原位杂交具体步骤

原位杂交流程

以下是用含有cDNA的质粒酶切出DNA片段标记探针 对石蜡切片进行mRNA检

测的流程图。这些实验操作方法很多参考书中均有 但没有一本书是专为这个目的而系

统地加以总结的 因此特加以综合供同行参考 在具体操作过程中很多地方可酌情变更。

在临床应用中 常常可以买到已经标记好的商品探针 那么前面一大部分扩增基因、酶切鉴定、标记探针的工作就可以省去 从石蜡切片处理做起即可。

下面介绍的方法笔者已亲手做过数次 可获满意结果。

主要操作步骤

制备感受态细菌

用含目的基因的质粒转化细菌

小量培养转化的细菌

小量提取质粒

小量酶切质粒

电泳鉴定

大量培养转化的细菌

大量提取质粒

大量酶切质粒

电泳分离、回收及纯化

标记探针

石蜡切片的处理

预杂交、杂交

杂交后处理

抗体连接、显色

制备感受态细菌

【试剂及配制】

1 LB液体培养基

在900ml三蒸水中加入

胰蛋白胨(bacto-tryptone) 10g

酵母提取物(bacto-extract) 5g

NaCl 10g

磁力搅拌使完全溶解 用5mol NaOH调节pH至7.0 如用进口试剂则不必调 。定容为1000ml 高压灭菌20min。

2 0.1mol CaCl2溶液

1.1g无水氯化钙 溶于90ml三蒸水中 定容至100ml 用0.22μm滤器过滤除菌置于灭菌试剂瓶中 4℃保存。

【材料】

大肠杆菌单菌落或冻存菌种 也可复苏陈旧的感受态细菌重新制备新的感受态。

【操作方法】

1 从37℃培养1

2 16h的平板中用无菌的接种环 用前酒精灯烧红晾凉 挑一单菌落 转入含有5ml LB培养基的无菌试管 37℃振摇 200r/min 过夜。次日取菌液1ml 加入含100ml LB培养基的500ml 锥形烧瓶 37℃振摇培养 200 300r/min 约2 3h

将烧瓶取出立即置冰浴10 15min

2 以下均为无菌操作。在超静工作台中将细菌转移到一个灭过的冰预冷50ml离心

管中

3 4℃离心 5000g ×10min 回收细菌

4 弃去培养液 将管倒置于滤纸上1min 流尽培养液

5 用冰预冷的0.1mol CaCl2 10ml 重悬菌体 置冰浴30min

6 4℃离心 5000g ×10min 弃上清 倒置于滤纸上1min

7 加4ml 用冰预冷的0.1mol CaCl2 重悬菌体 动作要轻

8 置4℃冰箱12 24h 即可用于转化。

感受态细菌的冻存

一次制备的感受态不能用完 可冻存起来备用。将甘油装1.5ml EP 管中 沸水浴

10min以杀菌。将感受态细菌分装成400μm一份 每份加30%体积的甘油 充分混匀 置-70℃冰箱 一年内可使用。

用含目的基因的质粒转化细菌

【试剂及配制】

1 LB液体培养基

2 氨苄青霉素 Amp 选择性培养基

LB培养基中加入1.5%的琼脂 15g/L 高压灭菌20min 取出 在无菌条件下 冷却至50℃左右时 烧手但尚可忍受 加入抗生素或其他必需成分 如为氨苄青霉素 Amp

选择性培养基 则以50mg/ml的氨苄青霉素贮存液按50μg/ml的量加入 即每ml培养

基加入1μl氨基苄。

3 氨苄贮存液

将氨苄青霉素钠溶于三蒸水 配成50mg/ml溶液 以0.22μm滤纸过滤 1ml一份

分装 存于-20℃。

【操作方法】

1 无菌状态下取新鲜感受态200μl置于无菌的10ml玻璃试管中。如果使用冻存的

感受态细菌时 将其从-70℃冰箱取出 握于手中 待其解冻后立即吸取200μl 转移至

10ml无菌玻璃试管中 剩余的感受态弃去 不能再冻存复用

2 每管加质粒50 100ng 轻轻旋转以混合内容物 在冰上放置30min

3 42℃水浴热休克90s 不要摇动试管

4 每管加无抗生素的LB培养基1ml 37℃摇床温和摇振 100 150r/min 45min

5 用无菌的弯头玻璃铺菌器 用前酒精灯烧 再晾凉 将200μl菌液铺于含氨苄青

霉素的琼脂平板表面 37℃放置20min 然后倒置培养14 20h 37℃ 。

小量培养转化的细菌

【操作方法】

1 取灭菌处理的10ml 玻璃试管 用无菌吸管加入约5ml LB液体培养基 再加入

50mg/ml 氨苄青霉素5μl

2 用接种环或无菌牙签挑取单菌落 送入培养液中 晃动使细菌进入培养液 封好管口

3 37℃摇床100 200r/min 约6 12h 可过夜 使生长饱和。

质粒的少量提取

【试剂及配制】

1 溶液Ⅰ

葡萄糖 C6H12O6·H2O 1.982g

三蒸水160ml

0.5mol EDTA pH8.0 4ml

1mol Tris-Cl pH8.0 5ml

以三蒸水定容至200ml 高压灭菌 4℃保存

0.5 mol EDTA pH8.0 的配制

Na2EDTA·H2O 186.1g 如无水 则为175g

三蒸水700ml

边磁力搅拌边加入固体NaOH 缓慢少量加入 待充分溶解 pH接近8.0 用酸度计

调节pH8.0 HCl/NaOH

1mol Tris-Cl pH8.0 的配制

Tris 碱121g

三蒸水800ml

充分搅拌 用浓盐酸将pH调节至8.0 酸度计测量

2 溶液Ⅱ

配制50ml的量 现用现配。

10 mol NaOH 1ml

三蒸水40ml

10% SDS 5ml

用三蒸水定容至50ml

10mol NaOH 的配制

40g NaOH晶体加三蒸水至100ml

10% SDS 的配制

戴口罩 称10g SDS 溶于80ml三蒸水中 68℃助溶 加数滴1mol HCl 调pH7.2

定容至100ml

1mol HCl 的配制

于通风橱中 三蒸水91.4ml 浓盐酸8.6ml 混匀

3 溶液Ⅲ

5mol 乙酸钾60ml

冰乙酸11.5ml

三蒸水28.5ml

高压灭菌 4℃保存

5mol 乙酸钾配制 200ml

乙酸钾98.14g

三蒸水160ml

搅拌溶解 定容至200ml;

4 3ml 乙酸钠 NaAc pH5.2

配制 500ml

乙酸钠 CH3COONa·H2O 201.1g

三蒸水200ml

用冰乙酸调节pH为5.2 三蒸水定容至500ml 高压灭菌 4℃保存。

5 平衡酚

在粗酚中加入0.1% 8-巯基喹啉 然后倒入0.1mol Tris-Cl pH8.0 避光磁力搅拌4h

静置后移去水相 再加0.1mol Tris-Cl pH8.0 搅拌、去除水相 反复进行 直到水相pH>7.8

时为止 装棕色瓶 4℃保存。

6 TE 缓冲液pH8.0

配制最终使 10mmol Tris-Cl pH8.0

1mmol EDTA pH8.0

7 其它试剂 氯仿 乙戊醇 V/V=24 1 、无水乙醇、70%乙醇

【操作方法】

1 取1ml菌液置于1.5ml的EP管中 10000g×30s 离心

2 控尽上清液

3 加溶液Ⅰ100μl 重悬菌体

4 加溶液Ⅱ200μl 倒转均匀

5 加溶液Ⅲ150μl 混匀

6 10000g×5min 离心

7 转移上清至另一EP管

8 加等体积平衡酚混匀 室温离心 8000g×5min

9 小心吸取上清 转移至另一EP管中 勿将酚层吸出

10 重复8、9的步骤

11 等体积氯仿 乙戊醇 混匀

12 离心 8000g×5min

13 转移上清至另一EP管

14 加1/10体积3mol NaAc pH5.2 和2.5倍体积的无水乙醇 混匀

15 置液氮10min 或-20℃冰箱1h

16 离心 10000g×10min

17 弃上清 留沉淀 70%乙醇洗一次

18 离心 10000g×10min

19 弃上清 留沉淀 晾干

20 加TE pH8.0 50μl 溶解沉淀

21 加RNase A (10mg/ml) 3 5μl 混匀 稍离心

22 37℃水浴30 min

23 -20℃保存待用。

小量酶切质粒

鉴定常用20μl反应体系。

【操作方法】

1 在灭菌的新EP管中加入7μl三蒸水

2 加入10×缓冲液2μl

3 加限制酶5μl

4 最后加入质粒DNA10μl

5 稍离心 混匀

6 37℃水浴1 1.5h

7 无水乙醇沉淀 2.5倍体积无水乙醇 混匀液氮10min或-20℃30min 离心

8 弃上清 晾干 加10μl TE 建立第二个酶切体系 37℃1 1.5h

电泳鉴定

【试剂及配制】

1 0.5×TBE

先配5×TBE贮存液 然后用三蒸水稀释10倍

5×TBE配制 1000ml

Tris 碱54g

硼酸27.5g

0.5mol EDTA pH8.0 2ml

2 EB 10mg/ml

3 琼脂糖

4 上样缓冲液

0.25% 溴酚蓝

0.25% 二甲苯青FF

30%甘油

【操作方法】

1 用胶带纸封住洗净、晾干的电泳胶盒两端 放好梳齿 水平放置于工作台上

2 0.5×TBE + 琼脂糖 1% 电炉上融化 勿暴沸 待其冷却至50 60℃时 加

入EB约5μl 充分混匀

3 将凝胶倒入胶模 厚约3 5mm 避免产生气泡

4 在室温中放置30 45min 撕去胶带纸 放入电泳槽 电泳槽内为0.5×TBE 应

没过凝胶 去除梳齿 预电泳10min

5 将DNA样品与上样缓冲液混合 加进上样孔内 应设一marker作对照

6 60 100V恒压电泳 使DNA向阳极移动 黑线为负极 红线为正极

7 电泳完成后 戴塑料手套 取出胶盒 将凝胶放紫外灯下观察有无切出的电泳带。

大量培养转化的细菌

小量酶切鉴定证实细菌内含有目的基因 即可大量培养。

【操作方法】

在500ml灭菌处理过的培养瓶中加LB培养基200ml 加入50mg/ml的氨苄贮存液200μl 将小量培养的菌液取2ml加入瓶中 37℃200 300r/min 振摇培养6 10h

可过夜。

大量提取质粒

常用碱裂解法。

【试剂及配制】

1.溶液Ⅰ

2.溶液Ⅱ

3.溶液Ⅲ

4.异丙醇

5.3mol NaAc pH5.2

6.平衡酚pH8.0

7.氯仿 乙戊醇 24 1

8.无水乙醇

9.70%乙醇

10.TE pH8.0

11.RNase A (10mg/ml)

12.溶菌酶

取100mg 溶菌酶 用2ml三蒸水溶解 分装成200μl /管 贮存于-20℃备用

【操作方法】

1 扩增好的菌液装入50ml离心管中 置冰浴10min

2 4℃离心 5000×10 min

3 将沉底的细菌收集到一只50ml离心管中 再离心 弃上清 将离心管倒置滤

纸

上1 min 控干残液

4 加入6ml冰预冷的溶液Ⅰ 200μl 溶菌酶 充分振摇混匀

5 加溶液Ⅱ10ml 缓慢振摇以充分混匀内容物 室温放置10min

6 加入8ml冰预冷的溶液Ⅲ 小心摇动离心管以混匀内容物 置冰酒精浴10min

7 4℃离心 10000g ×10min

8 小心倒出上清 弃沉淀 如有沉淀 再次离心

9 加入0.6体积异丙醇 充分混匀 -20℃放置20min

10 4℃离心 10000g ×10min

11 弃上清 晾干 2ml TE pH8.0 溶解沉淀

12 加入2ml冰预冷的5mol LiCl 溶液并混匀

13 4℃离心 10000g ×10min

14 将上清转移至另一离心管 加入0.6体积异丙醇 充分混匀 -20℃放置20min

15 4℃离心 10000g ×10min

16 弃上清 70%乙醇洗一次 4℃离心 10000g ×10min 弃上清 晾干

17 将沉淀溶于1.2ml TE pH8.0中

18 加RNase A 30μl 封管口 37℃水浴30min

19 将样品分装2个EP管 各加等体积平衡酚 混合

20 室温离心 5000g×5min

21 将上层水相转移至另一EP管 小心勿吸出酚相

22 重复平衡酚抽提

23 等体积氯仿 异戊醇 24 1 抽提

24 室温离心 5000g×5min

25 回收上层水相 勿吸出氯仿

26 加1/10体积3mol NaAC (pH5.2) 再加2.5体积无水乙醇 充分混匀 置-20℃30min

或液氮10min

27 室温离心 12000g×15min

28 弃上清 70%乙醇洗一次 再离心

29 晾干 溶于500μl TE pH8.0 -20℃保存

30 取2 μl 稀释至200μl 用紫外分光光度计测260nm、280nm OD值

OD260/OD280=1.7 2.0 如小于1.7 蛋白未提净 大于2.0 有机溶剂多。DNA含量为

OD260×50 μg /ml 。

大量酶切质粒

【操作方法】

1 在新的灭菌EP管中依次加入

三蒸水70μl

10×缓冲液10μl

限制酶5μl

质粒DNA 2μg /μl 15μl

稍离心以混匀

2 37℃水浴1.5 2h

3 取5μl 电泳鉴定酶解效果 如不完全 可延长时间或加限制酶

4 双酶解反应 如两种酶可用同一缓冲液 则可同时加入一个体系 稍增加反应体

积 否则以乙醇沉淀 晾干 重建第二个反应体系。

电泳分离、回收及纯化DNA片段

电泳的方法如前述 不同点在于 ①使用低熔点琼脂糖 在4℃冰箱中电泳 ②将

2 3个梳齿用透明胶布粘在一起 以增加上样量。

从低熔点琼脂糖中回收及纯化DNA

【操作方法】

1 在紫外灯下将含有所需DNA片段的凝胶条切下 放入EP管中 加入2倍体积的

TE缓冲液 在70℃保温10min 使凝胶条融化

2 冷却至室温 加等体积平衡酚 充分混匀后以6000g离心10min 回收水相 注

意不要将界面处的白色物质 即粉状的琼脂糖 吸出 再用等体积的氯仿/乙戊醇抽提一

次

3 将上清液转移到一个新的离心管中 加入0.2体积的10mol的乙酸胺和2倍体积

的无水乙醇 置-20℃冰箱20min 离心沉淀核酸 晾干后以TE 溶解。取2μl 稀释至200μl 测DNA浓度。

标记探针

使用Boehringer Mannheim 地高辛标记探针试剂盒。

【操作方法】

1 1μl 模板DNA加灭菌三蒸水至最终体积为16μl

2 10min沸水浴 立即冰乙醇冷轧

3 加入4μl 探针标记液 试剂盒中vial 1 稍微离心 混匀

4 37℃水浴20h

5 加入2μl 0.2mol EDTA pH8.0 或加热65℃10min以终止反应。

石蜡切片的处理

【试剂及配制】

1 二甲苯

2 乙醇 100% 95% 90% 75%

3 甲醇

4 0.2mol HCl

5 0.1% Triton X-100

6 0.2%甘氨酸PBS

7 5mmol MgCl2-PBS

8 PBS

配制 配成10×的贮存液 用时稀释10倍

NaCl 80g 137mmol

KCl 2g 2.7mmol

Na2HPO4·7H2O 11.5g 4.3mmol

KH2PO4 2g 1.4mmol

配成1000ml pH7.3 高压灭菌。

9 蛋白酶K

0.1mol Tris-Cl pH8.0 加50mmol EDTA pH8.0 配制浓度为1μg/ml。

10 4%多聚甲醛

在通风橱中配制 称40g多聚甲醛溶于装有500ml DEPC 水的烧瓶中 加热65℃并

磁力搅拌 使成乳白色悬液 用1mol NaOH 调节pH7.0 呈清亮状 再加入约450ml 的

2×PBS 充分混匀 再检查pH 过滤后定容至1000ml 4℃保存。

【操作方法】

1 将烤好的切片入二甲苯Ⅰ30min 二甲苯Ⅱ、Ⅲ各10min

2 逐级酒精入水 100%、95%、90%、75% 各5min 甲醇冲洗5min×2

3 用三蒸水或PBS快速洗2次

4 0.2mol HCl 室温作用10min 0.1% Triton X-100 作用15min

5 0.2%甘氨酸-PBS室温孵育15min

6 蛋白酶K37℃消化15 30min

7 0.2%甘氨酸-PBS室温孵育15min

8 PBS-5mmol MgCl2洗2次 各10min

9 4%多聚甲醛室温下固定15min

10 PBS-5mmol MgCl2洗2次 各10min

11 逐级酒精脱水 37℃烤干保存。

预杂交、杂交

【试剂及配制】

1 2×SSC

先配制20×SSC贮存液 用时稀释。

NaCl 175g 3mol

枸椽酸三钠·2H2O 88g 0.3mol

三蒸水加至1000ml 用1mol HCl 调pH7.0

2 4×SSC/50%去离子甲酰胺 V/V

去离子甲酰胺的配制 500ml 甲酰胺与25g Bio-Rad AG 501-X8(20 50目) 混合 室

温避光搅拌4h 过滤 分装为50ml -20℃存放

3 100×Denhardt液

聚蔗糖10g

聚乙烯吡咯烷酮10g

牛血清白蛋白10g

消毒三蒸水定容至100ml

4 预杂交液

去离子甲酰胺5ml

20× SSC 2.5ml

加温至50℃ 加入硫酸葡聚糖1g

聚合物溶解后 加入100×Denhardt 500μl

10%SDS 500μl

10mg/ml变性鲱鱼精子DNA 100μl

消毒三蒸水400μl

充分混合

5 杂交液

将标记好的探针用沸水浴10min 立即冰酒精冷轧 用预杂交液将探针稀释至0.5

5ng/μl 。

【操作方法】

1 用2×SSC 简洗15min

2 4×SSC/50%去离子甲酰胺37℃孵育15min

3 每片加预杂交液50μl 放入湿盒 42℃孵育2h

4 去除预杂交液 每片加杂交液50μl 放湿盒中 42℃杂交12 18h 不能超过

24h。

杂交后处理

【试剂及配制】

1 2×SSC

2 2×SSC/50%去离子甲酰胺

3 1×SSC/50%去离子甲酰胺

4 PBS

5 4×SSC/10mmol DTT

先配制1mol DTT 通风橱中称3.1g DTT 溶于20ml消毒三蒸水中 用时取2ml 加入198ml 4×SSC

【操作方法】

1 杂交完毕后 用2×SSC洗涤1 2min

2 2×SSC/50%去离子甲酰胺42℃10min

3 1×SSC/50%去离子甲酰胺37℃30min

4 4×SSC/10mmol DTT 1h

5 0.1×SSC 40℃2×30min

6 PBS洗10min 然后置于PBS中 直到进行下一步。

抗体连接、显色

【试剂及配制】

1 缓冲液Ⅰ

配1000ml,需加入

顺丁烯二酸11.6g

NaCl 8.8g

用10mol NaOH 将pH调至7.5 高压消毒

2 缓冲液Ⅱ

先制备阻断剂储存液 取试剂盒中阻断剂按10% V/V 加入溶液Ⅰ 混匀 用微

波炉加热使其完全溶解 高压消毒后4℃或-20℃保存。用时取上述10%阻断剂储存液用缓冲液Ⅰ按1 10稀释即制成缓冲液Ⅱ

3 缓冲液ⅢpH9.5

配制1000ml

Tris-Cl 12.1g 100mmol

NaOH 5.84g 100mmol

MgCl2 10.2g 50mmol

4 缓冲液ⅣpH8.0

Tris-Cl (pH8.0) 10mmol

EDTA (pH8.0) 1mmol

【操作方法】

1 2×SSC洗涤 2×5min 40℃

2 0.1×SSC 2×30min 40℃

3 缓冲液Ⅰ洗 室温2min 振摇

4 缓冲液Ⅱ洗 室温30min 振摇

5 擦去组织周围缓冲液 加抗地高辛抗体 vial 4 1 500 5000 用缓冲液Ⅱ稀

释 室温下于湿盒内2h

6 缓冲液Ⅰ室温洗2×15min

7 缓冲液Ⅲ室温洗3 min

8 擦去组织周围缓冲液 加显色液 vial 5 200μl 用缓冲液Ⅱ稀释至10ml

放

湿盒中 室温避光显色2h至过夜

9 显微镜下检查 阳性颗粒显深蓝色 获满意结果后终止反应

10 缓冲液Ⅰ洗涤 室温5min

11 缓冲液Ⅳ洗涤 室温2min

12 用中性红或核固红复染细胞核数秒 水冲洗 晾干后甘油封片。

DNA实验技术：原位杂交实验要求及步骤

原位杂交组织（或细胞）化学（In situ Hybridization Histochemistry，ISHH）简称原位杂交（In Situ Hybridization），属于固相分子杂交的范畴，它是用标记的DNA或RNA为探针，在原位检测组织细胞内特定核酸序列的方法。根据所用探针和靶核酸的不同，原位杂交可分为DNA-DNA杂交，DNA-RNA杂交和RNA-RNA 杂交三类。 根据探针的标记物是否直接被检测，原位杂交又可分为直接法和间接法两类。直接法主要用放射性同位素、荧光及某些酶标记的探针与靶核酸进行杂交，杂交后分别通过放射自显影、荧光显微镜术或成色酶促反应直接显示。间接法一般用半抗原标记探针，最后通过免疫组织化学法对半抗原定位，间接地显示探针与靶核酸形成的杂交体。 原位杂交最初是以同位素标记探针进行的。尽管同位素标记（如35S，3H，32P等）仍然广泛使用，但非同位素标记探针的迅速发展（尤其是生物素标记探针和地高辛标记探针），更引起科技工作者的极大兴趣。 一、基本要求 1. 组织取材：组织取材应尽可能新鲜。由于组织RNA降解较快，所以新鲜组织和培养细胞最好在30 min 内固定。 2. 固定目的是： （1）保持细胞结构； （2）最大限度地保持细胞内DNA或RNA的水平； （3）使探针易于进入细胞或组织。 最常用的固定剂是多聚甲醛，与其它醛类固定剂（如戊二醛）不同，多聚甲醛不会与蛋白质产生广泛的交叉连接，因而不会影响探针穿透入细胞或组织。 3. 增强组织的通透性和核酸探针的穿透性： （1）稀酸处理和酸酐处理：为防止探针与组织中碱性蛋白之间的静电结合，以降低背景，杂交前标本可用0.25%乙酸酐处理10 min，经乙酸酐处理后，组织蛋白中的碱性基团通过乙酰化而被阻断。组织和细胞标本亦可用0.2 M HCl处理10 min，稀酸能使碱性蛋白变性，结合蛋白酶消化，容易将碱性蛋白移除。 （2）去污剂处理：去污剂处理的目的是增加组织的通透性，利于杂交探针进入组织细胞，最常应用的去污剂是Triton X-100。注意：过度的去污剂处理不仅影响组织的形态结构，而且还会引起靶核酸的丢失。

原位杂交自己整理

一、DEPC水是用DEPC(diethyl pyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)处理过并经高温高压灭菌的MiliQ纯水。经检测不含杂质RNA、DNA和蛋白质。 物理性质分子式：C6H10O5 分子量：162.1 外观：无色液体折射率：1.398（20°C）密度：1.12g/ml 摩尔浓度：6.9M DEPC气味芳香浓烈，强挥发性，有毒，需在通风橱中操作。 化学性质DEPC对湿气和酸碱敏感，在乙醇和二氧化碳的水溶液中缓慢分解，在155°C自行分解。DEPC 在氨水中特别不稳定，生成一种致癌的聚氨酯胶的物质。DEPC对核酸酶有积极地抑制作用。（主要是对含有-NH，-SH，-OH活性部位的酶起作用）。 使用要点：DEPC水可以用于RNA沉淀的溶解，含有RNA的各种反应体系如反转录、siRNA的退火等，以及其它各种要求无RNase、DNase和proteinase的反应体系。通常使用0.1%的DEPC水溶液使Rnase 失活，即1ml DEPC溶于1L纯净水中。溶解时，DEPC不会很快溶解，开始时以小球的形式存在于溶液中，因此要在搅拌器中搅动直到小球消失为止。DEPC自行分解成乙醇和二氧化碳很慢，可以通过高压灭菌处理破坏DEPC或水溶液中煮沸15分钟以上。 注意事项保存：避光干燥密闭容器于2-8°C 注：使用时要戴乳胶手套和口罩。如果不慎溅到皮肤或眼睛，应立即用大量清水冲洗，如果感到不适，就医。 二、DEPC处理枪头： 1、用去离子水配制0.1%的DEPC，避光; 2、将枪头和EP管放入0.1%的DEPC内，保证枪头和EP管内都充满0.1%的DEPC（看自己的操作习惯了，本人是用左手拿住镊子夹住枪头或者EP管，右手使用移液器吸取0.1%的DEPC，将枪头或者EP管内充满0.1%的DEPC）； 3、避光、静置、过夜 4、装枪头和EP管的盒子不需要用DEPC浸泡，将枪头或者EP管内的DEPC水大致去除干净后，装起，包好 5、121摄氏度，30min 6、180摄氏度，干燥数个钟头（三个左右吧，这个时间具体记得不是很清楚了），用前拿出来 注意：处理DEPC时需要戴乳胶手套、口罩！ 三、 使用甲酰胺和二甲亚砜（DMSO）一般不会导致高背景。在杂交液中加入30%二甲亚砜可使T2噬菌体DNA的Tm值比原先降低14℃，而使用酰胺甚至可使DNA在室温下变性和

原位杂交原理及具体操作

原位杂交原理及具体操作

原位杂交实验原理与方法 一、目的 本实验的目的是学会原位杂交的使用方法。了解各种原位杂交的基本原理和优缺点。 二、原理 原位杂交组化（简称原位杂交，in situ hybridization histochemistry；ISHH）属于分子杂交的一种，是一种应用标记探针与组织细胞中的待测核酸杂交，再应用标记物相关的检测系统，在核酸原有的位置将其显示出来的一种检测技术。原位杂交的本质就是在一定的温度和离子浓度下，使具有特异序列的单链探针通过碱基互补规则与组织细胞内待测的核酸复性结合而使得组织细胞中的特异性核酸得到定位，并通过探针上所标记的检测系统将其在核酸的原有位置上显示出来。 当然杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补，所以不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互补顺序（即某种程度的同源性）就可以形成杂交双链。 探针的种类按所带标记物可分为同位素标记探针和非同位素标记探针两大类。目前，大多数放

射性标记法是通过酶促反应将标记的基因掺入DNA中，常用的同位素标记物有3H、35S、125I 和32P。同位素标记物虽然有灵敏性高，背底较为清晰等优点，但是由于放射性同位素对人和环境均会造成伤害，近来有被非同位素取代的趋势。非同位素标记物中目前最常用的有生物素、地高辛和荧光素三种。 探针的种类按核酸性质不同又可分为DNA探针、cDNA探针、cRNA探针和合成寡核苷酸探针。cDNA 探针又可分为双链cDNA探针和单链cDNA探针。原位杂交又可分为菌落原位杂交和组织原位杂交。 菌落原位杂交（Colony in situ hybridization）菌落原位杂交是将细菌从培养平板转移到硝酸 纤维素滤膜上，然后将滤膜上的菌落裂菌以释出DNA。将NDA烘干固定于膜上与32P标记的探针杂交，放射自显影检测菌落杂交信号，并与平板上的菌落对位。 组织原位杂交（Tissue in situ hybridization）组织原位杂交简称原位杂交，指组织或细胞的原位杂交，它与菌落的原位杂交不同。菌落原位杂交需裂解细菌释出DNA，然后进行杂交。而原位

原位杂交组织化学技术的基本方法

原位杂交组织化学技术的基本方法 一、核酸分子杂交技术 1961年Hall开拓了液相核酸杂交技术的研究，其基本原理是利用核酸分子单链之间有互补的碱基顺序，通过碱基对之间非共价键的形成，出现稳定的双链区，形成杂交的双链。自此以后，由于分子生物学技术的迅猛发展，特别是70年代末到80年代初，分子克隆">克隆、质粒和噬菌体DNA的构建成功，核酸自动合成仪的诞生，大大丰富了核酸探针的来源，新的核酸分子杂交类型和方法不断涌现。按其作用方式可大致分为固相杂交和液相杂交两种：液相杂交是指参加反应的两条核酸链都游离在溶液中，而固相杂交是将参加反应的一条核酸链固定在固体的支持物上常用的有硝酸纤维素滤膜，其它如尼龙膜、乳胶颗粒和微孔板等），另一条参加反应的核酸链游离在溶液中。固相杂交有菌落原位杂交（colony in situ hybri dization）、斑点杂交法（Dot blot）、Southern印迹杂交（Southern blot）、Northern印迹杂交（ N orthern blot）和组织原位杂交（Tissue in situ hybridization），即原位杂交组织化学技术和原位杂交免疫细胞化学技术。液相分子杂交技术包括吸附杂交、发光液相杂交、液相夹心杂交和复性速率液相分子杂交等。 二、原位杂交组织化学技术的由来及发展 原位杂交组织（或细胞）化学技术简称原位杂交（In situ hybridization），如上所述，属于固相核酸分子杂交的范畴。但它区别于固相核酸分子杂交中的任何一种核酸分子杂交技术。菌落杂交系细菌裂解释放出DNA，然后进行杂交。Southern印迹杂交法是以鉴定DNA中某一特定的基因片段，而Norhtern印迹杂交法是用以检测某一特定的RNA片段的。它们都只能证明该病原体、细胞或组织中是否存在待测的核酸而不能证明该核酸分子在细胞或组织中存在的部位。1969年美国耶鲁大学Gall和Pardue首先用爪蟾核糖体基因探针与其卵母细胞杂交，确定该基因定位于卵母细胞的核仁中。与此同时，Buongiorno– Nardell i和Amaldi, John及其同事等相继利用同位素标记核酸探针进行了细胞或组织的基因定位，从而创造了原位杂交细胞或组织化学技术。Orth（1970）应用3H标记的兔乳头状瘤病毒cRNA探针与兔乳头状瘤组织的冰冻切片进行杂交，首次用原位杂交检测了病毒DNA在细胞中的定位，但当时的工作多采用冰冻组织切片或培养细胞，探针均采用同位素标记。 由于同位素标记探针具有放射性既污染环境，又对人体有害，且受半衰期限制等缺点，科学工作者们开始探索用非放射性的标记物标记核酸探针进行原位杂交。Bauman（1981）等首先应用荧光素标记cRNA探针做原位杂交，然后用荧光显微镜观察获得成功。Shroyer（1982）报道用2，4二硝基苯甲醛（DNP）标记DNA探针，使该DNA探针具有抗原性，然后用兔抗DNP的抗体来识别杂交后的探针，最后经免疫过氧化物酶的方法来定位杂交探针。这两种方法至今仍有采用，但因敏感度不够高，应用不够普遍。 Pezzella（1 987）创建了用磺基化DNA探针来做细胞或组织原位杂交的方法，其基本原理是使DNA探针的胞嘧啶碱基磺基化，利用单克隆">克隆抗体识别磺基化探针，再通过免疫组化方法显示结合的单克隆抗体，从而对杂交结合的探针进行定位。本法的优点是磺基化DAN探针标记简便，不需作缺口平移标记，敏感度也较高。但自生物素和高辛标记探针技术建立后，已有取而代之的趋势。生物素标记探针技术是Brigat（1983）首先建立的，它利用生物素标记的探针在组织切片上检测了病毒DNA，通过生物素与抗生物素结合，过氧化物酶-抗过氧化物酶显示系统显示病毒DNA在细胞中的定位。生物素标记探针技术目前已被广泛应用，特别是在病毒学和病理学的临床诊断中。这种生物素标记技术又叫酶促生物素标记技术。另一种叫光促生物素标记核酸技术，该技术是用光敏生物素（Photobiotin）标记核酸。目前应用的光敏生物素有乙酸盐和补骨脂素生物素，它们都是由三个部分组成：光敏基团、连结臂和生物素（图20-1）。在强光下，不需酶反应，光敏生物素的光敏基团即可与核酸中的碱基相结合。光敏生物素标记核酸，方法简单，灵敏度也不低，但标记效率不高，每100～150个碱基才能标记一个生物素，对于短的基因探针特别是寡核苷酸探针不宜使用，以免因标记数过少而影响灵敏度（Forster et al 1985）。 近年来，地高辛（Digoxigonin）标记技术引起科技工作者的极大兴趣。Boeringer Mannhem Bio－ch emisca于1987年将地高辛标记的有关试剂及药盒投放市场。和其它非放射性标记物一样，地高辛较放射性标记系统安全，方便、省时间。同时在敏感性和质量控制方面比生物素标记技术要优越，可以检测出人基因组DNA中的单拷贝基因。地高辛标记法显示的颜色为紫蓝色（标记碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶显色系统），有较好的反差背景。 核酸探针根据标记方法的不同可粗略分为放射性探针和非放射性探针两类。根据探针的核酸性质不同可分为DNA探针、RNA探针、cDNA探针、cRNA探针和寡核苷酸探针等。DNA探针还有单链DNA（Single st randed, ssDNA）和双链DNA（Double stranded, dsDNA）之分（详见十九章）。早期应用的主要是DNA探

原位杂交实验操作步骤

原位杂交实验操作步骤 一质粒制备 1质粒的转化和扩增 1.1制备XL1-Blue感受态细菌 1.取400uLXL1-Blue菌种加入到含200mlLB培养基的锥形瓶中，37℃、100rpm 培养4h，离心，倒置，以冰冷的0.1mol/LCaCl_2重悬细菌，冰浴30min，离心，弃上清，倒置，再加4ml(含15%甘油)冰冷的CaCl2重悬细菌，分装(200μ/tube)，-80℃保存。 2.转化：在冰浴中将1管XL1-Blue感受态菌解冻，将浓度为2ng/μ1的质粒DNA4μ1加入到8Oμ1感受态菌中。 3.轻轻摇匀，冰浴30min。 4.42℃热激9O秒，然后迅速冰浴2min。 5.加入LB培养液(无氨苄青霉素)0.8ml，在37℃，100转/min水浴孵育60min。 6.取200μl菌液铺于琼脂板上(涂有X-Gal(20mg/ml)-IPTG(200mg/ml)的LB-氨苄青霉素50mg/ml,1μl/ml培养基)，待菌液全部被吸收后，倒置平板于37℃培养12-16h。 1.2鉴定和挑选含重组质粒的菌落 1.用无菌牙签挑取单菌落，接种到10ml含氨苄青霉素的LB培养液的离心管中，于37℃，200转/分培养2h，取1ml之一Eppendorf离心管，加 50μl10mmol/L EDTA(pH8.0)。 2.加入50μl新配置的0.2mol/LNaOH、0.5%SDS、20%蔗糖溶液后，振荡30秒。 3.在70℃温育5min，然后冷却到室温。 4.加1.5μ14mol/LKCl和0.5μ1含0.4%溴酚兰染液，振荡3O秒后，冰浴5min。 5.12000g，4℃离以3min，以除去细菌碎片。 6.制备1%的琼脂糖凝胶(含EB0.5μg/ml)，取50μl上清液加入到样品孔中，其中一孔加入中等分子量DNAMarker。恒压50V，进行电泳。 7.当溴酚兰迁移到凝胶全长的2/3-3/4时，停止电泳，在紫外灯下检查质粒DNA 分于量的大小是否与转入质粒相符。

原位杂交技术步骤

1.For each probe (control and experimental), set up a separate 100-ml PCR in a 0.5-ml sterile tube, as tabulated below. Either.cDNA inserted in plasmids or genomic DNA can be used as templates for the PCR (see REAGENT SETUP for details on primer design). 每个探针(实验组和对照组),在0.5 -ml无菌管设立一个独立的100毫升PCR,正如下面的表。另外。互补脱氧核糖核酸插入到基因组DNA质体或可用作模板PCR(见试剂设置有关底漆设计)。 **注意关键： 1.很多版本的实验反义核酸探针可以作为一种控制背景染色(见试剂设置)。然而,我们相信最好的方法来演示特异性是获取相同的空间限制表达模式使用不同的非重叠探测器相同的基因。 2.小心不要污染pcr.使用无菌试管和过滤器的技巧和戴手套 3.另外,PCR扩增,cDNAs质粒中可以使用约束线性化酶,独特的站点位于5￠(反义核酸探针)或3￠(对感官探测)来插入。净化的线性DNA可以通过苯酚/氯仿萃取乙醇沉淀紧随其后。 2| Run the PCR using the conditions tabulated below. 使用下面列出的条件运行PCR **暂停点：把扩增好的pcr产品放4℃降温和在-20℃贮藏几个星期。 3| Add the 100-ml PCR to a Microcon YM-50 column and add 400 ml of sterile water. Centrifuge for 15–20 min at 1,000 g at room temperature. 加入100毫升PCR到Microcon YM-50列并加入400毫升的无菌水。在室温下1000g离心15 - 20分钟。 **注意关键：膜应该是干的。如果没有再离心 4|Place the Microcon column into a new microfuge tube (provided in the kit), add 20ml of sterile water, vortex briefly and then turn the Microcon column upside down. Spin for 1 min at 1,000 g at room temperature to recover the DNA. 把小层析柱放在一个新的离心管(在这个工具包中提供),增加20毫升的无菌水、短暂离心,然后颠倒层析柱。自旋1分钟1000 g在室温下恢复了DNA **注意关键：离心的步骤应该快速。离心机1分钟只是为了避免样本太干。 5|Check the quality, quantity and size of the PCR amplification product by loading 1/20 of the preparation on a 1% (wt/vol) agarose gel in 1 TBE buffer. DNA should appear as a band and not as a smear. The 1/20 of the preparation should contain at least 40 ng of DNA. 通过装载1/20的稀释液在1*的TBE buffer缓冲液中的1% (wt/vol)的琼脂糖凝胶检查PCR的扩增产物的质量

原位杂交技术(in situ hybridization)

原位杂交的基本原理 原位杂交技术的基本原理是利用核酸分子单链之间有互补的碱基序列，将有放射性或非放射性的外源核酸(即探针)与组织、细胞或染色体上待测DNA或RNA互补配对，结合成专一的核酸杂交分子，经一定的检测手段将待测核酸在组织、细胞或染色体上的位置显示出来。为显示特定的核酸序列必须具备3个重要条件：组织、细胞或染色体的固定、具有能与特定片段互补的核苷酸序列(即探针)、有与探针结合的标记物(曾呈奎等2000)。 RNA原位核酸杂交又称RNA原位杂交组织化学或RNA原位杂交。该技术是指运用cRNA或寡核苷酸等探针检测细胞和组织内RNA表达的一种原位杂交技术。其基本原理是：在细胞或组织结构保持不变的条件下，用标记的已知的RNA核苷酸片段，按核酸杂交中碱基配对原则，与待测细胞或组织中相应的基因片段相结合(杂交)，所形成的杂交体 (Hybrids)经显色反应后在光学显微镜或电子显微镜下观察其细胞内相应的mRNA、rRNA和tRNA分子。RNA原位杂交技术经不断改进，其应用的领域已远超出DNA原位杂交技术。尤其在基因分析和诊断方面能作定性、定位和定量分析，已成为最有效的分子病理学技术，同时在分析低丰度和罕见的mRNA表达方面已展示了分子生物学的一重要方向。 原位杂交技术（in situ hybridization）是以标记的核酸分子为探针，在组织细胞原位检测特异核酸分子的技术。这一技术不需要从组织细胞中提取核酸，对组织中含量极低的靶序列有很高的灵敏度，并可保持组织与细胞的结构完整，反映特异核酸分子的定位。特别是配合使用能定位特异蛋白分子的免疫细胞化学技术，就能对生理或病理条件下从DNA 到mRNA到蛋白质这样一个基因表达过程进行定性和定位的分析，是基因表达研究强有力的手段。 （一）原位杂交技术的原理 原位杂交技术的原理是：使含有特异序列、经过标记的核酸单链即探针，在适宜条件下与组织细胞中的互补核酸单链即靶核酸发生杂交，再以放射自显影或免疫细胞化学方法对标记探针进行探测，从而在细胞原位显示特异的DNA或RNA分子。

原位杂交操作流程

原位杂交操作流程 1、使用地高辛标记的核酸探针进行石蜡切片的RNA原位杂交第一天 1）二甲苯于37℃脱蜡2次，每次15分钟； 2）无水乙醇浸泡2次，每次3分钟； 3） 95%乙醇浸泡2次，每次3分钟； 4） PBS清洗3分钟； 5） 2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟； 6） PBS清洗10分钟； 7）加入胃蛋白酶25ul/ml，37℃孵育15分钟； 8） PBS清洗2次，每次3分钟； 9） 0.2N的HCl孵育30分钟； 10）PBS清洗2次，每次3分钟； 11）0.25%无水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分钟； 12）PBS清洗2次，每次5分钟； 13）预杂交缓冲液孵育30分钟； 14）准备核酸探针混合物：使用预杂交缓冲液稀释探针，85℃加热5分钟，置于冰块中10分钟； 15）杂交；第二天 16）将玻片置于SSC中2次，每次5分钟以去除封片； 17）PBS清洗3分钟； 18）RNA酶A溶液中（或0.1-1ng/mlPBS中），37℃孵育30分钟； 19）PBS清洗5分钟； 20）室温，2×SSC清洗10分钟； 21）37℃，1×SSC清洗10分钟； 22）37℃，0.5×SSC清洗10分钟； 23）缓冲液A孵育10分钟； 24）缓冲液A（1%正常绵羊血清和0.03%三重氢核X-100）孵育30分钟； 25）加入抗地高辛抗体（1/200的上述缓冲液，来自Boehringer Mannheim），37℃孵育3 小时； 26）缓冲液A清洗2次，每次10分钟； 27）缓冲液B清洗2次，每次5分钟； 28）制成NBT/BCIP暗处保存30-60分钟，显微镜下进行观察，如果背景尚佳，显色时间可延长到16小时；29）停止缓冲液B的反应，用水进行简单的清洗； 30）固红，脱水以及封片进行核的复染。 2、使用地高辛标记的寡核苷酸探针进行石蜡切片的原位DNA杂交第一天 1）二甲苯于37℃脱蜡2次，每次15分钟； 2）无水乙醇浸泡2次，每次5分钟； 3） 95%乙醇浸泡2次，每次5分钟； 4） PBS清洗5分钟； 5） 2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟； 6） PBS清洗5分钟； 7）加入胃蛋白酶25ul/ml，37℃孵育10分钟； 8） PBS清洗2次，每次5分钟； 9） 0.2N的HCl孵育30分钟； 10）PBS清洗2次，每次5分钟； 11）0.25%无水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分钟；

植物(拟南芥水稻)原位杂交详细protocol试验方法

植物材料的固定、包埋和制片 一、植物材料的固定和包埋 在此过程应注意避免Rnase的污染。所使用的熔蜡管（管盖不能耐受180℃烘，只需高压湿热灭菌即可）、量筒、三角瓶和药勺均需180℃烘5小时以上。所用蒸馏水无需用DEPC处理。所固定的材料越小越好，尽可能切除多余的材料。材料取下后应立即固定。取材后若不能立即固定，则应置于冰上运输。配试剂前请计算一下所需用量，用多少配多少，节约试剂。 300 ml量为例） 1、先打开一个60℃左右的水浴锅。 2、在通风橱中往三角瓶中加入12 g多聚甲醛(终浓度为4%)。 3、用量筒配300 ml PBS缓冲液（30 ml 10×PBS+270 ml水），另加1粒NaOH，盖好锡 箔纸后，轻轻摇动，稍微溶化后置于水浴锅中溶解。 4、完全溶解后，取出，加0.1% Tween-20 (300 ul)和0.1% Triton(300 ul)混匀（包 埋水稻时还要再加3 ml 25%的戊二醛）。 5、置于冰上或4℃冰箱降至室温，然后用硫酸调pH 至7.0。 6、把配制好的甲醛溶液分装到小瓶中，（一般用10 ml的小瓶）。 7、分装好的甲醛溶液应放置在冰浴中当天使用。 二、固定材料 1、取植物新鲜材料，去除不需要的部分至适当大小。注意：所固定的材料越小越好， 尽可能去除无用多余的部分。 2、把取好材料放入冰浴的装有甲醛溶液的小瓶中。注意每瓶中的切块数：太多固定不 好；太少则浪费固定液（固定液:材料≥20:1）。 3、材料放入固定液后，应通过抽真空（1至数分钟，视具体情况而定：尽可能短时间， 以材料沉入固定液中为准），帮助固定液进入组织中，以达到迅速固定植物材料的目 的。抽气减压时，尽量不要使液体过分沸腾。抽真空时，材料一般在固定液中浮起； 抽完真空的材料应该沉入固定液中，有时可能要反复多次抽真空，直至材料沉没在 固定液中。一般抽真空多于5分钟大部份材料还不沉没在固定液中的情况极少见， 如果此情况发生，建议抽真空达10分钟后，继续做步骤4。 4、抽真空后需要更换一次新鲜的固定液。 5、更换新鲜固定液后，材料在4℃过夜。 注意：甲醛有剧毒，因此药品的称取和溶液的配置必须在通风橱中进行！多聚甲醛极易飞散；称取时通风橱可暂不抽风；要避免将多聚甲醛洒落在天平或台面上造成污染，如有洒落，要及 按以下序列对材料进行脱水（水为高压灭过菌的双蒸水）。 0.85% NaCl 冰浴，30 分钟 2、50%乙醇/0.85% NaCl 冰浴，5 小时 3、70%乙醇/0.85% NaCl 冰浴，5 小时 4、85%乙醇/0.85% NaCl 4℃，过夜 50%乙醇后，材料应开始脱色。 /水 4℃，5小时 2、100%乙醇 4℃，5小时 3、100%乙醇 4℃，过夜 注：第三天起，每个脱水步骤时间可延长至一天。两次100%乙醇脱水后，材料应为无色。

原位杂交的方法

原位杂交 1 探针的设计与合成 1)根据实验室已有的p8基因cDNA全长序列，用premier primer5.0设计引物p81和p82， 以卤虫cDNA为模板，PCR扩增得到346bp的产物，用Takara胶回收试剂盒回收纯化。引物编号引物序列长度 p81 TGCGGACGAAACAGGAAG 18 bp p82 GCTCAAACAGTGA TGCCAGT 20 bp 2)目的片段克隆 a. 在无菌离心管中加入连接载体的各种成分，载体与片段的摩尔比控制在1:3-1:8，根据凝胶电泳检测后的浓度及载体与片段分子大小来计算摩尔比。加入成分及比例如下： 目的PCR片段 5 μl pGM-T载体（约50ng/uL） 1 μl 10×T4 DNA Ligation Buffer 1 μl T4 DNA Ligase（3U/uL） 1 μl 无菌去离子水 3 μl 总体积10 μl b. 轻轻弹动离心管以混合内容物，短暂离心。置于PCR仪中16℃过夜连接，反应结束后将离心管置于冰上。 c. 向铺好的含有氨苄青霉素的固体平板表面加入16 μl的IPTG（50mg/ml）、40 μl的X-gal （20mg/ml），使用无菌的弯头玻璃棒将其均匀的涂开，避光置于37℃培养箱1-3小时，使溶解X-gal的二甲基甲酰挥发干净。 d. 将10 μl的连接产物加到100 μl DH5 感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴半小时，将离心管置于42℃水浴90秒，取出管后立即置于冰浴上放置2-3分钟，其间不要摇动离心管。向离心管加入500 μl 37℃预热的LB（不含抗生素）培养基，150rpm摇床37℃振荡培养45分钟。目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏。将菌液于4000g下离心10分钟，去掉上清，加入100 μl培养液重溶并加入到配制好的LB固体培养基上，用无菌的弯头玻璃棒轻轻将细胞均匀涂开。待平板表面干燥后，倒置平板，37℃培养12-16小时。 e. 挑取白色菌落直接进行PCR检测，筛选转化子。 f. 将转化子接种于LB液体培养基中培养24小时，吸取1mL菌液送至大连宝生物公司进行序列测序。 3)重组质粒的线性化 取6 μl以测序的重组质粒，选取NcoI内切酶37℃酶切4h。酶切反应体系为20 μl： 质粒 6 μl 10xK Buffer 2 μl NcoI酶 1 μl 0.1% BSA 2 μl 灭菌水9 μl 终体积20 μl 取酶切前后的质粒各4 μl，经1%琼脂糖电泳检测，确认酶切完全，将酶切产物用Takara胶回收试剂盒回收纯化，作为探针合成的模板。 4)探针合成 按罗氏DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7)试剂盒使用指南，标记反义RNA探针。 使用的所有试剂和器皿均经去RNase处理，合成方法如下:先准备反应体系。冰上向RNase-Free的微离心管中顺序加入下列试剂:

原位杂交技术的操作详解及小贴士

原位杂交技术的操作详解及小贴士 原位杂交技术应用于染色体、细胞和组织切片等样品中进行核酸特异性检测，与免疫组化技术的结合应用，能将DNA、mRNA和蛋白水平上的基因活性与样品的显微拓扑信息结合起来。1969年Pardue和Gall将放射性标记的探针直接应用于纯化核酸的杂交，此后得益于分子克隆技术的发展，及不同探针标记系统和检测系统的应用，大大增加了原位杂交检测的应用灵活性和检测灵敏度。 多种探针标记检测系统 基于地高辛、生物素和荧光标记分子的标记和检测系统是常见的原位杂交检测方法。 荧光标记检测常为直接探针标记方法，如在dUTP/UTP/ddUTP上连接Fluorescein后进行核酸标记。由于标记在核酸上的荧光分子必须经受杂交和洗脱过程中的考验，以及荧光分子易于衰减，其检测灵敏度受到一定的影响。但对荧光分子的直接检测呈现的背景较低。 间接标记的方法中应用了报告分子标记的探针，报告分子通过亲和酶促的方法进行显色。常用的报告分子如地高辛，生物素。结合地高辛抗体或链霉亲和素上耦联的酶系统进行间接的底物反应检测。地高辛标记核酸的历史可追溯到1987年，由于地高辛是洋地黄的花和叶中特有的成分，检测时使用的地高辛抗体不会结合于其他的生物分子。这是相较于生物素标记系统的优势。地高辛抗体上可耦联碱性磷酸酶、过氧化酶，及荧光分子和胶体金等，根据不同的应用需求，呈现高信噪比的核酸检测结果。但需注意，由于引入了免疫检测反应，在放大检测灵敏度的同时，应注意样品内源性酶的灭活，以降低检测背景。 通过不同标记方法的联合应用，还可在同一样本中实现染色体不同区域或细

胞样本中不同RNA序列的多重检测。 原位杂交中探针的选择 DNA探针、RNA探针和寡核苷酸探针均能通过不同的酶促分子反应进行标记。寡核苷酸探针的长度较短，因此避免了探针内部退火的问题，在杂交时的渗透能力也更好，探针与靶标的接触这是影响原位杂交是否成功的重要因素之一。DNA 探针、RNA探针在合成时需要控制探针片段长度，通常300-1000bp左右，能覆盖到较长片段的靶核酸序列，增加检测的灵敏度。 就DNA探针和RNA探针的比较，DNA探针在杂交过程中会出现探针双链之间退火的可能，也更倾向于在溶液中形成大分子的探针聚合体，从而影响其渗透能力。而RNA 探针的应用，将提高DNA-RNA杂交子的热稳定性。 Tips：RNA探针因其单链、高分子结合力、可适应高温杂交的特性，其检测特异性和灵敏度均优于DNA探针。常用的RNA探针标记方法为构建质粒后进行转率合成。通过PCR扩增的方法，可以更方便地进行RNA探针的制备；RNA探针合成后，还需验证其对目标片段检测的灵敏度和特异性。具体实验流程和注意事项可参考技术文章：A Method for High Quality Digoxigenin-Labeled RNA Probes for In Situ Hybridization 原位杂交检测步骤 原位杂交涉及的步骤：玻片的准备和样品固定，细胞或组织的预渗透处理，靶DNA变性（DNA原位杂交），探针制备，原位杂交过程，杂交后洗涤，探针（显色）检测。 1. 玻片的准备和样品固定 对于染色体涂片，1：1的乙醇/醚处理的载玻片已能符合要求。对于组织切片的原位杂交，为了在实验过程中不丢失组织样品，可使用多聚赖氨酸或铬矾

原位杂交实验操作步骤

原位杂交实验操作步骤 撰写人：范为民 一、实验原理 原位杂交是指借助于核酸分子杂交的方法，在显微镜水平检测和定位特异的核苷酸片段。现在原位杂交已经成为在分子水平研究肿瘤和遗传性疾病的发生，发展和调控等根本性问题的有力工具。 二、试剂盒 本实验室常用的原位杂交试剂盒是博士德公司生产的敏感加强型原位杂交检测试剂盒，此试剂盒分为两种，一种为过氧化物酶（POD）检测（MK1030型），一种为碱性磷酸酶(AP)检测系统（MK1032型），用于mRNA的杂交。过氧化物酶（POD）检测的最终信号为棕黄色，而碱性磷酸酶(AP)检测的信号为紫色，因后者信号比较突出，所以一般采用后一种检测方法。两种检测方法的实验步骤相差不多，所用洗脱缓冲液也大同小异。用于杂交的探针也可以分为两种，一种是DNA探针，即是用DNA与组织中的mRNA杂交，另一种是RNA 探针，即用RNA与组织中的mRNA杂交。DNA探针处理操作简单，但杂交信号一般不如RNA探针强烈，所以条件允许的话一般采用RNA探针。下面先介绍碱性磷酸酶(AP)检测试剂盒，采用RNA作为探针的操作步骤。 三、实验步骤 原位杂交实验主要包括三大部分，即组织冰冻切片、RNA探针标记、原位杂交三部分。 （一）组织冰冻切片 1. 实验准备 （1）原位杂交专用载玻片：用多聚赖氨酸处理后的载玻片，使切片紧密粘附在玻片上，可以用于后面的洗脱。一般一张载玻片上可以贴至多十张切片（可以是不同组织的切片），所以需要玻片的数目需要根据实验的要求而定。这种专用载玻片可以从中杉金桥公司购买，目前价格是每片2.2元，玻片有一面的一端是毛玻璃，用于标记组织名称等，切片应该贴在此面，切勿贴到反面。 （2）缓冲液配备 1.1器具准备 剪刀、镊子各三把，开壳钳一把，100ml量筒一个，磁力搅拌子一个；100ml试剂瓶一个，250ml试剂瓶三个。以上器具均洗净后置于180摄氏度以上烘烤6小时以上。铅笔、显微镜、冰、吸水纸、一次性塑料手套等。 1.2 溶液配制 0.1M PB缓冲液：Na2HPO4?12H2O 5.8021g,NaH2PO4?2 H2O 0.5928 g,加入200ml ddH2O溶解于之前准备的250ml试剂瓶中，再加入200ūl DEPC，充分摇匀后过夜，高压灭菌。以上溶液配制两份，其中一份瓶中放入磁力搅拌子。

原位杂交-经典方法-地高辛标记探针

原位杂交 (In situ hybridization) 一、目的 掌握核酸探针原位杂交操作技术，并利用该技术对单细胞的靶目标进行定位，用于细胞生物学基础研究。 二、原理 原位杂交技术（in situ hybridization）是分子生物学和组织化学成功结合的产物，是特定标记的已知序列核酸作为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交并对其实行检测的方法。其基本原理是含互补序列的标记DNA或RNA片段，即探针，在适宜的条件下与细胞内特定的DNA或RNA形成稳定的杂交体。 原位杂交能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究而不受同一组织中其它成分的影响，因此对于那些细胞数量少且散在于其他组织中的细胞内DNA或RNA研究更为方便；由于原位杂交不需要从组织中提取核酸，对于组织中含量极低的靶序列有极高的敏感性，并可完整地保持组织与细胞的形态，更能准确地反映出组织细胞的相互关系及功能状态。 三、仪器设备 烘箱，切片机，展片机，染色缸，湿盒，原位PCR仪，显微镜、镊子、量筒、烧杯、吸水纸、枪与枪头、载玻片、盖玻片、冰盒等。 四、材料和试剂 1．材料：带有病原体的水生动物，如感染WSSV病毒的对虾、感染虹彩病毒的水生动物等。 2．试剂： Davidson’s AFA固定液: 330 ml 95％乙醇 220 ml 福尔马林（37～39％甲醛水溶液） 115 ml 冰醋酸 335 ml H2O 混匀后封口，室温放置； DIG标记与检测试剂盒（Roche公司）； TNE：50 mmol/L Tris-HCl 6.57 g Tris Base 10 mmol/L NaCl 0.58 g NaCl 1 mmol/L EDTA 0.37 g EDTA ddH2O 900 ml （定容至1L） 用HCl调pH至7.4，高压灭菌，4℃保存；

原位杂交组织化学技术的基本方法及操作规程

原位杂交组织化学技术的基本方法及操作规程 一、核酸分子杂交技术 1961年Hall开拓了液相核酸杂交技术的研究，其基本原理是利用核酸分子单链之间有互补的碱基顺序，通过碱基对之间非共价键的形成，出现稳定的双链区，形成杂交的双链。自此以后，由于分子生物学技术的迅猛发展，特别是70年代末到80年代初，分子克隆">克隆、质粒和噬菌体DNA的构建成功，核酸自动合成仪的诞生，大大丰富了核酸探针的来源，新的核酸分子杂交类型和方法不断涌现。按其作用方式可大致分为固相杂交和液相杂交两种：液相杂交是指参加反应的两条核酸链都游离在溶液中，而固相杂交是将参加反应的一条核酸链固定在固体的支持物上常用的有硝酸纤维素滤膜，其它如尼龙膜、乳胶颗粒和微孔板等），另一条参加反应的核酸链游离在溶液中。固相杂交有菌落原位杂交（colony in situ hybri dization）、斑点杂交法（Dot blot）、Southern印迹杂交（Southern blot）、Northern印迹杂交（ N orthern blot）和组织原位杂交（Tissue in situ hybridization），即原位杂交组织化学技术和原位杂交免疫细胞化学技术。液相分子杂交技术包括吸附杂交、发光液相杂交、液相夹心杂交和复性速率液相分子杂交等。 二、原位杂交组织化学技术的由来及发展 原位杂交组织（或细胞）化学技术简称原位杂交（In situ hybridization），如上所述，属于固相核酸分子杂交的范畴。但它区别于固相核酸分子杂交中的任何一种核酸分子杂交技术。菌落杂交系细菌裂解释放出DNA，然后进行杂交。Southern印迹杂交法是以鉴定DNA中某一特定的基因片段，而Norhtern印迹杂交法是用以检测某一特定的RNA片段的。它们都只能证明该病原体、细胞或组织中是否存在待测的核酸而不能证明该核酸分子在细胞或组织中存在的部位。1969年美国耶鲁大学Gall和Pardue首先用爪蟾核糖体基因探针与其卵母细胞杂交，确定该基因定位于卵母细胞的核仁中。与此同时，Buongiorno– Nardell i和Amaldi, John及其同事等相继利用同位素标记核酸探针进行了细胞或组织的基因定位，从而创造了原位杂交细胞或组织化学技术。Orth（1970）应用3H标记的兔乳头状瘤病毒cRNA探针与兔乳头状瘤组织的冰冻切片进行杂交，首次用原位杂交检测了病毒DNA在细胞中的定位，但当时的工作多采用冰冻组织切片或培养细胞，探针均采用同位素标记。 由于同位素标记探针具有放射性既污染环境，又对人体有害，且受半衰期限制等缺点，科学工作者们开始探索用非放射性的标记物标记核酸探针进行原位杂交。Bauman（1981）等首先应用荧光素标记cRNA探针做原位杂交，然后用荧光显微镜观察获得成功。Shroyer（1982）报道用2，4二硝基苯甲醛（DNP）标记DNA探针，使该DNA探针具有抗原性，然后用兔抗DNP的抗体来识别杂交后的探针，最后经免疫过氧化物酶的方法来定位杂交探针。这两种方法至今仍有采用，但因敏感度不够高，应用不够普遍。 Pezzella（1 987）创建了用磺基化DNA探针来做细胞或组织原位杂交的方法，其基本原理是使DNA探针的胞嘧啶碱基磺基化，利用单克隆">克隆抗体识别磺基化探针，再通过免疫组化方法显示结合的单克隆抗体，从而对杂交结合的探针进行定位。本法的优点是磺基化DAN探针标记简便，不需作缺口平移标记，敏感度也较高。但自生物素和高辛标记探针技术建立后，已有取而代之的趋势。生物素标记探针技术是Brigat（1983）首先建立的，它利用生物素标记的探针在组织切片上检测了病毒DNA，通过生物素与抗生物素结合，过氧化物酶-抗过氧化物酶显示系统显示病毒DNA在细胞中的定位。生物素标记探针技术目前已被广泛应用，特别是在病毒学和病理学的临床诊断中。这种生物素标记技术又叫酶促生物素标记技术。另一种叫光促生物素标记核酸技术，该技术是用光敏生物素（Photobiotin）标记核酸。目前应用的光敏生物素有乙酸盐和补骨脂素生物素，它们都是由三个部分组成：光敏基团、连结臂和生物素（图20-1）。在强光下，不需酶反应，光敏生物素的光敏基团即可与核酸中的碱基相结合。光敏生物素标记核酸，方法简单，灵敏度也不低，但标记效率不高，每100～150个碱基才能标记一个生物素，对于短的基因探针特别是寡核苷酸探针不宜使用，以免因标记数过少而影响灵敏度（Forster et al 1985）。 近年来，地高辛（Digoxigonin）标记技术引起科技工作者的极大兴趣。Boeringer Mannhem Bio－ch emisca于1987年将地高辛标记的有关试剂及药盒投放市场。和其它非放射性标记物一样，地高辛较放射性标记系统安全，方便、省时间。同时在敏感性和质量控制方面比生物素标记技术要优越，可以检测出人基因组DNA中的单拷贝基因。地高辛标记法显示的颜色为紫蓝色（标记碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶显色系统），有较好的反差背景。 核酸探针根据标记方法的不同可粗略分为放射性探针和非放射性探针两类。根据探针的核酸性质不同可分为DNA探针、RNA探针、cDNA探针、cRNA探针和寡核苷酸探针等。DNA探针还有单链DNA（Single st

原位杂交ISH方法

原位杂交技术(ISH)步骤与注意事项 材料 （一）仪器：光学显微镜、烤箱、温箱、水浴箱、电吹风机 （二）器皿：塑料反应盒、玻片架、洗涤杯、微量移液器、Eppendorf 管 （三）试剂： 1．DEPC （所有的试剂以此配制，注：DEPC致癌，应在通风下进行，并避免接触皮肤；含有Tris 中不能用DEPC） 3．0.2mol/L HCl 1.72ml 浓HCl，加ddH2O至1000ml 4．20%冰醋酸20ml 冰醋酸,加ddH2O至100ml 5．蛋白酶（50μg/ml） 6．溶液I: 含0.1mol/L Tris、0.1mol/L NaCl、2mmol/L MgCl2、0.05% Triton X-100 取12.1g Tris; 5.85g NaCl; 0.41g MgCl2·6H2O，溶于800ml ddH2O中，再加入0.5ml Triton X-100，用HCl调pH至7.5，加ddH2O至1000ml。8×105Pa高压蒸汽灭菌15min 7．溶液II: 含0.1 mol/L Tris、0.1mol/L NaCl、50mol/L MgCl2。方法：取12.1gTris；5.85g NaCl ; 10.15g MgCl2·6H2O，溶于800ml ddH2O中，用HCl调至9.5 ddH2O至1000ml。8×105Pa高压蒸汽灭菌15min。 8．4%多聚甲醛：A液：称4g多聚甲醛，加40ml ddH2O，加温至60℃后，边摇边滴加1mol/L NaOH至全部溶解。B：液：1.69g NaH2PO4·2H2O，加30ml ddH2O至溶。C液：0.39gNaOH 溶于20ml ddH2O中。先将B液与C液混合后再加入A液，以1mol/L NaOH或HCl调pH 值至7.2~7.4，加ddH2O至100ml。4℃保存。 9．去离子甲酰胺：新的。 10．20×SSC：含有3mol/L NaCl, 0.3mol/L SSC。取175.32g NaCl，加ddH2O，充分溶解后，加88.2gSSC，溶解后加ddH2O至1000ml。8×105Pa高压蒸汽灭菌15min。 11．硫酸葡聚糖（1mg/ml）,取硫酸葡聚糖1g溶于1ml灭菌水，-20℃下保存。 12．50×Denhart液：含1% BSA，1% Ficoll-400(水溶性聚蔗糖)，1% PVP-40（聚乙烯吡咯烷酮），分别称取1g BSA，1g PVP-40，1g Ficoll-400，用少量的ddH2O溶解混合，加ddH2O 至100ml。过滤灭菌，贮存于-20℃下备用。 13．亲和素---碱性磷酸酶（Av-AP）200U/200μl 14．底物显色液 15．50%甲酰胺50ml甲酰胺，加50ml 2×SSC，混匀后备用。 16．0.1mol/L pH 7.4 PBS.。称取43.2g Na2PO4·2H2O,溶于少量ddH2O，分别溶解后将二者合并，加入127.5g NaCl至完全溶解，加ddH2O至1500ml。8×105Pa高压蒸汽灭菌15min。使用时作10倍稀释。 17．2%BSA。取0.1g BSA，溶于5ml溶液I中。 杂交前标本处理 试剂配制与准备 A 0.1mol/L PBS, pH 7.0 B 0.2% DEPC C 4%多聚甲醛 D 0.1mol/L HCl E 200μg/ml RNase A F 蛋白酶K，稀释成含0.5-1μg/ml, 必要时用1-3或5μg/ml(用10 mg/ml贮存液稀释) G 0.1%甘氨酸, 用0.1mol/L PBS, pH 7.5配制 H 2×SSC, 1×SSC, 用20×SSC贮存液稀释配制