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宏基因组学概述

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宏基因组学概述

王莹，马伊鸣

（北京交通大学土木建筑工程学院环境140２班）

摘要:随着分子生物学技术的快速发展及其在微生物生态学和环境微生物学研究中的广泛应用，促进了以环境中未培养微生物为研究对象的新兴学科——微生物环境基因组学(又叫宏基因组学、元基因组学，英文名Mｅｔａｇenomics)的产生和快速发展。宏基因组学通过直接从环境样品中提取全部微生物的DNＡ,构建宏基因组文库，利用基因组学的研究策略研究环境样品所包含的全部微生物的遗传组成及其群落功能．在短短几年内,宏基因组学研究已渗透到各个领域，包括海洋、土壤、热液口、热泉、人体口腔及胃肠道等,并在医药、替代能源、环境修复、生物技术，农业、生物防御及伦理学等各方面显示了重要的价值。本文对宏基因组学的主要研究方法、热点内容及发展趋势进行了综述

关键词:宏基因组宏基因组学环境基因组学基因文库的构建

Mａcｒo summary of Ｍetagenｏｍｉcs

WanｇＹｉng，Ma Ｙi-Mｉｎｇ

(BeｉjinｇＪiaoｔｏngUniｖeｒsiｔy, Inｓtitute of civiｌ enｇｉneerｉｎｇ,）Key ｗords:Metａgenｏmｅ; Ｍetagenoｍiｃs;The eｎviｒｏｎｍental genｏmics

宏基因组学（Meｔａgeｎomｉｃｓ)又叫微生物环境基因组学、元基因组学。它通过直接从环境样品中提取全部微生物的DNＡ,构建宏基因组文库,利用基因组学的研究策略研究环境样品所包含的全部微生物的遗传组成及其群落功能。它是在微生物基因组学的基础上发展起来的一种研究微生物多样性、开发新的生理活性物质（或获得新基因）的新理念和新方法。其主要含义是:对特定环境中全部微生物的总DNA(也称宏基因组，metａgeｎomｉc)进行克隆,并通过构建宏基因组文库和筛选等手段获得新的生理活性物质；或者根据ｒDNA数据库设计引物,通过系统学分析获得该环境中微生物的遗传多样性和分子生态学信息。

1.起源

宏基因组学这一概念最早是在19９８年由威斯康辛大学植物病理学部门的Jo Haｎｄelsman等提出的,是源于将来自环境中基因集可以在某种程度上当成一个单个基因组研究分析的想法，而宏的英文是"meta－"，具有更高层组织结构和动态变化的含义。后来伯克利分校的研究人员Kevin Chen和LｉoｒPaｃｈｔer将宏基因组定义为"应用现代基因组学的技术直接研究自然状态下的微生物的有机群落,而不需要在实验室中分离单一的菌株"的科学。

2 研究对象

宏基因组学(Ｍeｔagenｏｍics)是将环境中全部微生物的遗传信息看作一个整体自上而下地研究微生物与自然环境或生物体之间的关系。宏基因组学不仅克服了微生物难以培养的困难, 而且还可以结合生物信息学的方法, 揭示微生物之间、微生物与环境之间相互作用的规律, 大大拓展了微生物学的研究思路与方法, 为从群落结构水平上全面认识微生物的生态特征和功能开辟了新的途径。目前, 微生物宏基因组学已经成为微生物研究的热点和前沿, 广泛应用于气候变化、水处理工程系统、极端环境、人体肠道、石油污染、生物冶金等领域, 取得了一系列引人瞩目的重要成果。

3 研究方法

宏基因组学的研究过程一般包括样品和基因(组)的富集；提取特定环境中的基因组DNA;构建宏基因组DNＡ文库;筛选目的基因;目的基因活性产物表达(图1）五个步骤。

图1环境微生物宏基因组学研究过程

Fig. 1Gｅｎeraｌ proceｓs ｏf mｅtaｇenomic strategｉe

３.1 环境样品及目的基因组富集

在宏基因组文库筛选过程中目的基因仅占总DNA 的一小部分，对环境样品的预富集可以大大提高目的基因的检出几率。目前预富集技术主要分为细胞水平富集和基因组水平富集。其中细胞水平富集主要是通过利用选择培养基对目的微生物进行富集培养, 最常用的方法是底物选择, 此外还包括营养选择及物理化学指标选择。但是由于富集培养选择性地富集了具有快速生长特性的菌群, 因此导致大部分物种多样性信息丢失。目前可以通过先在严格胁迫条件下短期处理, 然后改为较温和的处理条件, 可以从一定程度上克服这种方法的局限性。基因组水平富集常用的技术为稳定同位素探针技术（SIＰ）, 原理是采用稳定同位素标记底物, 其中的“重”原子掺入到具有代谢活性的微生物核酸中, 采用密度梯度离心的方法将“重”的DNA 与“轻”组分分离, 被标记的“重”核酸可以作为ＰCR 的模板，用来构建宏基因组文库。例如采用Ｃ标记的甲醇研究森林土壤宏基因组DNＡ, 结果鉴定出变形细菌α-亚纲中所有已知的嗜甲基菌, 并在一种嗜酸菌中发现了新的甲醇还原酶基因。此外, 还有报道利用抑制性消减杂交技术、差异显示技术、噬菌体展示技术、亲和捕获技术及DＮA 微阵技术等技术来富集目的基因。

３.2宏基因组 DNA 的提取

获得高浓度、大片段、无偏好的环境样品总DNA 是宏基因组文库构建的难点之一。近年已有多种宏基因组DNＡ的提取纯化方法陆续建立起来, 大体可分为两类: 一类是直接提取法, 又称原位提取法。这类方法不经过样品中微生物的培养和分离, 通过化学法、酶解法或物理法直接破碎环境中的微生物细胞而使DNA 得以释放，并对DNA 进行纯化。其中以Ｚhou 法和Ｔsai法最为常用。该法

操作简便、省时、成本低, 所获得DNA 具有较好的完整性, 并能够代表某一生境的微生物群落多样性。但该发放常会出现细胞裂解不完全或DNＡ与土壤杂质成分产生共沉淀而无法有效地去除等问题, 所以一般需要进一步的DNA纯化处理, 同时所提取获得的ＤNＡ片段较小(１ｋb~50 kb), 主要适

用于小片段文库的构建；另一类是间接提取法, 即异位提取法, 是利用离心介质或者梯度离心等方法先把微生物从环境样品中分离出来，再按处理纯培养细胞的方法裂解微生物细胞提取DNＡ。该法获得的宏基因组DNA 受到胞外杂质污染干扰较少, 纯度较高、DNＡ完整性好(20 ｋb~500 kｂ), 适合构建大片段的宏基因组文库。但该法操作较繁琐、费时、成本高、偏差大、ＤNA 得率较低，其产率只是直接裂解法的１％~10％且获得的DNA 往往不能完全代表样品所在生境的生态学多样性。本实验室对温泉淤泥、纸厂污泥、红树林淤泥、沼泽淤泥等12 个环境样品的总ＤＮA 提取方法进行了摸索, 研究工作表明，直接提取法提取效率较高, 不容易丢失物种信息, 能够获得２3 kｂ左右的ＤNＡ片段。并首次加入漆酶来有效去处腐殖酸类物质, 比聚乙烯吡咯烷酮(PＶPP)处理效果更好, DNA 得率更高。而间接提取法DNA 提取效率较低, 容易丢失物种信息。因此, 建议采用直接提取法获得环境样品的总DＮＡ，以便分析环境样品微生物群落多样性信息。

3.3 宏基因组文库的构建

3.３.１载体的选择

载体选择在宏基因组技术中占有十分重要的地位。载体系统的选择主要依赖于DNA 提取质量、插入片段、质粒拷贝数、宿主菌及筛选方法。根据克隆载体的不同宏基因组文库可分为质粒文库、细菌/酵母人工染色体文库、噬菌体类载体文库。早期宏基因组文库主要以质粒载体和大肠杆菌宿主细胞构建而成的小片段（<１５kb）文库。该文库操作简便、拷贝数高、对ＤＮA 质量要求不高, 适合纯度低或剪切较严重的DNA 模版。但插入片段小, 筛选量大, 活性比率低, 对大基因簇无能为力, 主要适用于分析新的基因序列信息及筛选编码代谢相关的单一基因或小操纵子。然而, 很多微生物活性物质是其次生代谢产物, 代谢途径由多基因簇调控, 因此尽量插入大片段ＤＮA以获得完整的代谢途径多基因簇是很有必要的, 目前已有报道能容纳１５kb~4０ｋb外源ＤNＡ的Ｆosｍiｄ文库和Cｏsmｉd 文库, 同时已经成功构建了容量高达２０0 kb~3５0 kb 外源DＮA 的细菌人工染色体文库和酵母人工染色体文库。该文库不仅拥有巨大的插入片段载量, 而且稳定性好、筛选效率高、克隆表达能力强，可获得基因簇表达活性物质。主要用于分析某一生境中微生物群落多样性及筛选由基因簇或多个基因控制表达的活性物质。但其操作较复杂繁琐、对ＤNA 纯度要求较高, 且拷贝数低, 扩增较困难。此外, λ-噬菌体和其他病毒也可以作为构建宏基因组克隆文库的载体。噬菌体展示库是一种十分有效的高通量筛选技术, 该技术通过对表面展示表达产物的亲和选择分离相应的DNA 序列,能够从宏基因组中富集稀有DNＡ序列，但其局限性在于只能表达分子量小于50kＤ蛋白。

3.3．２宿主细胞的选择

不同的微生物种类所产生的活性物质类型有明显差异。宿主菌株的选择主要考虑转化效率、重组载体在宿主细胞中的稳定性、宏基因的表达、目标性状(如抗菌)缺陷型等因素。其中Ｅ. ｃolｉ是最为常用的宿主细胞，其优点是操作简单、繁殖迅速、培养代谢易于控制。但是由于环境样品的总DNＡ有很大一部分为真核基因组DＮA, 其在细菌宿主中往往不能表达, 大大限制了这部分基因的筛选。最近已有报道利用链霉菌、假单胞菌等真菌作为受体来鉴定有关新抗生素生物合成的基因。但是最近的生物信息学研究表明, 对于一个插入子(<１0 ｋb)的文库, 为寻找一个目的基因需要筛选105~106 个克隆, 这表明从复杂的宏基因组中筛选目的基因在技术上还存在着其特殊的困难。因此, 宿主系统的进一步探索是更有效的开发宏基因组资源的关键技术之一。

３.４宏基因组文库筛选

由于宏基因组文库容量较大, 目标克隆子的筛选一直是宏基因组学技术中的瓶颈。近年来，各种宏基因组文库筛选方法相继建立起来, 根据筛选原理大体分为两大类: 序列依赖性筛选法和非序列依赖性

筛选法。

１) 序列依赖性筛选法，是根据文库中的已知序列或保守序列来设计杂交探针或PCR 引物, 从宏基因组文库中筛选目标序列。该法克服了功能筛选法中必须依赖表达后的活性产物进行检测, 效率较高。其中已知功能基因PCR 扩增技术是最为常用的序列依赖性筛选法。此外, ＤＮＡ微阵技术和整合子系统技术也可以作为序列依赖性筛选法。例如Wagnｅｒ等应用DNA 微阵列技术对活性污泥中微生物的群落结构进行了研究, 获得了大量新的信息, Sｔoｋes 等利用整合子系统技术成功筛选到与DNA 糖苷酶、磷酸转移酶和甲基转移酶同源的新基因。但是该筛选法存在 2 个主要的缺陷：(１)引物的设计依赖于已有的序列信息, 共同进化的 2 个功能相似的基因难于用“族特异性”引物区分开来, 因此很难发现新的功能基因; (2) 通过PCR扩增功能基因, 一般只能获得结构基因的一个片段，而不能获得完整的功能基因。

2)?非序列依赖性筛选法, 其不依赖于任何已知序列信息, 仅根据文库克隆子产生的活性物质进行筛选。其中以功能筛选法最为常用, 原理是直接对目的克隆表达的性状在选择培养基上进行筛选, 已有报道成功筛选出产生木聚糖酶、纤维素酶、脂肪酶及抗菌活性的克隆子。该法筛选能够发现全新的活性物质或全长基因, 但工作量大、效率低，生物转化的产物仅在少数情况下具有可见性状，酶活性的检测受到研究方法的限制。此外, 由于受到酶活检测方法的限制，大多数宝贵的酶资源不能通过上述基于活性的方法发掘出来，近期基因陷阱技术筛选法倍受研究学者们的关注。其中，(1）利用目的基因缺失的突变体宿主菌株, 转化后在选择性培养基上进行功能互补的生长特征来筛选。例如Ｍajerｎiｋ等通过缺陷型大肠杆菌为宿主菌构建土壤宏基因组文库, 筛选出了与Na＋/H＋反向转运通道相关新基因; （2）将宏基因组DNＡ随机克隆到无启动子的绿色荧光蛋白基因(GFP)前面, 然后通过荧光激活细胞分离（FACＳ)技术, 在添加特定底物的条件下对表达库进行富集, 就能够选择出对该底物具有代谢活性的克隆。如Uｃｈiyaｍa 等利用底物诱导基因表达法从环境宏基因组文库中筛选到新的生物代谢相关基因; Ｗｉlｌiａｍson 等利用底物诱导基因表达法从泛洪区土壤宏基因组文库中筛选到新的生物小分子物质。该法优点在于它为高通量筛选提供了保障, 而且不需要对底物进行修饰, 尤其适合于工业生产上的应用。但也存在一些问题: (1) 无法利用不能进入细胞质的底物; （2）荧光激活细胞分离仪（ＦAＣS)对进样设备的要求也比较高；(3) 建立高度耐受“超相容性”表达系统, 以表达任意来源的编码蛋白和酶具有一定难度。

4 应用

采用宏基因组技术及基因组测序等手段，来发现难培养或不可培养微生物中的天然产物以及处于"沉默"状态的天然产物。宏基因组不依赖于微生物的分离与培养，因而减少了由此带来的瓶颈问题。

随着新一代测序技术的迅猛发展,研究宏基因组的方法也已经发生了翻天覆地的变化:传统的方法是测定微生物基因组上的16S ｒRNA基因，这些基因的长度通常在１５0０个碱基左右,广泛分布于原核生物，既能提供足够的信息,而且具有相对缓慢的进化过程;其保守性与特异性并存，通过保守区和特异区来区别微生物的种属。基于这些特性，科学家们通过选择这些基因区域,方便地研究环境中物种的组成多样性，但是还不能全面分析环境中的基因功能。而现在,新一代高通量低成本测序技术的广泛应用，科学家们可以对环境中的全基因组进行测序，在获得海量的数据后,全面地分析微生物群落结构以及基因功能组成等。

短短几年来,宏基因组学的研究已经渗透到各个领域,从海洋到陆地,再到空气，从白蚁到小鼠，再到人体，从发酵工艺到生物能源,再到环境治理等。

4. 1 在生态学方面的应用

当今微生物生态学研究的主要目的之一是将微生物与其所在环境中的代谢过程相联系。在研究的早期,科学家利用宏基因组研究探索海洋中未培养的以浮游生物为食的原核微生物,发现古菌螺旋状ＲNA 和谷氨酸半醛转氨酶，并首次揭示了基因组织形态，这些信息都显示了非培养系统的生物潜能。随着微生物治理的深入发展,研究者越来越趋向于应用菌群对废水进行生物治理。宏基因组在生态方面的研究方法主要有宏基因组快照测序法、随机鸟枪测序法和荧光原位杂交法等。宏基因组在生态学上的应用主要是土壤与水体。目前宏基因组学在土壤微生物研究中的应用主要包括两方面：一是进行土壤微生物及其资源的挖掘,目前的研究工作已经得到大批新基因,特别是在一些极端环境中的微生物宏基因组的研究中得到了一些具有特殊应用价值的功能酶基因；另一方面是揭示土壤微生物的多样性及其与环境之间的关系。海洋蕴涵着非常丰富的微生物资源，目前已应用宏基因组技术研究了多种海洋次生代谢产物合成途径，其中最为经典的是研究海洋聚酮类和非核糖体肽类的生物合成基因簇。

宏基因组技术在分析环境微生物复杂群落结构领域得到广泛应用。如Mａrtín 等构建地中海深层水体微生物宏基因组文库, 通过序列分析和１6ＳrRＮA 系统发育比对, 发现该水体的微生物种群与太平洋阿罗哈水域中层水体的微生物种群具有一定的相似性, 并提出在无光的条件下，温度是影响微生物种群在水体中分布的主要因素。Ｚhaｎg 等构建红树林淤泥宏基因组文库, 通过PCR 扩增及变性梯度凝胶电泳(DＧGE) 对该区域固氮菌的多样性进行分析, 结果揭示红树林地区固氮菌的生物多样性特征, 其结果表明多数为变形菌, 也含少数的固氮菌属、除硫单胞菌属、德克斯氏菌属和根瘤菌等。张薇等采用宏基因组技术对西北黄土高原柠条种植区土壤微生物多样性进行分析, 发现变形杆菌纲是根表土壤区系中的有优势微生物菌群(70.3%), 尤其存在大量能够诱导植物形成根瘤的根瘤菌和对植物有促生长作用的γ-Proteobactｅrｉａ类微生物, 说明了植物根系和土壤环境微生物菌群具有相互选择性；２008 年肖凯等以宏基因组DＮA 为模板, 采用不同的PCR 引物对温泉的高温水底沉积物微生物多样性进行分析, 发现了一株新的菌株JＳ-X2 与在美国黄石公园温泉发现的未培养细菌有95%的相似性, 并且与嗜热蓝细菌聚球藻有８9%的相似性。近年来宏基因组技术在环境病毒及噬菌体的多样性分析方面也被广泛应用。例如Fiｅreｒ等通过构建牧场、沙漠、雨林土壤宏基因组文库对环境中细菌、古生菌、真菌及病毒多样性进行了研究, 并揭示了土壤环境中包含着大量不可培养的新病毒种类, 其基因型特征与常规培养获得的病毒具有很大的差异性；Kiｍ等通过构建稻田土壤宏基因组文库，利用多重置换扩增（ＭDＡ)技术对土壤样品中病毒基因多样性进行了研究, 结果表明扩增得到的病毒基因序列与目前报道的病毒序列具有很大的差异性, 进一步说明了土壤环境中包含着大量不可培养的病毒种类; Sabet 等通过构建宏基因组文库对美国莫诺湖水体中噬菌体的多样性进行了研究, 研究发现不可培养的噬菌体才是该特殊生境中的优势群体，揭示了海洋是一个巨大的未知RNＡ病毒库[60]; Ｂrｅitbart 等通过构建海水及海底沉积物宏基因组文库对该地区不可培养病毒的多样性进行分析, 结果发现扩增得到的病毒基因型中６5%为新的基因型, 其中包含一类海藻病毒，多数病毒具有新的基因型, 与节肢动物和高等植物病毒存在很大的序列差异性[61]; 20０3 年Ｂreitｂart 等首次通过构建宏基因组文库对人体排泄物中的未培养病毒多样性进行研究, 经过扩增及鸟枪测序鉴定, 结果表明获得的病毒大约有１2００种基因型, 其基因序列与先前报道的病毒序列具有很大的差异性, 多为新的基因型病毒, 并揭示存在人体中的新病毒与人类疾病可能具有一定的相互性; ２005年Ｃann等通过构建宏基因组文库对马排泄物中的未培养病毒多样性进行研究, 经过测序鉴定, 获得2３３种不同基因型的病毒，其中52%为长尾噬菌体科, 26%为未分类的噬菌体, 1７％为肌病毒科；４％为短尾病毒科; 2％为脊椎动物正痘病毒。总的来说, 宏基因组技术为微生物多样性研究提供了巨大的平台。

4. ２在新型生物催化剂中的应用

宏基因组学技术最引人注目的贡献主要集中在新型生物酶制剂的探索和开发领域。近年来研究者们已成功构建了土壤、海底淤泥、温泉淤泥、油厂污泥、动物瘤胃内容物、动物粪便等宏基因组文库，并筛选到脂肪酶、蛋白酶、淀粉酶、乙醇氧化酶、木聚糖酶、纤维素酶及脱羧酶等酶制剂, 并且在此基础上获得新酶的许多特征信息（表1)。所采用的载体种类十分广泛, 包括Fosmｉｄ、Cosmid、BAC、λ噬菌体以及各种穿梭载体, 所采用的宿主系统为常用的大肠杆菌、链霉菌和假单胞菌等。

通过宏基因文库筛选得到的生物分子大多数与已知的基因产物相似性差或者完全是新的分子，这些新的生物分子主要来源于环境未培养微生物的基因和其多样的代谢物。环境样品DNA 的克隆和筛选只是所有环境遗传信息多样性的一小部分, 环境微生物和宏基因组的多样性仍旧是发现新的天然活性产物的丰富广阔资源，为研究者们探索开发新的生物催化剂提供了巨大的资源空间。

新型催化剂主要是酶。传统的新型酶的筛选方法限制了筛选的广泛性和有效性。宏基因组学则克服了这一限制,有效地提高了新酶的筛选效率，现已发现了抗生素及维生素生物合成相关基因簇的克隆,以及水解酶类和氧化还原酶类编码的基因。宏基因组技术通过对环境的直接克隆,为研究和利用占微生物99％以上的非培养微生物提供了新的途径，为微生物的研究和发展提供了全新的策略。但此技术的开发利用还有许多亟待解决的问题：如上面提及的两种DNA的提取方法各有其缺陷,使获得的DNA 不能完全代表样品ＤＮＡ组成，这就需要进一步优化样品DＮA的提取方法。另外，应根据筛选目的选用合适的载体和宿主菌。再者，文库的筛选方法有待进一步完善，对于序列筛选法来说主要是测序的速度和费用问题，功能筛选法则需克服从几万到几十万个克隆中只能筛选到几个有活性的基因的状况,应建立更为敏感的高通量筛选方法。

宏基因组学技术克服了传统新型酶的筛选方法在筛选的广泛性和有效性不足这一缺点，在新型生物酶制剂的开发应用上有着长足的进步。目前已经从构建的宏基因组文库(如海底淤泥、温泉淤泥、动物粪便、动物瘤胃内容物等)成功筛选到蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、木聚糖酶、纤维素酶、水解酶类和氧化还原酶类等酶制剂。

4.3 宏基因组学在医学上的应用

宏基因组技术的出现为新药物的探索和发现提供了可能的技术支持, 并扩大了微生物代谢产物及分子活性物质筛选平台。

例如早在２000 年, Wang 等构建土壤宏基因组文库，通过文库筛选获得TerraｇineA 及其相关成分, 目前已广泛应用于医学治疗领域, 证明了自然环境中的丰富微生物代谢产物可以通过宏基因组技术为人们所利用; 同年Bradｙ等从土壤宏基因组文库中筛选发现一种长链N-酰氨基酸抗生素物质; 并在20０4 年构建凤梨科植物树茎流出液宏基因组文库，筛选鉴定获得了抗菌物质PaｌmitoｙｌPｕtresｃine。200１年Ｍａｃnｅil 等构建了土壤宏基因组BAC 文库，通过序列分析筛选获得５个能产生抗菌小分子物质靛玉红并对其相关成分进行研究; ２00２年Giｌlespiｅ等构建土壤宏基因组文库筛选获得两种抗菌物质Tｕrboｍycin A 和B, 并且发现TurbomycｉｎA和Ｂ对革兰氏阴性和革兰氏阳性菌具有广谱抗菌活性；２00３年DiazTorres 等通过构建人唾液宏基因组文库，筛选获得一种新的四环素抗性基因Teｔ（３７）, 该活性物质对四环素具有很好的抗性; 20０８年Mｏrｉ等通过活性污泥宏基因组文库筛选获得两种不同的博来霉素抗性基因，经过比对发现于来源放射菌类基因差异较大, 可能为新的博来霉素抗性基因。国内在利用宏基因组技术获取新型药物的研究较少, 尚处于萌芽阶段, 赵晶等从南极中山站排污口采集污泥, 构建宏基因组文库, 并通过差异性ＤNA 修复实验(DDRT)筛选得到具有抗肿瘤效应的

物质。同时利用宏基因组技术研究探讨人类肠道中不可培养微生物多样性也有了很大进展。如Ｋurｏkaｗa 等利用宏基因组技术对１3 个处于不同年龄层的健康人体粪便微生物种群进行了研究，结果分析表明未断奶婴儿的肠道微生物种群在系统发育和基因组成上具有较大个体差异性,而在成人及已断奶儿童则呈现出高度的功能一致性,并对成人及婴儿肠道内编码该生境微生物主要功能的基因家族的特性进行分析，发现了一个新的人类肠道微生物基因家族和一个共扼转座子。2003 年Ｂreｉtbａrt 等通过构建宏基因组文库对人体排放物中的未培养病毒多样性进行研究，经过鸟枪测序法鉴定，获得的病毒大约有1２０0 种基因型,结果比对表明其基因序列与先前报道的病毒具有很大的差异性，大多数为新病毒，并证明这些病毒极有可能与人类的疾病有着密切的关系。2008 年Finkbeiner 等通过构建１2 个腹泻小孩肠道内容物宏基因组文库，来观察病人肠道中病毒的生物多样性，发现扩增得到的病毒序列与GｅnＢank 病毒库中的已知序列同源性很低, 并推断这些病毒极有可能与人类的腹泻疾病有着密切的关系。随着宏基因组技术的成熟,必将加快宏基因组技术在医学中的应用。在人体微生物抗药性的研究，人体与不可培养病原菌的相互关系的探索等方面将做出重大贡献。

宏基因组技术突破了大量微生物无法通过纯培养方法而进行研究的束缚,为新药的开发和利用提供了技术支持,相信随着宏基因组技术的成熟,该技术在发现新基因、研究人体微生物抗药性以及与不可培养病原微生物的相互关系方面做出重大贡献。

4．4宏基因组学在气候变化中的应用

由人类活动引起的全球气候变化问题一直备受关注。其中，温室气体特别是CO2浓度的上升引起的全球变暖问题尤其受到关注。气候变暖将对地球碳氮等物质循环、陆地及海洋生态系统功能等产生重大影响。同时，地球化学物质循环（如碳、氮、磷、硫等)也是生态系统响应气候变化的关键过程, 而微生物是该循环过程的主要驱动力。近年来, 宏基因组学的运用为微生物对气候变化响应和反馈的研究提供了全新的视角, 并取得了相当大的进展。例如, Danｏｖaｒo等的研究表明, 海洋中病毒的结构、功能以及病毒与宿主的相互作用都受到全球气候变化的影响, 并反作用于全球气候变化和物质循环。另外, Ｓiｍisｔｅr等研究了珊瑚礁微生物群落对升温的响应, 发现处于生长状态的珊瑚礁上的微生物群落不受温度升高的影响, 而坏死珊瑚礁上的微生物的群落结构和组成发生了改变。上述研究结果都说明微生物群落的复杂性, 不同的种群有不同的反应机制, 因此微生物群落的结构与功能需要进一步深入探讨。Ｚhou等基于功能基因芯片的长期增温实验表明, 土壤微生物群落结构在增温条件下发生了显著改变，分解易降解碳的基因变得活跃, 而分解难降解碳的基因并没有显著改变, 保证了土壤碳存储的相对稳定。通过构建微生物的分子生态学网络, Dｅｎg等发现不同气温条件下, 微生物基因在网络中扮演的角色以及相互作用规律发生了明显改变。另外, 功能基因芯片也被用于研究CO2浓度升高的效应。CO2浓度升高刺激了调节重要物质循环过程基因的活性, 其中碳固定基因、易降解碳基因以及氮循环基因的数量明显增多。另一方面, He(２０12）基于系统发育芯片的实验发现，CO2浓度升高导致微生物可操作分类单元ｏperatｉonal ｔａxｏｎｏｍic uｎiｔ，ＯTU)的丰度显著增加。将上述两种芯片分别进行网络构建后发现微生物基因间的相互作用受到CＯ２浓度的显著影响, 且不同ＣＯ2浓度下发挥关键作用的特征基因和模块的核心基因均不同。

4.5宏基因组学在水处理工程系统中的应用

对水处理工程系统的微生物群落组成和功能研究, 尤其是对活性污泥中微生物的研究, 不仅有助于深入了解反应器处理污染物的作用机理, 更可以指示反应器的性能, 为系统运行提供预警和管理措施。Ｙe等基于Ｉllumiｎa高通量测序的研究揭示了不同反应器中微生物整体新陈代谢路径相似, 但参与特定糖类代谢和膜运输的基因显著不同。在不同污水处理反应器和不同采样时间条件下, 微生物的降解基

因丰度和多样性有显著差异, 这一结果为监测和评估活性污泥降解有机污染物和净化废水能力提供了重要依据。此外，Ｉlluｍina技术的应用还包括对饮用水氯消毒的微生物研究。研究发现，微生物群落结构显著受到氯消毒的影响, 抗性微生物和微生物的抗性基因都得到浓缩，其中变形菌（Prｏteoｂa ｃtｅｒｉa）是优势抗性微生物。Yｅ和Zhaｎg利用罗氏４54测序技术也有效揭示了活性污泥中微生物的优势种群为研究活性污泥中的微生物群落结构组成提供了重要信息。

4.6宏基因组学在石油污染中的应用

如果原油或其他石油制品在开采、炼制、贮运和使用过程中进入环境, 则容易造成环境污染, 严重影响土壤和水的生态环境和质量, 甚至危害人类健康。目前, 利用微生物降解对石油污染进行生物修复越来越受到关注, 其主要思路是通过调控土壤或水体的微生物生态环境, 改变微生物群落结构, 以提高微生物降解石油的活性和能力。对此学者已开展了对石油污染的土壤或水体中微生物群落特征的研究, 希望能够找到在降解污染过程中起作用的关键微生物或功能基因。Kosｔkａ等利用高通量测序技术研究了201０年墨西哥湾石油污染事件对沿海沙滩的影响，发现石油污染对微生物群落的丰度和组成有明显的扰动, 而γ变形菌(Ｇａmma-ｐｒｏtｅoｂａcteｒia）中的食碱菌属(Alcanivorax)、海杆菌属(Maｒinobaｃtｅr)和α变形菌(Alphａ-ｐroｔeobaｃteｒia)中的红杆菌科(Rhodoｂacteraｃeae)中的微生物对自然清除石油污染起了关键作用。这一成果被Dos Santos使用454测序的工作所部分证实, 海细菌属(Maｒinｏbacterium), 海杆菌属（Mａrinobaｃter)和解环菌属(Ｃyｃlｏcl ａstｉcｕｓ)微生物种群在石油污染的土壤中丰度增加，因此这些微生物可以用来作为表征石油污染的关键指示类群。

5 目前遇到的问题

样品的提取方法还有待改进,生物信息分析依赖于样品的复杂度。

6 结论

鉴于９9% 以上的微生物无法通过培养来获得,而这些微生物中又蕴含了大量的有价值的活性物质，所以宏基因组技术的利用就显得尤为重要。所幸的是到目前为止已经利用宏基因组技术获得了许多全新的功能基因和活性物质,在药学和生物技术方面都有着重要的应用。同时我们也应该看到,作为一种新兴的技术,宏基因组技术才刚刚起步，在整个技术流程中还有许多问题需要解决。这些问题主要集中在两个方面,一个是载体系统的选择,一个是宿主系统的选择。目前的载体系统多以质粒和BＡＣ为主,由于质粒所承载的克隆能力较小，无法满足大片段目的基因的携带,而ＢAＣ载体虽然能插入较大的基因片段，但其拷贝数较少,产生的活性物质较少。目前的宿主系统多以细菌为主，选用真核生物作为宿主系统的较少。由于真核微生物相比较细菌来说具有更加复杂的基因转录表达体系，最终导致许多真核微生物基因无法在细菌中表达,因此研究利用真核微生物作为宿主系统就显得尤为迫切和重要。另外,DNA的提取方法、文库的筛选方法等都需要进一步的完善和改进。

需要说明的是,由于宏基因组技术中涉及海量序列的筛选和比对,这就从另一侧面反映宏基因组技术要与生物信息学紧密结合才能取得预期的效果。幸好现代芯片技术的发展已经可以用来分析宏基因组文库中的海量数据。宏基因组技术也为生物信息学的发展作出了贡献。总的来说,宏基因组技术作为一个新兴的技术,凭借其再分析未知微生物方面的优势,未来必将为我们带来更多更惊喜的发现。

参考文献：

1.李凤,李艳萍,张小蒙.宏基因组学的研究方法进展及应用概述[J].生命科学与实验研究.

2.贺纪正,张丽梅,沈菊培,朱永官. 宏基因组学(Mｅtａgenomiｃs)的研究现状和发展趋势［Ｍ].环境科学学报。：20０7

－12．04

３.彭昌文，颜梅. 宏基因组学研究方法及应用概述.生物学教学．2０09年(第34卷)第9期

4. 黄循柳,黄仕杰,郭丽琼,林俊芳.宏基因组学研究进展.微生物学通报.２０09.７．2０

5.孙欣，高莹，杨云锋．环境微生物的宏基因组学研究新进展.生物多样性. 2０1３, ２1 (4）：1–1

宏基因组学的研究进展

宏基因组学的研究状况及其发展摘要：宏基因组学是近年来发展起来的一门新兴学科，主要技术包括从环境样品中提取微生物混合基因组DNA、利用可培养的宿主菌建立宏基因组文库及筛选目的基因。该技术可以克服传统培养技术的不足，是研究未培养微生物、寻找新功能基因和开发获得新资源的重要新途径。目前宏基因组学已广泛应用于各个领域，并在医药、农业、能源开发、环境修复、生物技术、生物防御等方面有了较深入的研究。关键词：宏基因组学、宏基因组、基因组文库构建、文库筛选、未培养微生物、研究进展随着微生物学的发展，微生物基因组全序列测定计划正在全球被快速地推行，但现有技术条件下，自然界存在的可培养微生物不到总数的1％，阻碍了该计划的发展，使得绝大多数的微生物资源不能被开发和利用。21世纪初，随着测序能力的提高和基因组学的发展，科学家提出了一种研究不可培养微生物基因组的新思路——直接对含有各种不可培养的微生物的群体进行基因组序列的测定。这类研究称为Metagenomics，前缀“Meta”源于希腊语。意思是“超越”。科学家选择它来表示这种基因组研究超越了传统意义上分析单一物种的基因组学，将研究对象定为由种类众多的微生物组成的整个菌落。国内的研究者也据此将该术语翻译为“宏基因组学”。 1 宏基因组的概念宏基因组 (也称微生物环境基因组、宏基因组学、元基因组学、生态基因组学) 是由Handelsman等1998年提出的新名词, 其定义为“the genomes of the total microbiota found in nature”，即生境中全部微小生物遗传物质的总和。它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因, 目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。而所谓宏基因组学就是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象, 以功能基因筛选和测序分析为研究手段, 以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的的新的微生物研究方法。一般包括从环境样品中提取基因组 DNA, 克隆DNA到合适的载体,导入宿主菌体,筛选目的转化子等工作。宏基因组文库既包含了可培养的又包含了不能培养的微生物基因，避开了微生物分离培养的问题，极大地扩展了微生物资源的利用空间，增加了获得新的生物活性物质的机会，为新的医药产业和发现新的生物技术提供丰富的基因文库，并利于环境微生物有机群体的分布和功能的研究。 2 宏基因组学的研究过程 2．1 宏基因组文库的构建宏基因组文库的构建沿用了分子克隆的基本原理和技术方法，并根据具体环境样品的特点和建库目的采用了一些特殊的步骤和策略。一般包括样品总DNA的提取、与载体连接和克隆到宿主中。 2．1．1样品总DNA的提取宏基因组文库构建的关键之一是获得高质量的目的样品的总DNA。目的样品的采集是第一步，除了需严格遵循取样规则外，取样中应尽量避免对样品的干扰，缩短保存和运输的时间，使样品能更好地代表自然状态下的微生物原貌。根据提取样品总DNA前是否分离细胞，提取方法可以分为原位裂解法和异位裂解法。原位裂解法主要是通过去污剂处理(如SDS)、酶解法(如蛋白酶K)、机械

宏基因组学概述

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宏基因组学概述王莹，马伊鸣（北京交通大学土木建筑工程学院环境140２班）摘要:随着分子生物学技术的快速发展及其在微生物生态学和环境微生物学研究中的广泛应用，促进了以环境中未培养微生物为研究对象的新兴学科——微生物环境基因组学(又叫宏基因组学、元基因组学，英文名Mｅｔａｇenomics)的产生和快速发展。宏基因组学通过直接从环境样品中提取全部微生物的DNＡ,构建宏基因组文库，利用基因组学的研究策略研究环境样品所包含的全部微生物的遗传组成及其群落功能．在短短几年内,宏基因组学研究已渗透到各个领域，包括海洋、土壤、热液口、热泉、人体口腔及胃肠道等,并在医药、替代能源、环境修复、生物技术，农业、生物防御及伦理学等各方面显示了重要的价值。本文对宏基因组学的主要研究方法、热点内容及发展趋势进行了综述关键词:宏基因组宏基因组学环境基因组学基因文库的构建 Mａcｒo summary of Ｍetagenｏｍｉcs WanｇＹｉng，Ma Ｙi-Mｉｎｇ (BeｉjinｇＪiaoｔｏngUniｖeｒsiｔy, Inｓtitute of civiｌ enｇｉneerｉｎｇ,）Key ｗords:Metａgenｏmｅ; Ｍetagenoｍiｃs;The eｎviｒｏｎｍental genｏmics 宏基因组学（Meｔａgeｎomｉｃｓ)又叫微生物环境基因组学、元基因组学。它通过直接从环境样品中提取全部微生物的DNＡ,构建宏基因组文库,利用基因组学的研究策略研究环境样品所包含的全部微生物的遗传组成及其群落功能。它是在微生物基因组学的基础上发展起来的一种研究微生物多样性、开发新的生理活性物质（或获得新基因）的新理念和新方法。其主要含义是:对特定环境中全部微生物的总DNA(也称宏基因组，metａgeｎomｉc)进行克隆,并通过构建宏基因组文库和筛选等手段获得新的生理活性物质；或者根据ｒDNA数据库设计引物,通过系统学分析获得该环境中微生物的遗传多样性和分子生态学信息。 1.起源宏基因组学这一概念最早是在19９８年由威斯康辛大学植物病理学部门的Jo Haｎｄelsman等提出的,是源于将来自环境中基因集可以在某种程度上当成一个单个基因组研究分析的想法，而宏的英文是"meta－"，具有更高层组织结构和动态变化的含义。后来伯克利分校的研究人员Kevin Chen和LｉoｒPaｃｈｔer将宏基因组定义为"应用现代基因组学的技术直接研究自然状态下的微生物的有机群落,而不需要在实验室中分离单一的菌株"的科学。 2 研究对象宏基因组学(Ｍeｔagenｏｍics)是将环境中全部微生物的遗传信息看作一个整体自上而下地研究微生物与自然环境或生物体之间的关系。宏基因组学不仅克服了微生物难以培养的困难, 而且还可以结合生物信息学的方法, 揭示微生物之间、微生物与环境之间相互作用的规律, 大大拓展了微生物学的研究思路与方法, 为从群落结构水平上全面认识微生物的生态特征和功能开辟了新的途径。目前, 微生物宏基因组学已经成为微生物研究的热点和前沿, 广泛应用于气候变化、水处理工程系统、极端环境、人体肠道、石油污染、生物冶金等领域, 取得了一系列引人瞩目的重要成果。 3 研究方法

宏基因组测序技术检测方法

宏基因组测序技术检测标准简介：宏基因组测序介绍宏基因组学是以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，通过现代基因组技术手段包括功能基因的筛选和测序分析，对环境中微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系以及环境之间的关系进行研究的新的微生物研究方法。随着高通量测序技术的发展，为宏基因组学研究提供了新的理想研究方法。高通量测序的方法无需分离环境中各种微生物，也无需构建克隆文库就可以直接对环境中所有微生物进行测序。可以真实客观的反映环境中微生物的多样性、种群结构、进化关系等。目前又可以分为针对16s DNA/18sDNA/ITS测序和针对宏基因组全序列的测序研究。下面就是对这两者的具体介绍。一、16s DNA/18s DNA/ITS测序 16sDNA是最常用的微生物物种分子鉴定的标签，，通过对样品中16sDNA测序可以鉴定其中微生物物种的丰度和分布情况。目前，普遍使用Roche 454平台来对环境样品进行16s DNA测序。因为16s DNA序列比较相似，读长短的话，难以进行有效的比对，而454平台的平均读长在400bp左右，可以很好的避免此类问题。二、宏基因组全测序在这种测序方式中，我们可以假定一个环境中的所有微生物就是一个整体，然后对其中所有的微生物进行测序。这样我们就可以研究样品中的功能基因以及其在环境中所起的作用而不用关心其来自哪个微生物。可以发现新的基因，可以进行基因的预测，甚至有可能得到某个细菌基因组的全序列。此外，该项测序不单可以针对DNA水平，也可以针对全RNA进行基因表达水平的研究。样品处理：

宏基因组样品收集主要有口腔，下呼吸道痰液，下呼吸道灌洗液，皮肤和粪便。样品采集遵照样品采集规范（人）所规定的操作来进行。尽量留足备份样品。核酸提取：宏基因组核酸提取主要有两种方法：膜过滤法和直接裂解提取。对于液体样品如痰液，灌洗液两种方法都适用，对于固体样品如粪便宜采用直接裂解的方法。核酸提取后用NanoDrop ND-1000测定，260/280 = ， 260/230 = ，电泳检测DNA 应是完整的一条带。测序Sequencing 1)16S/18S测序： Sanger测序：用于低通量的16S/18S DNA测序，提取宏基因组后，首先通过PCR将16S/18S 序列扩增出来，再将其连接到克隆载体上，导入感受态细胞，涂平板做蓝白斑筛选，选出阳性克隆提质粒，对质粒进行测序反应，测序反应后纯化后用ABI 3130或ABI 3730进行毛细管电泳测序。由于其测序准确率比较高，而通量非常低，现通常用做二代测序结果的验证。454 Platform： 454平台主要包括两种测序系统：454 GS FLX+ System和454 GS Junior System。454 GS FLX+ System测序读长可以达到600-1000bp，通量450-700M，GS Junior System测序读长在400bp左右，通量在35M。

病毒宏基因组学方法优缺点及意义

病毒宏基因组学方法优缺点及意义病毒宏基因组学方法优缺点及意义随着时代的发展和生物科学技术的进步，新兴的病毒宏基因组学为解决这些问题提供了契机，以下是一篇关于病毒宏基因组学探究的论文范文，供大家阅读参考。病毒个体微小，多数病毒直径在100nm(20~200nm)，较大的病毒直径300~450nm,较小仅为18~22nm,结构简单，不能独立复制需要依赖于宿主细胞复制繁殖，被许多生物学家认为是处于生命和非生命交叉区域的存在物。据估计目前对病毒的发掘还不到1%[1],对病毒的研究具有广阔的前景和现实意义。病毒独特的结构和特性给病毒的研究和鉴别带来许多困难，主要体现在两个方面：第一，病毒没有专门的宿主细胞系，60%以上的病毒无法成功的进行离体培养[2]或在培养中不能表达致病性;第二，病毒基因本身变异率高，通过与宿主间的相互作用进化，增加核酸多样性，产生新病毒，导致宿主范围扩大、跨物种传播[3].对细菌的研究可以通过保守的16sRNA的分析来定位分类信息、进化关系和种群多样性等。对于真菌有18sRNA及ITS序列。然而病毒不像细菌真菌，没有固定保守的进化标记基因。所以一些传统研究方法的应用受到限制，不能完全满足病毒研究的需要。如电镜观察病毒的灵敏性不高，细胞培养病毒可能观察不到细胞病变，血清学反应中不但难以获得高价抗体而且容易出现交叉反应导致错误结果，传统PCR方法对未知序列及高变异的病毒研究难以发挥作用。加之近年来病毒流行病的频繁发生及其可怕的传染性，对人类及动植物的健康产生严重威胁，如HIV病毒、SARS病毒、禽流感病毒和在西非等地肆虐的埃博拉病毒[4]等，给人们造成了巨大的恐慌和经济损失。因此，对病毒基因组的研究、致病源的探索、病毒在生物体和环境中如何存在及传播、病毒病防治的研究已迫在眉睫。随着时代的发展和生物科学技术的进步，新兴的病毒宏基因组学为解决这些问题提供了契机，宏基因组学(Metagenomics)的概念是1998年由Handelsman[5]首次提出，对特定环境中基因组的总和进行研究，包括培养的和未培养的.微生物。病毒宏基因组学(Viral metagenomics)就是宏基因组学在病毒领域的应用，即从环境或生物组织中浓缩病毒粒子的遗传物质进行生物学信息分析的技术。它的应用需要一些交叉学科的创新技术的支持，随机

宏基因组学的一般研究策略

宏基因组学的一般研究策略摘要: 宏基因组学是目前微生物基因工程的一个重要方向与热点。它把微生物的总群体特性与基因组学实验手段结合了起来，包括从环境样品中提取总DNA、再用可培养的宿主微生物建立文库及筛选目的克隆和基因。该法是研究不可培养微生物、寻找新的基因和开发新活性产物的重要新途径。它避开了微生物分离、纯化和培养的步骤,大大扩展了微生物资源的利用范围。本文旨在介绍宏基因组学的一般研究方法并结合我们的实验情况,对这一崭新领域中的最新研究策略进行了简要综述。关键词: 宏基因组学, 不可培养微生物, 文库构建, 文库筛选，研究策略 Strategies for accessing metagenomics for desired applications Abstract: Metagenomics is a new field of microbial genetic engineering. It has the characteristics of microbial ecology and the methodology of genomics. Metagenomics includes genomic DNA isolation, library construction and screening strategies, and can be used in the discovery of new gene and biocatalysts and in the study of uncultured microorganism. Metagenomics can overcome the advantages of isolation and cultivation procedures in traditional microbial method, and thus greatly broaden the space of microbial resource utilization. In this paper, we mainly reviewed the metagenomic methodology, together with the latest advances and novel strategy in this research field. Keywords：Metagenomics; Uncultured microorganism；Library construction；Library screening Research strategies 大自然中蕴藏着无数具有重要价值的微生物及其活性产物,也是新基因及生物学资源的重要源泉，对其进行研究成为微生物学和分子生物学研究的一个重要方向。然而人们现在能够培养与利用的不到环境中总微生物的1%[1]。宏基因组学(metagenomics)是直接从环境样品中提取全部微生物的总DNA, 避开了分离、纯化和培养微生物的过程来构建宏基因组文库,用基因组学的研究策略来研究环境样品中的总微生物的组成及其在群落中的功能等。现在,宏基因组学技术方法已在微生物多样性,微生物细胞间的相互作用,新基因和新型生物催化剂的开发，新的抗生素的开发及环境生态等方面得到了广泛应用[2]。本文旨在介绍宏基因组学的一般实验方法并结合我们的研究情况,对这一崭新领域中的最新研究策略进行了简要综述。深化了我们对这一学科的认识,促进了该学科的进步。 1 宏基因组学研究策略 1.1宏基因组学概要宏基因组学是Handelsman等于1998年提出的[3], 可见是一门很新的学科，其随着基因组实验手段，生物信息学和测序技术等的日新月异也迅猛发展了起来，这个新学科是以环境样品的总微生物基因组为实验对象，通过测序分析、文库评价、产活性物质及其基因的克隆的获取和基因功能的鉴别，对微生物种群组成与生物量、生态学关系、生物化学关系与环境关系以及功能活性进行研究[4]。其主要过程包括样品和基因的富集和提取; 宏基因组文库的构建; 目的基因的筛选; 目的基因活性产物的表达(图1)。 1.2 微生物及其基因的富集在文库筛选过程中由于目的基因比例较小, 对环境中微生物的富集不但可提高基因总量，有利于基因的提取，还可增加目的基因的比例，如Kouker 等用橄榄油富集产脂肪酶的微生物收到了很好的效果[5 ]，橄榄油不仅可作为底物，还可诱导脂肪酶的合成。目前富集技术主要分为细胞水平和基因水平。其中细胞水平主要是用选择培养基来富集某些微生物, 常

宏基因组测序技术检测方法模板

宏基因组测序技术检测方法

宏基因组测序技术检测标准简介：宏基因组测序介绍宏基因组学是以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，经过现代基因组技术手段包括功能基因的筛选和测序分析，对环境中微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系以及环境之间的关系进行研究的新的微生物研究方法。随着高通量测序技术的发展，为宏基因组学研究提供了新的理想研究方法。高通量测序的方法无需分离环境中各种微生物，也无需构建克隆文库就能够直接对环境中所有微生物进行测序。能够真实客观的反映环境中微生物的多样性、种群结构、进化关系等。当前又能够分为针对16s DNA/18sDNA/ITS测序和针对宏基因组全序列的测序研究。下面就是对这两者的具体介绍。一、16s DNA/18s DNA/ITS测序 16sDNA是最常见的微生物物种分子鉴定的标签，，经过对样品中16sDNA测序能够鉴定其中微生物物种的丰度和分布情况。当前，普遍使用Roche 454平台来对环境样品进行16s DNA测序。因为16s DNA序列比较相似，读长短的话，难以进行有效的比对，而454平台的平均读长在400bp左右，能够很好的避免此类问题。二、宏基因组全测序

在这种测序方式中，我们能够假定一个环境中的所有微生物就是一个整体，然后对其中所有的微生物进行测序。这样我们就能够研究样品中的功能基因以及其在环境中所起的作用而不用关心其来自哪个微生物。能够发现新的基因，能够进行基因的预测，甚至有可能得到某个细菌基因组的全序列。另外，该项测序不单能够针对DNA水平，也能够针对全RNA进行基因表示水平的研究。样品处理：宏基因组样品收集主要有口腔，下呼吸道痰液，下呼吸道灌洗液，皮肤和粪便。样品采集遵照样品采集规范（人）所规定的操作来进行。尽量留足备份样品。核酸提取：宏基因组核酸提取主要有两种方法：膜过滤法和直接裂解提取。对于液体样品如痰液，灌洗液两种方法都适用，对于固体样品如粪便宜采用直接裂解的方法。核酸提取后用NanoDrop ND-1000测定，260/280 = 1.8-2.0， 260/230 = 1.8-2.0，电泳检测DNA应是完整的一条带。测序Sequencing 1)16S/18S测序： Sanger测序：用于低通量的16S/18S DNA测序，提取宏基因组后，首先经过PCR将16S/18S序列扩增出来，再将其连接到克隆载体上，导

病毒宏基因组学方法优缺点及意义【可编辑版】

病毒宏基因组学方法优缺点及意义【可编辑版】病毒宏基因组学方法优缺点及意义病毒宏基因组学方法优缺点及意义病毒个体微小，多数病毒直径在100nm，较大的病毒直径300~450nm,较小仅为18~22nm,结构简单，不能独立复制需要依赖于宿主细胞复制繁殖，被许多生物学家认为是处于生命和非生命交叉区域的存在物。据估计目前对病毒的发掘还不到1%,对病毒的研究具有广阔的前景和现实意义。病毒独特的结构和特性给病毒的研究和鉴别带来许多困难，主要体现在两个方面: 第一，病毒没有专门的宿主细胞系，60%以上的病毒无法成功的进行离体培养或在培养中不能表达致病性;第二，病毒基因本身变异率高，通过与宿主间的相互作用进化，增加核酸多样性，产生新病毒，导致宿主范围扩大、跨物种传播.对细菌的研究可以通过保守的16sRNA的分析来定位分类信息、进化关系和种群多样性等。对于真菌有18sRNA及ITS序列。然而病毒不像细菌真菌，没有固定保守的进化标记基因。所以一些传统研究方法的应用受到限制，不能完全满足病毒研究的需要。如电镜观察病毒的灵敏性不高，细胞培养病毒可能观察不到细胞病变，血清学反应中不但难以获得高价抗体而且容易出现交叉反应导致错误结果，传统PCR方法对未知序列及高变异的病毒研究难以发挥作用。加之近年来病毒流行病的频繁发生及其可怕的传染性，对人类及动植物的健康产生严重威胁，如HIV病毒、SARS病毒、禽流感病毒和在西非等地肆虐的埃博拉病毒等，给人们造成了巨大的恐慌和经济损失。因此，对病毒基因组的研究、致病源的探索、病毒在生物体和环境中如何存在及传播、病毒病防治的研究已迫在眉睫。随着时代的发展和生物科学技术的进步，新兴的病毒宏基因组学为解决这些问题提供了契机，宏基因组学的概念是1998年由Handelsman首次提出，对特定环境

宏基因组学研究方法及应用概述

宏基因组学研究方法及应用概述彭昌文　(山东省济宁学院生物学系　273155)　颜　梅　(山东省曲阜师范大学生命科学学院　273165) 摘　要　本文简要介绍了宏基因组的概念,概述了其原理及应用。关键词　宏基因组　宏基因组学　环境基因组学　基因文库的构建迄今,人们对微生物世界的认识基本都来源于对占细菌总种数不到1%的微生物的单个种群的孤立研究结果。然而微生物是通过其群落而非单一种群来执行在自然界物质与能量循环中的作用的,对微生物群落作为整体的功能认识远远落后于对其个体的认识。这种状况不利于全面认识微生物在自然界所扮演的重要角色。为了获得完整的环境微生物基因表达产物,早在1978年许多学者就提出了直接从环境中提取微生物DNA的思路,1998年,AR I A D phar maceutical公司的科学家Handels man等首次提出宏基因组的概念[1]。宏基因组(the genomes of the total m icrobi ota found in nature)是指生境中全部微生物基因的总和[2]。它包含了可培养的和未培养的微生物的基因总和,微生物主要包括环境样品中的细菌和真菌。而宏基因组学就是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象,以功能基因筛选和测序分析为研究手段,以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系等为研究目的的新的微生物研究方法,也称为微生物环境基因组学、元基因组学或生态基因组学。它主要研究从环境样品获得的基因组中所包含的微生物的遗传组成及其群落功能,为充分认识和开发利用非培养微生物,并从完整的群落水平上认识微生物的活动、最大限度地挖掘微生物资源,提供了可能,已成为国际生命科学技术研究的热点和前沿。 1　宏基因组学的研究方法宏基因组学的研究过程一般包括从环境样品中提取基因组DNA,克隆DNA到合适的载体,导入宿主菌体,筛选目的转化子等工作,可分为三个步骤。 1.1　宏基因组的提取　在宏基因组筛选过程中,目的基因是整个核苷酸链中的一部分,因此样品前期的富集能够提高筛选命中率。DNA的提取是宏基因文库构建的关键步骤。提取步骤通常需要满足两个条件:既要尽可能提取样品所有微生物的基因,又要保持片段的完整和纯度。目前所开发的DNA提取方法有两种:细胞提取法和直接裂解法。直接裂解法包括物理法(冻融法、超声法、玻璃球珠击打法、液氮碾磨法)、化学法(常用化学试剂有表面活性剂、盐类、有机溶剂等)及酶裂解法。另外,依据提取样品总DNA前是否分离细胞,可以分为原位裂解法和异位裂解法。原位裂解法可以直接破碎样品中的微生物细胞而使DNA 得以释放,由于无需对样品微生物进行复苏,且黏附颗粒上的微生物细胞亦能被裂解,所得DNA能更好地代表样品微生物的多样性。此法操作容易、成本低,DNA 提取率高,但由于机械剪切作用较强,所提取的DNA 片段小(1～50kb),通常适用于构建小片段插入文库(以质粒和λ噬菌体为载体)的DNA提取。异位裂解法则先采用物理方法将微生物从样品中分离出来,然后采用较温和的方法抽提DNA。此法条件温和,可获得大片段DNA(20～500kb),纯度高,但操作繁琐、成本高、得率低,通常适用于构建大片段插入文库(以柯斯质粒或者细菌人工染色体为载体)的DNA提取。1.2　宏基因组文库的构建　宏基因组文库的构建需适宜的克隆载体。通常用于DNA克隆的载体主要包括质粒、黏粒和细菌人工染色体等。质粒一般用于克隆小于10kb的DNA片段,适用于单基因的克隆与表达。黏粒的插入片段可达40kb左右,细菌人工染色体插入片段可达350kb,可用来制备由多基因簇调控的微生物活性物质的完整代谢途径的相关片段文库。1.3　目的基因的筛选　目的基因的筛选方法包括序列分析和功能分析两种。序列分析适用于小片段DNA文库的基因筛选;而功能分析通常适用于大片段DNA文库的筛选。序列分析筛选不依赖于重组基因在外源宿主中的表达,因为所使用的寡聚核苷酸引物是直接通过DNA序列中的保守区域设计的,反映了氨基酸序列的保守性,可获得未知序列的目的基因。该方法对DNA量的要求不高,筛选到新活性物质的可能性较大。序列分析的另一个手段是对宏基因组克隆测序,无论是全部或随机测序都是发现新基因的有效手段。对于功能分析而言,首先需获得目的克隆,然后通过序列和生化分析对其进行表征。此法能快速鉴定出全新且有开发价值的活性物质,可用于医药、工农业等行业。由于此法检出率较低,工作量较大,且受检测手段的限制,所以常要借助于高通量筛选。 2　宏基因组学的应用 2.1　在生态学方面的应用　当今微生物生态学研究的主要目的之一是将微生物与其所在环境中的代谢过程相联系。应用16s r DNA作为系统发育锚去鉴定属于某种微生物的克隆,然后对基因进行测序,从而获得

宏基因组学概述

宏基因组学概述王莹，马伊鸣（北京交通大学土木建筑工程学院环境1402班）摘要：随着分子生物学技术的快速发展及其在微生物生态学和环境微生物学研究中的广泛应用，促进了以环境中未培养微生物为研究对象的新兴学科——微生物环境基因组学(又叫宏基因组学、元基因组学，英文名Metagenomics)的产生和快速发展。宏基因组学通过直接从环境样品中提取全部微生物的DNA，构建宏基因组文库，利用基因组学的研究策略研究环境样品所包含的全部微生物的遗传组成及其群落功能．在短短几年内，宏基因组学研究已渗透到各个领域，包括海洋、土壤、热液口、热泉、人体口腔及胃肠道等，并在医药、替代能源、环境修复、生物技术，农业、生物防御及伦理学等各方面显示了重要的价值。本文对宏基因组学的主要研究方法、热点内容及发展趋势进行了综述关键词：宏基因组宏基因组学环境基因组学基因文库的构建 Macro summary of Metagenomics Wang Ying, Ma Yi-Ming （BeijingJiaotongUniversity, Institute of civil engineering,） Key words: Metagenome; Metagenomics; The environmental genomics 宏基因组学（Metagenomics）又叫微生物环境基因组学、元基因组学。它通过直接从环境样品中提取全部微生物的DNA,构建宏基因组文库，利用基因组学的研究策略研究环境样品所包含的全部微生物的遗传组成及其群落功能。它是在微生物基因组学的基础上发展起来的一种研究微生物多样性、开发新的生理活性物质（或获得新基因）的新理念和新方法。其主要含义是：对特定环境中全部微生物的总DNA （也称宏基因组，metagenomic）进行克隆，并通过构建宏基因组文库和筛选等手段获得新的生理活性物质；或者根据rDNA数据库设计引物，通过系统学分析获得该环境中微生物的遗传多样性和分子生态学信息。 1.起源宏基因组学这一概念最早是在1998年由威斯康辛大学植物病理学部门的Jo Handelsman等提出的，是源于将来自环境中基因集可以在某种程度上当成一个单个基因组研究分析的想法，而宏的英文是"met a-"，具有更高层组织结构和动态变化的含义。后来伯克利分校的研究人员Kevin Chen和Lior Pachter 将宏基因组定义为"应用现代基因组学的技术直接研究自然状态下的微生物的有机群落，而不需要在实验室中分离单一的菌株"的科学。 2 研究对象宏基因组学(Metagenomics)是将环境中全部微生物的遗传信息看作一个整体自上而下地研究微生物与自然环境或生物体之间的关系。宏基因组学不仅克服了微生物难以培养的困难, 而且还可以结合生物信息学的方法, 揭示微生物之间、微生物与环境之间相互作用的规律, 大大拓展了微生物学的研究思路与方法, 为从群落结构水平上全面认识微生物的生态特征和功能开辟了新的途径。目前, 微生物宏基因组学已经成为微生物研究的热点和前沿, 广泛应用于气候变化、水处理工程系统、极端环境、人体肠道、石油污染、生物冶金等领域, 取得了一系列引人瞩目的重要成果。 3 研究方法宏基因组学的研究过程一般包括样品和基因(组)的富集；提取特定环境中的基因组 DNA；构建宏基因组 DNA 文库；筛选目的基因；目的基因活性产物表达(图 1)五个步骤。

宏基因组学的研究

因组学研究进展及其应用摘要：本文先简要介绍了当前生物化学的一些研究热点，再针对因组学展开论述，介绍了因组学的产生背景和概念，当前的研究进展及应用。因组学尝试通过免培方法获得微生物的纯培养，主要技术包括DNA的提取、文库的构建和目标基因克隆的筛选，可用于开发新型酶、发现新基因、筛选医药等方面。关键字：因组学；因组学基本策略；文库构建与筛选；因组学研究进展及其应用引言：微生物是地球上种类最多、数量最大、分布最广的生物群。仅原核生物(细菌和古细菌)即构成地球生物总量的的25～50 %[1]。自然条件下，包括病毒在的微生物,通过群落广泛参与C、N、O 和S等重要元素的循环转化，在人体的食物消化、毒素降解及机体免疫反应，环境污染物降解等方面发挥着重要作用[2]。人们对于微生物的研究主要是建立在纯培养基础上，后来人们发现通过纯培养方法估计的环境微生物多样性只占总量的0.1%~1%[3]，多达99%以上的微生物是不可培养的, 其中蕴含着巨大的应用潜能——其代产物中可能有众多具有应用开发价值的化合物[4]。为了研究不能培养的微生物，一个全新的理念——因组学应运而生，该技术不需预先培养就能开发这些微生物基因组，目前已广泛应用于微生物活性物质的开发与利用、环境微生物种群分布及动态变化分析等方面的研究[5]。因组学的提出为解决上述问题提供了一个可行途径。因组学以生境中全部

DNA作为研究对象，通过克隆、异源表达来筛选有用基因及其产物。由于突破了传统研究领域无法涵盖不可培养微生物的瓶颈，因组学概念及研究方法一经提出，就被广泛接受。尽管在方法上还存在一定缺陷，但并不妨碍不同领域学者利用该方法来研究各种生境中微生物生态以及筛选功能基因的热情，有关因组学研究的文章逐年增多[4]。 1.因组学的概念因组( metagenome) 的概念是指从生境样本中取得全部微生物的基因组, 而不是采用传统的培养微生物的基因组。因组的样本既包括可培养的微生物，也包括更大量的传统方法无法研究的不可培养微生物[6]。而所谓因组学 (也称元基因组学Metagenomics 、微生物环境基因组学Microbial Environmental Genomics、生态基因组学Ecogenomics ) 就是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，以功能基因筛选和测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的的新的微生物研究方法，一般包括克隆、构建文库和功能分析筛选等工作[7]。 2.因组学的基本策略及方法 2.1因组学的基本策略因组学的研究还处于初期发展阶段，但其研究的基本过程和基本策略已基本清楚。在此要强调的是，因组学研究有着明确的指导思想，它是在反向生物学原则指导下，基于特定生态环境基础上，依据整体、系统、动态变化和相互作用的观点，运用特殊的技术路线和方法，对研究围中所有基因组展开研究的学科。因组学是一种整体性的研究策略，它建立在微生物基因组学的迅速发展和聚

(完整word版)宏基因组测序讲解

宏基因组测序目的研究藻类物种的分类，研究与特定环境与相关的代谢通路，以及通过不同样品的比较研究微生物内部，微生物与环境，与宿主的关系。技术简介宏基因组( Metagenome)(也称微生物环境基因组Microbial Environmental Genome, 或元基因组) 。是由 Handelsman 等 1998 年提出的新名词，其定义为"the genomes of the total microbiota found in nature" , 即生境中全部微小生物遗传物质的总和。它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因，目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。而所谓宏基因组学 (或元基因组学， metagenomics) 就是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，以功能基因筛选和/或测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的的新的微生物研究方法。一般包括从环境样品中提取基因组 DNA, 进行高通量测序分析，或克隆DNA到合适的载体，导入宿主菌体，筛选目的转化子等工作。宏基因组( Metagenome)(也称微生物环境基因组Microbial Environmental Genome, 或元基因组) 。是由 Handelsman 等 1998 年提出的新名词，其定义为"the genomes of the total microbiota found in nature" , 即生境中全部微小生物遗传物质的总和。它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因，目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。而所谓宏基因组学 (或元基因组学， metagenomics) 就是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，以功能基因筛选和/或测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究

宏基因组测序技术检测方法

宏基因组测序技术检测标准简介：宏基因组测序介绍宏基因组学是以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，通过现代基因组技术手段包括功能基因的筛选和测序分析，对环境中微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系以及环境之间的关系进行研究的新的微生物研究方法。随着高通量测序技术的发展，为宏基因组学研究提供了新的理想研究方法。高通量测序的方法无需分离环境中各种微生物，也无需构建克隆文库就可以直接对环境中所有微生物进行测序。可以真实客观的反映环境中微生物的多样性、种群结构、进化关系等。目前又可以分为针对16s DNA/18sDNA/ITS测序和针对宏基因组全序列的测序研究。下面就是对这两者的具体介绍。一、16s DNA/18s DNA/ITS测序 16sDNA是最常用的微生物物种分子鉴定的标签，，通过对样品中16sDNA 测序可以鉴定其中微生物物种的丰度和分布情况。目前，普遍使用Roche 454平台来对环境样品进行16s DNA测序。因为16s DNA序列比较相似，读长短的话，难以进行有效的比对，而454平台的平均读长在400bp左右，可以很好的避免此类问题。二、宏基因组全测序在这种测序方式中，我们可以假定一个环境中的所有微生物就是一个整体，然后对其中所有的微生物进行测序。这样我们就可以研究样品中的功能基因以及其在环境中所起的作用而不用关心其来自哪个微生物。可以发现新的基因，可以进行基因的预测，甚至有可能得到某个细菌基因组的全序列。此外，该项测序不单可以针对DNA水平，也可以针对全RNA进行基因表达水平的研究。样品处理：宏基因组样品收集主要有口腔，下呼吸道痰液，下呼吸道灌洗液，皮肤和粪便。样品采集遵照样品采集规范（人）所规定的操作来进行。尽量留足备份样品。

宏基因组测序讲解

宏基因组学的研究

宏基因组学研究进展及其应用摘要：本文先简要介绍了当前生物化学的一些研究热点，再针对宏基因组学展开论述，介绍了宏基因组学的产生背景和概念，当前的研究进展及应用。宏基因组学尝试通过免培方法获得微生物的纯培养，主要技术包括DNA的提取、文库的构建和目标基因克隆的筛选，可用于开发新型酶、发现新基因、筛选医药等方面。关键字：宏基因组学；宏基因组学基本策略；文库构建与筛选；宏基因组学研究进展及其应用引言：微生物是地球上种类最多、数量最大、分布最广的生物群。仅原核生物(细菌和古细菌)即构成地球生物总量的的25～50 %[1]。自然条件下，包括病毒在内的微生物,通过群落广泛参与C、N、O 和S等重要元素的循环转化，在人体的食物消化、毒素降解及机体免疫反应，环境污染物降解等方面发挥着重要作用[2]。人们对于微生物的研究主要是建立在纯培养基础上，后来人们发现通过纯培养方法估计的环境微生物多样性只占总量的0.1%~1%[3]，多达99%以上的微生物是不可培养的, 其中蕴含着巨大的应用潜能——其代谢产物中可能有众多具有应用开发价值的化合物[4]。为了研究不能培养的微生物，一个全新的理念——宏基因组学应运而生，该技术不需预先培养就能开发这些微生物基因组，目前已广泛应用于微生物活性物质的开发与利用、环境微生物种群分布及动态变化分析等方面的研究[5]。宏基因组学的提出为解决上述问题提供了一个可行途径。宏基因组学以生境中全部DNA作为研究对象，通过克隆、异源表达来筛选有用基因及其产物。由于突破了传统研究领域无法涵盖不可培养微生物的瓶颈，宏基因组学概念及研究方法一经提出，就被广泛接受。尽管在方法上还存在一定缺陷，但并不妨碍不同领域学者利用该方法来研究各种生境中微生物生态以及筛选功能基因的热情，有关宏基因组学研究的文章逐年增多[4]。 1.宏基因组学的概念宏基因组( metagenome) 的概念是指从生境样本中取得全部微生物的基因组, 而不是采用传统的培养微生物的基因组。宏基因组的样本既包括可培养的微生物，也包括更大量的传统方法无法研究的不可培养微生物[6]。而所谓宏基因组学(也称元基因组学Metagenomics 、微生物环境基因组学Microbial Environmental Genomics、生态基因组学Ecogenomics ) 就是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，以功能基因筛选和测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的的新的微生物研究方法，一般包括克隆、构建文库和功能分析筛选等工作[7]。 2.宏基因组学的基本策略及方法 2.1宏基因组学的基本策略宏基因组学的研究还处于初期发展阶段，但其研究的基本过程和基本策略已基本清楚。在此要强调的是，宏基因组学研究有着明确的指导思想，它是在反向生物学原则指导下，基于特定生态环境基础上，依据整体、系统、动态变化

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