒病防治的研究已迫在眉睫。 随着时代的发展和生物科学技术的进步，新兴的病毒宏基因组学为解决这些问题提供了契机，宏基因组学的概念是1998年由Handelsman首次提出，对特定环境

宏基因组学研究方法及应用概述

宏基因组学研究方法及应用概述彭昌文　(山东省济宁学院生物学系　273155)　颜　梅　(山东省曲阜师范大学生命科学学院　273165) 摘　要　本文简要介绍了宏基因组的概念,概述了其原理及应用。 关键词　宏基因组　宏基因组学　环境基因组学　基因文库的构建 迄今,人们对微生物世界的认识基本都来源于对占细菌总种数不到1%的微生物的单个种群的孤立研究结果。然而微生物是通过其群落而非单一种群来执行在自然界物质与能量循环中的作用的,对微生物群落作为整体的功能认识远远落后于对其个体的认识。这种状况不利于全面认识微生物在自然界所扮演的重要角色。为了获得完整的环境微生物基因表达产物,早在1978年许多学者就提出了直接从环境中提取微生物DNA的思路,1998年,AR I A D phar maceutical公司的科学家Handels man等首次提出宏基因组的概念[1]。宏基因组(the genomes of the total m icrobi ota found in nature)是指生境中全部微生物基因的总和[2]。它包含了可培养的和未培养的微生物的基因总和,微生物主要包括环境样品中的细菌和真菌。而宏基因组学就是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象,以功能基因筛选和测序分析为研究手段,以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系等为研究目的的新的微生物研究方法,也称为微生物环境基因组学、元基因组学或生态基因组学。它主要研究从环境样品获得的基因组中所包含的微生物的遗传组成及其群落功能,为充分认识和开发利用非培养微生物,并从完整的群落水平上认识微生物的活动、最大限度地挖掘微生物资源,提供了可能,已成为国际生命科学技术研究的热点和前沿。 1　宏基因组学的研究方法 宏基因组学的研究过程一般包括从环境样品中提取基因组DNA,克隆DNA到合适的载体,导入宿主菌体,筛选目的转化子等工作,可分为三个步骤。 1.1　宏基因组的提取　在宏基因组筛选过程中,目的基因是整个核苷酸链中的一部分,因此样品前期的富集能够提高筛选命中率。DNA的提取是宏基因文库构建的关键步骤。提取步骤通常需要满足两个条件:既要尽可能提取样品所有微生物的基因,又要保持片段的完整和纯度。目前所开发的DNA提取方法有两种:细胞提取法和直接裂解法。直接裂解法包括物理法(冻融法、超声法、玻璃球珠击打法、液氮碾磨法)、化学法(常用化学试剂有表面活性剂、盐类、有机溶剂等)及酶裂解法。另外,依据提取样品总DNA前是否分离细胞,可以分为原位裂解法和异位裂解法。原位裂解法可以直接破碎样品中的微生物细胞而使DNA 得以释放,由于无需对样品微生物进行复苏,且黏附颗粒上的微生物细胞亦能被裂解,所得DNA能更好地代表样品微生物的多样性。此法操作容易、成本低,DNA 提取率高,但由于机械剪切作用较强,所提取的DNA 片段小(1～50kb),通常适用于构建小片段插入文库(以质粒和λ噬菌体为载体)的DNA提取。异位裂解法则先采用物理方法将微生物从样品中分离出来,然后采用较温和的方法抽提DNA。此法条件温和,可获得大片段DNA(20～500kb),纯度高,但操作繁琐、成本高、得率低,通常适用于构建大片段插入文库(以柯斯质粒或者细菌人工染色体为载体)的DNA提取。1.2　宏基因组文库的构建　宏基因组文库的构建需适宜的克隆载体。通常用于DNA克隆的载体主要包括质粒、黏粒和细菌人工染色体等。质粒一般用于克隆小于10kb的DNA片段,适用于单基因的克隆与表达。黏粒的插入片段可达40kb左右,细菌人工染色体插入片段可达350kb,可用来制备由多基因簇调控的微生物活性物质的完整代谢途径的相关片段文库。1.3　目的基因的筛选　目的基因的筛选方法包括序列分析和功能分析两种。序列分析适用于小片段DNA文库的基因筛选;而功能分析通常适用于大片段DNA文库的筛选。序列分析筛选不依赖于重组基因在外源宿主中的表达,因为所使用的寡聚核苷酸引物是直接通过DNA序列中的保守区域设计的,反映了氨基酸序列的保守性,可获得未知序列的目的基因。该方法对DNA量的要求不高,筛选到新活性物质的可能性较大。序列分析的另一个手段是对宏基因组克隆测序,无论是全部或随机测序都是发现新基因的有效手段。 对于功能分析而言,首先需获得目的克隆,然后通过序列和生化分析对其进行表征。此法能快速鉴定出全新且有开发价值的活性物质,可用于医药、工农业等行业。由于此法检出率较低,工作量较大,且受检测手段的限制,所以常要借助于高通量筛选。 2　宏基因组学的应用 2.1　在生态学方面的应用　当今微生物生态学研究的主要目的之一是将微生物与其所在环境中的代谢过程相联系。应用16s r DNA作为系统发育锚去鉴定属于某种微生物的克隆,然后对基因进行测序,从而获得

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病毒宏基因组学方法优缺点及意义 随着时代的发展和生物科学技术的进步，新兴的病毒宏基因组学为解决这些问题提供了契机，以下是一篇关于病毒宏基因组学探究的，供大家阅读参考。 病毒个体微小，多数病毒直径在100nm(20~200nm)，较大的病毒直径 300~450nm,较小仅为18~22nm,结构简单，不能独立复制需要依赖于宿主细胞复制繁殖，被许多生物学家认为是处于生命和非生命交叉区域的存在物。据估计目前对病毒的发掘还不到1%[1],对病毒的研究具有广阔的前景和现实意义。病毒独特的结构和特性给病毒的研究和鉴别带来许多困难，主要体现在两个方面：第一，病毒没有专门的宿主细胞系，60%以上的病毒无法成功的进行离体培养[2]或在培养中不能表达致病性;第二，病毒基因本身变异率高，通过与宿主间的相互作用进化，增加核酸多样性，产生新病毒，导致宿主范围扩大、跨物种传播[3].对细菌的研究可以通过保守的16sRNA的分析来定位分类信息、进化关系和种群多样性等。对于真菌有18sRNA及ITS序列。然而病毒不像细菌真菌，没有固定保守的进化标记基因。 所以一些传统研究方法的应用受到限制，不能完全满足病毒研究的需要。如电镜观察病毒的灵敏性不高，细胞培养病毒可能观察不到细胞病变，血清学反应中不但难以获得高价抗体而且容易出现交叉反应导致错误结果，传统PCR 方法对未知序列及高变异的病毒研究难以发挥作用。加之近年来病毒流行病的频繁发生及其可怕的传染性，对人类及动植物的健康产生严重威胁，如HIV病毒、SARS病毒、禽流感病毒和在西非等地肆虐的埃博拉病毒[4]等，给人们造成了巨大的恐慌和经济损失。因此，对病毒基因组的研究、致病源的探索、病毒在生物体和环境中如何存在及传播、病毒病防治的研究已迫在眉睫。 随着时代的发展和生物科学技术的进步，新兴的病毒宏基因组学为解决这些问题提供了契机，宏基因组学(Metagenomics)的概念是1998年由Handelsman[5]首次提出，对特定环境中基因组的总和进行研究，包括培养的和未培养的微生物。病毒宏基因组学(Viral metagenomics)就是宏基因组学在病毒领域的应用，即从环境或生物组织中浓缩病毒粒子的遗传物质进行生物学信息分析的技术。它的应用需要一些交叉学科的创新技术的支持，随机引物PCR 和新一代测序技术---高通量测序的应用大大提高了研究的效率和获取信息的丰度，克服大环境中病毒浓度低、易受干扰的不足，拓展了病毒宏基因组学的应用范围和现实作用，为探索未知病毒提供广阔的前景和应用空间。在人类预防疾病、开发疫苗方面具有重大贡献。 1病毒宏基因组学的研究过程 对于未知病毒的研究过程如下：SISPA方法是1991年Gregory和Jung在随机引物PCR方法的基础上创造的[6],SISPA-PCR使用含有已知片段的随机引物进行逆转录，这个已知片段在接下来的PCR反应中将作为引物[7],此方法先后经Breitbart[8]和Djikeng[9]等人的改进，在SISPA的基础上建立了

宏基因组学概述

宏基因组学概述 王莹，马伊鸣 （北京交通大学土木建筑工程学院环境1402班） 摘要：随着分子生物学技术的快速发展及其在微生物生态学和环境微生物学研究中的广泛应用，促进了以环境中未培养微生物为研究对象的新兴学科——微生物环境基因组学(又叫宏基因组学、元基因组学，英文名Metagenomics)的产生和快速发展。宏基因组学通过直接从环境样品中提取全部微生物的DNA，构建宏基因组文库，利用基因组学的研究策略研究环境样品所包含的全部微生物的遗传组成及其群落功能．在短短几年内，宏基因组学研究已渗透到各个领域，包括海洋、土壤、热液口、热泉、人体口腔及胃肠道等，并在医药、替代能源、环境修复、生物技术，农业、生物防御及伦理学等各方面显示了重要的价值。本文对宏基因组学的主要研究方法、热点内容及发展趋势进行了综述 关键词：宏基因组宏基因组学环境基因组学基因文库的构建 Macro summary of Metagenomics Wang Ying, Ma Yi-Ming （BeijingJiaotongUniversity, Institute of civil engineering,） Key words: Metagenome; Metagenomics; The environmental genomics 宏基因组学（Metagenomics）又叫微生物环境基因组学、元基因组学。它通过直接从环境样品中提取全部微生物的DNA,构建宏基因组文库，利用基因组学的研究策略研究环境样品所包含的全部微生物的遗传组成及其群落功能。它是在微生物基因组学的基础上发展起来的一种研究微生物多样性、开发新的生理活性物质（或获得新基因）的新理念和新方法。其主要含义是：对特定环境中全部微生物的总DNA （也称宏基因组，metagenomic）进行克隆，并通过构建宏基因组文库和筛选等手段获得新的生理活性物质；或者根据rDNA数据库设计引物，通过系统学分析获得该环境中微生物的遗传多样性和分子生态学信息。 1.起源 宏基因组学这一概念最早是在1998年由威斯康辛大学植物病理学部门的Jo Handelsman等提出的，是源于将来自环境中基因集可以在某种程度上当成一个单个基因组研究分析的想法，而宏的英文是"met a-"，具有更高层组织结构和动态变化的含义。后来伯克利分校的研究人员Kevin Chen和Lior Pachter 将宏基因组定义为"应用现代基因组学的技术直接研究自然状态下的微生物的有机群落，而不需要在实验室中分离单一的菌株"的科学。 2 研究对象 宏基因组学(Metagenomics)是将环境中全部微生物的遗传信息看作一个整体自上而下地研究微生 物与自然环境或生物体之间的关系。宏基因组学不仅克服了微生物难以培养的困难, 而且还可以结合生物信息学的方法, 揭示微生物之间、微生物与环境之间相互作用的规律, 大大拓展了微生物学的研究思路与方法, 为从群落结构水平上全面认识微生物的生态特征和功能开辟了新的途径。目前, 微生物宏基因组学已经成为微生物研究的热点和前沿, 广泛应用于气候变化、水处理工程系统、极端环境、人体肠道、石油污染、生物冶金等领域, 取得了一系列引人瞩目的重要成果。 3 研究方法 宏基因组学的研究过程一般包括样品和基因(组)的富集；提取特定环境中的基因组 DNA；构建宏基因组 DNA 文库；筛选目的基因；目的基因活性产物表达(图 1)五个步骤。

宏基因组学的研究

因组学研究进展及其应用 摘要： 本文先简要介绍了当前生物化学的一些研究热点，再针对因组学展开论述，介绍了因组学的产生背景和概念，当前的研究进展及应用。 因组学尝试通过免培方法获得微生物的纯培养，主要技术包括DNA的提取、文库的构建和目标基因克隆的筛选，可用于开发新型酶、发现新基因、筛选医药等方面。 关键字：因组学；因组学基本策略；文库构建与筛选；因组学研究进展及其应用引言： 微生物是地球上种类最多、数量最大、分布最广的生物群。仅原核生物(细菌和古细菌)即构成地球生物总量的的25～50 %[1]。自然条件下，包括病毒在的微生物,通过群落广泛参与C、N、O 和S等重要元素的循环转化，在人体的食物消化、毒素降解及机体免疫反应，环境污染物降解等方面发挥着重要作用[2]。人们对于微生物的研究主要是建立在纯培养基础上，后来人们发现通过纯培养方法估计的环境微生物多样性只占总量的0.1%~1%[3]，多达99%以上的微生物是不可培养的, 其中蕴含着巨大的应用潜能——其代产物中可能有众多具有应用开发价值的化合物[4]。为了研究不能培养的微生物，一个全新的理念——因组学应运而生，该技术不需预先培养就能开发这些微生物基因组，目前已广泛应用于微生物活性物质的开发与利用、环境微生物种群分布及动态变化分析等方面的研究[5]。 因组学的提出为解决上述问题提供了一个可行途径。因组学以生境中全部

DNA作为研究对象，通过克隆、异源表达来筛选有用基因及其产物。由于突破了传统研究领域无法涵盖不可培养微生物的瓶颈，因组学概念及研究方法一经提出，就被广泛接受。尽管在方法上还存在一定缺陷，但并不妨碍不同领域学者利用该方法来研究各种生境中微生物生态以及筛选功能基因的热情，有关因组学研究的文章逐年增多[4]。 1.因组学的概念 因组( metagenome) 的概念是指从生境样本中取得全部微生物的基因组, 而不是采用传统的培养微生物的基因组。因组的样本既包括可培养的微生物，也包括更大量的传统方法无法研究的不可培养微生物[6]。而所谓因组学 (也称元基因组学Metagenomics 、微生物环境基因组学Microbial Environmental Genomics、生态基因组学Ecogenomics ) 就是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，以功能基因筛选和测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的的新的微生物研究方法，一般包括克隆、构建文库和功能分析筛选等工作[7]。 2.因组学的基本策略及方法 2.1因组学的基本策略 因组学的研究还处于初期发展阶段，但其研究的基本过程和基本策略已基本清楚。在此要强调的是，因组学研究有着明确的指导思想，它是在反向生物学原则指导下，基于特定生态环境基础上，依据整体、系统、动态变化和相互作用的观点，运用特殊的技术路线和方法，对研究围中所有基因组展开研究的学科。 因组学是一种整体性的研究策略，它建立在微生物基因组学的迅速发展和聚

宏基因组测序技术检测方法

宏基因组测序技术检测方法

宏基因组测序技术检测标准 简介： 宏基因组测序介绍 宏基因组学是以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，通过现代基因组技术手段包括功能基因的筛选和测序分析，对环境中微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系以及环境之间的关系进行研究的新的微生物研究方法。随着高通量测序技术的发展，为宏基因组学研究提供了新的理想研究方法。高通量测序的方法无需分离环境中各种微生物，也无需构建克隆文库就可以直接对环境中所有微生物进行测序。可以真实客观的反映环境中微生物的多样性、种群结构、进化关系等。目前又可以分为针对16s DNA/18sDNA/ITS测序和针对宏基因组全序列的测序研究。下面就是对这两者的具体介绍。 一、16s DNA/18s DNA/ITS测序 16sDNA是最常用的微生物物种分子鉴定的标签，，通过对样品中16sDNA 测序可以鉴定其中微生物物种的丰度和分布情况。目前，普遍使用Roche 454平台来对环境样品进行16s DNA测序。因为16s DNA序列比较相似，读长短的话，难以进行有效的比对，而454平台的平均读长在400bp左右，可以很好的避免此类问题。 二、宏基因组全测序 在这种测序方式中，我们可以假定一个环境中的所有微生物就是一个整体，然后对其中所有的微生物进行测序。这样我们就可以研究样品中的功能基因以及其在环境中所起的作用而不用关心其来自哪个微生物。可以发现新的基因，可以进行基因的预测，甚至有可能得到某个细菌基因组的全序列。此外，该项测序不单可以针对DNA水平，也可以针对全RNA进行基因表达水平的研究。 样品处理： 宏基因组样品收集主要有口腔，下呼吸道痰液，下呼吸道灌洗液，皮肤和粪便。样品采集遵照样品采集规范（人）所规定的操作来进行。尽量留足备份样品。