软骨细胞培养及其调控

关键词：软骨细胞自从1965年chestman和Smith首先开始软骨细胞体外培养用于软骨缺损修复的研究以来［1］，人们开始对关节软骨损伤不能通过自身的软骨增殖修复的概念有了新的认识。实验证明不仅年幼且年老的关节软骨标本仍可在体外培养出新生透明软骨［2］。虽然软骨细胞增殖能力有限，其质与量直接影响体外培养扩增效果，软骨细胞生长环境不同所表现出的生物学特性也有差别。软骨细胞在悬浮培养或半固体琼脂培养基中生长良好并保持表型稳定，在培养瓶底水凝胶覆盖的四维培养环境中长期培养时软骨细胞可形成结节结构其细胞形态胞外基质分泌和软骨特异性基因表达皆与关节软骨相似。软骨细胞的生长密度对其生长也至关重要。在同样的条件下体外单层培养时，由于细胞密度不同，软骨细胞的生长分裂经过和形态功能完全不同。组织学检查表明，细胞形态不同，其碱性磷酸酶活性、细胞分泌特异性基质的功能及对细胞作用因子的反应也不同，进一步研究表明，软骨细胞靠自分泌或旁分泌信号的方式而存活。1 细胞因子对体外培养软骨细胞的影响软骨细胞的有限增殖性及存活密度的要求是限制软骨细胞单层培养修复关节软骨缺损及体外大量扩增的因素之一，随着细胞生物学的发展，软骨细胞体外培养特异基因表达的研究日益深入，细胞因子参与调节软骨细胞的增殖、分化过程渐被人们所揭示，这对软骨细胞体外培养研究又提出了一个新方向。近年来，关于细胞因子等多肽蛋白质对软骨细胞体外增殖分化等的影响研究也较多。也有些学者发现软骨细胞内含许多细胞因子及其受体，且表明许多细胞因子通过自分泌或旁分泌两种基本方式来调节软骨细胞。目前认为促进软骨细胞增殖和基质合成代谢的细胞因子有：IGFs.TGF-βs.PDGF,FGF.EGF，对软骨细胞有抑制作用的有IL- 1、IL-2、IL-7、TNF-α、IFN-γ等，现就对软骨细胞有显著调节的细胞因子分述如下：1.1 转化生长因子beta(TGF-β) TGF-β最初是由Robert等学者在1978年作为一种可诱导大鼠成纤维细胞增殖因子而描述。T GF-β可以诱导间充质细胞转化为软骨细胞。现已实验证明TGF-βs具有促进软骨细胞增殖、调节其分化和胞外基质合成的能力［3］。F.Redni等实验证明培养兔关节软骨细胞表达了不同的TGFβ受体且与软骨细胞生长周期功能有关，软骨细胞在S期表现了低亲和力受体表型(kd=appiox 1100pm)然而GO/G期的软骨细胞表现了高亲和力受体。因此， TGF-β对软骨细胞的作用有多种受体参与。同时也有实验证明TGF-β更多的结合在GO/G1 期比S期的同步化软骨细胞，从而说明TGF-βs对软骨细胞的作用是通过不同的途径［ 4］。也有学者证明TGF-βs在不同的条件下对成软骨细胞有促进分化或降低分化的双重作用，1-10ng/ml浓度的TGF-β可诱导大鼠胚胎肌细胞分化成软骨细胞，合成特异性的Ⅱ型胶原和蛋白多糖，而在0.4mol/L浓度下，TGF-β可诱导大鼠颅骨成骨细胞的碱性磷酸酶活性，减少软骨细胞Ⅱ型胶原、蛋白多糖的合成［5］。同时也有实验证明TGF-β可抑制培养兔关节软骨细胞的终末分化及钙化。TGF-β可能与多种因素如胞外基质和其它分化调控生? ?］。TGF-β在细胞对其它各种分化信号的应答过程中同样也有调节作用。Wen-Ning Qi等实验证明Ⅱ型胶原能特异的调节TGF- β刺激软骨细胞合成Ⅱ型前胶原DNA和蛋白多糖，同时说明Ⅱ型胶原在TGF-β存在的条件下调节软骨细胞特异性基因表达具有剂量依赖性(量效关系)。因此Ⅱ型胶原基因表达的变化在 TGF存在条件下受Ⅱ型胶原的调控［7，8］。[!--empirenews.page--] 体外实验证明，许多细胞因子对软骨细胞有协同或拮抗作用如TGF-βs、IGFs、FGF、BMP、 IL-1等，兔关节软骨细胞体外培养时，TGF-β对IGF的分泌作用有三种，(1)减少41KD的IG FBP；(2)增加IGF受体的结合位点；

(3)下调了诱导型IGF-1受体的自身磷酸化［9］，从而促进软骨细胞的增殖和特异性基质的合成。也有学者认为TGF-β和IGF可以使反分化的软骨细胞再分化诱导和持久表达Ⅱ型胶原和蛋白多糖［10］。软骨细胞在传代培养中表型的变化可能与软骨细胞自分泌IL-1有关，而TGFβ可作为一种IL-1的拮抗剂，减少了IL-1对胞外基质的分解代谢同时也下调了IL-1受体及其金属蛋白酶的表达［1 1］。TGFβ可能通过以下两种途径拮抗IL-1的作用，(1)刺激成软骨细胞中蛋白糖抑制剂的产生。(2)抑制软骨细胞蛋白酶的产生，因而对细胞外基质的

合成有促进作用［1 2］。1.2 骨形态发生蛋白(BMP) BMP是TGFβ的超家族成员之一，BMP-7(OP-1)是BMP家族中的一员，其对无血清培养的高密度单层细胞和悬浮在琼脂糖中的细胞有促进生长和成熟作用，可增加其碱性磷酸酶活性和提高mRNA和Ⅱ型胶原的合成能力。实验rhBMP(OP-1)能有效促进胚胎和成人关节软骨细胞合成蛋白多糖和Ⅱ型胶原而Ⅰ、Ⅲ型胶原没有增加。也有实验证明OP-1对人软骨细胞特异性胶原、蛋白多糖的促合成作用比IGF-Ⅰ、TGF-β和激活素更显著［13］。在培养软骨细胞生长周期的不同时期，BMP的作用也不同，rhBMP调节软骨细胞增殖、分化作用依赖于细胞的成熟状态，且静止区软骨细胞更敏感，同时对软骨细胞的自分泌也有作用［14 ］。关节软骨细胞原代培养时表达了BMP-4功能性受体。1998年Rach1,venena等实验证明BMP2和维生素C共同作用下培养的软骨细胞没有诱导其肥大，同时BMP-2独自干预下细胞凋亡明显少于维生素C的干预，从而说明软骨细胞向肥大软骨细胞的过度与细胞增殖数量减少而相对高的凋亡水平有关。软骨细胞体外传代培养渐反分化为成纤维样细胞或过度为肥大软骨细胞与细胞生存的微环境有关［15］。1.3 胰岛素样生长因子(IGFs) IGF于1953年由salmon和Danghaday研究表明，IGFs家族由两种相关多肽组成即IGF-Ⅰ和IGF -Ⅱ。在软骨细胞表面有IGF的受体且软骨细胞能合成和分泌这种多肽。IGF-Ⅰ能与软骨细胞膜上的受体结合也以旁分泌和自分泌的方式起作用。IGF-Ⅰ能强烈刺激软骨细胞合成Ⅱ型胶原和蛋白多糖，IGF-Ⅰ还能刺激软骨细胞集落形成和细胞增殖，体内IGF-Ⅰ能促进骨骺软骨生长。而IGF-Ⅱ能刺激软骨细胞DNA和RNA的合成且比IGF-Ⅰ更有效的刺激胚胎细胞的生长。但IGF-Ⅰ对成年软骨细胞的作用强于IGF-Ⅱ，也能促进蛋白多糖的合成。软骨细胞表面的IGF-Ⅱ的受体与IGF-Ⅰ相比，两者的结构与体外活性相似，但体内生物效应不同。而IGF结合蛋白(IGF1BPs)它通过特异性结合IGFs而起作用，尽管目前对IGFBPs的生理功能还不十分清楚，但它们对IGFs的调节作用是肯定的，它们通过结合IGFs减少了IGFs与其受体的相互作用，从而降低了IGFs的活性。onley等人实验表明细胞因子可以调节IGFBPs的产生，IGFBPs反过来调节IGF的作用，同时表明IL-1α、TNF-α降低细胞对IGF-Ⅰ的反应性可能是通过增加IGFBPs而起作用。[!--empirenews.page--]1.4 成纤维细胞生长因子(FGFs) FGFs最初是从牛脑垂体分离出来的一种蛋白质，后来发现它在人体组织包括骨、软骨基质中广泛存在，且对胚胎发育及软骨修复起重要作用。体外实验发现它能促进软骨细胞的增殖、成熟和胞外基质的合成，而bFGF是一种强大的软骨细胞有丝分裂原，它能刺激生长板中软骨细胞蛋白多糖的合成。在成人关节软骨中它与IGF有协同作用，两者协同刺激软骨细胞有丝分裂和蛋白多糖的合成，抑制软骨细胞分化为肥大表型。1.5 白介素和肿瘤坏死因子(IL、TNF) 近来报道IL-1对关节软骨细胞代谢的干预作用主要表现为抑制透明软骨特征性Ⅱ、Ⅳ型胶原的合成，而促进Ⅰ、Ⅲ型胶原的合成使软骨细胞变性，抑制软骨细胞增殖和蛋白多糖的合成同时IL-1对关节软骨的降解作用主要表现在促进软骨细胞合成和分泌金属蛋白酶，并提高软骨基质中溶解蛋白分子酶类的活性。TNF是通过IL-1而抑制Ⅱ型胶原和蛋白多糖的合成，但其作用远弱于IL-1。2 力学刺激对培养软骨细胞的影响关节软骨主要由软骨细胞和胞外基质组成，而胞外基质主要包括胶原和蛋白多糖，其中Ⅱ型胶原占胶原的95%，聚合素是蛋白多糖的主要成分，关节运动时软骨经历循环应力载荷而发生周期性变形和恢复，循环载荷是软骨细胞执行正常功能和维持胞外基质正常表型的基本因素。而体外培养软骨细胞其随传代次数增加而发生代谢、表型的变化伴有Ⅱ、Ⅳ型胶原合成减少，Ⅰ、Ⅲ型胶原合成增加和蛋白多糖分子量的改变，为维持体外培养软骨细胞的正常形态和功能则许多学者进行了软骨细胞培养的力学刺激实验研究。这种压力可分为两种：一种是持续静压力，一种是循环动压力，力学刺激对调控软骨代谢和维持其胞外基质正常表型起重要作用，其中静压力刺激减少了Ⅱ胶原和蛋白多糖的合成，而正常动压力刺激则促进Ⅱ型胶原和蛋白多糖的合成［16，17］，K.Koarninnta［18］实验表明持续高流体静压力抑制蛋白多糖的合成和分泌，减少了聚合素

mRNA的表达，改变了高尔基氏器的形态和抑制微丝的组成。在循环压力作用下软骨组织内4

种物理特性发生变化；①静水压；②毛细液流；③流能；④组织与细胞变形。低频循环压力

促进基质降解而高频循环压力则促进软骨细胞合成代谢。所以力学刺激是软骨细胞的一个重

要调节者，但软骨细胞又如何接受力学刺激信号呢自从认识软骨细胞可以分泌整合素以来，

整合素就在软骨细胞与胞外基质信号转导方面起着重要作用。整合素是一种异二聚体(α、

β)转膜糖蛋白特异性受体，力学刺激使胞外基质与整合素结合同时与细胞骨架相连，从而

影响着基因表达和调控细胞生长和分化［19，20］。力学刺激促进胶原合成增加同时整合素

合成也上调，力学刺激增加了α2整事素亚单位mRNA表达。实验表明在软骨细胞培养一周

后，给予循环压力刺激 15次/min，结果3h后，循环压力促进了Ⅱ型胶原和聚合素mRNA的

表达，从而说明胞外基质调节整合素来应答力学刺激。α2 β1整合素是Ⅱ型胶原受体。

软骨基质受体作为一种应力感受器在软骨基[!--empirenews.page--] 质网络中通过力学刺激信号来调控软骨细胞。周期性力学刺激促进基质合成，而静压力则促

进基质合成减少［21，22］，所以力学刺激信号可能通过力学刺激、细胞外基质、整合素、

细胞骨架(肌动蛋白)而调控软骨细胞的增殖和分化功能。Taka haki-k［23

L－6和TNF-α mRNA表达增加而缩减了蛋白多糖核心蛋白的表达，生理

水平的静水压则增加了蛋白多糖核心蛋白的表达，组织与细胞变形可兴奋ECM受体［24］细

胞膜张力受体、细胞网架结构［25 ］而促进合成功能，总之，机构压力对培养软骨细胞的作

用在有效范围内与压力值无关，而与压缩程度(静压力)和频率(循环压力)有关，持续的静压

力抑制软骨细胞的合成代谢，一定频率的循环压力则促进软骨细胞的合成功能［26］。3 其

它因素对培养软骨细胞的影响体外培养软骨细胞随其传代而表型整个发生改变，正常的

Ⅱ、Ⅳ型胶原合成减少，Ⅰ、Ⅲ型胶原合成增加，在不同的培养条件下(如培养基、PH细胞

的接种密度、血清浓度、氧分压及其培养基的离子浓度、培养方式)其表型不同，有时可以

反分化或向肥大软骨细胞转化。体外培养只有保持其正常形态才能保持其正常功能。Freed

［27］等将软骨细胞移植于DGA、PLA进行三维体外培养，证明三维培养6周后其细胞数扩

增了近8.3倍，且传代后细胞产生蛋白多糖和Ⅱ型胶原的能力较佳，所以软骨细胞三维培养

有利于维持其形状，常利用胶原纤维蛋白、琼脂、海澡酸盐、PGA、PLA等为附属物进行三

维培养。也有学者认为无血清培养可以阻止软骨细胞反分化。培养基PH值轻度偏碱不利于

蛋白多糖的合成，偏酸则相反。低钙环境有利于软骨细胞的稳定［28］。1995年Baragi［29］

等将IL - Rα和标记基因LacZ分别构建在腺病毒上转染软骨细胞并将它们分别与骨关节炎

软骨组织块一起培养，结果表明与IL-1Rα转染软骨细胞培养的组织块能抵制IL-1β的作用

而与LacZ 细胞培养的软骨细胞块抵制作用明显减弱，从而说明基因转染可以用来调控软骨

细胞从而维持其表型。4 结束语体外培养软骨细胞的优点是可以大量扩增及研究其生

命活动的状况，但要维持其正常表型则受到众多复杂因素的调控。就其细胞因子而言，细胞

因子对体外培养软骨细胞的作用非单一的，而是一个复杂的网络调节作用，如生长因子的生

物学活性是由受体介导的，生长因子在软骨细胞合成分泌后，多为无活性的前体分子需要经

过特异性的激活才能发挥作用。生长因子之间存在基因表达及其活性的相互调控TGF-β能

促进PDGF的A链和B链的mRNA表达和分泌［30］。bFGF能促进TGF-β mRNA的表达，诱导

间充质细胞分化成软骨细胞，增强 TGF对软骨细胞的增殖及其基质合成作用。生长因子之间

还存在受体水平的调控，胰岛素不影响TGF-Ⅱ型受体的亲和力但增加了Ⅱ型受体的数目引

起受体上调效应，从而Ⅱ型受体与Ⅰ型受体竞争，使胰岛素与Ⅰ型受体结合减少。IL-1可

使TNF受体下调，而IFN-γ却使TNF 受体上调等。但是网络生长因子如何调控体外培养软骨

细胞的增殖、分化阻滞反分化或向肥大型转化、维持其正常软骨细胞表型及合成特异性胞外

基质还需进一步的研究。总之软骨细胞体外培养维持其正常表型则受到众多因素的影响如培

养条件及其方式，细胞的微环境，PH&nb sp;值、细胞密度、力学变化、生长因子等等。

随着细胞生物学和分子生物学的发展，软骨细胞体外培养大量扩增、分化维持其正常的表型及代谢的调控因素会渐为人们所明晰，为组织工程化软骨修复软骨缺损、体外培养软骨细胞建立软骨细胞库(永生化软骨细胞)及揭示退变性骨关节病又开拓了一条新的途径。

鱼类细胞培养及其在病毒学研究中的应用_李文峰

动物医学进展,2010,31(5):107-110 Pr ogress in Veterinary Medicine 专论与讲座 鱼类细胞培养及其在病毒学研究中的应用* 李文峰1,2,麦康森1,黄倢2,史成银2* (1.中国海洋大学水产学院,山东青岛266003;2.中国水产科学研究院黄海水产研究所,山东青岛266071) 摘要:鱼类细胞培养技术作为一种重要的研究和应用技术方法,自1962年发展至今,已建立了超过220个株系。鱼类病毒学是其应用最为广泛的领域。论文主要就鱼类细胞的主要株系、我国鱼类细胞培养的发展以及鱼类细胞株系对于鱼类病毒的分离、鉴定、增殖及病毒病防控研究做一综述,以期对水产动物的疾病防控具有一定的指导意义。 关键词:细胞培养;病毒学;鱼类 中图分类号:S941;S852.65文献标识码:B文章编号:1007-5038(2010)04-0107-04 细胞培养作为细胞生物学乃至生物学研究的重要技术,在生物领域中占有重要地位。动物组织(细胞)培养开始于20世纪初,发展至今已成为生物、医学研究及应用广泛采用的技术方法。鱼类细胞培养晚于陆生动物,自20世纪60年代兴起,主要用于病毒学,免疫学以及生理和毒理学研究,尤其对鱼类病毒病防制具有重要意义。 1鱼类细胞培养研究现状 鱼类细胞培养的系统研究和建系实践起始于1962年W olf和Quim by建立的虹鳟性腺细胞系RT G-2,随后各种鱼类细胞系相继建立,离体细胞培养在鱼类生物技术研究中的应用日趋广泛。目前据不完全统计,世界上已经建立的鱼类细胞株系超过220株[1-13]。其中淡水鱼类和溯河洄游性鱼类的细胞系占大部分,海水鱼类的细胞系约占30%左右。 1.1国际上已经建成的主要鱼类细胞系 国内外用于研究的鱼细胞系有多种,来源的组织有吻端、肾脏、卵巢、尾鳍、膘、性腺、肝脏、胚胎、囊胚、原肠胚、鳍条等,主要包括鲤鱼(Cy p rinus catp io)上皮瘤细胞系EPC,鲫鱼(Car assius auratus)鳍细胞系CAR,金鱼巨噬细胞系GM CL,棕鮰(Pinmp halesp romehz s)性腺细胞系CCO,大菱鲆(Scop hthalmus max imus)纤维细胞T V-1、鳍条细胞系TF[2]、胚胎细胞系TEC,中华鲟(Acip enser sinensis)尾鳍细胞系[3],虹鳟(Oncorhy nchus my kiss)性腺细胞系RT G-2、前肾基质细胞TPS,褐牙鲆(Paralichthy s olivaceus)鳃细胞系FG-9307、胚胎细胞系FEC,斑马鱼胚胎细胞系ZEF、肝脏细胞系ZF-L,鲹(Car anx mate)鱼苗细胞系,大鳞大马哈鱼(Oncor hy nchus tschaw y tscha)胚胎细胞系CH SE-sp,金头鲷(Sp ar us aurata)细胞系SAF-1,太阳鱼(Lep omis macrochirus)鳃细胞系BG/G、鳍细胞系BG/F,羊鲷(Archosar gusp r obatocep halus)细胞系,银鲷(Bair diella chr y sur a)SP-1细胞系,大西洋鲑(Salmo salar)头肾细胞LSH K-1,遮目鱼(Chanos chanos)心肌细胞系及斜带石斑鱼(Ep inep helus coioides)眼睛细胞系[13]等。鱼类细胞的培养相对比较容易,对传代培养时间的要求弹性比较大,适温范围广,使得鱼类细胞系在生物学研究领域中得到广泛应用。 1.2我国鱼类细胞系建系概况 我国对于鱼类细胞培养的研究始于20世纪70年代,迄今已建立了超过40株细胞系。张念慈、杨广智建立了草鱼吻端组织细胞株ZC-7901及其上皮样细胞亚株ZC-7901S1。钱华鑫建立了鲢尾鳍细胞系等多个细胞系,并对细胞体外培养技术、保存条件以及传代细胞生物学特性进行了研究。童裳亮建立了牙鲆鱼鳃细胞系FG、鲈鱼脾细胞系SPS、鲈鱼心细胞系SPH和真鲷鳍细胞系RSBF四株海水鱼类细胞系。张铭等建立淡水白鲳鱼胚胎和尾鳍等4株细胞系。Chen在2003年-2005年建立了鲈鱼多能 *收稿日期:2009-09-20 基金项目:中央级科研院所基本科研业务费专项资金(2007-chb-01) 作者简介:李文峰(1984-),男,山东烟台人,硕士研究生,主要从事海水养殖动物分子营养与免疫学研究。*通讯作者

软骨细胞培养

软骨细胞培养 (1)豚鼠脱颈处死，备皮，用75%酒精消毒背部及四肢皮肤。 (2)无菌操作下取下双侧股骨头及膝关节（保留周围肌肉，软骨不能暴露），75%酒精浸泡5分钟，转移至PBS缓冲液中，带入超净工作台，剔除关节周围附着的软组织，打开髋、膝关节，用尖刀削取关节软骨组织，置入装有PBS缓冲液的无菌培养皿，防止软骨组织被风干。 (3)PBS缓冲液充分漂洗软骨小块3次，然后用小剪刀将软骨块切碎至约lmm3大小。 (4)再次用PBS缓冲液冲洗3次，滤干，将细小的软骨块置入放有0.2%的Ⅱ型胶原酶3ml的广口瓶里，摇匀后置于37℃恒温震荡箱中消化，40分钟后将上层消化液转移至15ml规格离心管中，800r/min离心5min，收集细胞（沉淀物），加入含10%的胎牛血清DMEM培养液4ml并吹打混匀，制成软骨细胞混悬液。 (5)把消化所得的软骨细胞混悬液收集于离心管中，经滤网过滤后用细胞计数板计数，并把细胞混悬液密度调整为2×105/ml接种于25cm2规格的培养瓶中。将培养瓶放置于CO2培养箱内。培养条件为37℃、5%CO2。 (6)未消化完的软骨小块继续用Ⅱ型胶原酶如上法消化，直至软骨块基本消失。 (7)每日在倒置显微镜下观察软骨细胞生长情况并拍照保存。 药物制备 龟甲胶、鹿角胶各10克，氨基葡萄糖1.5克，分别加PBS缓冲液30ml配成 10g/30ml、10g/30ml和1.5g/30ml的溶液。然后分别取上述溶液各0.25ml、0.5ml、1ml、2ml、3ml、4ml放于不同的15ml离心管中，加PBS定容至10ml，各配成6管分别为2.5%、5%、10%、20%、30%、40%含药的PBS，放4℃冰箱备用。药物组：将上述6管含药PBS分别各取1ml放于不同的15ml离心管中，加含10%胎牛血清的DMEM培养液定容至10ml，分别配成10%含药的胎牛血清DMEM培养液（避免胎牛血清的干扰），做好标记，放4℃冰箱备用。另外取1ml PBS缓冲液加到9ml含10%胎牛血清的DMEM培养液中，配成10ml 10%PBS的含胎牛血清的DMEM培养液作为空白对照组，放4℃冰箱备用。

细胞培养技术在医药研究中的应用

细胞培养技术在医药研究中的应用 摘要：近年来，动物细胞培养技术在生物制药领域成为最受关注的热点之一，动物细胞培养技术广泛应用于动物细胞高密度培养，推动了现代生物医药 产业的发展。动物细胞培养是指离散的动物活细胞在体外模拟体内的: 生理环境 , 在无菌、适宜的培养条件下生长、繁殖的过程。利用人工培养的动物细胞可以进行科学研究和生物制药, 动物细胞的大规模的培养技术是生物制药中非 常重要的环节。在动物细胞培养过程中, 最重要的是使细胞的培养条件达到最 优化程度, 尽可能消除或减轻环境对细胞的影响, 因此动物细胞培养环境的控 制是细胞培养的关健技术。 关键词：动物细胞培养技术，生物制药，培养条件,人工培养。 自1885 年，Roux 从鸡胚中分离细胞首次建立体外细胞培养; Dulbecco于1943 年创建单层细胞培养已有半个多世纪。因其具有的培养简单、操作方便、消耗少、大量运用等优点，被广泛运用于生命科学的各个领域[1]。全球生物制药技术和市场的迅速发展为动物细胞培养基市场提供了快速成长的发展环境， 并使之保持强劲的发展势头。 1 细胞培养的环境及条件 1.1 无污染的环境 无菌无毒的操作环境和培养环境是保证细胞在体外培养成功的首要条件[3]。 1.2 适宜的温度 维持培养细胞旺盛生长, 必须有恒定而适宜的温度。不同种类的细胞对培养温度要求也不同[3]。 1.3 气体环境和氢离子浓度 气体是哺乳动物细胞培养生存必需条件之一, 所需气体主要有氧气和二氧化碳[3]。 1.4 适宜的p H 值 每种细胞都有其最适p H 值。p H 值随培养的细胞种类不同而不同, 大多数细胞的适宜pH 为7.2至7.4, 偏离这一范围对细胞培养将产生有害的影响[3]。 1.5 培养基 培养基不仅提供细胞营养和促使细胞生长增殖的基础物质, 而且还提供培养细胞生长和繁殖的生存环境[3]。 1.6 细胞培养外部环境 细胞培养是一种无菌操作技术, 对实验室、常用设施及设备、培养器皿等都有严格的要求[3]。 2 细胞培养无菌操作基本技术无菌操作技术分为: 工作环境及表面、细胞培养所用器皿、培养液与培养细胞的处理。 2.1 工作环境的处理 使用层流超净工作台是最经济有效的手段[3]。 2.2 细胞培养所用玻璃及塑料制品的清洗与消毒 消毒方法分为物理灭菌法( 紫外线、湿热、干烤、过滤等), 化学灭菌法( 各种化学消毒剂) 和抗生素三类。[3] 细胞培养基的质量标准及产品质量控制参考国内外细胞培养基产品企业标 准的现状，着重考虑了生物制药用户对产品质量的要求以及《中华人民共和国

鱼类染色体研究进展

鱼类染色体研究进展 X 高 文(宁德师范高等专科学校生物系,福建宁德 352100) 摘要:综述了鱼类染色体在核型和显带技术研究及多倍体技术研究方面的概况和新进展. 关键词:鱼类;染色体核型;染色体显带;多倍体技术 中图分类号:Q 959 文献标识码:A 文章编号:1004-2911(2005)01-0015-03 全世界现存鱼类有22000多种,是脊椎动物中分布最广、种类最多的类群,体现多种多样的生物学特性,具有重大的经济价值.在脊椎动物中,鱼类的染色体较小,数目偏多,研究工作难度较大,进展较为缓慢,但鱼类与人类生产、生活休戚相关.保护鱼类资源,进一步开发鱼类资源,发展鱼类养殖业造福人类,对其染色体的研究必将越来越重要.本文对国内外在鱼类染色体核型、带型及染色体组多倍体研究方面成果及新进展做一概述. 1 核型研究 早期对鱼类染色体的研究,由于方法上的限制,进展缓慢.椐不完全统计,截至1980年,报道染色体核型的鱼类有1076种,到1985年已增加到1600余种[1].人们对鱼类染色体的研究,近些年发展较快, 仍偏重于核型分析.到目前为止,已报道染色体核型的鱼类有2100种左右,约占总数的10%[1~ 9].这些有染色体记载的鱼类主要集中在鲤形目和鲈形目,每个目都有150种以上,且大多数为淡水鱼类. 2 显带技术研究染色体的显带技术可以揭示染色体的精细结构,从而检测出同型染色体之间的细微结构区别,是染色体研究必不可少的手段.染色体显带技术运用于鱼类染色体结构分析,推进了人们对鱼类遗传物质的深化研究,并且取得了一系列重大成果. 2.1 Ag-NORs 硝酸银特异地染色与NORs 结合的酸性蛋白,使该区域呈黑色.Ag-NORs 法应用于鱼类染色体研究中获得可靠的结果,成为研究鱼类物种间的亲缘关系以及染色体进化的一个指标[2~8].多态性是动物染色体Ag-NORs 的一个重要特征.鱼类的Ag-NORs 一般只呈现数目多态和形态多态等2种表现形式,有些研究认为鱼类的这两种多态现象无个体特异性.因此关于Ag-NORs 的多态性一度被认为是rDNA 转录活性差异的反映,即有转录活性的NORs 方能被银染,失活的NORs 则不能被银染[9].然而,近几年有些研究表明,某些动物种内Ag-NORs 多态性的表现可能是遗传变异的产物,例如不同地理位置的红点鲑交配群的Ag-NORs 数目及分布多态的检测以及某些动物中Ag-NORs 数目及形态的个体特异性研究等文献都证实,Ag-NORs 多态性是可以遗传的[8]. 任修海等[8,10]对黄鳝进行了Ag-NORs 多态性及荧光显带的研究,发现黄鳝染色体Ag-NORs 具有明显的个体特异性的数目多态、分布多态和形态多态现象.已证实黄鳝Ag-NORs 位置变化实质上是由于NORs 分布多态性,而不是Ag-NORs 的失活所致.Ag-NORs 多态性可以作为核型进化的指标来探讨近缘物种间或物种内不同地理居群间的关系.王蕊芳等[11]通过对不同地理区域鲫鱼染色体银染核仁组织者的比较,认为在鱼类进化中,随着NORs 增大和数目的增加,DNA 和rDNA 数量也随之增 第17卷第1期 宁德师专学报(自然科学版) 2005年2月 Journal of Ningde Teachers College(Natural Science)Vol 117 No 11 F eb.2005 X 收稿日期:2004-12-03作者简介:高 文(1966-),女,讲师,福建福鼎人,现从事高校生物教学及研究.

软骨细胞培养及其调控(一)

软骨细胞培养及其调控(一) 关键词：软骨细胞 自从1965年chestman和Smith首先开始软骨细胞体外培养用于软骨缺损修复的研究以来〔1〕，人们开始对关节软骨损伤不能通过自身的软骨增殖修复的概念有了新的认识。实验证明不仅年幼且年老的关节软骨标本仍可在体外培养出新生透明软骨〔2〕。虽然软骨细胞增殖能力有限，其质与量直接影响体外培养扩增效果，软骨细胞生长环境不同所表现出的生物学特性也有差别。软骨细胞在悬浮培养或半固体琼脂培养基中生长良好并保持表型稳定，在培养瓶底水凝胶覆盖的四维培养环境中长期培养时软骨细胞可形成结节结构其细胞形态胞外基质分泌和软骨特异性基因表达皆与关节软骨相似。软骨细胞的生长密度对其生长也至关重要。在同样的条件下体外单层培养时，由于细胞密度不同，软骨细胞的生长分裂经过和形态功能完全不同。组织学检查表明，细胞形态不同，其碱性磷酸酶活性、细胞分泌特异性基质的功能及对细胞作用因子的反应也不同，进一步研究表明，软骨细胞靠自分泌或旁分泌信号的方式而存活。 1细胞因子对体外培养软骨细胞的影响 软骨细胞的有限增殖性及存活密度的要求是限制软骨细胞单层培养修复关节软骨缺损及体外大量扩增的因素之一，随着细胞生物学的发展，软骨细胞体外培养特异基因表达的研究日益深入，细胞因子参与调节软骨细胞的增殖、分化过程渐被人们所揭示，这对软骨细胞体外培养研究又提出了一个新方向。近年来，关于细胞因子等多肽蛋白质对软骨细胞体外增殖分化等的影响研究也较多。也有些学者发现软骨细胞内含许多细胞因子及其受体，且表明许多细胞因子通过自分泌或旁分泌两种基本方式来调节软骨细胞。目前认为促进软骨细胞增殖和基质合成代谢的细胞因子有：IGFs.TGF-βs.PDGF,FGF.EGF，对软骨细胞有抑制作用的有IL-1、IL-2、IL-7、TNF-α、IFN-γ等，现就对软骨细胞有显著调节的细胞因子分述如下： 1.1转化生长因子beta(TGF-β) TGF-β最初是由Robert等学者在1978年作为一种可诱导大鼠成纤维细胞增殖因子而描述。TGF-β可以诱导间充质细胞转化为软骨细胞。现已实验证明TGF-βs具有促进软骨细胞增殖、调节其分化和胞外基质合成的能力〔3〕。F.Redni等实验证明培养兔关节软骨细胞表达了不同的TGFβ受体且与软骨细胞生长周期功能有关，软骨细胞在S期表现了低亲和力受体表型(kd=appiox1100pm)然而GO/G期的软骨细胞表现了高亲和力受体。因此，TGF-β对软骨细胞的作用有多种受体参与。同时也有实验证明TGF-β更多的结合在GO/G1期比S期的同步化软骨细胞，从而说明TGF-βs对软骨细胞的作用是通过不同的途径〔4〕。也有学者证明TGF-βs 在不同的条件下对成软骨细胞有促进分化或降低分化的双重作用，1-10ng/ml浓度的TGF-β可诱导大鼠胚胎肌细胞分化成软骨细胞，合成特异性的Ⅱ型胶原和蛋白多糖，而在0.4mol/L 浓度下，TGF-β可诱导大鼠颅骨成骨细胞的碱性磷酸酶活性，减少软骨细胞Ⅱ型胶原、蛋白多糖的合成〔5〕。同时也有实验证明TGF-β可抑制培养兔关节软骨细胞的终末分化及钙化。TGF-β可能与多种因素如胞外基质和其它分化调控生长因子参与对细胞的调节作用〔6〕。TGF-β在细胞对其它各种分化信号的应答过程中同样也有调节作用。Wen-NingQi等实验证明Ⅱ型胶原能特异的调节TGF-β刺激软骨细胞合成Ⅱ型前胶原DNA和蛋白多糖，同时说明Ⅱ

细胞培养标准流程

精品文档 细胞间基本规定 每次操作结束后开启超净台紫外（30 min）和房间大紫外（30 min）。 显微镜开启使用后将光调暗，最后一个操作者将显微镜关闭。 超净台用完收拾干净，移液器、盒子等摆放整齐。 带走空盒子、细胞圆盘以及封口膜等任何因你而产生的垃圾。 细胞培养盘至少需备注：所属者，细胞系名称 细胞间冰箱内物品至少需备注：所属者，物品名称。基培需写上开启时间。 细胞培养标准流程 1、细胞换液、传代（以圆盘培养为例） Note：所有用于培养细胞的液体均需提取20-30分钟从冰箱取出恢复到室温或置于37℃的水浴箱内。所有物品（包括双手）进入安全柜之前要酒精消毒。 步骤：1.观察：高倍镜下观察细胞状态、密度以及是否染菌 2.弃旧：细胞生长融合达90%时，吸出培养基 3.漂洗：PBS（2mL）漂洗1-2次 4.消化：加入1ml 0.25%胰蛋白酶，轻轻晃动圆盘让所有细胞接触到胰酶，后吸去胰酶计时CO放置40s-1min,，轻轻拍打圆盘侧壁促使细胞2 脱壁。 5.终止：吸弃胰酶后加入2ml含10?S的完全培养基终止消化。 6.吹悬：轻轻吹打混匀，(倒置显微镜下观察细胞完全脱壁，呈卵圆形)，吹打成单细胞悬液后按1：2 或1：3 比例传代接种于新培养皿。再加入10ml全培。（大盘10ml全培，小盘6ml全培） （细胞生长快留30%，慢40%-50%；其余细胞可提取蛋白或RNA） 7.培养：每天或每两天更换一次培养基，直至细胞生长至融合时再次进行传代，每日在倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况。 PS:六孔板一般加培养基2300μL/孔。 . 精品文档 2、细胞转染 TurboFect 转染试剂转染（用于质粒的转染，说明书附后） 细胞接板24 h 后转染。转染时细胞密度需达到70-90%。

细胞培养技术原理及应用

细胞培养技术原理及应用研究进展 姓名：赵鹏学号：158033038 专业：流行病与卫生统计学 摘要：细胞培养是指将采集体内组织的细胞模拟体内生长环境，放置在无菌、一定营养条件、适宜的温度及酸碱度下，使其生长、繁殖，并维持其结构和功能的一种技术，已成为生物、医学研究及应用广泛采用的技术方法。文章对细胞培养技术的应用作一综述。 关键词：细胞培养；应用；研究进展 细胞是构成机体的基本单位，是生命活动的基本单位。一切有机体（除病毒）都是由细胞组成的。细胞具有独立的、有序的自控代谢体系。因此，对细胞的深入研究是揭开生命奥秘、征服疾病的关键。细胞培养是指将采集体内组织的细胞模拟体内生长环境，放置在无菌、一定营养条件、适宜的温度及酸碱度下，使其生长、繁殖，并维持其结构和功能的一种技术。细胞培养技术的优点是可以直接观察活细胞的形态结构、生命活动及其变化；提供大量生物性状相似的试验对象，特别是研究大型动物（奶牛）时具有耗资少的优点。但模拟体内环境仍与实际有很大的差异，因此利用细胞培养技术的试验结果不可以轻易做出与体内等同的结论。 动物组织（细胞）培养开始于20世纪初，现已成为生物、医学研究及应用广泛采用的技术方法[1 ]。随着细胞培养技术的不断发展，现在也广泛应用于动物生产研究。20 世纪60 年代，该技术应用于水产动物的病毒分离和纯化，对于鱼类疾病的防治具有重要作用。近年来研究发现单一种子细胞难以完成构建复杂组织的需要，因此产生了联合培养细胞技术。联合培养下的细胞之间存在着精细的相互调控关系，因而更符合仿生学的原理且更有利于种子细胞的增殖与分化，为复杂的细胞诱导分化以及体外组织构建提供了新思路、新方法[2 ]。 1 细胞培养 细胞培养是将活体组织或细胞从试验动物体内取出，放在模拟体内生存环境的体外环境（无菌、适温、营养丰富）中，使高体细胞生长、发育的一种方法。按照培养的结构成分不同，将其分为组织培养、细胞培养及器官培养等。根据细胞是否在支持物上生长，将其分为贴壁型和悬浮型。一般来说，圆形细胞如淋巴细胞属于悬浮型，而胞体梭型（成纤维型细胞）、扁平不规则（上皮型细胞）等属于贴壁型，贴壁型细胞必需贴附在支持物表面生长。细胞培养开始于1906 年，Harrison 用蛙新鲜淋巴液培养蛙胚神经组织4 周，首次成功地利用体外培养液培养神经元，标志着组织细胞的体外培养模式的基本建立。随着细胞培养技术的不断发展和完善，20 世纪50 年代进入繁盛阶段，细胞培养逐渐被基础研究与应用领域所应用，特别是在医学领域得到迅速的发展。目前，细胞培养技术已经涉及到生物学、农业、环境保护等领域[ 3 ]。 目前，在细胞培养过程中，只能根据离体细胞的特点和培养条件，提供满足其生长和发育的一些基本生理条件。必须在无菌条件下进行，细胞感染微生物后，会因被夺营养物质而导致细胞生长缓慢或停滞，甚至死亡。需要提供适宜的温度和pH，一般哺乳动物细胞培养的温度控制在37 ℃，鱼类的温度要低一些。温度过高或过低时，均不利于细胞生长甚至会导致细胞死亡。动物细胞最适宜pH一般控制在7.2~7.4，在此范围细胞生长活跃，增殖速度快，如果过低或过高性，细胞会因为细胞膜受损而死亡。细胞离体培养技术的关键是细胞培养液的设计，理想的细胞培养液可以同时解决细胞离体培养所需要的pH、渗透压、营养物质、调节物质的全部需要。细胞培养液中需含有细胞增殖、生长所需要的各种营养物质。如提供能量的物质（N源、C源）、代谢调节控制的物质（无机盐、维生素、激素）。另外，在细胞培养过程中需要提供一定量的气体（O2和CO2）。CO2具有调节pH和缓冲的作用，一般提供5% CO2。

MRI对膝关节软骨损伤的诊断

MRI对膝关节软骨损伤的诊断一、介绍关节软骨属于透明软骨，表面光滑，呈淡蓝色，有光泽，厚度约1-5mm。关节镜检查只能看到形态，MRI是目前唯一日常性成像方式，已经发展成检查关节软骨主要的主要技术。二、关节软骨的组织结构关节软骨属于透明软骨，关节软骨根据细胞胶原介质分四层结构第一层是浅表层，也称为切线层。胶原纤维排列方向与关节面相互平行；第二层是附着层；胶原纤维成斜线排列；第三层是辐射层；胶原纤维排列方向与关节面相互垂直；第四层是钙化层；与骨性关节面紧密结合在一起。在辐射层和钙化层之间有一条线，称之为潮线，是关节软骨成熟的标志。 三、MRI对关节软骨的成像技术MRI对关节软骨的成像技术分为形态学成像技术和分子影像学成像技术。分子影像学成像技术涉及关节软骨的组织成分。分为软骨细胞、细胞外基质（包括电解液、5%蛋白多糖、20%胶原纤维等）。分子影像学从分子角度检测钠离子浓度变化、蛋白多糖变化以及蛋白多糖中糖原多糖变化情况，然后通过分子结构的改变来重建图像。从组织学上说，软骨损伤的因素包括外伤、配电以及其他非理化性因素等。软骨的损伤包括浅层、附着层、辐射层甚至钙化层的损伤。关节软骨无神经血管乃至淋巴，因此关节软骨受到创伤很难愈合。软骨损伤不是单一的疾病，还涉及邻近组织一些静态的改变，如韧带的损伤、组织下变化以及骨性关节炎的变化等。最终导致患者的功能障碍。核磁有很强的空间和密度

分辨率，能够早期探测出软骨的变化，进而做出适当的处理。因此核磁在软骨的探测方面，具有独到的优势。（一）形态学成像技术形态学成像技术，也是临床上常用的检测技术，可以清楚的显示关节软骨形态、大小以及厚度。能够提供准确的信息，对关节软骨的分度如局限性缺损、全层的缺损以及关节软骨修复术当中也起着很重要的作用。关节软骨从形态学上分类：0级：正常关节软骨。如右图A 1级：形态正常，信号略有增高。如右图 B 2级：关节软骨表层缺损，但未及关节软骨厚度的50%。如右图C 3级：关节软骨表层缺损，超过关节软骨厚度的50%但未达到100%。如右图D 4级：全层关节软骨的缺损。其中4级分为 1 累及关节软骨下骨质的缺损(如上图F)和未关节软骨下骨质(如上图E)两类形态学成像技术临床上常用的有T1WI、T2WI以及T2WI-fs。如上图。它们显示骨性结构，关节软骨和关节腔积液方面都具有各自的优势。 T1WI显示解剖细节有图特的优势。 T1WI下可以看见解剖结构序列、关节软骨以及软骨下的骨质、骨小梁以及骨髓分层的对比度都能很好地显示。因为关节积液在TI加权图像上显示低信号，关节软骨显示中等信号，低信号的关节积液和中等信号的关节软骨之间缺乏明显的对比，因此TI加权像对软骨表层浅层缺损的显示不敏感。但因为T1WI关节软骨和关节软骨下骨质对比明显，则T1WI显示关节软骨深层缺损比较敏感。 T2WI以及亚真像对关节积液和游离水的信号非常

软骨细胞培养

实验方法 各种溶液的配制 1、配制D-Hanks液(无钙镁)1L，PH8-9 （1）称量Nacl8.0g，kcl0.4g,Na2Hpo4.H2o 0.06g, kH2po40.06g，NaHco30.35g，酚红0.02g （2）依次将各成分逐个溶解于800ml水中。 （3）用5.6% NaHco3溶解酚红0.02克。 （4）将酚红液（３）加入（２）中。 （5）补加水至1000ml，混匀。 （6）将Hanks液分装盐水瓶内，110℃、8镑高压蒸汽消毒灭菌20分钟，4℃冰箱保存备用。 2、配制0.25%胰蛋白酶溶液75ml （1）称取胰蛋白酶187.5mg，用少量D-Hanks液先将胰蛋白酶粉末调成糊状。（2）补足Hanks液至75ml，搅拌混匀，置40℃水浴搅拌帮助溶解。 （3）冷却至室温后，置4℃冰箱过夜。 （4）用滤纸粗滤，再用0.22μm微孔过滤膜过滤除菌。 （5）分装小瓶，低温冰箱冰冻保存备用。 3、配制0.3%Ⅱ型胶原酶溶液49.5ml （1）称取Ⅱ型胶原酶150mg，用D-Hanks液溶解。 （2）补足Hanks液至49.5ml，搅拌混匀。 （3）用0.22μm微孔滤膜过滤除菌。 （4）分装小瓶，低温冰箱保存备用。 4、配制闪烁液 （1）用电子天平称取POPOP 0.2g，PPO 2.0g。 （2）将上二者溶解在500ml二甲苯中，避光保存，备用。 取材与培养 （1）取3kg重6月龄青紫蓝兔一只(购自首都医科大学动物房)，兔耳静脉注射5ml空气致死。 （2）无菌条件下取双侧下肢膝，髋关节面软骨，置于D-Hanks液中漂洗2次,并用眼科剪将软骨剪碎至1mm3大小,继续用D-Hanks液漂洗2次。 （3）吸去漂洗液，加入0.25%胰蛋白酶溶液，并置入37℃、5%CO2孵箱中消化30分钟,中途不时摇晃。 （4）吸出胰蛋白酶溶液，加入0.3%Ⅱ型胶原酶溶液，置入37℃、5%CO2孵箱中继续消化3小时。每1小时更换Ⅱ型胶原酶溶液1次。用离心管留取各次消化液，离心2000rpmX10min，去除上清液。 （5）用加了青霉素及链霉素的Hanks液洗1次，以同样方法再离心一次。（6）过120目纱目，去除上清液。 （7）用含10%FBS的DMEM制成细胞悬液，调细胞悬液浓度至7.5X104。（8）将细胞悬液接种于24孔培养板（1ml）及96孔培养板（200μm）中，24孔板及96孔板各2板。

软骨细胞培养及其调控

关键词：软骨细胞自从1965年chestman和Smith首先开始软骨细胞体外培养用于软骨缺损修复的研究以来［1］，人们开始对关节软骨损伤不能通过自身的软骨增殖修复的概念有了新的认识。实验证明不仅年幼且年老的关节软骨标本仍可在体外培养出新生透明软骨［2］。虽然软骨细胞增殖能力有限，其质与量直接影响体外培养扩增效果，软骨细胞生长环境不同所表现出的生物学特性也有差别。软骨细胞在悬浮培养或半固体琼脂培养基中生长良好并保持表型稳定，在培养瓶底水凝胶覆盖的四维培养环境中长期培养时软骨细胞可形成结节结构其细胞形态胞外基质分泌和软骨特异性基因表达皆与关节软骨相似。软骨细胞的生长密度对其生长也至关重要。在同样的条件下体外单层培养时，由于细胞密度不同，软骨细胞的生长分裂经过和形态功能完全不同。组织学检查表明，细胞形态不同，其碱性磷酸酶活性、细胞分泌特异性基质的功能及对细胞作用因子的反应也不同，进一步研究表明，软骨细胞靠自分泌或旁分泌信号的方式而存活。1 细胞因子对体外培养软骨细胞的影响软骨细胞的有限增殖性及存活密度的要求是限制软骨细胞单层培养修复关节软骨缺损及体外大量扩增的因素之一，随着细胞生物学的发展，软骨细胞体外培养特异基因表达的研究日益深入，细胞因子参与调节软骨细胞的增殖、分化过程渐被人们所揭示，这对软骨细胞体外培养研究又提出了一个新方向。近年来，关于细胞因子等多肽蛋白质对软骨细胞体外增殖分化等的影响研究也较多。也有些学者发现软骨细胞内含许多细胞因子及其受体，且表明许多细胞因子通过自分泌或旁分泌两种基本方式来调节软骨细胞。目前认为促进软骨细胞增殖和基质合成代谢的细胞因子有：IGFs.TGF-βs.PDGF,FGF.EGF，对软骨细胞有抑制作用的有IL- 1、IL-2、IL-7、TNF-α、IFN-γ等，现就对软骨细胞有显著调节的细胞因子分述如下：1.1 转化生长因子beta(TGF-β) TGF-β最初是由Robert等学者在1978年作为一种可诱导大鼠成纤维细胞增殖因子而描述。T GF-β可以诱导间充质细胞转化为软骨细胞。现已实验证明TGF-βs具有促进软骨细胞增殖、调节其分化和胞外基质合成的能力［3］。F.Redni等实验证明培养兔关节软骨细胞表达了不同的TGFβ受体且与软骨细胞生长周期功能有关，软骨细胞在S期表现了低亲和力受体表型(kd=appiox 1100pm)然而GO/G期的软骨细胞表现了高亲和力受体。因此， TGF-β对软骨细胞的作用有多种受体参与。同时也有实验证明TGF-β更多的结合在GO/G1 期比S期的同步化软骨细胞，从而说明TGF-βs对软骨细胞的作用是通过不同的途径［ 4］。也有学者证明TGF-βs在不同的条件下对成软骨细胞有促进分化或降低分化的双重作用，1-10ng/ml浓度的TGF-β可诱导大鼠胚胎肌细胞分化成软骨细胞，合成特异性的Ⅱ型胶原和蛋白多糖，而在0.4mol/L浓度下，TGF-β可诱导大鼠颅骨成骨细胞的碱性磷酸酶活性，减少软骨细胞Ⅱ型胶原、蛋白多糖的合成［5］。同时也有实验证明TGF-β可抑制培养兔关节软骨细胞的终末分化及钙化。TGF-β可能与多种因素如胞外基质和其它分化调控生? ?］。TGF-β在细胞对其它各种分化信号的应答过程中同样也有调节作用。Wen-Ning Qi等实验证明Ⅱ型胶原能特异的调节TGF- β刺激软骨细胞合成Ⅱ型前胶原DNA和蛋白多糖，同时说明Ⅱ型胶原在TGF-β存在的条件下调节软骨细胞特异性基因表达具有剂量依赖性(量效关系)。因此Ⅱ型胶原基因表达的变化在 TGF存在条件下受Ⅱ型胶原的调控［7，8］。[!--empirenews.page--] 体外实验证明，许多细胞因子对软骨细胞有协同或拮抗作用如TGF-βs、IGFs、FGF、BMP、 IL-1等，兔关节软骨细胞体外培养时，TGF-β对IGF的分泌作用有三种，(1)减少41KD的IG FBP；(2)增加IGF受体的结合位点； (3)下调了诱导型IGF-1受体的自身磷酸化［9］，从而促进软骨细胞的增殖和特异性基质的合成。也有学者认为TGF-β和IGF可以使反分化的软骨细胞再分化诱导和持久表达Ⅱ型胶原和蛋白多糖［10］。软骨细胞在传代培养中表型的变化可能与软骨细胞自分泌IL-1有关，而TGFβ可作为一种IL-1的拮抗剂，减少了IL-1对胞外基质的分解代谢同时也下调了IL-1受体及其金属蛋白酶的表达［1 1］。TGFβ可能通过以下两种途径拮抗IL-1的作用，(1)刺激成软骨细胞中蛋白糖抑制剂的产生。(2)抑制软骨细胞蛋白酶的产生，因而对细胞外基质的

细胞培养基本条件培训讲学

细胞培养基本条件

细胞培养基本条件 1、合适的细胞培养基 合适的细胞培养基是体外细胞生长增殖的最重要的条件之一，培养基不仅提供细胞营养和促使细胞生长增殖的基础物质，而且还提供培养细胞生长和繁殖的生存环境。 2、优质血清 目前，大多数合成培养基都需要添加血清。血清是细胞培养液中最重要的成分之一，含有细胞生长所需的多种生长因子及其它营养成分。 3、无菌无毒细胞培养环境 无菌无毒的操作环境和培养环境是保证细胞在体外培养成功的首要条件。在体外培养的细胞由于缺乏对微生物和有毒物的防御能力，一旦被微生物或有毒物质污染，或者自身代谢物质积累，可导致细胞中毒死亡。因此，在体外培养细胞时，必须保持细胞生存环境无菌无毒，及时清除细胞代谢产物。 4、恒定的细胞生长温度 维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定适宜的温度。 5、合适的气体环境 气体是哺乳动物细胞培养生存必需条件之一，所需气体主要有氧气和二氧化碳。 细胞培养基种类与基本成分 细胞培养基的种类很多，按其来源分为合成培养基和天然培养基（目前使用的培养基绝大部分是合成培养基），按其物质状态分为干粉培养基和液体培养基

两类。干粉培养基需由实验者自己配制并灭菌，液体培养基由专业商家提供，用户可直接使用，非常方便。 1、合成培养基的主要成分有：氨基酸、碳水化合物、无机盐、维生素及其它辅助物质： 氨基酸 氨基酸是组成蛋白质的基本单位。不同种类的细胞对氨基酸的要求各异，但有几种氨基酸细胞自身不能合成，必须依靠培养液提供，这几种氨基酸称为必需氨基酸。其中谷氨酰胺是细胞合成核酸和蛋白质必需的氨基酸，在缺少谷氨酰胺时，细胞生长不良而死亡。因此，各种培养液中都有较大量的谷氨酰胺。但是，由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定，应置于-20℃冰箱中保存，在使用前加入培养液内。已含谷氨酰胺的培养液在4℃冰箱中储存2 周以上时，还应重新加入原来量的谷氨酰胺。 碳水化合物 碳水化合物是细胞生长主要能量来源，其中有的是合成蛋白质和核酸的成分。主要有葡萄糖、核糖、脱氧核糖、丙酮酸钠和醋酸等。 无机盐 培养液中无机盐的主要功能是帮助细胞维持渗透压平衡。此外，通过提供钠，钾和钙离子，帮助细胞调节细胞膜功能。培养液的渗透压是一个非常重要的因素, 细胞通常可耐受260mOsm/kg ～320 mOsm/kg。标准培养液的渗透压在此范围内波动。特别注意：向培养液中加入其它物质有可能会明显改变培养液的渗透压，特别是溶于强酸或强碱中的物质。向培养液中添加HEPES 时需按以下方法调节钠离子浓度。

鱼类细胞原代培养及其Giemsa形态、MTT增殖分析、细胞计数

血细胞原代培养及其形态、增殖分析 1材料 1.1试剂、药品 培养基配制：血清使用时临时添加，培养基为DMEM培养基添加双抗。双抗(青霉素、链霉素)终浓度均为100μg/ml。血清为临时添加，终浓度为20%。 巯基乙醇：根据换算0.1mM的1L溶液须0.7ul巯基乙醇。换言之，以巯基乙醇与双蒸水按70ul：930ul比例配置为母液，每100ml培养基仅需1ul 双抗：先各取0.5g溶于50ml无菌双蒸水中，此时其浓度为0.1mg/ml= 10,000μg/ml,分装入250ulEP管中，此部切记EP管架。使用时每1ml加10μL即100μg/mL。剩余-4°冻存。 鉴于各组分均为使用时添加，故不进行单独过滤除菌。 培养基分装于250mL试剂瓶，血清分装于50mL试剂瓶。 PBS：NaCl:8g；KCl:2g; Na2HPO4·7H2O:1.15g（如果是12水合则为1.44g）; KH2PO4:0.2g 加水定容至1L，高压灭菌。 操作中使用一次性10ml滴定管，移液器1mL，100μL。 胰酶：以PBS添加0.25%胰酶配制。过滤除菌，此步须注射一次性过滤器0.2微米。 肝素钠：取肝素钠100mg溶于10mL生理盐水中（0.9%NaCl），以10ml离心管盛装，过滤除菌。 麻醉剂：5ml丁香酚与5ml无水乙醇混溶， 冻存液：无色甘油或DMSO加入含20%FBS培养基中，终浓度为10% MTT：取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS），用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃避光保存即可 Wright-Giemsa：取两样各0.5g，甲醇500ml，配成染液 台盼蓝染色液：4%台盼蓝母液，取4g台盼蓝，加少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100ml滤纸过滤，4°保存。使用时用PBS稀释至0.4%。 1.2器材 离心机1、15、50ml 离心管1.5、15、50ml 脱脂棉、纱布、锡箔纸 血细胞计数板、细胞计数器 培养容器：96孔、24孔板，一次性细胞培养瓶、一次性培养皿30、60mm、载玻片、盖玻片 倒置显微镜（可拍照） 细胞培养箱 酒精喷壶 5ml、15ml一次性注射器 1000、500、250ml、100、50ml试剂瓶 一次性针头过滤灭菌器0.22um

细胞培养技术原理与应用

细胞培养技术原理及应用研究进展 ：鹏学号：158033038 专业：流行病与卫生统计学 摘要：细胞培养是指将采集体组织的细胞模拟体生长环境，放置在无菌、一定营养条件、适宜的温度及酸碱度下，使其生长、繁殖，并维持其结构和功能的一种技术，已成为生物、医学研究及应用广泛采用的技术方法。文章对细胞培养技术的应用作一综述。 关键词：细胞培养；应用；研究进展 细胞是构成机体的基本单位，是生命活动的基本单位。一切有机体（除病毒）都是由细胞组成的。细胞具有独立的、有序的自控代体系。因此，对细胞的深入研究是揭开生命奥秘、征服疾病的关键。细胞培养是指将采集体组织的细胞模拟体生长环境，放置在无菌、一定营养条件、适宜的温度及酸碱度下，使其生长、繁殖，并维持其结构和功能的一种技术。细胞培养技术的优点是可以直接观察活细胞的形态结构、生命活动及其变化；提供大量生物性状相似的试验对象，特别是研究大型动物（奶牛）时具有耗资少的优点。但模拟体环境仍与实际有很大的差异，因此利用细胞培养技术的试验结果不可以轻易做出与体等同的结论。 动物组织（细胞）培养开始于20世纪初，现已成为生物、医学研究及应用广泛采用的技术方法[1 ]。随着细胞培养技术的不断发展，现在也广泛应用于动物生产研究。 20 世纪60 年代，该技术应用于水产动物的病毒分离和纯化，对于鱼类疾病的防治具有重要作用。近年来研究发现单一种子细胞难以完成构建复杂组织的需要，因此产生了联合培养细胞技术。联合培养下的细胞之间存在着精细的相互调控关系，因而更符合仿生学的原理且更有利于种子细胞的增殖与分化，为复杂的细胞诱导分化以及体外组织构建提供了新思路、新方法[2 ]。 1 细胞培养

细胞培养中的注意事项

细胞培养中的注意事项 1 冷冻管应如何解冻？ 取出冷冻管后，须立即放入37C水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化，并注意水面不可超过冷冻管盖沿，否则易发生污染情形。另冷冻管由液氮桶中取出解冻时，必须注意安全，预防冷冻管之爆裂。 2 细胞冷冻管解冻培养时，是否应马上去除DMSO？ 除少数特别注明对DMSO敏感之细胞外，绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞），在解冻之后，应直接放入含有10-15ml新鲜培养基之培养角瓶中，待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO即可，如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。 3 可否使用与原先培养条件不同之培养基？ 不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基，若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基，细胞大都无法立即适应，造成细胞无法存活。 4 可否使用与原先培养条件不同之血清种类？ 不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源，所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同物种的血清，在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞无法存活。 5 何谓FBS, FCS, CS, HS ? FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum)是相同的意思，两者都是指胎牛血清，FCS乃错误的使用字眼，请不要再使用。CS (calf serum) 则是指小牛血清。HS(horseserum)则是指马血清。 6 培养细胞时应使用5 %或10% CO2？或根本没有影响？ 一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+作为pH的缓冲系统，而培养基中NaHCO3的含量将决定细胞培养时应使用的CO2浓度。当培养基中NaHCO3含量为每公升3.7g时，细胞培养时应使用10% CO2；当培养基中NaHCO3为每公升1.5 g时，则应使用5%CO2培养细胞。 7 何时须更换培养基？ 视细胞生长密度而定，或遵照细胞株基本数据上之更换时间，按时更换培养基即可。 8 培养基中是否须添加抗生素？ 除于特殊筛选系统中外，一般正常培养状态下，培养基中不应添加任何抗生素。 9附着性细胞继代时所使用之trypsin-EDTA浓度？应如何处理？ 一般使用之trypsin-EDTA 浓度为0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4Na。第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于–20C，避免反复冷冻解冻造成trypsin之活性降低，并可减少污染之机会。 10 悬浮性细胞应如何继代处理？ 一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶中，稀释细胞浓度即可，若培养液太多时，可将培养角瓶口端稍微抬高，直到无法容纳为止。分瓶时取出一部份含细胞之培养液至另一新的培养角瓶，加入新鲜培养基稀释至适当浓度，重复前述步骤即可。 11 欲将一般动物细胞离心下来，其离心速率应为多少转速？ 欲回收动物细胞，其离心速率一般为300xg (约1,000rpm)，5 - 10分钟，过高之转速，将造成细胞死亡。 12 细胞之接种密度为何？ 依照细胞株基本数据上之接种密度或稀释分盘之比例接种即可。细胞数太少或稀释的太多亦是造成细胞无法生长之一重要原因。 13 细胞冷冻培养基之成份为何？ 动物细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基是含5 - 10% DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 -95%原来细胞生长用之新鲜培养基均匀混合之。注意：由于DMSO稀释时会放出大量热能，故不可

MRI对膝关节软骨损伤的诊断

MRI对膝关节软骨损伤的诊断 一、介绍 关节软骨属于透明软骨，表面光滑，呈淡蓝色，有光泽，厚度约1-5mm。关节镜检查只能看到形态，MRI是目前唯一日常性成像方式，已经发展成检查关节软骨主要的主要技术。 二、关节软骨的组织结构 关节软骨属于透明软骨，关节软骨根 据细胞胶原介质分四层结构 第一层是浅表层，也称为切线层。胶原 纤维排列方向与关节面相互平行； 第二层是附着层；胶原纤维成斜线排 列； 第三层是辐射层；胶原纤维排列方向与 关节面相互垂直； 第四层是钙化层；与骨性关节面紧密结 合在一起。在辐射层和钙化层之间有一条 线，称之为潮线，是关节软骨成熟的标志。 三、MRI对关节软骨的成像技术 MRI对关节软骨的成像技术分为形态学成像技术和分子影像学成像技术。分子影像学成像技术涉及关节软骨的组织成分。分为软骨细胞、细胞外基质（包括电解液、5%蛋白多糖、20%胶原纤维等）。分子影像学从分子角度检测钠离子浓度变化、蛋白多糖变化以及蛋白多糖中糖原多糖变化情况，然后通过分子结构的改变来重建图像。 从组织学上说，软骨损伤的因素包括外伤、配电以及其他非理化性因素等。软骨的损伤包括浅层、附着层、辐射层甚至钙化层的损伤。关节软骨无神经血管乃至淋巴，因此关节软骨受到创伤很难愈合。软骨损伤不是单一的疾病，还涉及邻近组织一些静态的改变，如韧带的损伤、组织下变化以及骨性关节炎的变化等。最终导致患者的功能障碍。 核磁有很强的空间和密度分辨率，能够早期探测出软骨的变化，进而做出适当的处理。因此核磁在软骨的探测方面，具有独到的优势。 （一）形态学成像技术 形态学成像技术，也是临床上常用的检测技术，可以清楚的显示关节软骨形态、大小以及厚度。能够提供准确的信息，对关节软骨的分度如局限性缺损、全层的缺损以及 关节软骨修复术当中也起着很重要的作用。 关节软骨从形态学上分类： 0级：正常关节软骨。如右图A 1级：形态正常，信号略有增高。如右图B 2级：关节软骨表层缺损，但未及关节软骨 厚度的50%。如右图C 3级：关节软骨表层缺损，超过关节软骨厚 度的50%但未达到100%。如右图D 4级：全层关节软骨的缺损。其中4级分为