蛋白质与酶工程

蛋白质与酶工程重点

1.蛋白质工程：以蛋白质结构与功能的关系研究为基础，利用基因工程技术或化学修饰技术对现有蛋白质加以改造，组建成新型蛋白质的现代生物技术。

2.酶工程：利用酶、细胞器或细胞的特异催化功能，通过适当的反应器工业化生产人类所需产品或达到某种特殊目的的一门技术科学。

3.酶工程研究的主要内容：1）化学酶工程2）生物酶工程3）固定化酶与细胞4）酶反应器与传感器5）酶的非水相催化

4.蛋白质的融合：将编码一种蛋白质的部分基因重组到另一种蛋白质基因上，或将不同蛋白质基因的片段组合在一起，经基因克隆和表达产生新的融合蛋白。

5.蛋白质的融合的作用：1）用于表达产物的分离纯化；2）提高表达产物的溶解度；3）提高蛋白质稳定性。

6.蛋白质晶体学：利用X射线衍射技术，进行生物大分子结构研究的工程，是结构生物学的一个重要组成部分。

8.定点突变：通过分子克隆手段定点的改变特定基因的局部核苷酸序列，通常被用来研究蛋白质的功能结构以及用于目的蛋白的改造。

10.酶工程的研究范围：

1）各类自然酶的开发和生产；

2）酶的分离纯化和鉴定技术；

3）固定化技术；

4）利用其他的生物技术领域交叉渗透；

5）多酶反应器的研制和应用。

11.酶的稳定性和稳定化：

（一）引起酶失活的原因：

1）酶的活性中心一些特定氨基酸残基被化学修饰，使酶活性丧失（微观）；

2）外部环境的影响，酶活性中心出现空间障碍，使其不能与底物结合；

3）酶的高级结构发生变化（螺旋、折叠发生变化）；

4）多肽链的断裂（很强烈）；

（二）酶的稳定化：

1）低温保存（酶的本身不易变性，不易使其他酶把目的蛋白降解）；

2）添加盐类（高浓度(NH4)2SO4）；

3）添加底物辅酶等配体；

4）添加强变性剂（保护一级结构，使用时可复活）；

5）结晶化。

12.微生物作为酶源的优越性：

1）容易获得酶需要的酶类；

2）容易获得高产菌株；

3）生产周期短；

4）生产成本低；

5）生产易管理；

6）提高微生物产酶的途径比较多。

13.固定化酶：指在一定空间呈封锁状态存在的酶，能连续地进行反应，反应后的酶可以回收重复使用。

14.固定化酶的优点：

1）极易将固定化酶与产物和底物分开；

2）可以在较长时间内进行反复的分批反应和装柱连续反应；

3）在大多数情况下能够提高酶的稳定性；

4）酶的反应过程能加以严格控制；

5）产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺；

6）较游离酶更适合于多酶反应；

7）可以增加产物的收率，提高产物的质量；8）酶的使用效率提高、成本降低。

15.固定化酶的缺点：

1）固定化时酶活力有损失；

2）增加了生产的成本，工厂初始投资大；

3）只能用于可溶性底物，而且较适用于小分子底物；

4）与完整的菌体相比不适合多酶反应，特别是需要辅因子的反应；

5）胞内酶必须经过的分离手续。

16.固定化酶的制备原则：

1）必须注意维持酶的催化活性和专一性；

2）固定化应有利于生产的自动化和连续化；

3）固定化酶应有最小的空间位阻，尽可能不妨碍煤与底物的接近，以提高产品产量；

4）酶与载体必须结合力牢固，使固定化酶能够回收，储藏利于反复使用；

5）固定化酶应有最大的稳定性，所选的载体不与废物产物或反应液发生化学反应；

6）固定化酶成本要低，利于工业使用。

17.酶固定的方法：

（一）非共价结合法：

1）结晶法：适用于酶活性低的酶，结晶后浓度变化大，在不断的连续使用中没有所损耗；2）分解法：将酶制成干粉，将其分散于水中不溶相中，即使干粉悬浮于溶剂上，优点：回收较方便，缺点：干粉易吸水，颗粒变大，活性降低，在有机溶剂中酶活力会受到影响；3）物理吸附法：酶被物理吸附于不溶性载体的一种方法；优点：酶活性中心不容易被破坏，高级结构变化少，酶活力损失小，也适用于固定化细胞；缺点：酶与载体相互作用弱，酶易脱落；

4）通过离子键结合到水溶性载体上；优点：操作简单、条件温和、高级结构及活性中心不能被破坏，也适用于固定化细胞；缺点：载体与酶的结合力较弱，阴阳离子或阳离子缓冲液，离子浓度影响较大、酶较易从载体上脱落；

（二）化学结合法：

1）共价结合法：酶与载体共价结合；方法：将载体有关的基因活化，然后与酶有关的基因发生偶联反应，在载体结合比较牢固，一般不会固定底物浓度变化而改变；缺点：反应条件较激烈，往往会引起高级结构的变化，破坏活性中心，只适用于酶的固定化，不适用于细胞的固定化；

2）交联法：就使用多功能试剂或者是双功能试剂，使酶与酶或微生物与微生物细胞之间交联的固定化方法，一般会通过降低交联剂浓度及反应时间保持酶活力；

（三）包埋法：

1）网格型：将酶或微生物包埋在高分子凝胶的细微网格中，此法是固定化微生物细胞用得较多的方法；优点：不需要与酶蛋白发生结合反应，酶活回收率较高；

2）微胶囊型：把酶分子包在一个胶囊中，高分子膜为半透型的，此胶囊不渗透，可以在一些无水的有机相中存在。

18.固定化酶的性质：

（一）固定化后酶活力的变化：

原因：1）酶分子在固定化过程中空间构象有所变化，甚至影响活性中心的氨基酸；

固定化后酶分子空间自由度受到限制，直接影响到活性中心对底物的空位作用；

内扩散阻力使底物分子与活性中心的接近受阻力；

包埋时，酶被高分子半透膜包围，大分子底物不能透过膜与酶接近；

固定化对酶稳定性的影响：

热稳定性提高；

2）对各种有机试剂及酶试剂稳定性提高；

3）对不同pH值的稳定性，对蛋白酶的稳定性，贮存稳定性和操作稳定性都有影响；

4）固定化酶稳定性提高的原因：固定化酶与载体可以多点连接，可以防止蛋白酶分子伸展变形；固定化后酶的活力可以缓解释放；可以抑制酶的自降解；

（三）最适温度变化----升高；

（四）最适pH值变化：范围扩宽；

（五）Km（米氏常数的变化的变化----变小，亲和力提高）。

19.固定化方法：

1）将辅酶和酶共同的固定在同一个载体上，可得到一个永久性不需外加辅酶的体系；

2）将辅酶直接固定在酶分子上。

20.细胞固定化：被限制自由移动的细胞，即细胞受到物理、化学等因素的约束或限制在一定的空间界限内，但细胞仍保留催化活性，并且有能被反复连续使用的活力。

1.细胞固定化的优缺点：

优点：1）固定化细胞保持了细胞内酶系的原始状态和天然环境，因而更稳定；

保持胞内原有的多酶系统，对于多步催化优势更加明显，不需要辅酶再生；

对固定化增殖细胞发酵更具明显优势；固定化细胞密度大，可增殖，缩短发酵生产周期；发酵稳定性好，可较长时间的反复连续使用；发酵液中含的菌体较少有利于产品分离纯化，提高产品质量；

缺点：1）细胞内多种酶的存在，会形成不需要的副产物；

细胞膜、细胞壁，还有载体的存在都会形成一种扩散限制的作用；

3）载体形成的孔隙大小影响到高分子底物的通透性。

2.化学修饰：凡是通过化学基因的列入或除去而使蛋白质的共价结构发生改变，我们把这种现象称为化学修饰。

3.蛋白质功能基反应性影响因素：1）微区的极性：2）氢键效应；3）静电效应；4）位阻效应。

4.酶蛋白功能级的超反应性：指蛋白质的某个侧链基因与个别试剂能发生迅速反应。

5.影响超反应性的因素：1）改变蛋白质功能的pK值；2）蛋白质功能基具有较大的反应性；3）通过静电相互作用来吸引试剂并使其具有适当的取向；4）试剂与靠近修饰部位的蛋白区域之间的立体化学适应性。

6.修饰剂反应性的决定因素：1）选择吸附；2）静电相互作用；3）位阻因素；4）催化因素：5）微区极性（局部环境的极性）。

7.修饰反应专一性的控制：

（一）试剂的选择：

1）对氨基酸的修饰有几种情况：

a.修饰所有的氨基而不修饰其他基因；

b.反修饰α氨基；

c.修饰具有催化活性的氨基；

d.改变蛋白质的带电状态和溶解性，改变蛋白质的带电状态要选择能够在中性条件下带最大电荷量的试剂，改变蛋白质的溶解性反应在水中进行，选择化

学试剂为能溶于水的；3）反应产物的定量测定；4）考虑试剂的大小：选择试剂体积小一些，便于修饰，不致使蛋白质的构象发生较大变化；

反应条件的选择：

反应条件不会造成蛋白质的不可逆变性；

反应条件选择有利于专一性修饰蛋白质；

（三）反应的专一性：1）可以利用蛋白质中某些基因的特殊性；2）选择不同反应pH值；3）利用某些产物不稳定性；4）亲和标记；5）差别标记：在体系中有酶分子、底物、抑制剂存在时；6）利用蛋白状态的差异。

8.亲和试剂：也称作为位点专一性抑制剂，试剂作用于被作用位点的某一基因，而不与被作用部位以外的其他基因发生作用，这类修饰剂叫做亲和试剂。

9.亲和标记：亲和试剂一般都具有与底物相类似的结构，对酶的活性部位具有高度的亲和性，能对活性部位的氨基酸残基进行共价标记，把这一类专一性的化学修饰成为亲和标记，也称专一性不可逆抑制。

10.固定化酶：在一定空间上，呈闭合状态，可发生连续作用，最后回收再利用。

11.固定化是如何通过下列三种效应影响酶的稳定性：1）产生空间障碍；2）产生扩散限制；3）多点共价连接。

12.稳定化的方法：

（一）固定化（化学结合、包埋法等）：1）产生空间障碍：抑制化学失活；2）产生扩散限制：把酶包埋在多孔颗粒内部，底物先接触多孔颗粒表面，再扩散到内部与酶作用，不受底物浓度控制；3）多点共价连接：将酶多点共价连接到载体表面，或用双功能试剂交联酶，或降酶包埋在载体紧密的孔中，可以使酶构象更加牢固，从而阻止酶构象从折叠态向伸展态过度。

13.核酶：是描述具有催化活性的RNA，其化学本质是核糖核酸具有酶的催化功能，底物可以是不同分子，也可以是同一RNA分子中的某些部位。

14.天然核酶：（一）剪切型核酶（催化自身和异体RNA的切割，核酸内切酶）：1）锤头型核酶；2）发卡型核酶；3）蛋白质—RNA复合酶；（二）剪接型核酶：包括组Ⅰ内含子和组Ⅱ内含子；实现RNA的自我剪接；具有核酸内切酶和连接酶的活性。

15.体外选择：从顺序随机的RNA或DNA分子构建的大容量随机分子库出发，在其中筛选得到极少数具有特异功能的分子。

16.适体：能与有机物或蛋白质等配体专一高效结合的RNA或DNA片段分别称RNA适体或DNA适体。

17.筛选适体的方案：1）化学合成DNA分子库，在分子链上的某一位置引入完全随机或部分突变的顺序，分子的两端是固定的顺序，以便PCR扩增；2）经过几轮PCR扩增后，体外转录形成一个具有随机顺序的RNA库；3）将这些RNA分子通过结合有靶分子的亲和层析柱，根据RNA与靶分子的结合能力大小将其区分开来，结合力强的RNA分子被最后洗脱下来；4）洗脱下来的RNA分子经过反转录、PCR扩增、转录，在进入下一次筛选循环，经过5~10个循环后，获得库中富集了与靶分子亲和力高的RNA分子。

18.核酶的筛选过程：1）通过转录随机序列的RNA构建一个DNA随机库；2）随机库中具有催化活性分子可以催化底物与进行共价连接；3）将反应产物通过固定在底物RNA的5’端顺序互补配对的寡核苷酸亲和柱，选择性的吸附随机库中那些可以催化连接反应的RNA 分子；4）经过高盐洗脱：逆转录、PCR扩增、转录、进入下一轮筛选；5）在接下来的筛选循环中，用易错PCR以一定频率向有活性的分子中引入突变，增加了筛选得到的随机库的分子多选择性；6）经过多轮筛选，有催化活性的RNA分子富集起来，而活性比较低的

分子被淘汰。

19.脱氧核酶：利用体外分子进化技术合成的一种具有催化功能的单链DNA片段具有高效催化活性和结构识别能力。

1.体外选择方法：1）不需要转录和逆转录，人工合成DNA分子，直接进行PCR扩增；2）获得单链DNA分子：PCR扩增在引物上连接一个生物素，将PCR产物经过生物素蛋白的亲和柱来实现正负链的分离；3）引入二价的金属离子作为辅助因子；4）针对这些脱氧核酶，将一些额外功能团引入到DNA当中，来增加结构和功能的亲和性。

2.脱氧核酶的分类：（切割RNA的脱氧核酶）（切割DNA的脱氧核酶）（具有激酶活力的脱氧核酶）（连接酶功能的脱氧核苷酶）（催化卟啉环金属螯合反应）

3.反义核酸：DNA或RNA分子与mRNA分子结合，形成空间位阻，使其不能与核糖体结合，进而翻译成蛋白质另外也能降解mRNA。

4.酶分子的合理性设计：利用各种生物化学、晶体学、光谱学等方法对天然酶或其实突变性进行研究，获得酶分子特征。空间结构。结构和功能之间关系，以及氨基酸残基等方面的信息，然后以此为依据对酶进行改造。

5.酶分子的非合理性设计：不需要准确的酶分子结构信息，而通过随机突变、基因重组、空白筛选等方法对其进行改造，定向选择出所需要性质的突变酶。

6.酶分子定向进化：即酶分子的发展方向；是从一个或多个存在的亲本酶（天然的或人为获得的）出发，经过基因的突变或重组，构建一个人工突变酶库，通过筛选最终获得领先期望的具有某些特性的进化酶。定向进化=随机突变+正向重组+选择（或筛选）。

7.易错PCR：在采用Taq酶进行PCR扩增目的基因时，通过调整反应条件，例如提高Mg2+浓度，加入Mn离子，改变体系中dNTP的浓度等，改变Taq酶的突变频率，从而向目的基因中以一定的频率随机引入突变构建突变库，然后选择或筛选需要的突变体。

8.连续易错PCR：将一次PCR扩增得到的有用突变基因，作为下一次PCR扩增模板，连续反复地进行随机诱变，使每一次后的的小突变累积而产生重要的有意突变。

9.DNA改组：将已经获得的存在于不同基因中的正突变结合在一起，形成新的突变基因库，又称有性PCR。

10.DNA改组的操作：从正突变基因库中分离出来的DNA片段用脱氧核糖核酸酶Ⅰ随机切割得到的随机片段，经过不加引物的多次PCR循环，在PCR循环过程中，随机片段之间互为模板和引物进行扩增，直到获得全长的基因，这导致来自不同基因片段之间的重组，将亲本中的有意突变进行重新组合。

11.交错延伸法：在PCR反应中，把常规的退火和延伸合并为一步，并大大缩短其反应时间，从而只能合成出非常短的新生链，经变性的新生链再作为引物，与体系内同时存在的不同模板退火，而继续延伸。此过程反复进行，直到产生完整长度的基因片段，结果会产生间隔的含有不同模板序列的新生DNA分子，这样的新生DNA分子中，含有大量的突变组合，将有利于新的酶性质的产生。

12.基因文库：一个生物体的基因组DNA用限制性内切酶部分酶切后，将酶切片段插入到载体DNA分子中，所有插入基因组DNA片段的载体分子集合体将包含这个生物体的整个基因组，也就是构成了这个生物体的基因文库。

13.文库的代表性：指文库包含的DNA分子是否能完整地反映出来外源基因的全部可能的变化和改变，它是体现文库质量的最重要指标。文库代表性好坏衡量指标是文库的库容量。

14.库容量：指构建出的原始突变文库中所包含的独立的重组子克隆数。

15.构建突变库的载体：（λ噬菌体载体系统）（质粒载体系统）（哺乳类细胞表达载体系统）。

16.模拟酶：又称为人工酶或酶模型，在分子水平上模拟酶活性部位的形状、大小及其微环境等结构特征以及酶的作用机理和立体化学等特征的应用科学。

17.酶模型的（催化基团）和（底物之间）必须具有相互匹配的立体化学特征，这对形成良好的反应特异性和催化效力是相当重要的。

18.“主—客体”化学：主体（酶）和客体（底物）通过配位键和其他次级键形成稳定复合物的化学领域称为“主—客体”化学。

19.模拟酶的分类：（一）根据类型分：1）单纯酶模型；2）机理酶模型；3）单纯合成的酶样化合物；（二）根据属性分：1）主—客体酶模型；2）胶束酶模型；3）肽酶；4）半合成酶；5）分子印迹酶；6）抗体酶。

20.抗体酶：抗体高度选择性和酶的高效催化能力巧妙的产物，本质是一类具有催化能力的免疫球蛋白，也叫催化抗体，专一性超过酶反应专一性催化速度，有的也可以达到酶的催化速度。

21.分子印迹：制备对某一化合物具有选择性的聚合物的过程，把化合物叫做印迹分子，也叫做模板分子。

22.分子印迹的原理（分子印迹的制备方法）：1）选择印迹分子的功能单体，使二者发生互补反应；2）在印迹分子----单体复合物周围发生聚合反应；3）用抽提法从聚合物中除掉印迹分子；4）形成的聚合物内保留与印迹分子形状、大小完全一样的空穴，该聚合物能以高选择性重新结合印迹分子。

23.表面分子印迹的种类：1）无机物为载体的表面分子印迹；2）固体材料表面修饰；3）蛋白质表面印迹。

24.生物印迹：分子印迹的一种，指以天然的生物材料（如蛋白质和糖类物质）为骨架，在其上进行分子印迹，而产生对印迹分子具有特异性识别空腔的过程。

25.生物印迹原理：生物分子构象的柔性在无水有机相中被取消，其构象被固定，因而模板分子与生物分子在水溶液中相互作用后产生的构象变化，在移入无水有机相中才能得以保持。

26.用生物印迹方法将蛋白质转化为半合成酶：1）使蛋白部分变性，扰乱起始蛋白的构象；2）加入印迹分子，使印迹分子与部分变形的蛋白充分结合；3）待印迹分子与蛋白质相互作用后，用交联剂交联印记的蛋白质；4）经透析方法除去印迹分子。

01【课堂笔记】《蛋白质与酶工程》-酶的分离与纯化02部分

第一章酶的分离提取与纯化 1.1离心分离和层析分离 1.1.1酶的提取方法 离心是利用离心机旋转所产生的的离心力以及物质的沉降系数或浮力密度的差异，进行分离浓缩和提纯生物样品的一种方法。 离心分离时，要根据待分离物质以及杂志的颗粒大小、密度和特性的不同，选择适当的离心机、离心方法和离心条件。 1.1.1.1离心机的种类与用途 常速离心机，高速离心机，超速离心机 1)常速离心机：转速<8000 r/min 用途：分离细胞、细胞碎片、培养基残渣 及粗结晶等较大颗粒 2)高速离心机：转速：1~2.5*104 r/min 用途：分离各种沉淀物、细胞碎片 及较大的细胞器 3)超速离心机：转速：2.5~12*104 r/min 用途：用于DNA、RNA、蛋白质 等生物大分子以及细胞器、病毒的分离纯化 1.1.1.2离心方法 差速离心，密度梯度离心，等密度梯度离心 1)差速离心：原理：是采用不同的离心速度和离心时间，是沉降速度不同的颗 粒分不分离的方法。用途：分离沉降系数相差较大的蛋白质分子 2)密度梯度离心原理：不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用 下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带的方法。 常用介质：蔗糖、甘油 3)等密度梯度离心：原理：当待分离的不同颗粒的密度范围在离心介质的密 度梯度范围内时，不同浮力密度的颗粒在离心力作用下一直移动到与各自浮力密度相等的位置，形成区带。介质：铯盐 1.1.1.3层析分离技术 又称色谱技术，是一种物理的分离方法。利用混合物中的各组分的物理化学性质（分子的大小和形状，分子极性，吸附力，分子亲和力）的不同，使各组分以不同的程度分布在两个相中，其中一个相为固定的（固定相），另一个相则流过固定相（流动相）并使各组分以不同速度一定，从而达到分离 根据分离原理分类 吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶层析和亲和层析等 1)吸附层析 原理：是利用吸附剂对不同物质的吸附力不同，而使混合物中各组分分离的方法。 2)分配层析 原理：在一个有两相同时存在的溶剂系统中，根据不同物质的分配系数不同而达到分离目的的一种层析技术。

蛋白质酶工程课堂问题整理

蛋白质酶工程，课堂提问整理 第一章 1、酶：酶是生物体内进行新陈代谢不可缺少的受多种因素调节控制的具有催化能力的生物催化剂。 2、酶工程的研究主要分为三个部分：酶的生产，酶的改性，酶的应用 3、蛋白类酶可以分为六大类，分别是（如图） 4、酶的命名有两种方法：系统名（包括所有底物的名称和反应类型）、 惯用名（只取一个较重要的底物名称和反应类型） 判断： （1）寡聚酶：由几个或多个亚基组成，亚基牢固地联在一起，单个 亚基没有催化活性。亚基之间以非共价键结合。（√） （2）酶活力指在一定条件下酶所催化的反应速度，反应速度越大， 意味着酶活力越高。（×） （3）青霉素酰化酶不但能催化青霉素侧链的水解作用，而且也能催化逆反应。（√） （4）不同细胞最适PH不同，细胞产酶的最适PH与生长最适PH往往有所不同，同一种细胞，生产不同酶的最适PH不同。（√） 5、酶的必需基团包括：（如图） 6、酶的专一性：指酶对底物及其催化反应的严格选择性。（可分为结 构专一性和立体异构专一性） 7、温度对酶的双重影响：温度升高，酶促反应速度升高；由于酶的本质是蛋白质，温度升高，可引起酶的变性，从而反应速度降低。 8、最适温度：酶促反应速度最快时的环境温度。 9、最适PH:酶催化活性最大时的环境pH。 10、酶促反应速度：在适宜的反应条件下，用单位时间内底物的消耗或产物的生成量来表示。 11、酶活力测定的一般步骤：(P8 )1. 根据酶催化的专一性，选择适宜的底物，并配制成一定浓度的底物溶液。 2. 根据酶的动力学性质，确定酶催化反应的温度、pH、底物浓度、激活剂浓度等反应条件。 3. 在一定的条件下，将一定量的酶液和底物溶液混合均匀，适时记下反应开始的时间。 4. 反应到一定的时间，取出适量的反应液，运用各种生化检测技术，测定产物的生成量或底物的减少量。 PS:酶的活力的国际单位是IU 12、酶工程：是酶的生产与应用的技术过程，主要任务是通过预先设计，经过人工操作，获得所需的酶，并通过各种方法使酶充分发挥其催化功能。 第二章 1．酶的生产方法：提取分离法，生物合成法，化学合成法 2．遗传密码子的特点：连续性，简并性，普遍性与特殊性 3．酶的生物合成法根据使用的细胞不同分类：微生物发酵产酶，植物细胞培养产酶，动物细胞培养产酶 4．葡萄糖效应的概念：细菌在含有葡萄糖和乳糖的培养基上生长，优先利用葡萄糖。待葡萄糖耗尽后才开始利用乳糖，产生了两个对数生长期中间隔开一个生长延滞期的“二次生长现象”，这一现象称葡萄糖效应。 产生的原因是由于葡萄糖降解物阻遏了分解乳糖酶系的合成。

蛋白质工程重点

一、名词解释 1、蛋白质工程（Protein Engineering）——以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过化学、物理和分子生物学的手段进行基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类对生产和生活的需求的工程技术。 2、结构模体（supersecondary structure，motif）——介于蛋白质二级结构和三级结构之间的空间结构,指相邻的二级结构单元组合在一起，彼此相互作用，排列形成规则的、在空间结构上能够辨认的二级结构组合体，并充当三级结构的构件（block building），其基本形式有αα、βαβ和βββ等。 3、结构域（domain）——是在二级结构或超二级结构的基础上形成三级结构的局部折叠区，它是相对独立的紧密球状实体。 4、蛋白质的折叠(protein folding)——从体内新生的多肽链或体外变性的多肽链的一维线性氨基酸序列转化为具有特征三维结构的活性蛋白质的过程。 5、分子伴侣（molecular chaperone）——一大类相互之间没有关系的蛋白质，它们具有的共同功能是帮助其他含蛋白质的结构在体内进行非共价的组装和卸装，但不是这些结构在发挥其正常的生物学功能时的永久组成部分。 6、晶胞(Unit cel l)——空间点阵的单位（大小和形状完全相同的平行六面体），是晶体结构的最小单位。 7、核磁共振现象（nuclear magnetic resonance ，NMR）——指核磁矩不为零的核，在外磁场的作用下，核自旋能级发生塞曼分裂(Zeeman splitting)，共振吸收某一特定频率的射频辐射（radio frequency, RF）的物理过程。 8、化学势（位）移（ ）——在有机化合物中，各种氢核周围的电子云密度不同（结构中不同位置）共振频率有差异，即引起共振吸收峰的位移，这种现象称为化学位移。 9、耦合常数（J）——由于自旋裂分形成的多重峰中相邻2峰间的距离。用以表征2核之间耦合作用的大小，单位赫兹Hz。 10、蛋白质组（proteome）——一个基因组、一种生物或一种细胞/ 组织所表达的全套蛋白质。 二、问答题 1、蛋白质修饰特异性与非特异性诱变方法： 随机突变：UV、X射线、其他化学方法、转座元件、简并引物 定点突变：核式突变、限制性内切酶位点、寡核苷酸介导突变、PCR依赖 1）、Kunkel突变法 双突变菌株 转染于dut+ung+野生型受体菌不含U碱基的保留，含U碱基的被切除 原理：当大肠杆菌dUTP酶缺失突变时（dut-），这些细菌就不能把dUTP转化为dUMP,因而细菌体内的dUTP浓度大为增加，并且一些dUTP会掺入到DNA合成中应该由胸腺嘧

蛋白质与酶工程复习资料

酶工程复习提纲 第一章绪论 1.酶及酶工程的概念。 酶：是生物体内一类具有催化活性和特殊空间构象的生物大分子物质。 酶工程：利用酶的催化作用，在一定的生物反应器中，将相应的原料转化成所需产品的一门工程技术。(名词解释) 2.了解酶学的发展历史，尤其是一些关键事件。 1833年，Payen和Persoz发现了淀粉酶。1878年，Kuhne首次将酵母中进行乙醇发酵的物质称为酶。给酶一个统一的名词，叫Enzyme，这个词来自希腊文，其意思“在酵母中”。 1902年，Henri提出中间产物学说。1913年，Michaelis and Menton推导出酶催化反应的基本动力学方程，米氏方程：V=VmS/（Km+S）。1926年，Summer分离纯化得到脲酶结晶。人们开始接受“酶是具有生物催化功能的蛋白质”。Cech and Altman于1982和1983年发现具有催化活性的RNA即核酸类酶，1989年获诺贝尔化学奖。现已鉴定出5000多种酶，上千种酶已得到结晶，而且每年都有新酶被发现。 3.了解酶在医药、食品、轻工业方面的应用。 医药：（1）用酶进行疾病的诊断：通过酶活力变化进行疾病诊断，谷丙转氨酶/谷草转氨酶用于诊断肝病、心肌梗塞等，酶活力升高；葡萄糖氧化酶用于测定血糖含量，诊断糖尿病。 （2）用酶进行疾病的治疗：来源于蛋清、细菌的溶菌酶用于治疗各种细菌性和病毒性疾病；来源于动物、蛇、细菌、酵母等的凝血酶用于治疗各种出血病；来源于蚯蚓、尿液、微生物的纤溶酶用于溶血栓。 （3）用酶制造各种药物：来源于微生物的青霉素酰化酶用于制造半合成青霉素和头孢菌素；来源于动物、植物、微生物的蛋白酶用于生产L-氨基酸。 食品：生产低聚果糖，原料为蔗糖，所需酶为果糖基转移酶、蔗糖酶α（黑曲霉、担子菌）；生产低聚异麦芽糖，原料为淀粉，所需酶为α-淀粉酶、β-淀粉酶、真菌α-淀粉酶（米曲霉）、α-葡萄糖苷酶（黑曲霉）、普鲁兰酶、糖化型α-淀粉酶（枯草杆菌）。 轻工业：用酶进行原料处理；用酶生产各种轻工、化工产品；用酶增强产品的使用效果。

蛋白质与酶工程教学大纲

《蛋白质与酶工程》教学大纲 课程名称：蛋白质与酶工程 学分：2 学时：32 先修课程：生物化学 适用专业：生物工程 开课系部：生命科学学院 一、课程性质、目的和培养目标 课程性质：专业选修课 课程目的：本课程是生物工程本科专业选修课，目的是让学生在学习了普通生化的基础上，进一步对蛋白质和酶工程进行深入系统的学习。并对于酶在生产实践中的应用，也能有一些感性和理性的认识。 课程培养目标：采用多媒体课件和国内外最新的教学参考书、教案，灵活运用多种教学方法，因材施教，使学生在牢固掌握基础知识和基本概念的同时，得到科学研究、科学思维和科学方法的良好训练，为其他专业基础课和专业课的学习及日后的研究工作打下基础。 二、课程内容和建议学时分配 第一章绪 论 2课时 （一）教学基本要求 掌握蛋白质工程和酶工程的定义，了解其发展史，以及应用前景。 （二）教学内容 第一节蛋白质工程概论 第二节蛋白质工程的应用 第三节蛋白质工程展望 第四节酶工程简介 一酶工程 二组成：酶的产生；酶的分离纯化；酶的固定化；生物反应器。 三分类：化学酶工程；生物酶工程。 第五节酶与酶工程的发展简史 一酶学研究简史 二酶工程研究简史

（三）教学重点和难点 重点：蛋白质与酶工程定义; 难点：酶工程的组成分类 第二章蛋白质的结构与功能 2课时（一）教学基本要求 掌握蛋白质的基本结构组成及功能 （二）教学内容 第一节蛋白质的基本结构与功能 一蛋白质的组成 二蛋白质的一级结构 三蛋白质一级结构与功能的关系 第二节蛋白质的空间结构与功能 一蛋白质的二级结构 二超二级结构和结构域 三蛋白质的三级结构 四蛋白质空间结构与功能的关系 五蛋白质-蛋白质相互作用 （三）教学重点和难点 重点：蛋白质的空间结构；难点：蛋白质间的相互作用； 第三章蛋白质的修饰和表达4课时（一）教学基本要求 掌握蛋白质的化学修饰途经，了解蛋白质改造的一些途经等。 （二）教学内容 第一节蛋白质修饰的化学途径 一功能基团的特异性修饰 1多位点取代 2 3 二基于蛋白质片段的嵌合修饰 第二节蛋白质改造的分子生物学途径 一编码基因的专一性位点和区域性定向突变 1 2 二基因融合和基因剪接 三tRNA介导定点搀入非天然氨基酸 第三节重组蛋白质的表达

酶学与酶工程复习资料

酶学与酶工程复习资料 上一届考试试题 一、名字解释 1、酶的活性中性：酶分子中直接与底物结合，并和酶催化作用直接有关的区域叫酶的活性中心，参与构成酶的活性中心和维持酶的特定构象所必需的基团为酶的必需基团。 2、米式方程及各字母的意义：米氏方程表示一个酶促反应的起始速度v与底物浓度S关系的速度方程，v＝V max·S/（K m+S）。其中 K m值称为米氏常数，V max是酶被底物饱和时的反应速度，[S]为底物浓度。由此可见K m值的物理意义为反应速度（v）达到1/2V max时的底物浓度（即K m=[S]），单位一般为mol/L，只由酶的性质决定，而与酶的浓度无关。 3、别构效应：一个蛋白质与其配体（或其他蛋白质）结合后，蛋白质的空间结构发生改变，使它适用于功能的需要，这一类变化称为别构效应或变构效应。 4、遗传密码：遗传密码决定蛋白质中氨基酸顺序的核苷酸顺序，由3个连续的核苷酸组成的密码子所构成。 5、盐析：增加中性盐浓度使蛋白质、气体、未带电分子溶解度降低的现象。是蛋白质分离纯化中经常使用的方法，最常用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠和氯化钠等。 6、内囊性包埋法：系利用天然的或合成的高分子材料（统称为囊材）作为囊膜壁壳，将固态或液态药物包裹成为的药库型微型胶囊。 7、固定化酶：水溶性酶经物理或化学方法处理后，成为不溶于水的但仍具有酶活性的一种酶的衍生物。在催化反应中以固相状态作用于底物。 8、必需水：维持酶分子完整的空间构象所必需的最低水量。 二、问答题 1、温度对酶促反应的影响及原因。 答：温度对酶促反应的影响包括两方面：一方面是当温度升高时，反应速度也加快，这与一般化学反应相同。另一方面，随温度升高而使酶逐步变性，即通过减少有活性的酶而降低酶的反应速度。在低于最适温度时，前一种效应为主，在高于最适温度时，则后一种效应为主，因而酶活性丧失，反应速度下降。 2、操纵子的定义及组成。 答：操纵子：指启动基因、操纵基因和一系列紧密连锁的结构基因的总称，基因表达的协同单位，转录的功能单位。很多功能上相关的基因前后相连成串，由一个共同的控制区进行转录的控制，包括结构基因以及调节基因的整个DNA 序列。操纵子通常由2个以上的编码序列与启动序列、操纵序列以及其他调节序列在基因组中成簇串联组成。 3、蛋白质合成过程当中的主要物质。 答：主要为mRNA、tRNA、氨基酸、核糖核蛋白体以及有关的酶和辅助因子。蛋白质合成是以mRNA为模板，以氨基酸为底物，在核糖体上通过各种tRNA、酶和辅助因子的作用，合成多肽链的过程。 4、酶生物合成模式有哪几种及其特点?简述其接近理想模式的方法？ 答：1、同步合成型：酶的生物合成与细胞生长同步进行的一种酶生物合成模式。该类型酶的 生物合成速度与细胞生长速度紧密联系，又称为生长偶联型。2、延续合成型：酶的生物合成在细胞的生长阶段开始，在细胞生长进入平衡期后，酶还可以延续合成一段较长时间。3、中期合成型：酶在细胞生长一段时间以后才开始，而在细胞生长进入平衡期以后，酶的生物合成也随着停止。4、滞后合成型：酶是在细胞生长一段时间或者进入平衡期以后才开始其生物合成并大量积累，又称为非生长偶联型，许多水解酶的生物合成都属于这一类型。 在酶的发酵生产中，为了提高产酶率和缩短发酵周期，最理想的合成模式应是延续合成型。属于延续合成型的酶，在发酵过程中没有生长期和产酶期的明显差别。细胞一开始生长就有酶产生，直至细胞生长进入平衡期以后，酶还可以继续合成一段较长的时间。对于其他合成模式的酶，可以通过基因工程\细胞工程等先进技术,选育得到优良的菌株, 并通过工艺条件的优化控制, 使他们的生物合成模式更加接近于延续合成型。其中对于同步合成型的酶，要尽量提高其对应的mRNA的稳定性，为此适当降低发酵温度是可取的措施；对于滞后合成型的酶，要设法降低培养基中阻遏物的浓度，尽量减少甚至解除产物阻遏或分解代谢物阻遏作用，使酶的生物合成提早开始；而对于中期合成型的酶，则要在提高mRNA的稳定性以及解除阻遏两方面考虑，使其生物合成的开始时间提前，并尽量延迟其生物合成停止的时间。 5、举例说明生物酶制剂生产工艺流程。 答：一、植物细胞培养的工艺流程：外植体→细胞的获取→细胞培养→分离纯化→产物。植物细胞培养产酶的工艺过程——大蒜细胞培养生产超氧化物歧化酶（SOD）：1、大蒜愈伤组织的诱导：打破休眠的大蒜蒜瓣，去除外皮消毒在无菌条件下，将蒜瓣切成0.5cm3左右的小块，植入培养基中，25℃、600lux、12h/d光照的条件下培养18d，诱导得到愈

蛋白质与酶工程选择与解答

一、选择题 1．下列不属于Prion蛋白特点的是（C） A.没有核酸 B.没有病毒形态 C.在120℃高温及2h高压下可灭活 D.病毒潜伏期长 2．蛋白质工程研究的核心内容是（A） A.蛋白质结构分析 B.蛋白质结构预测 C.改造蛋白质 D.创造新蛋白质 3．蛋白质工程的最终目的是（C） A.研究蛋白质的结构组成 B.创造新理论 C.生产具有新性能的蛋白质 D.研究蛋白质的氨基酸组成 4．蛋白质分子设计中“小改”是指（B） A.对来源于不同蛋白的结构域进行拼接组装 B.对已知结构的蛋白质进行少数几个残基的替换 C.完全从头设计全新的蛋白质 D.对蛋白质中的一个肽段进行替换 5．可用于蛋白质功能分析的方法是（D） A.X射线晶体衍射技术 B.圆二色谱法 C.显微技术 D.蛋白质芯片技术 6．以下那种方法，可以方便地在溶液中研究分子结构，并且是唯一可以使试样不经受任何破坏的结构分析方法？（B） A. X射线晶体衍射技术 B.核磁共振技术 C.圆二色谱法 D.电镜三维重构法 7．以下不属于根据分子大小不同进行蛋白质纯化的方法的是（D） A.超滤 B.透析 C.密度梯度离心 D.盐析 8．Western-Blotting是对（B）进行印迹分析的方法。 A.RNA B.单向电泳后的蛋白质分子 C.DNA D.双向电泳后的蛋白质分子 9．以下不属于酶的固定化方法中非化学结合法的是（A） A.交联法 B.结晶法 C.吸附法 D.离子结合法 10.最常用的交联剂是（A） A.戊二醛 B.聚乙二醇

C.异氰酸酯 D.双重氮联苯胺 11.世界上生产规模最大，应用最成功的固定化酶是（C） A.氨基酰酶 B.天冬酰胺酶 C.葡萄糖异构酶 D.胆固醇氧化酶 12.抗体酶是（ A ） A、具有催化活性的抗体分子 B、具有催化活性的RNA分子 C、催化抗体水解的酶 D、催化抗体生成的酶 13.以天然蛋白质或酶为母体，用化学或生物学方法引进适当的活性部位或催化基团，或改变其结构而形成一种新的人工酶是（C） A.胶束酶 B.肽酶 C.半合成酶 D.抗体酶 14.制备游离酶可选用的酶反应器是（B） A.填充床反应器 B.喷射式反应器 C.连续搅拌罐反应器 D.流化床反应器 15.金属离子置换修饰是将（ D）中的金属离子用另一种金属离子置。 A.酶液 B.反应介质 C.反应体系 D.酶分子 16.被称为“分子手术刀”和“分子针线”的酶分别是（A） A.限制性内切酶、DNA连接酶 B.DNA解旋酶、DNA连接酶 C.DNA聚合酶、限制性内切酶 D.DNA解旋酶、DNA聚合酶 17.当前生产酶制剂所需的酶主要的来自（C） A.动物组织和器官 B.植物组织和器官 C.微生物发酵 D.基因工程 18.溶菌酶的作用对象是（A） A.革兰氏阳性菌 B.酵母

蛋白质工程和酶工程在现代工艺中的应用

蛋白质工程和酶工程在现代工艺中的应用 06120801 20081903 付婷钰 摘要：蛋白质工程[1]，是指在基因工程的基础上，结合蛋白质结晶学，计算机辅助设计和蛋白质化学等多学科的基础知识通过对基因的人工定向改造等手段，对蛋白质进行修饰，改造和拼接以生产出能满足人类需要的新型蛋白质；酶作为一种生物催化剂，已广泛地应用于轻工业的各个生产领域。近几十年来，随着酶工程不断的技术性突破，在工业、农业、医药卫生、能源开发及环境工程等方面的应用越来越广泛。 关键词：蛋白质工程酶工程应用 正文： 一、蛋白质工程的应用 1、在医药方面[2] 许多蛋白质工程的目标是设法提高蛋白质的稳定性。在酶反应器中可延长酶的半衰期或增强其热稳定性，也可以延长治疗用蛋白质的贮存寿命或重要氨基酸抗氧化失活的能力。在这个领域已取得了一些重要研究成果。用蛋白质工程来改造特殊蛋白质为制造特效抗癌药物开辟了新途径。如人的β- 干扰素和白细胞- 2 是两种抗癌作用的蛋白质。但在它们的分子结构中，有一个不成对的基因，是游离的，因而很不稳定，会使蛋白质失去活性。当通过蛋白质工程修饰这种不稳定的结构就可以提高这两种抗癌物质的生物活性。美国的Cetus 公司成功地修饰了这两种治疗癌瘤的蛋白质，大大提高了它们的稳定性，已用于临床试验并取得了良好的效果。具有抗癌作用的蛋白质工程产品免疫球蛋白质是一种高效治癌药物，它能成为征服癌症的“生物导弹”，即具有对准目标杀死特定癌细胞而不伤害正常细胞的特效。近年来，澳大利亚医学科学研究所的一个微生物研究课题组经过多年的研究后发现了激发基因开始或停止产生癌细胞的蛋白质。这种蛋白质在癌细胞生长过程中对癌基因起着开通或关闭的作用。这个发现，对于通过蛋白质工程研制鉴别与控制多种类型的血液癌、固体癌的蛋白质有很好的作用，并为诊断和治疗癌症提供了新的方法。目前，应用蛋白质工程研究开发抗癌及抗艾滋病等重大疑难病症等方面，均取得了重大进展。 另据实验，蛋白质工程还可以改变α1 抗胰蛋白（ATT）。运用此工程技术在ATT 的Met358 和Ser359 之间切开后，可以与嗜中性白细胞弹性蛋白酶迅速结合而引发抑制作用。在病理学的氧化条件下可导致Met358变成蛋氨酸硫氧化物使ATT 不可能与弹性蛋白酶的弹性位点相结合。通过位点直接诱变，Met358 被Val 代替就成为抗氧化疗法的AAT 突变体。含AAT 突变体的血浆静脉替代疗法已经用于AAT 产物基因缺陷疾病患者的治疗，并已取得明显疗效。 2、在农业方面 蛋白质工程正在成为改造农业，大幅度提高粮食产量的新途径。如植物光合作用是利用白光能将二氧化碳转化成贮成能量淀粉，在植物叶片中普遍存在着一种重要的起催化作用的酶，它能固定住二氧化碳，这种酶叫核酮糖- 1.5- 二磷酸羧化酶。而这种酶具有双重性：它既能固定二氧化碳，又会使二氧化碳在光照条件下通过光呼吸作用损失一半，即光 合效率只有50%。现在。这种酶的三维结构已经搞清楚了。参与研究的工作人员认为，可以通过蛋白质工程改造这种酶，控制其不利于人需要的一面，从而大大提高其光合作用效率，增加粮食产量。近年来，美国坎布里奇的雷普里根公司的科研人员立题，以蛋白质工程作为设计优良微生物农药的新思路，他们实施对微生物蛋白质结构进行修改，仅此一举，使微生物农药的杀虫率提高了10 倍。 3、在工业方面[3] 蛋白质工程在工业上的应用取得的成果亦是很多。现以改变酶的动力学特性研制出高效

10生物技术蛋白质与酶工程复习题与答案.

一. 名词解释 1．生物酶工程又称高级酶工程它是酶学与现代分子生物学技术相结合的产物。 2．蛋白质工程蛋白质工程就是运用蛋白质结构功能和分子遗传学知识，从改变或合成基因入手，定向地改造天然蛋白质或设计制造新的蛋白质。 3.多核糖体把细胞放在极其温和的条件下处理，就能得到几个到几十个核糖体在一条mRNA上结合起来的形态 4.固定化酶水溶性酶经物理或化学方法处理后，成为不溶于水的但仍具有酶活性的一种酶的衍生物。在催化反应中以固相状态作用于底物 5.酶反应器以酶或固定化酶为催化剂进行酶促反应的装置。 6．酶工程又叫酶技术，是酶制剂的大规模生产和应用的技术 7.生物传感器对生物物质敏感并将其浓度转换为电信号进行检测的仪器。 8. motif(模体指的是蛋白质分子结构中介于二级结构与三级结构之间的一个结构层次，又称超二级结构 9. domain功能域生物大分子中具有特异结构和独立功能的区域,特别指蛋白质中这样的区域 10.PDB蛋白质数据库（Protein Data Bank,PDB）是一个生物大分子， 11. DNA shuffling体外同源重组技术。通过改变单个基因原有的核苷酸序列创造新基因，并赋予产物以新功能。 12.生物催化剂是指生物反指应过程中起催化作用的游离或固定化细胞各游离或固定化酶的总称 13.必需基团有的基团既在结合中起作用，又在催化中起作用，所以常将活性部位的功能基团统称为必需基团(essential group 14.活性中心。酶的活性中心是酶与底物结合并发挥其催化作用的部位。 15.有性PCR dna改组 16.DNA改组通过改变单个基因原有的核苷酸序列创造新基因，并赋予产物以新功能。 17.免疫传感器偶联抗原/抗体分子的生物敏感膜与信号转换器组成的，基于抗原抗体特异性免疫反应的一种生物传感器。

蛋白质与酶工程复习资料

第一章 1、蛋白质工程的产生： 1，最早的蛋白工程是福什特（Forsht）等在1982-1985年间对酪氨酰-t-RNA合成酶的分子改造工作。2，佩里（Perry）1984年通过将溶菌酶中Ile(3)改成Cys(3)，并进一步氧化生成Cys(3)-Cys（97）二硫键，使酶热稳定性提高，显著改进了这种食品工业用酶的应用价值。3，1987年福什特通过将枯草杆菌蛋白酶分子表面的Asp（99）和Glu（156）改成Lys，而导致了活性中心His（64）质子pKa从7下降到6，使酶在pH＝6时的活力提高10倍。 二，蛋白质工程的内容 1、定义：广义上来说，蛋白质工程是通过物理、化学、生物和基因重组等技术改造蛋白质或设计合成具有特定功能的新蛋白质。 2、内容：确定蛋白质的化学组成、空间结构与生物功能之间的关系。根据需要合成具有特定氨基酸序列和空间结构的蛋白质 三，蛋白质工程的程序 蛋白质分子设计基因改造方案基因成或突变 分离纯化蛋白质结构蛋白质分子基因克隆与表达 目的基因和功能测定 改造的蛋白质分子 四，酶工程的应用范围 （1）对生物宝库中存在天然酶的开发和生产； （2）自然酶的分离纯化及鉴定技术； （3）酶的固定化技术（酶和细胞固定化）； （4）酶反应器的研制和应用； （5）与其他生物技术领域的交叉和渗透。 其中固定化酶技术是酶工程的核心。实际上有了酶的固定化技术，酶在工业生产中的利用价值才真正得以体现。 五，医用药物酶应用的问题：1）异体蛋白引起免疫反应；2）酶不纯，引起各种副作 3）酶在体内降解，时间短； 4）药物无法定向分布。 解决办法： 1) 制成微胶囊； 2) 制成衍生物；3) 制成脂质体包埋与免疫系统隔开(酶蛋白)；4) 酶上引入一定基团，起导向作用。 五，分子酶学与酶工程 1、酶——由活细胞产生的具有催化功能的蛋白质（或其它类型的生物大分子），是生物体进行代谢、维持生命活动的必需物质，没有酶就没有生命，因此研究酶的结构与功能、性质与作用机理，对于阐明生命现象的本质具有重要意义。

酶工程的研究及进展

LUOYANG NORMAL UNIVERSITY 2010年酶工程学年论文分子酶工程研究进展 院（系）名称生命科学系 专业名称生物科学 学生姓名李艳艳 学号101314022 指导教师程彦伟 完成时间2013年12月

分子酶工程研究进展 李艳艳 （生命科学系生物科学专业学号：101314022） 摘要：酶工程的研究已经发展到分子水平，通过基因操作，已实现了许多酶的克隆和表达定点突变成为研究酶结构与功能的常规手段，并被广泛用于改善酶的性能。体外分子进化方法则大幅提高了酶分子的进化效率，并有可能发展新功能酶。融合蛋白技术的发展使构建新型多功能融合酶成为可能。这里对分子酶工程学的研究与发展情况进行了综述。 关键词：分子酶工程；基因克隆；改造；定向进化；融合；人工模拟 酶，由于其特异和高效的催化作用，在生命活动中扮演重要的角色。其中，尤其是源于微生物的酶。很早就被广泛开发服务于人类的各种需求，如酿造、酶法转化、疾病诊断与治疗、药物生产、环境污染物去除，等等。然而，天然酶常常十分昂贵，且大多数酶由于非常“娇嫩”而难以实际应用。近年来，结构生物学和基因操作技术的发展使得科学家能够对酶分子进行有效地改造，甚至开始为“目的”而设计，从而导致了分子酶工程学的发展。概括地说，分子酶工程学就是采用基因工程和蛋白质工程的方法和技术，研究酶基因的克隆和表达、酶蛋白的结构与功能的关系以及对酶进行再设计和定向加工，以发展性能更加优良的酶或新功能酶。当前的研究热点可以概括为3个方面：一是利用基因工程技术大量生产酶制剂；二是通过基因定点突变和体外分子定向进化对天然酶蛋白进行改造；三是通过基因和基因片段的融合构建双功能融合酶。 1 酶的基因克隆与异源表达 天然酶在生物体中含量一般较低，难以提取和大量制备。限制了它的推广应用。重组DNA技术的建立，使人们可以较容易地克隆各种各样天然的酶基因，并将其在微生物系统中高效表达，从而在很大程度上摆脱对天然酶源的依赖。这一技术已成功地应用于酶制剂的工业生产。世界上最大的工业酶制剂生产商丹麦Novozymes公司生产的酶制剂80％为基因工程产品。我国在这个领域中也取得了令世人瞩目的研究成果。黄日波教授研究小组从广西象州温泉中分离到一株硫

蛋白质与酶工程知识点(完)---仅供参考

1、易错PCR:通过调整反应条件来使PCR扩增过程中复制错配率增加，在目的基因中随机引入突变，继而获得蛋白质分子的随机突变体 * 提高镁离子浓度或加入锰离子 * 降低体系中一种的dNTP浓度（至少5-10%） * 运用低保真度DNA聚合酶 * 增加DNA聚合酶的浓度 属于无性进化：单一基因内进行遗传突变，费力、耗时，多用于小片段（800bp以下） 2、酶的概念：酶是一类由活细胞产生的，对其特异底物（substrate）具有高效催化作用的生大分子，包括蛋白质和核酸

3、辅酶:与酶蛋白结合疏松，可用透析或超滤的方法除去(NAD+)。 辅基:与酶蛋白结合紧密，不能用透析或超滤的方法除去(FAD、FMN) 酶的活性中心：或称活性部位，指必需基团在空间结构上彼此靠近，组成具有特定空间结构的区域，能与底物特异结合并将底物转化为产物。

4、抗体酶或催化抗体：是具有催化功能的抗体。本质：免疫球蛋白，即具有催 化作用的免疫球蛋白 5、酶促反应特点： ①酶促反应具有极高的效率 ②酶促反应具有高度的特异性：绝对特异性、相对特异性、立体结构特异性 ③酶促反应的可调节性：对酶量的调节，对酶活性的调节 6、诱导契合假说：酶与底物相互接近时，其结构相互诱导、相互变形和相互适应，进而相互结合。这一过程称为酶-底物结合的诱导契合假说。 7、底物浓度对反应速度的影响：

①当底物浓度较低时：反应速度与底物浓度成正比；反应为一级反应。 ②随着底物浓度的增加：反应速度不再成正比例加速；反应为混合级反应。 ③当底物浓度高达一定程度：反应速度不再增加，达最大速度；反应为零级反应 8、Km与Vmax的意义

生物工程—蛋白质与酶工程复习题

生工13级蛋白质与酶工程复习题 二、分析与应用题 1.酶在制造业、食品工业、制药、实验等众多领域有许多用处，但游离酶因生产成本高、不易回收、稳定性差，有时与产物混杂难以分离，用何种具体方法可以解决这些问题。固定化酶：用物理或化学手段定位在限定的空间区域，并使其保持催化活性，可重复利用的酶。 固定化细胞：将具有一定生理功能的生物细胞（如微生物细胞、植物细胞或动物细胞等），用一定的方法将其固定，作为固体生物催化剂而加以利用的一门技术。 2.目前固定化酶技术常用吸附法、包埋法、共价偶联法、交联法等多种方法，分析比较各自的优缺点。 1）.吸附法:依据带电的酶或细胞和载体之间的静电作用，使酶吸附于惰性固体的表面或离子交换剂上。 优点：条件温和，操作简便，酶活力损失少。缺点：结合力弱，易解吸附。 （2）共价偶联法：借助共价键将酶的活性非必需侧链基团和载体的功能基团进行偶联。 优点：酶与载体结合牢固，不会轻易脱落，可连续使用。缺点：反应条件较激烈，易影响酶的空间构象而影响酶的催化活性

（3）.交联法：借助双功能试剂使酶分子之间发生交联的固定化方法。 优点：反应条件激烈，酶分子多个基团被交联，酶活力损失大。 缺点：制备的固定化酶颗粒较小，使用不便 (4）包埋法（entrapment）：将酶用物理的方法包埋在各种载体（高聚物）内。 优点：不与酶蛋白氨基酸残基反应，很少改变酶的高级结构，酶活回收率高。 缺点：只适合作用于小分子底物和产物的酶 3.分析模拟酶与天然酶的不同之处及优点，分析说明模拟酶为什么可以进行一些催化反应？ 天然酶的特点： 优点：温和条件下，高效、专一地催化某些化学反应；应用于糖生物工业、能源工业、饮料产业以及医药行业。 不足：对热敏感、稳定性差、分离回收不易、来源有限，限制了天然酶的规模开发和利用。 模拟酶：是用有机化学方法设计和合成一些较天然酶更简单的非蛋白质分子，以这些分子作为模型来模拟酶对其作用底物的结合和催化过程。

蛋白质与酶工程复习题

1. 名词解释 1．生物酶工程：在化学酶工程基础上发展起来的、酶学与现代分子生物学技术相结合的产物。其主要研究内容为用基因工程技术大量生产酶、用蛋白质工程技术定点改变酶的结构基因、设计新的酶结构基因生产新酶。 2．蛋白质工程：是以蛋白质空间结构及其与生物学功能的关系为基础，通过分子设计和由设计结果所指导的特定的基因修饰，而实现的对天然蛋白质的定向改造。 3.多核糖体：在蛋白质合成过程中,同一条mRNA分子能够同多个核糖体结合，同时合成若干条蛋白质多肽链，结合在同一条mRNA上的核糖体就称为多聚核糖体 4.固定化酶：固定在载体上并在一定的空间范围内进行催化反应的酶。 5.酶反应器：以酶或固定化酶作为催化剂进行酶促反应的装置称为酶反应器。以尽可能低的成本，按一定的速度由规定的反应物制备特定的产物。 6．酶工程：将酶学理论与化工技术相结合，研究酶的生产和应用的一门新的技术性学科。包括酶制剂的制备，酶的固定化，酶的修饰与改造及酶反应器等方面内容。 7.生物传感器：是一类由生物学、医学、电化学、光学、热学及电子技术等多学科相互渗透而成长起来的分析检测装置。具有选择性高、分析速度快、操作简单、价格低廉等特点。 8. motifs（超二级结构）:相邻的二级结构单元组合在一起，彼此相邻相互作用，排列形成规则的、在空间上能够辨认的二级结构组合体，并充当三级结构的构件，成为超二级结构，介于二级结构与结构域之间的结构层次。 10. domains(结构域):多肽链在超二级结构的基础上进一步折叠成紧密的近乎球状的结构，这种结构称 为结构域 12.PDB：蛋白质数据库：汇集已知蛋白质各种参数的集合。 13. DNA shuffling：（又叫有性PCR）：将DNA拆散后重排，它是模仿自然进化的一种DNA体外随机突变方法。 15.生物催化剂：游离或活细胞的总称。包括从生物体，主要是微生物细胞中提取出来的游离酶或经固定化技术加工后的酶。 16.必需基团：酶分子上与酶活性有关的化学基团称为酶的必需基团。包括活性部位的基团、活性部位以外的对维持空间构象必须的基团。

蛋白质与酶工程实习报告 福来格

《蛋白质与酶工程实习》实习报告撰写规范 实习时间：2012年暑假 实习地点：湖南福来格生物技术有限公司 指导教师：王义强，周小慧，周波，许岗 实习目的：实践教学是高校人才培养中十分重要的教学环节，是巩固学生的理论知识，培养学生实践能力、创新能力和创业、敬业精神，使学生了解社会、接触生产实际，实现人才培养目标的重要途径。通过实习，让学生深入企业，了解企业，接触生产实际，巩固专业理论知识，达到理论与实践相结合的目的。《蛋白质与酶工程实习》是生物技术专业的实践教学课程。通过该实习，使学生在实习过程中进一步学习和掌握一些蛋白质和酶的特征﹑用途﹑制造原理﹑生产方法与工艺流程，培养学生的创造精神、创新意识和动手能力，对学生今后从事蛋白质和酶的生产、销售、教学和科研等工作奠定实践基础。 实习内容： 1. 实习总动员 2012年暑假，我们生命科学与技术学院09级的学生，在任课老师的带领下，来到湖南福来格生物技术有限公司参观实习。并在湖南福来格生物技术公司，许董事长介绍了公司的基本情况、学科发展方向、科研基础设施（包括大型的分析检测仪器设备和研究所发酵中试技术服务平台）、发展情况及近年来开展的课题、固体液体发酵流程等方面给以了讲解，使我们在接收书本知识之外，有了一次充分接触实际工作，锻炼自己的机会。 1.1上网站查询并了解浑南福来格生物技术有限公司的相关产业，技术产品已经公司的大体经营状况。预习酶制剂产品的工艺流程，酶制剂产品工艺流程图，掌握主要生物化学反应原理。 1.2在公司负责人许总和曾总的讲解下，分如下三个部分： 来了解福来格生物技术有限公司在当代社会发展中的地位及战略目标。 1.2.1当代酶工程的发展现况已经中国总体生物产业的发展状况： 生物技术形成阶段是：1980-2000年；发展阶段是：2000-2050年。 酶工程是指利用酶、细胞或细胞器等具有的特异催化功能，借助生物反应装置和通过一定的工艺手段生产出人类所需要的产品。它是酶学理论与化工技术相结合而形成的一种新技术。可以分为两部分。一部分是如何生产酶，一部分是如何应用酶。

蛋白质与酶工程名词解释

蛋白质与酶工程名词解释 一、名词解释 1.蛋白质工程（Protein Engineering）：以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能 的关系为基础，通过有控制的修饰和合成，对现有蛋白质加以定向改造，设计、构建并最终生产出性能比自然界存在的蛋白质更加优良、更加符合人类社会需要的新型蛋白质。 2.蛋白质分子设计（Protein Molecule Design）:从分子、电子水平上，通过 数据库等大量实验数据，结合现代量子化学方法，通过计算机图形学技术等设计新的分子。 3.亲和标记/亲和标记试剂（Affinity Labeling /reagent）：试剂对蛋白质分子中被修 饰部位的专一性修饰，为亲和标记或专一性的不可抑制作用。(亲和标记试剂，不仅具有对被作用基团的专一性，而且具有对被作用部位的专一性，即试剂作用于被作用部位的某一基团，而不与被作用部位以外的同类基团发生作用。 这类修饰试剂也被称为位点专一性抑制剂) 4.定向进化（Directed Evolution）：在较短时间内完成漫长的自然进化过程（突 变、重组和筛选），有效地改造蛋白质，使之适合于人类的需要，这种策略只针对特定的蛋白质的特定性质，因而被称为定向进化。 5.DNA改组技术（DNA Shuffling）：是指DNA分子的体外重组，是基因在分子 水平上进行有性重组，通过改变单个基因原有的核苷酸序列，创造新基因，并赋予表达产物以新功能。 DNA家族改组技术（DNA Family Shuffling）：是以来自不同种属的同源基因作为重排对象进行DNA改组操作的技术。该技术打破不同种、属间的遗传界限，利用同源基因之间的同源序列进行DNA改组 6.超滤（Ultrafiltration）：利用压力或离心力使溶液中的小分子物质通过超滤膜， 而大分子则被截留，一次实验就可以将蛋白质混合物分为分子大小不同的两部分的分离方法。 7.亲和层析（Affinity Chromatography）：是利用蛋白质与配体专一性识别并结合 的特性而分离蛋白质的一种层析方法。将与目标蛋白质专一性结合的配体固定于支持物上，当混合样品流过此支持物时，只有目标蛋白能与配体专一性结合，而其他杂蛋白不能结合。 8.蛋白质免疫印迹法（Western Blotting）：印迹法是将样品转移到固相载体上， 而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。对单向电泳后的蛋白质分子的印记分析称为蛋白质免疫印迹法。 9.酶联免疫吸附技术（ELISA）:是采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接， 然后通过酶与底物产生颜色反应，根据颜色反应深浅进行定性或定量分析的一种技术。 10.蛋白质芯片（Prion Chip）：又称蛋白质微阵列，是将大量蛋白质有规则的固 定在某种介质载体上，利用蛋白质与蛋白质、酶与底物、蛋白质与其他小分子之间相互作用检测分析蛋白质的一种芯片。 11.酶工程（Enzyme Engineering）：将酶所具有的生物催化作用，借助工程学的手 段，应用于生产、生活、医疗诊断和环境保护等方面的一门科学技术。概括的说，酶工程是由酶制剂的生产和应用两方面组成的。酶工程的应用主要集中于食品工业、轻工业以及医药工业中。

蛋白质与酶工程 期末考试资料

第一章绪论 1、蛋白质工程:广义上来说，蛋白质工程是通过物理、化学、生物和基因重组等技术改造蛋白质或设计合成具有特定功能的新蛋白质。 2、蛋白质工程的研究内容：（1）确定蛋白质的化学组成、空间结构与生物功能之间的关系。（2）根据需要合成具有特定氨基酸序列和空间结构的蛋白质。 3、酶工程：酶工程（enzyme engineering ）是指从细胞和分子水平上对酶进行改造和加工，使酶最大限度地发挥其效率的过程。虽然目前已发现少数酶具有核酸本质，但目前一般所指的酶工程主要对象是化学本质为蛋白质的酶类。 4、酶：酶是具有生物催化功能的生物大分子（蛋白质或RNA）。 5、酶的分类：①主要由蛋白质组成——蛋白类酶（P酶）②主要由核糖核酸组成——核酸类酶（R酶） 6、“基因工程＋发酵工艺＋先进的发酵设备”可以算是酶工业的第三次飞跃。 7、酶的催化作用特点：①催化效率高、②专一性强、③反应条件温和、④反应容易调节控制、⑤需要辅因子参与作用 8、生物技术的四大支柱：基因工程，细胞工程，酶工程，发酵工程。 基因工程：“剪刀+糨糊”跨越物种界限的工程。 细胞工程：微观水平的嫁接技术。

酶工程：让工业生产高效、安静而环保的工程。 发酵工程：将微生物或细胞造就成无数微型工厂，将神话变为现实的桥梁。 第二章蛋白质结构基础 9、在有机体内通过生物合成连接成多肽链，其顺序由编码基因中的核苷酸三联体遗传密码决定。 10、20种常见氨基酸中，19种都具有如下共同的化学结构：R H2N-C H-CO2H 另有一种脯氨酸具有类似而不相同的化学结构。 11、20种氨基酸在蛋白质中是通过肽键(peptide bond)连接在一起的。一个氨基酸的羧基与下一个氨基酸的氨基经缩合反应形成的共价连接称为肽键： 12、结构域：二级结构和结构模体以特定的方式组织连接，在蛋白质分子中形成两个或多个在空间上可以明显区分的三级折叠实体，称为结构域(domain)。 第三章蛋白质分子的设定 13、大改、中改、小改、 第一类为“小改”，可通过定位突变或化学修饰来实现；小改是指对已知结构的蛋白质进行少数几个残基的替换，这是目前蛋白质工程中最为广泛使用的方法。

高三生物蛋白质工程

一、教学目标 1.举例说出蛋白质工程崛起的缘由。 2.简述蛋白质工程的原理。 3.尝试运用逆向思维分析和解决问题。 二、教学重点和难点 1.教学重点 （1）为什么要开展蛋白质工程的研究？ （2）蛋白质工程的原理。 2.教学难点 蛋白质工程的原理。 三、教学策略 1.建议采用"问题-探究-新问题-再探究"的教学模式。 本节内容是基因工程的延伸和发展。由于蛋白质工程刚刚起步，学习内容较少。如何学得充实，又让学生悟出些终身学习的道理，建议采用"问题-探究-新问题-再探究"的教学模式。 新课一开始，可以带领学生回忆原有知识：要想让一种生物的性状在另一种生物中表达，在种内可以用常规杂交育种的办法实现，但要使有生殖隔离的种间生物实现基因交流，就显得力不从心了。基因工程的诞生，为克服这一远缘杂交的障碍问题，带来了新的希望。于是取得了丰硕成果：大肠杆菌为人类生产出了胰岛素，牛的乳腺生物反应器为人类制造出了蛋白质类药物，烟草植物体内含有了某种药物蛋白......至此，人们也只是实现了世界上现有基因在转基因生物中的表达。但一个新问题出现了，生物产生的天然蛋白质是在长期进化过程中形成的，它的结构、性能不能完全满足人类生产和生活的需要。为了加深这一点的认识，可调动学生从书中找实例（干扰素例子、工业用酶的例子）加以佐证。于是要对现有蛋白质进行改造，制造出目前从天然蛋白质中找不到的蛋白质。这样人们又开始了新一轮的探索，蛋白质工程应运而生了。 2.建议加强与已有知识的联系，用逆向思维的方法解决新问题。 学生在必修课中已学习过中心法则及蛋白质具有复杂的空间结构等知识。中心法则告诉我们遗传信息的流动方向如图1-4所示。 图1-4 遗传信息的流动方向 这是学习新知识的基础。既然蛋白质的功能是由dna决定的，那么要制造出新的蛋白质，就要改造dna。所以蛋白质工程的原理应该是中心法则的逆推。结合课本中插图，可以较明确地说明这一点。 还有两点教学建议需要说明。第一，蛋白质工程的诞生是有其理论与技术条件支撑的，正如课本中开头描述的，它是随着分子生物学、晶体学以及计算机技术的迅猛发展而诞生的，也与基因组学、蛋白质组学、生物信息学的发展等因素有关（本书"前沿动态"中有简要介绍）。第二，说明蛋白质工程目前的现状：成功的例子不多，主要是因为蛋白质发挥其功能需要依赖于正确的空间结构，而科学家目前对大多数蛋白质的空间结构了解很少。这样学习，可以使学生认识到科学探索之路的漫长、艰辛和永无止境。 四、答案和提示 （一）思考与探究 1.蛋白质工程是应怎样的需求而崛起的？ 提示（供教师在教学中参考）：蛋白质工程的崛起主要是工业生产和基础理论研究的需要。而结构生物学对大量蛋白质分子的精确立体结构及其复杂的生物功能的分析结果，为设计改造天然蛋白质提供了蓝图。分子遗传学的以定点突变为中心的基因操作技术为蛋白质工程提