双水相萃取技术

三、双水相萃取

3.1 双水相萃取的原理及特点

3.1.1 双水相萃取的原理

双水相萃取与水-有机相萃取的原理相似，都是依据物质在两相间的选择性分配，但萃取体系的性质不同。当物质进入双水相体系后，由于表面性质、电荷作用和各种力(如憎水键、氢键和离子键等)的存在和环境因素的影响，使其在上、下相中的浓度不同。分配系数K等于物质在两相的浓度比，由于各种物质的K值不同，可利用双水相萃取体系对物质进行分离。

3.1.2 双水相萃取的特点

双水相体系萃取具有如下特点：(1)含水量高(70%~90%)，是在接近生理环境的温度和体系中进行萃取，不会引起生物活性物质失活或变性；(2)分相时间短，自然分相时间一般为5~15min；

(3)界面张力小(10-7~10-4mN/m)，有助于强化相际间的质量传递；(4)不存在有机溶剂残留问题；

(5)大量杂质能与所有固体物质一同除去，使分离过程更经济；(6)易于工程放大和连续操作。由于双水相萃取具有上述优点，因此，被广泛用于生物化学、细胞生物学和生物化工等领域的产品分离和提取。

3.2 双水相萃取在分离和提取各种蛋白质(酶)上的应用

用聚乙二醇(PEG)/羟丙基淀粉酶(Reppal PEG)体系经两步法可从黄豆中分离磷酸甘油酸激酶(PGK)和磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)。在黄豆匀浆中加入PEG4000，可絮凝细胞碎片及大部分杂蛋白。在上清液中加入PEG4000(12%)-ReppalPES(40%)，PGK在上相、GAPGH在下相的收率均在80%以上。萃取过程的放大采用离心倾析机连续处理匀浆液，用离心萃取器完成双水相体系的两相分离，整个工艺具有处理量大、接触时间短、酶收率高的特点。用PEG/(NH4)2SO4双水相体系，经一次萃取从A-淀粉酶发酵液中分离提取α-淀粉酶和蛋白酶，萃取最适宜条件为PEG1000(15%)-(NH4)2SO4(20%)，pH=8，α-淀粉酶收率为90%，分配系数为19.6，蛋白酶的分离系数高达15.1。比活率为原发酵液的1.5倍，蛋白酶在水相中的收率高于60%。通过向萃取相(上相)中加进适当浓度的(NH4)2SO4可达到反萃取。实验结果表明，随着(NH4)2SO4浓度的增加，双水相体系两相间固体物析出量也增加。固体沉淀物既可干燥后生产工业级酶制剂，也可将固体物加水溶解后用有机溶剂沉淀法制造食品级酶制剂.

Harris用双水相体系从羊奶中纯化蛋白，研究了牛血清清蛋白(OSA)、牛酪蛋白、β-乳球蛋白在PEG/磷酸盐体系中的分配以及PEG相对分子质量、pH值和盐的加入对3种蛋白分配的影响。实验结果表明。增加NaCl浓度，可提高分配系数，最佳pH为5。对OSA和牛酪蛋白，可得到更高的分配系数。在含有疏水基葡聚糖中，蛋白质和类囊体薄膜泡囊的分配研究表明，苯甲酰基葡聚糖和戊酰基葡聚糖具有疏水性。疏水基影响氨基酸、蛋白质和薄膜泡囊在双水相体系中的分配，在只有磷酸盐缓冲溶液的PEG8000/葡聚糖双水相体系中，大部分β-半乳糖苷酶被分配在上相，但在下相中加入少量的苯甲酰基葡聚糖(取代程度为0.054)或戊酰基葡聚糖(取代程度为0.12)时，β-半乳糖苷酶的分配系数就降低了100倍。在对牛血清清蛋白、溶菌酶、脂肪酶和β-乳球蛋白的分配进行的观察中发现具有相似的现象。类囊体薄膜泡囊的分配受疏水基的影响特别大，薄膜泡囊被分配在含有疏水基的一相中。在含有N，N-二甲基甲酰胺的聚合物双水相中，利用逆流分配可对玉米醇溶蛋白进行分级分离。Miyuki在PEG/K3PO4双水相体系中用两步法对葡糖淀粉酶进行了萃取纯化。用第一步萃取后含有酶的下相和PEG组成双水相作为第二步萃取体系，称作两步法。葡糖淀粉酶的最佳分配条件是PEG4000(第一步)、PEG1500(第二步)，pH=7，纯化系数提高了3倍。

液- 液萃取技术是化学工业中普遍采用的分离技术之一,在生物化工中也有广泛的应用。然而,大部分生物物质是有生物活性的,需要在低温或室温条件下进行分离纯化,而采用传统萃取技术无法完成。双水相萃取就是考虑到这种现状,基于液- 液萃取理论并考虑保持生物活性所开发的一种新型液- 液萃取分离技术。

与传统的液- 液分离方法相比,双水相萃取技术分离纯化蛋白质具有以下优势:体系含水量高,可达80 %以上;蛋白质在其中不易变性;界面张力远远低于水- 有机溶剂两相体系的界面张力,有助于强化相际间的质量传递;分相时间短,一般只需5～15 min ;易于放大和进行连续性操作;萃取环境温和,生物相容性高;聚合物对

蛋白质的结构有稳定和保护作用等。正是由于双水相萃取技术的诸多优势,现已被广泛用于蛋白质、核酸、氨基酸、多肽、细胞器等产品的分离和纯化。

1 双水相萃取原理

双水相体系是指某些高聚物之间或高聚物与无机盐之间,在水中以适当的浓度溶解后形成的互不相溶的两相或多相水相体系。高聚物- 高聚物- 水体系主要依靠高聚物之间的不容性,即高聚物分子的空间阻碍作用,促使其分相;高聚物- 盐- 水体系一般认为是盐析作用的结果。

双水相萃取与水- 有机相萃取的原理相似,都是依据物质在两相间的选择性分配,不同之处在于萃取体系的性质差异。当生物物质进入双水相体系后,由于表面性质、电荷作用和各种力(如憎水键、氢键和离子键等) 的存在和环境的影响,使其在上、下相中的浓度不同。分配系数K 等于两相中生物物质的浓度比,由于蛋白质的K 值不相同(大致在011～10 之间) ,因而双水相体系对各类蛋白质的分配具有较好的选择性。[/size]

1.2.1双水相体系简介（Aqueous two phase extraction, ATPE）

早在1896年,Beijerinck发现,当明胶与琼脂或明胶与可溶性淀粉溶液相混时,得到一个混浊不透明的溶液，随之分为两相,上相富含明胶,下相富含琼脂(或淀粉), 这种现象被称为聚合物的不相溶性（incompatibility），从而产生了双水相体系(Aqueous two phase system,ATPS)。双水相体系的形成主要是由于高聚物之间的不相溶性，即高聚物分子的空间阻碍作用，相互无法渗透，不能形成均一相，从而具有分离倾向，在一定条件下即可分为二相。一般认为只要两聚合物水溶液的憎水程度有所差异，混合时就可发生相分离，且憎水程度相差越大，相分离的倾向也就越大。可形成双水相体系的聚合物有很多，典型的聚合物双水相体系有聚乙二醇(polyethylene glycol，略作PEG)/葡聚糖(dextran),聚丙二醇(polypropylene glycol)/聚乙二醇和甲基纤维素(methylcellulose)/葡聚糖等。另一类双水相体系是由聚合物/盐构成的。此类双水相体系一般采用聚乙二醇(polyethylene glycol)作为其中一相成相物质，而盐相则多采用硫酸盐或者磷酸盐。

1.2.2萃取原理

双水相萃取与水-有机相萃取的原理相似,都是依据物质在两相间的选择性分配。当萃取体系的性质不同时,物质进入双水相体系后,由于表面性质、电荷作用和各种力(如憎水键、氢键和离子键等) 的存在和环境因素的影响,使其在上、下相中的浓度不同。物质在双水相体系中分配系数K可用下式表示：

K= C上/ C下

其中K为分配系数，C上和C下分别为被分离物质在上、下相的浓度。

分配系数K等于物质在两相的浓度比,由于各种物质的K值不同,可利用双水相萃取体系对物质进行分离。其分配情况服从分配定律，即，“在一定温度一定压强下，如果一个物质溶解在两个同时存在的互不相溶的液体里，达到平衡后，该物质在两相中浓度比等于常数”，分离效果由分配系数来表征。

由于溶质在双水相系统两相间的分配时至少有四类物质在两个不同相系统共存，要分配的物质和各相组分之间的相互作用是个复杂的现象，它涉及到氢键、电荷相互作用、范德华力、疏水性相互作用以及空间效应等，因此，可以预料到溶质在双水相系统中两相间的分配取决于许多因素，它既与构成双水相系统组成化合物的分子量和化学特性有关，也与要分配物质的大小、化学特性和生物特性相关。

大量研究表明，生物分子在双水相系统中的实际分配是生物分子与双水相系统间静电作用、疏水作用、生物亲和作用等共同作用的结果，形式上可以将分配系数的对数值分解为几项: InK = InKm+InKe+In Kh+InKb+InKs+InKc

式中，Ke-----静电作用对溶质分配系数的贡献；

Kh----- 疏水作用对溶质分配系数的贡献；

Kb-----生物亲和作用对溶质分配系数的贡献；

Ks----- 分子大小对溶质分配系数的贡献；

Kc----- 分子构型影响对溶质分配系数的贡献；

Km -----除上述因素外的其它因素影响对溶质分配系数的贡献。

值得指出的是，这些因素中虽然没有一个因素完全独立于其它因素，但一般来说，这些不同的因素或多或少是独立存在的。

影响待分离物质在双水相体系中分配行为的主要参数有成相聚合物的种类、成相聚合物的分子质量和总浓度、无机盐的种类和浓度、pH 值、温度等。

1.2.3双水相的优势

ATPE作为一种新型的分离技术，对生物物质、天然产物、抗生素等的提取、纯化表现出以下优势：

(1)含水量高(70％--90％)，在接近生理环境的体系中进行萃取，不会引起生物活性物质失活或变性；

(2)可以直接从含有菌体的发酵液和培养液中提取所需的蛋白质（或者酶），还能不经过破碎直接提取细胞内酶，省略了破碎或过滤等步骤；

(3)分相时间短，自然分相时间一般为5min～15 min；

(4)界面张力小(10-7～10-4mN／m)，有助于两相之间的质量传递，界面与试管壁形成的接触角几乎是直角；

(5)不存在有机溶剂残留问题，高聚物一般是不挥发物质，对人体无害；

(6)大量杂质可与固体物质一同除去；

(7)易于工艺放大和连续操作，与后续提纯工序可直接相连接，无需进行特殊处理；

(8)操作条件温和，整个操作过程在常温常压下进行；

(9)亲和双水相萃取技术可以提高分配系数和萃取的选择性。

虽然该技术在应用方面已经取得了很大的进展，但几乎都是建立在实验的基础上，到目前为止还没能完全清楚地从理论上解释双水相系统的形成机理以及生物分子在系统中的分配机理。

现代生物分离技术在多肽蛋白质分离纯化中的应用

点击次数：408 发布时间：2010-5-24 8:31:47

摘要：蛋白质是生物体的重要组成部分，在现代生物制药领域有着重要的作用，本文介绍了现代生物分离技术反胶束萃取、双水相萃取和电泳在多肽蛋白质分离中的应用和现状。

关键词：蛋白质反胶束萃取双水相萃取电泳

一、前言

随着基因工程和细胞工程的发展，尽管传统的分离方法(如溶剂萃取技术)已在抗生素等物质的生产中广泛应用，并显示出优良的分离性能，但它难以提取和分离蛋白质。其主要原因有两个：被分离对象—蛋白质等在40~500C便不稳定，开始变性，而且绝大多数蛋白质都不溶于有机溶剂，若使蛋白质与有机溶剂接触，也会引起蛋白质的变性；

萃取剂问题—蛋白质分子表面带有许多电荷，普通的离子缔合型萃取剂很难奏效。

新兴的生物分离技术反胶束萃取、双水相萃取和电泳在蛋白质的分离纯化方面显示出了自身的优势，并展现出了广阔的前景。

二、反胶束萃取

2.1 反胶束萃取技术及其萃取蛋白质的机理

2.1.1 反胶束及其萃取原理

反胶束(reversed micelle)是双亲物质在非极性有机溶剂中自发聚集体，又称为反胶团、逆胶束

(inverse micelle)。双亲物质的这种胶团化过程的自由能变化主要来源于双亲分子之间偶极子－偶极子相互作用，除此之外，平动能和转动能的丢失以及氢键或金属配位键的形成等都可能参与这种胶团化过程。

在反胶束内部，双亲分子极性头基相互聚集形成一个“极性核”，可以增溶水、蛋白质等极性物质，增溶了大量水的反胶束体系即为微乳液(microemulsion)。水在反胶束中以两种形式存在：自由水(free water)和结合水(bound water)，后者由于受到双亲分子极性头基的束缚，具有与主体水(普通水)不同的物化性质，如粘度增大，介电常数减小，氢键形成的空间网络结构遭到破坏等。

对于增溶了物质(如水，蛋白质等)的反胶束基本上都认为是单层双亲分子聚集的近似球体，并忽视胶束之间的相互作用。事实上，反胶束体系处于不停的运动状态，反胶束之间的碰撞频率为109~1011次/s，而且反胶束中的增溶物在频繁的交换。

2.1.2反胶束萃取蛋白质的机理

蛋白质溶解于小水池中(正萃，或称萃取)，其周围有一层水膜及表面活性剂极性头的保护，使其避免与有机溶剂接触而失活。改变pH、盐浓度等条件蛋白质又可回到水相(反萃)，实现了蛋白

质的萃取分离、纯化目的。反胶团萃取蛋白质的机理目前尚不十分清楚。一般认为，萃取过程是静电力、疏水力、空间力、亲和力或几种力协同作用的结果，其中蛋白质与表面活性剂极性头间的静电相互作用是主要推动力。根据所用表面活性剂类型，通过控制水相pH高于或低于蛋白质的等电点(pI)，达到正萃反萃的目的。

2.2 反胶束萃取蛋白质的应用

2.2.1 同时提取蛋白质和油脂：陈复生等在AO-异辛烷反胶束同时萃取花生蛋白和花生油的过程，采用正交试验分析讨论了影响萃取的主要因素得到了最佳萃取工业条件。萃取后，油进入有机相而蛋白质溶入反胶束中。克服了传统方法工艺复杂，得率低，蛋白质容易变性的缺点。同时用蒸馏方法将油和烃分开，提炼出了油脂。

2.2.2 分离蛋白质混合物：Chang在Aliquat336/异辛烷反胶束分离枯草杆菌中两种酶——淀粉酶和中性蛋白酶时，通过加入助表面活性剂丁醇，有效地分离了这两种不同等电点的酶。

2.2.3 从发酵液中分离和提纯酶：Krishnakant用AOT/异辛烷体系从土豆发酵液中提取酸性磷酸酶，在pH值810，萃取水相与有机相体积比为3：1，反萃水相与有机相体积比为1：1时得到最大活性的酸性磷酸酶。Sun在CB-卵磷脂亲和反胶束中加入Tween85，直接从鸡蛋清中提取了溶

菌酶。而该反胶束系统还可以回收后反复使用。

三、双水相萃取

3.1 双水相萃取的原理及特点

3.1.1 双水相萃取的原理

双水相萃取与水-有机相萃取的原理相似，都是依据物质在两相间的选择性分配，但萃取体系的

性质不同。当物质进入双水相体系后，由于表面性质、电荷作用和各种力(如憎水键、氢键和离子键等)的存在和环境因素的影响，使其在上、下相中的浓度不同。分配系数K等于物质在两相的浓度比，由于各种物质的K值不同，可利用双水相萃取体系对物质进行分离。

3.1.2 双水相萃取的特点

双水相体系萃取具有如下特点：(1)含水量高(70%~90%)，是在接近生理环境的温度和体系中进行萃取，不会引起生物活性物质失活或变性；(2)分相时间短，自然分相时间一般为5~15min；(3)界面张力小(10-7~10-4mN/m)，有助于强化相际间的质量传递；(4)不存在有机溶剂残留问题；(5)大量杂质能与所有固体物质一同除去，使分离过程更经济；(6)易于工程放大和连续操作。由于双水相萃取具有上述优点，因此，被广泛用于生物化学、细胞生物学和生物化工等领域的产品分离和提取。

3.2 双水相萃取在分离和提取各种蛋白质(酶)上的应用

用聚乙二醇(PEG)/羟丙基淀粉酶(Reppal PEG)体系经两步法可从黄豆中分离磷酸甘油酸激酶(PGK)和磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)。在黄豆匀浆中加入PEG4000，可絮凝细胞碎片及大部分杂蛋白。在上清液中加入PEG4000(12%)-ReppalPES(40%)，PGK在上相、GAPGH在下相的收率均在80%以上。萃取过程的放大采用离心倾析机连续处理匀浆液，用离心萃取器完成双水相体系的两相分离，整个工艺具有处理量大、接触时间短、酶收率高的特点。用PEG/(NH4)2SO4双水相体系，经一次萃取从A-淀粉酶发酵液中分离提取α-淀粉酶和蛋白酶，萃取最适宜条件为

PEG1000(15%)-(NH4)2SO4(20%)，pH=8，α-淀粉酶收率为90%，分配系数为19.6，蛋白酶的分离系数高达15.1。比活率为原发酵液的1.5倍，蛋白酶在水相中的收率高于60%。通过向萃取相(上相)中加进适当浓度的(NH4)2SO4可达到反萃取。实验结果表明，随着(NH4)2SO4浓度的增加，双水相体系两相间固体物析出量也增加。固体沉淀物既可干燥后生产工业级酶制剂，也可将固体物加水溶解后用有机溶剂沉淀法制造食品级酶制剂.

Harris用双水相体系从羊奶中纯化蛋白，研究了牛血清清蛋白(OSA)、牛酪蛋白、β-乳球蛋白

在PEG/磷酸盐体系中的分配以及PEG相对分子质量、pH值和盐的加入对3种蛋白分配的影响。实验结果表明。增加NaCl浓度，可提高分配系数，最佳pH为5。对OSA和牛酪蛋白，可得到更高的分配系数。在含有疏水基葡聚糖中，蛋白质和类囊体薄膜泡囊的分配研究表明，苯甲酰基葡聚糖和戊酰基葡聚糖具有疏水性。疏水基影响氨基酸、蛋白质和薄膜泡囊在双水相体系中的分配，在只有磷酸盐缓冲溶液的PEG8000/葡聚糖双水相体系中，大部分β-半乳糖苷酶被分配在上相，但在下相中加入少量的苯甲酰基葡聚糖(取代程度为0.054)或戊酰基葡聚糖(取代程度为0.12)时，β-半乳糖苷酶的分配系数就降低了100倍。在对牛血清清蛋白、溶菌酶、脂肪酶和β-乳

球蛋白的分配进行的观察中发现具有相似的现象。类囊体薄膜泡囊的分配受疏水基的影响特别大，薄膜泡囊被分配在含有疏水基的一相中。在含有N，N-二甲基甲酰胺的聚合物双水相中，利用逆流分配可对玉米醇溶蛋白进行分级分离。Miyuki在PEG/K3PO4双水相体系中用两步法对葡糖淀

粉酶进行了萃取纯化。用第一步萃取后含有酶的下相和PEG组成双水相作为第二步萃取体系，称作两步法。葡糖淀粉酶的最佳分配条件是PEG4000(第一步)、PEG1500(第二步)，pH=7，纯化系数提高了3倍。

四、电泳

4.1 电泳的定义原理及优点

在电场作用下，带电颗粒在溶液中的运动称为电泳，在小离子的情况下，称为离子导电性现象。这是一种不完全的电解现象，所需的产物不是直接释放在电极上，而是使它们不同的运动同步受阻在两电极间的中间位置上。它能分离非常类似的物质，包括不同的蛋白质，提高了分折和制备的效果，特别是在纸上和在聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶上区带电泳的采用。

电泳是分离生化物质的一种有效的和多功能的方法。在电场的作用下，电泳流动性的差别，可用于许多物质的分离，其中包括离子、胶体、细胞物质、细胞器以及全细胞。以前电泳仅用于常规的生化分析，但近期在制备电泳上取得了许多重大的进展(如低容积高价值的化合物或试剂的生产中)。

电泳分离的优点是分辨率高和能保持产物的生物活性。

4.2 毛细管电泳(CE)

毛细管电泳是一类以毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力的新型液相分离技术。毛细管电泳具有多种分离模式：毛细管区带电泳(CZE)、毛细管等速电泳(CITP)、毛细管等电聚焦(CIEF)等。应用毛细管电泳分离多肽类物质具有柱效高、分析时间短、所用样品量和试剂少等优点。黄志东等使用MECC在8min分离了7种肽类物质。

与高效液相色谱相比，CE的制备总量低，只适用于微量制备；对扩散系数小的生物大分子而言，CE比HPLC的分辨率高得多，因此CE被用来作为收集非常纯的单一馏分的微量制备手段。

4.3 二维凝胶电泳技术(two－dimensional del electrophoresis，2-DE)

2-DE是1975年由O’Farrell首次建立的，其基本原理是根据蛋白质具有不同等电点和相对分子质量的二个一级特性，将蛋白质的混合物在等电聚焦电泳(isoelectric focusing，IEF)中进行第一维的分离，然后转入十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行第二维分离，分离胶经显色后，通过商业化的计算机软件对凝胶图像进行分析处理。

经典的22DE采用载体两性电解质(carrier ampholyte CA)进行等电聚焦，这种方法重复性差、pH梯度不稳定，因此，限制了2－DE的广泛应用。1988年，固相化pH梯度胶条(immobilized PH gradients， IPGs)技术的建立，克服了CA的缺点。IPGs技术的应用为各实验室间的交流、蛋白质图谱及蛋白质数据库的建立奠定了基础。

生物体内的蛋白质除数量多之外，还具有不同的丰度、相对分子质量、酸碱度以及可溶性、疏水性的不同，因此2－DE的一次分离不能完全呈现所有的蛋白质，尤其对于组织和细胞内低丰度蛋白质、极酸和极碱性区蛋白质、高分子质量区蛋白以及膜蛋白等。针对以上缺点，研究者对2－

DE进行了许多改进，如采用窄范围的pH胶条(2～3pH单位和1pH单位)、预分离技术、预分离技术与窄范围pH胶条的联合应用等。这些技术的应用改善了2－DE的分辨率，提高了低丰度蛋白质和膜蛋白的检出率。

二维差异凝胶电泳(two2－dimensional difference gel electrophoresis，2D-DIGE)是二维电泳技术的另一个突破.该技术应用两种不同的荧光染料Cy3和Cy5，分别标记不同的蛋白质样品，然后将两种样品等量混合，在同一2-DE中分离.通过在同一块胶上对比一个蛋白点处两种不同荧光的强度，比较两种状态下特定蛋白质丰度变化、蛋白质的缺失或是否有新蛋白质的出现等。DIGE 克服了二维电泳过程中不同凝胶间重复性差的问题；同时可以在同一块胶上更精确直观地观察两种样品蛋白质的差异表达并对其定量。

五、结论

随着生物分离技术的发展、新的生物分离技术的不断出现，为蛋白质的分离提供了许多新的方法和途径。但其中仍然有许多问题，如成本过高，分离量少，难以实现工业化等。还需要我们不懈努力改进。

双水相萃取法

双水相萃取法的应用及研究进展 摘要:双水相萃取技术作为一项新的分离技术日益受到重视，它与传统的萃取及其它分离技 术相比具有操作条件温和、处理、量大、易于连续操作等优点，从而使其能广泛应用于生物分离工程中。本文介绍了双水相的形成、双水相萃取技术的基本原理以及影响物质分配系数的因素。同时对双水相萃取技术的研究进展及其应用进行了综述。 关键词：双水相萃取分离纯化进展 一：方法 随着基因工程、蛋白质工程、细胞培养工程、代谢工程等高新技术研究工作的广泛开展，各种高附加值的生化新产品不断涌现，对生化分离技术也提出了越来越高的要求。包括精馏、吸收、萃取、蒸发、结晶在内传统的分离技术有三大特点:分离过程伴随有相的变化;筛分过程不能实现分子级别的分离;精制过程成本极高，这些特征对于节约能源、生物分离、环境 保护、资源开发、替代能源、高纯材料等当代化学工程与科学技术发展不相适应。围绕以上几个问题的讨论就构成了分离技术研究与发展的主流，即新型分离技术产生的背景。双水相萃取技术始于20世纪60年代，从1956年瑞典伦德大学Albertsson发现双水相体系[2]到1979年德国GBF的Kula等人将双水相萃取分离技术应用于生物产品分离，虽然只有20多年的历史，但由于其条件温和，容易放大，可连续操作，目前，已成功的应用于蛋白质、核酸和病毒等生物产品的分离和纯化，双水相体系也已被成功的应用到生物转化及生物分析中。 双水相现象是当两种聚合物或一种聚合物与一种盐溶于同一溶剂时，由于聚合物之间或聚合物与盐之间的不相溶性，使得聚合物或无机盐浓度达到一定值时，就会分成不相溶的两相，因使用的溶剂是水，因此称为双水相原则上，无论是天然的还是合成的亲水聚合物，绝大多数在与另一种聚合物水溶液混合时都可分成两相，构成双水相体系。 双水相萃取与水一有机相萃取的原理相似，都是依据物质在两相间的选择性分配，但萃取体系的性质不同。当物质进入双水相体系后，由于表面性质、电荷作用和各种力(如憎水键、氢键和离子键等)的存在和环境的影响，使其在上、下相中的浓度不同。对于某一 物质，只要选择合适的双水相体系，控制一定的条件，就可以得到合适的分配系数，从而达到分离纯化之目的。 二：讨论 双水相萃取是一项可以利用不复杂的设备，并在温和条件下进行简单的操作就可获得较高收率和有效成分的新型分离技术。因此，广泛应用于生物化学、细胞生物学和生物化工等领域。然而有关双水相分配的基础研究还不够，工业化的一些关键问题还没有解决。为此，有必要加强这方面的基础研究，解决大规模萃取生物活性物质的工艺条件和设备方面的问题，促进双水相萃取技术的不断发展。 影响双水相萃取的因素比较复杂，主要包括静电作用、疏水作用和界面张力等。通过对各个因素的调节，可以极大地提高蛋白质的选择性，达到向一相富集的目的。A 1}'帅的组分性质千差万别，从晶体到无定形聚合物、从非极性到极性、从电解质到非电解质、从无扫L 小分子到有扫L高分子甚至生物大分子，这些都不可避免地造成理论计算的复杂性，以至 于现在还没有一套比较完善的理论来衡量各个影响因素之问的关系和解释生物大分子在体 系中的分配扫L理.有关A丁PS分配模型的研究中，较为成功的有的渗透维里模型，以及晶格模型。前者在预测聚合物的成相行为和蛋白质的分配上有较高的准确度;后者在粒子的能

双水相体系萃取(精)

双水相萃取技术 早在1896年,Beijerinck发现,当明胶与琼脂或明胶与可溶性淀粉溶液相混时,得到一个混浊不透明的溶液,随之分为两相,上相富含明胶,下相富含琼脂(或淀粉,这种现象被称为聚合物的不相溶性(incompatibility,从而产生了双水相体系(Aqueous two phase system,ATPS。 传统的双水相体系是指双高聚物双水相体系,其成相机理是由于高聚物分子的空间阻碍作用,相互无法渗透,不能形成均一相,从而具有分离倾向,在一定条件下即可分为二相。一般认为只要两聚合物水溶液的憎水程度有所差异,混合时就可发生相分离,且憎水程度相差越大,相分离的倾向也就越大。可形成双水相体系的聚合物有很多,典型的聚合物双水相体系有聚乙二醇(polyethylene glycol,略作PEG/葡聚糖(dextran,聚丙二醇(polypropylene glycol/聚乙二醇和甲基纤维素(methylcellulose/葡聚糖等。另一类双水相体系是由聚合物/盐构成的。此类双水相体系一般采用聚乙二醇(polyethylene glycol作为其中一相成相物质,而盐相则多采用硫酸盐或者磷酸盐。 萃取原理 双水相萃取与水-有机相萃取的原理相似,都是依据物质在两相间的选择性分配。当萃取体系的性质不同时,物质进入双水相体系后,由于表面性质、电荷作用和各种力(如憎水键、氢键和离子键等的存在和环境因素的影响,使其在上、下相中的浓度不同。物质在双水相体系中分配系数K可用下式表示: K= C上/ C下 其中K为分配系数,C上和C下分别为被分离物质在上、下相的浓度。 分配系数K等于物质在两相的浓度比,由于各种物质的K值不同,可利用双水相萃取体系对物质进行分离。其分配情况服从分配定律,即,“在一定温度一定压强下,如果一个物质溶解在两个同时存在的互不相溶的液体里,达到平衡后,该物质在两相中浓度比等于常数”,分离效果由分配系数来表征。

双水相萃取技术及应用

《生物资源开发与利用专题》 双水相萃取技术及应用 152310018 杨云梅 双水相萃取（Aqueous two phase extraction，英文缩写ATPE）是利用物质在互不相容的两水相间分配系数的差异来进行萃取的方法。如：葡聚糖（dextran）与聚乙二醇（PEG)按一定比例与水混合，溶液混浊，静置平衡后,分成互不相溶的两相，上相富含PEG,下相富含葡聚糖。当两种聚合物或一种聚合物与一种盐溶于同一溶剂时，由于聚合物之间或聚合物与盐之间的不相容性，当聚合物或无机盐浓度达到一定值时，就会分成不互溶的两相。因使用的溶剂是水，因此称为双水相，在这两相中水分都占很大比例(85％一95％),活性蛋白或细胞在这种环境中不会失活，但可以不同比例分配于两相,这就克服了有机溶剂萃取中蛋白容易失活和强亲水性蛋白难溶于有机溶剂的缺点。 双水相萃取的优点： 1、操作条件温和，在常温常压下进行；不会引起生物活性物质的失活或变性。 2、两相的界面张力小，萃取时两相能高度分散,传质速度快。 3、排除了使用有毒、易燃的有机溶剂，能够提供温和的水环境，避免被萃取成分的脱水变性。 4、溶质对目标组分选择性强，大量杂质能与所有固形物一同除去，使分离操作 5、过程简化，易于连续操作，处理量大，适合工业应用。 缺点：系统易乳化，成相聚合物的成本较高，水溶性高聚物大多数粘度较大，不易定量控制，高聚物回收困难。 一：双水相萃取技术的发展趋势 目前，分离生物物质经常采用的双水相系统主要有2类：非离子型聚合物/ 水系统（最常用的为聚乙二醇/葡聚糖）和非离子型聚合物/无机盐/水系统（常用的如聚乙二醇/盐体系）原因在于此2类双水相系统采用的是无毒性的聚合物，且其多元醇、多元糖结构能够保证生物大分子的稳定性但在实际应用中，2类双水相系统各有弊端，非离子型聚合物/水系统能够保证生物活性物质的活性,且界面吸附少，但所用聚合物材料如葡聚糖成本较大，且体系黏度大，制约大规模的工业生产过程；相对于前者，非离子型聚合物/无机盐/水系统成本低，体系黏度小，但该系统会导致某些敏感生物活性物质失活，此外还会产生大量的高浓度盐废水。因此，寻求新型双水相体系成为日后的主要研究方向。目前，新型双水相体系的开发主要有廉价的双水相系统及其他新型功能双水相系统。

双水相萃取技术

双水相萃取技术 D09生物张燊睿092203112 内容提要:本文主要叙述双水相萃取技术的概念，原理，操作，未来发展方向以及在生物、食品工业中的应用。 Abstract:This paper mainly describes the two aqueous phase extraction technology concept, principle, operation, the future development direction as well as in the biological, food industry application 关键词：萃取、分离、双水相体系、提取、生物分离、未来发展、亲和作用。 引言：随着基因工程、蛋白质工程、细胞培养工程、、代谢工程等高新技术研究工作的广泛的开展，各种高附加值得食品生化新产品不断涌现，对食品、生化等分离技术提出了越来越高的要求。包括精馏、吸取、萃取、蒸发、结晶在内传统的分离技术的三大特点：分离过程伴随有相的变化；筛分过程不能实现分子级别的分离；精制过程成本极高，这些特征对于节约能源、生物分离、环境保护、资源开发、替代能源、高纯材料等当代化学工程与科学技术不相适应。围绕以上几个问题的讨论就构成了分离技术研究与发展的主流，即新型分离技术产生的背景。 双水相系统：基因工程产品如蛋白质和酶往往是胞内产品，需经细胞破碎后才能提取、纯化，细胞颗粒尺寸的变化给固－液分离带来了困难，同时这类产品的活性和功能对pH值、温度和离子强度等环境因素特别敏感。由于它们在有机溶剂中的溶解度低并且会变性，因此传统的溶剂萃取法并不适合。采用在有机相中添加表面活性剂产生反胶束的办法可克服这些问题，但同样存在相的分离问题。当两种聚合物、一种聚合物与一种亲液盐或是两种盐（一种是离散盐且另一种是亲液盐）在适当的浓度或是在一个特定的温度下相混合在一起时就形成的。 例如用聚乙二醇（PEG Mr为6000）/磷酸钾系统从大肠杆菌匀浆中提取β-半乳糖苷酶。这是一个很有前途的新的分离方法，特别适用于生物工程得出的产品的分离。 一．双水相萃取原理： 双水相萃取技术又称水溶液两相分配技术（partition of two aqueoue phase system）近年来发现的、引人注目的、极有前途的新型分离技术。早在1896年，荷兰微生物学家Beijerinck[1]发现，把明胶与琼脂或明胶与可溶性淀粉溶液混合时得到一种不透明的混合溶液，静止后风味两相，上相含大部分水，下相含大部分琼脂，而两相的主要成分都是水，人们把这种现象称为聚合物的不相溶性，由此产生了双水相萃取。1955年，瑞典伦德大学的Albertsson[2]首次利用双水相技术从单细胞藻类中分离淀粉核，从此开创了双水相分配技术。1979年德国GBF 的Kula和Kroner等[3]水相体系用于提取酶和蛋白质，使胞内酶提取过程大为改善。几十年来，国内外的研究者们已经就双水相分配技术的各个方面展开了系统的研究，包括新型双水相体统的开发，成相机理研究、系统物性的测定、热力学性质的研究生物大分子及小分子活性物质的分配、萃取工艺流程的设计、工业化大生产中的应用以及聚合物的回收等等，并取得很大进展。 双水相萃取的聚合物不相容性：根据热力学第二定律，混合是熵增过程可以自发进行，但分子间存在相互作用力，这种分子间作用力随相对分子质量增大而增大。当两种高分子聚合物之间存在相互排斥作用时，由于相对分子质量较大

双水相萃取实验

一、双水相系统的相图绘制 1.实验目的 了解制作双水相系统的相图的方法，加深对相图的认识。 2.实验原理 相图是研究两水相萃取的基础，双水相形成条件和定量关系常用相图来表示。图1是典型的高聚物-高聚物-水双水相体系的直角坐标相图，两种聚合物A、B以适当比例溶于水就会分别形成有不同组成、度的两相，上相组成用T点表示，下相组成用B点表示，由图1可知上下相所含高聚物有所偏重，上相主要含B，下相主要含A。曲线TCB称为结线，直线TMB称为系线。结线上方是两相区，下方为单相区，若配比取在曲线上，则混合后，溶液恰好从澄清变为混浊。组成在系线上的点，分为两相后，其上下相组成分别为T和B，T、B量的多少服从相图的杠杆定律。即T和B相质量之比等于系线上MB与MT的线段长度之比。又由于两相密度相差很小，故上下相体积之比也近似等于系线上MB与MT线段长度之比。 图1 A-B-水双水相体系相图 O aqueous two-phase system Figure 1 The phase diagram of the A-B-H 2 3.实验器材和试剂 （1）器材：电子台秤，漩涡混合器，大试管，滴定管，密度计，温度计。（2）试剂：聚乙二醇，硫酸铵，硫酸镁。 4.操作方法 （1）溶液的配制 配制40%的盐（硫酸铵或硫酸镁）溶液 配制40%的聚乙二醇溶液，液体聚乙二醇可用纯溶液。 （2）相图的制作

精确称取一定质量（0.7000g 左右）PEG 溶液于大试管中，按表1所列第1列数据，加入0.5mL 去离子水，用滴定管缓慢滴加已配好的40%的盐溶液，并不断在漩涡混合器上混合，观察溶液的澄清程度，直至试管内液体出现浑浊为止。记录盐溶液的加量(g)。然后，按表格所列第2列数据加入水，溶液澄清，继续向试管中滴加盐溶液并不断混匀，直至再次达到浑浊，如此反复操作。计算每次达到浑浊时，PEG 和盐在系统总量中的质量分数，将实验数据填入表中，以PEG 的质量分数为纵坐标，某种盐的质量分数为横坐标作图，即得到一条双节线的相图。 表1相图制作表 编 号 水 /g (NH 4)2SO 4溶液加量/g 纯(NH 4)2SO 4累计量/g 溶液累计总量/g (NH 4)2SO 4质量分 数/% PEG 质量分数/% 1 0.5 3.1315 0.895 4.3786 20.4 4.79 2 0.3 2.1792 1.5186 5.9511 21.85 3.02 3 0.3 2.0456 2.1 9.2867 22.65 2.26 4 0.3 3.1372 3.0 12.6738 23.68 1.65 5 0.5 6.0769 4.7 19.3276 24.52 1.08 6 0.5 6.1909 6.5 26.0138 25.02 0.8 7 0.5 6.8585 8.5 33.4596 25.32 0.62 根据以上数据以(NH 4)2SO 4质量分数为横坐标，以PEG 质量分数为纵坐标即可做出相图。 二、双水相系统比例的选择 根据相图，选择五个成相比例。 三、蛋白酶酶活标准曲线的绘制—— Folin 酚法或紫外分光光度法 PEG4000与MgSO4双水相图 y = 0.0995x 2 - 5.3887x + 73.334 2012345 6 20 21 22 2324 25 26 MgSO4% P E G 4000%

双水相萃取和超临界萃取的方法与特点

双水相萃取和超临界萃取的方法与特点 专业生物工程092 课程酶工程 老师王明力 学生吴志洪 学号 0908110342 2012年12月25日

双水相萃取和超临界萃取的方法与特点 摘要：双水相萃取技术是一种高效温和的新分离技术，它与传统的萃取及其它分离技术相比具有操作条件温和、处理量大、易于连续操作等优点，从而使其能广泛应用于生物分离工程中。同时文章简要介绍了超临界流体萃取的基本原理和特点及其应用，其中超临界CO2萃取是最常用的.随着研究的深入和认识的加强，超临界流体技术作为一项可持续的绿色工艺，将具有广泛的应用前景。 关键词：双水相萃取超临界流体萃取 Abstract: Phasepartitioning technology is a kind of high efficient mild new separation technique ，and the traditional extraction and other separation technology compared with mild conditions, large quantity of operation, easy for operation, which makes its advantages such as extensively applied in biological separation engineering.And his article introduces the basic principle of supercritical fluid extraction and it,s application ,The supercritical CO2extraction is the most commonly used.With the deepening of research and understanding of the strengthen, supercritical fluid technology as a sustainable green technology, has a broad prospect of application.

双水相萃取研究(论文)

双水相萃取技术 姓名：小行星学号： 20128888专业：化工工艺 摘要：双水相萃取是一种新型的萃取分离技术，本文介绍了双水相体系的形成 及特点，重点介绍了双水相萃取技术的应用和双水相萃取的主要设备， 对双水相萃取技术应用前景及展望 关键字：双水相萃取分离技术应用展望 1、引言 溶剂萃取法是分离技术中最重要的方法之一。传统的溶剂萃取分离是依据被分离物质在两个互不相溶液相中的溶解性不同而达到分离目的。一般的萃取体系包括有机相和水相两部分,迄今为止,已有若干种分类方法。随着近年来分离技术在生命科学、天然药物提纯及各类抗生素药物等方面应用的迅速发展,新型的萃取技术应运而生。例如对于生物物质来说,分离的对象复杂,既包括可溶物,如蛋白质和核酸,也包括悬浮的小颗粒,如细胞器和整个细胞;由于生物物质极易变性和失活,传统的有机相和水相的两相萃取不能解决生物物质失活等问题，给分离带来很大的难度，而双水相萃取技术能够很好的解决这一难题。 双水相萃取(Aqueoustwo-phase extraction, ATPE)[1]是两种水溶性不同的聚合物或者一种聚合物和无机盐的混合溶液,在一定的浓度下,体系就会自然分成互不相容的两相，被分离物质进入双水相体系后由于表面性质、电荷间作用和各种作用力(如憎水键、氢键和离子键)等因素的影响,在两相间的分配系数K不同,导致其在上下相的浓度不同,达到分离目的，这种现象在1896年被 B eijerinck首次发现,随后双水相萃取技术作为一种新型的分离技术日益受到重视,与传统的萃取及其他分离技术相比具有操作条件温和、处理量大、易于连续操作等优点,随着生物、医药等行业的蓬勃发展，从而使双水相萃取技术能越来越广泛应用于生物工程、药物分析和金属分离等方面。 2、双水相体系

双水相萃取技术及其应用

题目：双水相萃取技术及其应用 学院：化学化工学院 专业：生物工程班级：0801 学号：200806030106 学生姓名：李夫 教师姓名：谢涛 完成日期：2011年10月30日

双水相萃取技术及其应用 摘要：介绍了双水相萃取技术(ATPE)的应用现状，综述了近年来取水相萃取技术的相关研究进展。针对双水相系统(ATPE)的经济适用性问题，对新型A TPS相组成材料的研究取得了极大的发展；为了提高双水相萃取技术的选择性和分离效率，在组成传统ATPS的聚合物上偶联亲和配基的亲和ATPS也得到关注；双水相萃取技术的发展趋势还体现在与其他生物分离技术的结合以及萃取机理和热力学模型的优化上。 关键词：双水相萃取;原理;应用 The Techniques and Application of the Aqueous Two-Phase Extraction Abstract：The applications of the aqueous two-phase extraction(ATPE) in the years were summarized, and the advances on the research of A TPE were reviewed The novel aqueous two-phase systems were developed by using the cheaper phase forming polymer. In order to improve the selective and separation efficiency，the affinity extraction using aqueous two-phase systems(ATPS) which links affinity ligand to polymer In traditional A TPS got progressed. The integration with related techniques was also the development direction of A TPE, which overcame some shortcomings in the single A TPE. Although the application of the extraction equipments and continuous operation technique in A TPE indicated that the industrializations of APTE were growing up, establishing the thermodynamic model and theories about the partioning of solute in A TPS need to be optimized. Key words: aqueous two-phase extraction; principle; application 双水相萃取(Aqueous two-phase extraction，AIPE)技术始于20世纪印年代，从1956年瑞典伦德大学的Albensson发现双水相体系到1979年德国GBF的Kula等人将双水相萃取分离技术应用于生物产品分离，虽然只有20多年的历史，但由于其条件温和，容易放大，可连续操作，目前，已成功地应用于蛋白质、核酸和病毒等生物产品的分离和纯化，双水相体系也已被成功的应用到生物转化及生物分析中。双水相技术作为一种新型的分离技术，因其体积小，处理能力强，成相时间短，适合大规模化操作等特点，已经越来越受到人们的重视。双水相萃取技术作为一种新型的萃取分离技术，有着很多的优点，但也存在着一定的局限性。一是成相聚合物的价格，如PEG/Dextran体系，葡聚糖比较昂贵，而且体系黏度大。[1]

双水相萃取的应用

双水相萃取在蛋白质分离纯化中的应用双水相萃取技术( Aqueous two-phase extraction ,ATPE) 是指亲水性聚合物水溶液在一定条件下形成双水相,由于被分离物在两相中分配的不同,便可实 现分离；其双水相体系可由高聚物/高聚物双水相体系、高聚物/无机盐双水相体系、低分子有机物/无机盐双水相体系、表面活性剂双水相体系等组成，被广泛用于生物化学、细胞生物学和生物化工等领域的产品分离和提取。同时，双水相萃取技术作为一种新型的分离技术日益受到重视；此方法可以在室温环境下进行,双水相中的聚合物还可以提高蛋白质的稳定性,收率较高【1】。 1、近年来双水相萃取技术研究综述概述 由于双水相萃取技术在生物工程、医药分析、金属及一些煤矿等化学分析中具有重要作用,因此也一直是分离提纯领域研究的热点。特别是在近几年，随着生物工程技术、生物化学技术、高分子技术的发展，双水相萃取技术的研究也取得了较快的发展。 2008年，郭宪厚【2】对双水相萃取技术进行了综述,阐述了双水相萃取技术的基本原理、特点、工艺流程、物质分配平衡的影响因素及其在生命科学，复杂中药体系的分离以及重金属回收等方面的应用，并对双水相萃取技术的发展前景作了展望。2009年，徐长波、王巍杰【3】对双水相萃取技术进行了综述，并发表了《双水相萃取技术研究进展》，以此综述了双水相萃取技术基本原理、特点、应用及热力学模型,并对双水相萃取技术存在的问题和发展趋势作了论述。2010年，马春宏、朱红【4】等，发表了《双水相萃取技术的应用研究进展》，对双水相萃取技术的具体应用进行了相关综述，简单介绍了双水相萃取技术及其原理、特点, 综述了双水相体系在生物工程( 其中包括萃取分离抗生素、酶、分离提纯蛋白质和萃取其他生物活性物质) 、药物分析和金属分离等方面的应用。2010年，姜大雨、朱红【5】对离子液体双水相萃取的应用研究进行了综述，指出了离子液体双水相的研究取得的一些阶段性的成果，介绍了离子液体双水相体系及其优点, 综述了离子液体双水相体系在生物工业分析、药物分析和金属分离等方面的应用，同时展望了离子液体双水相体系的应用前景。2010年，谭志坚、李芬芳、邢建敏

双水相萃取技术分离纯化蛋白质的研究(精)

化学与生物工程 2006,Vol.23N o.10 Ch emistry &B ioengin eerin g 7 收稿日期:2006-04-17 作者简介:郑楠(1982-,女,陕西人,硕士研究生,主要从事生化制药方面的研究。E -mail:zheng nan1982@https://www.wendangku.net/doc/b118672230.html, 。 双水相萃取技术分离纯化蛋白质的研究 郑楠,刘杰 (南昌大学环境科学与工程学院,江西南昌330029 摘要:阐述了双水相萃取原理,详细分析了影响双水相萃取分离纯化蛋白质的各种因素,探讨了双水相萃取技术在蛋白质分离纯化中的应用并对其前景进行了展望。 关键词:双水相;蛋白质;分离纯化;影响因素 中图分类号:T Q 02818 Q 512+11 文献标识码:A 文章编号:1672-5425(200610-0007-03 液-液萃取技术是化学工业中普遍采用的分离技术之一,在生物化工中也有广泛的应用。然而,大部分生物物质是有生物活性的,需要在低温或室温条件下进行分离纯化,而采用传统萃取技术无法完成。双水相萃取就是考虑到这种现状,基于液-液萃取理论并考虑保持生物活性所开发的一种新型液-液萃取分离技术。

与传统的液-液分离方法相比,双水相萃取技术分离纯化蛋白质具有以下优势:体系含水量高,可达80%以上;蛋白质在其中不易变性;界面张力远远低于水-有机溶剂两相体系的界面张力,有助于强化相际间的质量传递;分相时间短,一般只需5~15min;易于放大和进行连续性操作;萃取环境温和,生物相容性高;聚合物对蛋白质的结构有稳定和保护作用等。正是由于双水相萃取技术的诸多优势,现已被广泛用于蛋白质、核酸、氨基酸、多肽、细胞器等产品的分离和纯化。 1 双水相萃取原理 双水相体系是指某些高聚物之间或高聚物与无机盐之间,在水中以适当的浓度溶解后形成的互不相溶的两相或多相水相体系。高聚物-高聚物-水体系主要依靠高聚物之间的不容性,即高聚物分子的空间阻碍作用,促使其分相;高聚物-盐-水体系一般认为是盐析作用的结果。 双水相萃取与水-有机相萃取的原理相似,都是依据物质在两相间的选择性分配,不同之处在于萃取体系的性质差异。当生物物质进入双水相体系后,由 于表面性质、电荷作用和各种力(如憎水键、氢键和离子键等的存在和环境的影响,使其在上、下相中的浓度不同。分配系数K 等于两相中生物物质的浓度比,由于蛋白质的K 值不相同(大致在011~10之间,因而双水相体系对各类蛋白质的分配具有较好的选择性。 2 双水相萃取中影响蛋白质分配的因素 211 聚合物的分子量 同一类聚合物的疏水性随分子量的增大而增强[1] ,当聚合物的分子量减小时,蛋白质易分配于富含该聚合物的相。如在PEG -Dex tr an 系统中,PEG 的分子量减小或Dextran 的分子量增大都会使分配系数变大,相反PEG 的分子量增大或Dex tran 的分子量减小会使分配系数变小。这是由于PEG 分子量增大时,它的疏水性显著增强,使蛋白质在上相的表面张力增大,从而易于向下相

双水相萃取应用作业

双水相技术在青霉素的领域的应用 （12级生物工程 杨申雨 豆志伟 苗春雷 高佳林 刘泽培） 一、药品青霉素的特性 青霉素是人类最早掌握的抗生素，也是目前生产量最大应用最广泛的抗生素之一。青霉素是一大类抗生素的总称，是指从青霉菌培养液中提取的能破坏细菌的细胞壁并在细菌细胞的繁殖期起杀菌作用的一类抗生素。然而，青霉素不耐酸碱，过酸过碱都可使其结构发生变化而失去抗菌性。此外，青霉素为窄谱抗生素，其抗菌作用很强，低浓度时起抑菌作用，高浓度时具有强大的杀菌作用。但只对革兰氏阳性菌及少数革兰氏阴性菌效果好，对大多数阴性菌则无效。青霉素的抗菌机制主要抑制细菌细胞壁的合成，从而破坏其对菌体的保护作用。细菌细胞壁的主要成分由粘肽组成，青霉素能制止粘肽的合成，而对已形成的细胞壁无破坏作用。因此其对生长旺盛(即细胞壁生物合成时期)的敏感菌特别有效，而对代谢受到抑制的静止期细菌则效果较差。 二、双水相的特点 双水相系统萃取成为新兴生物技术产业研究的热点，主要是该技术对于生物物质的分离和纯化表现出特有的优点和独特的技术优势 ：(1)分相时间短. (2)含水量高，在接近生理环境的体系中进行萃取，不会引起生物活性物质失活或变性；(3)界面张力小 (4)不存在有机溶剂的残留问题，且高聚物对人体无害；(5)大量杂质能与所有固体物质一同除去，使分离过程更经济；(6)易于工艺放大和连续操作 ，与后续提纯工序可直接相连接，无需进行特殊处理；(7)操作条件温和，整个操作过程在常温常压下进行。(8)多种因素都可以对被萃取物质在两相的分配产生影响，故而可以利用多种手段来提高选择性和回收率。 三、华药青霉素的生产状况 华北制药厂是国内生产青霉素的主要企业之一，它采用了以醋酸丁酯为萃取剂的溶媒萃取工艺，它属于酸式萃取，其酸性可以破坏青霉素活性。溶媒萃取对青霉素的分离提纯的关键设备是离心萃取机，90年代前华药采用的罐式萃取，其萃取时间长，故而酸性溶液对青霉素活度的破坏作用大。自1989年华药采取Decanter离心机萃取工艺取代传统的罐式萃取工艺进行研究，青霉素混合液在数秒即将达到充分混合后高速离心分离，使青霉素快速转移到醋酸丁酯相中，大大缩短了青霉素在酸性条件下的混合、分离时间，减少了青霉素的酸性降解，分离效率较之罐式萃取工艺也大大提高。 四、国外研究生产状况 尽管华北制药采用的溶媒萃取工艺应用了Decanter离心机，使得青霉素的提取工艺得以改善，分离效率也得以大大提高。但其低收率高能耗，迫使人们寻找更好的提取工艺，双水相就是其中之一。自20世纪80年代中期以来，各国学者开展了进一步的研究

双水相萃取实验设计方案

双水相萃取地豆蛋白实验设计方案 史庚林 一、引言 地豆又名金果，长寿果、长果、番豆、金果花生、无花果、地果、地豆、唐人豆、花生豆、落花生和长生果。花生滋养补益，有助于延年益寿，所以民间又称之为“长生果”，并且和黄豆一同被誉为“植物肉”、“素中之荤”。花生的营养价值比粮食高，可以与鸡蛋、牛奶、肉类等一些动物性食物媲美。它含有大量的蛋白质和脂肪，特别是不饱和脂肪酸的含量很高，很适宜制作各种营养食品。 双水相萃取系统通常是由水溶性的两种聚合物或一种水溶性聚合物与一种盐和水构成的三组分双相体系。近年来, 该萃取技术受到研究者的青睐, 尤其是它对蛋白质、酶、核酸等生物活性物质的分离纯化等方面受到广泛重视, 双水相萃取在提取生物活性物质方面有如下优点: 含水量高;分相时间短; 界面张力小; 不存在有机溶剂残留问题; 大量杂质能与所有固体物质一同除去; 易于工程放大和连续操作 ; 更重要的是双水相萃取避免了传统液- 液萃取中生物活性物质与有机溶剂的直接接触, 保护了其活性, 有研究表明聚合物对颗粒或生物分子的结构不但没有破坏作用, 反而有稳定作用。 本实验以PEG/ ( NH 4) 2 SO 4 双水相体系为考察对象, 比较了不同浓度的PEG 和 ( NH 4 ) 2 SO 4 组成的双水相体系对地豆蛋白的萃取效果, 并考察了影响萃取效果 的各种因素。 二、实验仪器与试剂 1 仪器：离心机,电热恒温水浴锅，分光光度计,磁力搅拌器，电子天平，超声波仪 2 试剂：PEG( 分子量分别为600、1000，2000、4000、6000) , 硫酸铵，Nacl， NaH 2PO 4 ，K 2 HPO 4 ，考马斯亮蓝（G-250） 三、方法 1 粗蛋白的提取 1.1 用前面超声波处理的方法提取蛋白质1.2 用考马斯亮蓝法测定蛋白质的含量

双水相萃取技术

三、双水相萃取 3.1 双水相萃取的原理及特点 3.1.1 双水相萃取的原理 双水相萃取与水-有机相萃取的原理相似，都是依据物质在两相间的选择性分配，但萃取体系的性质不同。当物质进入双水相体系后，由于表面性质、电荷作用和各种力(如憎水键、氢键和离子键等)的存在和环境因素的影响，使其在上、下相中的浓度不同。分配系数K等于物质在两相的浓度比，由于各种物质的K值不同，可利用双水相萃取体系对物质进行分离。 3.1.2 双水相萃取的特点 双水相体系萃取具有如下特点：(1)含水量高(70%~90%)，是在接近生理环境的温度和体系中进行萃取，不会引起生物活性物质失活或变性；(2)分相时间短，自然分相时间一般为5~15min； (3)界面张力小(10-7~10-4mN/m)，有助于强化相际间的质量传递；(4)不存在有机溶剂残留问题； (5)大量杂质能与所有固体物质一同除去，使分离过程更经济；(6)易于工程放大和连续操作。由于双水相萃取具有上述优点，因此，被广泛用于生物化学、细胞生物学和生物化工等领域的产品分离和提取。 3.2 双水相萃取在分离和提取各种蛋白质(酶)上的应用 用聚乙二醇(PEG)/羟丙基淀粉酶(Reppal PEG)体系经两步法可从黄豆中分离磷酸甘油酸激酶(PGK)和磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)。在黄豆匀浆中加入PEG4000，可絮凝细胞碎片及大部分杂蛋白。在上清液中加入PEG4000(12%)-ReppalPES(40%)，PGK在上相、GAPGH在下相的收率均在80%以上。萃取过程的放大采用离心倾析机连续处理匀浆液，用离心萃取器完成双水相体系的两相分离，整个工艺具有处理量大、接触时间短、酶收率高的特点。用PEG/(NH4)2SO4双水相体系，经一次萃取从A-淀粉酶发酵液中分离提取α-淀粉酶和蛋白酶，萃取最适宜条件为PEG1000(15%)-(NH4)2SO4(20%)，pH=8，α-淀粉酶收率为90%，分配系数为19.6，蛋白酶的分离系数高达15.1。比活率为原发酵液的1.5倍，蛋白酶在水相中的收率高于60%。通过向萃取相(上相)中加进适当浓度的(NH4)2SO4可达到反萃取。实验结果表明，随着(NH4)2SO4浓度的增加，双水相体系两相间固体物析出量也增加。固体沉淀物既可干燥后生产工业级酶制剂，也可将固体物加水溶解后用有机溶剂沉淀法制造食品级酶制剂. Harris用双水相体系从羊奶中纯化蛋白，研究了牛血清清蛋白(OSA)、牛酪蛋白、β-乳球蛋白在PEG/磷酸盐体系中的分配以及PEG相对分子质量、pH值和盐的加入对3种蛋白分配的影响。实验结果表明。增加NaCl浓度，可提高分配系数，最佳pH为5。对OSA和牛酪蛋白，可得到更高的分配系数。在含有疏水基葡聚糖中，蛋白质和类囊体薄膜泡囊的分配研究表明，苯甲酰基葡聚糖和戊酰基葡聚糖具有疏水性。疏水基影响氨基酸、蛋白质和薄膜泡囊在双水相体系中的分配，在只有磷酸盐缓冲溶液的PEG8000/葡聚糖双水相体系中，大部分β-半乳糖苷酶被分配在上相，但在下相中加入少量的苯甲酰基葡聚糖(取代程度为0.054)或戊酰基葡聚糖(取代程度为0.12)时，β-半乳糖苷酶的分配系数就降低了100倍。在对牛血清清蛋白、溶菌酶、脂肪酶和β-乳球蛋白的分配进行的观察中发现具有相似的现象。类囊体薄膜泡囊的分配受疏水基的影响特别大，薄膜泡囊被分配在含有疏水基的一相中。在含有N，N-二甲基甲酰胺的聚合物双水相中，利用逆流分配可对玉米醇溶蛋白进行分级分离。Miyuki在PEG/K3PO4双水相体系中用两步法对葡糖淀粉酶进行了萃取纯化。用第一步萃取后含有酶的下相和PEG组成双水相作为第二步萃取体系，称作两步法。葡糖淀粉酶的最佳分配条件是PEG4000(第一步)、PEG1500(第二步)，pH=7，纯化系数提高了3倍。

双水相萃取的特点

双水相萃取的特点 双水相萃取是一种可以利用较为简单的设备, 并在温和条件下进行简单操作就可获得较高收率和纯度的新型分离技术。与一些传统的分离方法相比, 双水相萃取技术具有以下独有的特点。 ( 1) 两相间的界面张力小, 一般为10- 7—10- 4mN·m- 1 ( 一般体系10- 3—2×10- 2mN·m- 1 ) ,因此两相易分散, 而且它比一般的有机萃取两相体系界面张力低的多, 这样有利于强化相际间的物质传递。 ( 2) 操作条件温和, 由于双水相的界面张力大大低于有机溶剂与水相之间的界面张力, 整个操作过程可以在常温常压下进行, 对于生物活性物质的提取来说有助于保持生物活性和强化相际传质。 ( 3) 双水相体系中的传质和平衡速度快, 回收率高, 分相时间短, 传质过程和平衡过程速度均很快, 自然分相时间一般为5—15min, 因此相对于某些分离过程来说, 能耗较低, 而且可以实现快速的分离。 ( 4) 大量杂质能够与所有固体物质一起去掉, 与其他常用固液分离方法相比, 双水相分配技术可省去1—2 个分离步骤, 使整个分离过程更经济。 ( 5) 含水量高, 一般为75%—90% , 在接近生理环境的体系中进行萃取, 不会引起生物活性物质失活或变性。 ( 6) 一般不存在有机溶剂的残留问题, 现已证明形成双水相的聚合物( 如PEG) 对人体无害, 可用于食品添加剂、注射剂和制药, 因此

对环境污染小。 ( 7) 聚合物的浓度、无机盐的种类和浓度, 以及体系的pH 值等因素都对被萃取物质在两相间的分配产生影响, 因此可以采用多种手段来提高选择性和回收率。 ( 8) 易于连续化操作, 设备简单, 并且可直接与后续提纯工序相连接, 无需进行特殊处理。例如可以采用高分配系数和高选择性的多级逆流分配操作。 ( 9) 分配过程因素较多, 可以采取多种手段来提高分配选择性或过程收率。

双水相萃取

双水相萃取 一实训目的掌握双水相萃取的原理 及方法。 学习双水相萃取相图的制作。 二实训原理 双水相萃取法（aqueous two-phase extraction）是利用物质在互不相溶的两水相间分配系数的差异来进行萃取的方法。高聚物PEG和盐（硫酸铵）形成的互不相溶的两相，倒入牛奶中，蛋白质富集在一相中。 三实训仪器和药品 试管，离心机，天平，离心管，三角瓶，滴定管，聚乙二醇2000 （PEG2000），硫酸铵，牛奶。 四实训步骤 1 PEG2000-硫酸铵双水相体系相图的测定（1） 取10%PEG2000溶液10mL于三角瓶中； （2）用40%硫酸铵溶液装入滴定管中滴定至三角瓶中溶液出现浑浊，记录硫酸铵消耗的体积。加入1mL水使溶液澄清，继续用硫酸铵滴定至浑 浊，重复7~8次，记录每次硫酸铵消耗的体积，计算每次出现浑浊时体 （3）以硫酸铵的浓度（W/V）为横坐标，PEG浓度（W/V）为纵坐标，绘制出PEG2000-硫酸铵双水相体系相图。 2PEG2000-硫酸铵双水相体系的配制 自行在相图中双水相区选择一个点，根据该点的PEG2000浓度和硫酸铵浓度，分别量取适量的10%PEG2000溶液和硫酸溶液，混合均匀后以2500rpm/min离心5min后分相，得到双水相体系（总量约3mL）。 3利用PEG2000-硫酸铵双水相体系萃取分离牛奶中的蛋白质 取1mL 牛奶装入上述双水相体系中，搅拌均匀，于2500rpm/min 离心5min，静置分层，分别量取上下相的体积。 萃取完成后，如果牛奶中的蛋白质不能被萃取到上相，则证明所选的

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PEG2000 与硫酸铵浓度不对，应重新选择。 五结果与讨论 1如果正确地绘制相图。 2如何根据相图配制双水相体系，并对混合物进行分离。 2