HE染色步骤

常规HE染色步骤

（1）二甲苯（Ⅰ）5-10min

(2)二甲苯（Ⅱ）5-10min

(3)95%乙醇（Ⅰ）1-3min （4）95%乙醇（Ⅱ）1-3min （5）80%乙醇1min （6）蒸馏水1min （7）苏木精液染色5-15min

(8)流水稍洗去苏木精液1-3s

(9)1%盐酸乙醇1-3s

(10)稍水洗10-30s

(11)促蓝液返蓝10-30s

(12)流水冲洗10-15min （13）蒸馏水过洗1-2s

(14)0.5%曙红液染色1-3min

(15)蒸馏水稍洗1-2s

(16)80%乙醇稍洗1-2s

(17)95%乙醇（Ⅰ）3-5min

(18)95%乙醇（Ⅱ）3-5min

(19)无水乙醇5-10min

(20)无水乙醇5-10min

(21)二甲苯（Ⅰ）3-5min

(22)二甲苯（Ⅱ）2-5min

(23)二甲苯（Ⅲ）3-5min

(24)中性树胶封固

结果：细胞浆红色，细胞核蓝紫色。

HE染色基本流程

HE（Hematoxylin & Eosin）染色基本流程 苏木精—伊红染色法简称HE染色法，它是最常用的普通染色方法。苏木精是阳离子染料，将细胞核内的嗜碱性物质染成蓝紫色。伊红是阴离子染料，将细胞质和胶原纤维等染成粉红色。 1、二甲苯脱蜡三道，每道30min 2、无水乙醇两道，每道5min 3、95%乙醇两道，每道5min 4、80%乙醇5min 5、70%乙醇5min 6、50%乙醇5min 7、蒸馏水3-5min 8、苏木素染色液5-10min，根据染色结果和气温调整时间 9、浸自来水冲洗多余的染色液 10、0.5%盐酸酒精分色（70%酒精配制）3-10seconds 11、水洗蓝化15-30min 12、50%乙醇5min 13、70%乙醇5min 14、80%乙醇5min 15、伊红染色液（95%乙醇配制）60seconds 16、95%乙醇两道，每道5min 17、无水乙醇两道，每道5min 18、乙醇+二甲苯（1:1）5min 19、二甲苯三道，每道5min 20、中性树胶封片

HE染色注意事项： 1. 染色时调节pH值很重要。如果组织块在福尔马林中固定时间长，组织酸化而影响细胞核着色。因此，自来水中冲洗时间要长一些或在饱和碳酸锂水溶液中处理10-30min，这样可以使细胞核着色较深。染伊红时胞浆着色不佳，可在伊红溶液中滴加1-2滴冰醋酸。 2. 切片染苏木精后，分色这一步是关键，应在显微镜下控制进行，一般以细胞核染色清楚（晰）而细胞质基本无色为佳。如果过分延长分色时间将导致染色太浅，应重新染色后再行分色。 3. 切片经酒精脱水后，入二甲苯时可出现白色不透明状态，此为脱水不彻底，应将切片退回无水酒精，更换酒精、二甲苯，以求彻底脱水与透明。 4. 在染色过程中不要让切片干燥，以免切片收缩、变形，影响神经元形态。 5. 切片从二甲苯取出或进入二甲苯前，切片周边均应擦干净或吸干多余水分。 6. 最后封固时，要用中性树脂，防止日后褪色，盖片要选大于组织块的面积，如漏出一部分不久将会褪色，所用树脂浓度要适当，树脂封固时不能有气泡。 试剂配制： 0.5%盐酸酒精分色液 浓盐酸0.5～1 ml 70%酒精99 ml

HE染色原理

苏木精-伊红染色方法 苏木精（hematoxylin）和伊红（eosin）染色方法，简称HE染色方法，是细胞与组织学最广泛的染色方法。 一、HE染色的基本原理 （一）细胞核染色的原理 细胞核内的染色质主要是去氧核糖核酸（DNA），DNA的双螺旋结构中，两边链上的磷酸基向外，带负电荷，呈酸性，很容易与带正电荷的苏木精碱性染料以离子键或氢键结合而被染色。苏木精在碱性溶液中呈蓝色，所以细胞核被染成蓝色。 （二）细胞浆染色的原理 细胞浆内主要成分是蛋白质，为两性化合物、细胞浆的染色与pH 值有密切关系，当pH调到蛋白质等电点4.7-5.0时，胞浆对外不显电性，此时酸或碱性染料不易染色。当pH调到6.7-6.8时，大于蛋白质的等电点pH值，表现酸性电离，而带负电荷的阴离子，可被带正电荷的染料染我以，现时胞核也被染色，核和胞浆难以区分。因此必须把pH调至胞浆等电点以下，在染液中加入醋酸使胞浆带正电荷（阳离子），就可被带负电荷（阴离子）的染料染色。伊红Y是一种化学合成的酸性染料，在水中离解成带负电荷的阴离子，与蛋白质的氨基正电荷（阳离子）结合而使细胞浆染色，细胞浆、红细胞、肌肉、结缔组织，嗜伊红颗料等被感染成不同程度的红色或粉红色，与蓝色的细胞核形成鲜明的对比。（三）、二甲苯的作用

烤片后切片进入二甲苯是脱蜡的作用。组织处理和染色后进入二甲苯是透明作用。组织处理的透明是为了石蜡能进入到细胞中去，染色后透明是为了使细胞的折光率与玻璃相同，以便显微镜观察。（四）、酒精的作用 酒精用于苏木精染色前由高浓度至低浓度是为了洗脱用于脱蜡的二甲苯。 伊红染色以后的酒精由低浓度至高浓度酒精逐渐过度是为了彻底脱去组织中的水份。 （五）、水洗的作用 在脱蜡经酒精处理之后，水洗切片，是为了苏木精染液能更好的进入细胞核中去，使细胞核染色均匀。 染色之后的水洗作用是为洗去未与切片结合的染液。 分化以后的水洗则是为了除去分化液和脱下的染料，中止分化作用。 在伊红染色之后也可以水洗，是为了减少伊红染液进入脱水的酒精中。 （六）分化和蓝化作用 1、分化作用 苏木精染色之后，先用水洗去未结合在切片中的染液。然后用分化液1%盐酸酒精脱去细胞核中结合过多的染料和细胞浆中吸附 的染料，这个过程称为染色的分化作用。 2、蓝化作用

免疫组化、HE染色步骤

骨组织石蜡切片制作 步骤： 1.固定：切取骨缺损出的骨组织，用PBS冲洗，放入4%多聚甲醛缓 冲液内固定12—24h。 2.脱钙：将固定好的骨组织放入脱钙液中侵泡脱钙24h. 3.脱水：将固定好的骨组织用蒸馏水冲洗3次，再用50%的酒精冲洗2 次，常规脱水，70%酒精（60min），80%酒精（40min）,95%酒精（30min）,100%酒精1（25min）,100%酒精II（25min）。 4.透明：二甲苯I(35min)，二甲苯II（35min）。 5.包埋：将透明处理后的骨组织依次侵入石蜡I 1小时，石蜡II 1小时。 6.切片：包埋后的组织块经修理后，用切片机切成4um的石蜡带，将组织石蜡块在50℃温水中展片，然后用干净的载玻片捞片。 7.烤片：将切好的组织片放入63℃恒温箱中烤片2小时。 免疫组化检测 步骤： 1.脱蜡：将组织切片放入62℃恒温箱中烘烤20min 二甲苯 1（10min）二甲苯2（10min）。 2.水化：100%酒精1（2min） 100%酒精（2min）95%酒精（2min）80%酒精（2min）70%酒精(2min) 。

3.PBS冲洗3次，每次5min.。 4.抗原修复：将组织片置0.01M的柠檬酸缓冲液（PH6.0）中煮沸 15min ,自然冷却至室温。 5.PBS冲洗3次，每次5min。 6.阻断：3%去离子水37℃孵育10min,以灭活内源性过氧化物酶活 性。 7.PBS冲洗3次，每次5min。 8.滴加1抗（GFP 1：100稀释, 4℃过夜） 9.PBS冲洗3次，每次5min。 10.滴加二步法免疫组化检测试剂的试剂1，37℃孵育,20min, PBS 冲洗3次，每次5min。 11. 滴加二步法免疫组化检测试剂的试剂2，37℃孵育,20min, PBS 冲洗3次，每次5min。 12.DAB显色5min。 13.自来水冲洗10min。 14.苏木精复染2min,盐酸酒精分化。 15.自来水冲洗10min。 16.常规脱水，透明，封片，镜检。 组织切片HE染色 步骤

免疫组化HE染色步骤

免疫组化H E染色步骤 The Standardization Office was revised on the afternoon of December 13, 2020

骨组织石蜡切片制作 步骤： 1.固定：切取骨缺损出的骨组织，用PBS冲洗，放入4%多聚甲醛缓冲 液内固定12—24h。 2.脱钙：将固定好的骨组织放入脱钙液中侵泡脱钙24h. 3.脱水：将固定好的骨组织用蒸馏水冲洗3次，再用50%的酒精冲洗2次，常规脱水，70%酒精（60min），80%酒精（40min）,95%酒精（30min）,100%酒精1（25min）,100%酒精II（25min）。 4.透明：二甲苯I(35min)，二甲苯II（35min）。 5.包埋：将透明处理后的骨组织依次侵入石蜡I1小时，石蜡II1小时。 6.切片：包埋后的组织块经修理后，用切片机切成4um的石蜡带，将组织石蜡块在50℃温水中展片，然后用干净的载玻片捞片。 7.烤片：将切好的组织片放入63℃恒温箱中烤片2小时。 免疫组化检测 步骤： 1.脱蜡：将组织切片放入62℃恒温箱中烘烤20min二甲苯1 （10min）二甲苯2（10min）。 2.水化：100%酒精1（2min）100%酒精（2min）95%酒精（2min） 80%酒精（2min）70%酒精(2min)。 冲洗3次，每次5min.。

4.抗原修复：将组织片置的柠檬酸缓冲液（）中煮沸15min,自然冷 却至室温。 冲洗3次，每次5min。 6.阻断：3%去离子水37℃孵育10min,以灭活内源性过氧化物酶活 性。 冲洗3次，每次5min。 8.滴加1抗（GFP1：100稀释,4℃过夜） 冲洗3次，每次5min。 10.滴加二步法免疫组化检测试剂的试剂1，37℃孵育,20min,PBS冲洗 3次，每次5min。 11.滴加二步法免疫组化检测试剂的试剂2，37℃孵育,20min,PBS冲洗 3次，每次5min。 显色5min。 13.自来水冲洗10min。 14.苏木精复染2min,盐酸酒精分化。 15.自来水冲洗10min。 16.常规脱水，透明，封片，镜检。 组织切片HE染色 步骤 1、将烘烤后的组织切片依次侵入二甲苯1，二甲苯II进行脱蜡各 10min。 2、脱蜡后的组织切片依次浸入无水乙醇I、无水乙醇II、95%酒精、80%酒精、70%酒精中各2min，PBS冲洗2次，每次5min。

HE染色方法与步骤吐血整理

HE染色 试剂配置 A：0.5~1%的伊红酒精溶液： 称取伊红Y0.5~1g，加少量蒸馏水溶解后，再滴加冰醋酸直至浆糊状。以滤纸过滤，将滤渣在烘箱中烤干后，以95%酒精（即工业酒精，如果不怕浪费，用无水乙醇配制也可）100毫升溶解。 B：苏木素染液配方：(配制3000ml，可按比列减少) 苏木精6g 无水乙醇100ml 硫酸铝钾150g 蒸馏水2000ml 碘酸钠1.2g 冰醋酸120ml 甘油900ml 配制方法：将苏木素溶于无水乙醇，再将硫酸铝钾溶于蒸馏水，溶解后将甘油倾入一起混合，最后加入冰醋酸和碘酸钠。 C：1%盐酸酒精分化液：将1毫升浓盐酸加入99毫升70%酒精中即可。 染色流程 (1)二甲苯（Ⅰ）15min (2)二甲苯（Ⅱ）15min （3）二甲苯：无水乙醇=1:12min (4)100%乙醇（Ⅰ）5min (5)100%乙醇（Ⅱ）5min (6)80%乙醇5min (7)蒸馏水5min (8)苏木精液染色5min (9)流水稍洗去苏木精液1-3s (10)1%盐酸乙醇1-3s (11)稍水洗10-30s (12)蒸馏水过洗1-2s (13)0.5%伊红液染色1-3min (14)蒸馏水稍洗1-2s (15)80%乙醇稍洗1-2s (16)95%乙醇（Ⅰ）2-3s (17)95%乙醇（Ⅱ）3-5s (18)无水乙醇5-10min (19)石炭酸二甲苯5-10min (20)二甲苯（Ⅰ）2min (21)二甲苯（Ⅱ）2min

(22)二甲苯（Ⅲ）2min (23)中性树胶封固 注：①第（11）、（12）步可省去，（13）步冲水时间需延长至20-30min。 ②第（21）步如果不用石炭酸二甲苯，可改用无水乙醇。 *冷冻切片HE染色步骤： （1）冰冻切片固定10～30s （2）稍水洗1～2s （3）苏木精液染色（60℃）30～60s （4）流水洗去苏木精液5～10s （5）1%盐酸乙醇1～3s （6）稍水洗1～2s （7）促蓝液返蓝5～10s （8）流水冲洗15～30s （9）0.5%曙红液染色30～60s （10）蒸馏水稍洗1～2s （11）80%乙醇1～2s （12）95%乙醇1～2s （13）无水乙醇1～2s （14）石炭酸二甲苯2～3s （15）二甲苯（Ⅰ）2～3s （16）二甲苯（Ⅱ）2～3s （17）中性树胶封固。 注：第（14）步如果不用石炭酸二甲苯，可改用无水乙醇。 染色结果：细胞核蓝色，胞质、肌纤维、胶原纤维和红细胞呈深浅不一的红色。 4．12切片脱水透明切片经HE染色后，要彻底脱水透明，才能用中性树胶封盖。如果脱水不彻底，封片后呈白色雾状，镜下观察模糊不清，且容易褪色。切片1-2级无水乙醇脱水，也可使用石碳酸二甲苯进行脱水。石碳酸有较强脱水能力，但长时间可使切片脱色，因此要经过多次二甲苯以使石碳酸完全除去。 5.H-E染色评定标准： （1）切片完整，厚度4-6微米，厚薄均匀，无皱褶无刀痕； （2）染色核浆分明，红蓝适度，透明洁净，封裱美观。 4 染色结果编辑 细胞核被苏木精染成鲜明的蓝色，软骨基质、钙盐颗粒呈深蓝色，粘液呈灰蓝色。细胞浆被伊红染成深浅不同的粉红色至桃红色，胞浆内嗜酸性颗粒呈反光强的鲜红色。胶原纤维呈淡粉红色，弹力纤维呈亮粉红色，红血球呈橘红色，蛋白性液体呈粉红色。 着色情况与组织或细胞的种类有关，也随其生活周期及病理变化而改变。例如，很多细胞在新生时期胞浆对伊红着色较淡或轻度嗜碱，当其衰老时或发生退行性变则呈现嗜伊红浓染。胶原纤维在老化和出现透明变性时，伊红着色由浅变深。

HE染色步骤

常规HE染色步骤 （1）二甲苯（Ⅰ） 5-10 min (2) 二甲苯（Ⅱ） 5-10 min (3) 95%乙醇（Ⅰ） 1-3 min （4）95%乙醇（Ⅱ） 1-3 min （5）80%乙醇 1 min （6）蒸馏水 1 min （7）苏木精液染色 5-15 min (8 ) 流水稍洗去苏木精液 1-3 s (9) 1%盐酸乙醇 1-3 s (10) 稍水洗 10-30 s (11)促蓝液返蓝 10-30 s (12) 流水冲洗 10-15 min （13）蒸馏水过洗 1-2 s (14) 0.5%曙红液染色 1-3 min (15) 蒸馏水稍洗 1-2 s (16) 80%乙醇稍洗 1-2 s (17) 95%乙醇（Ⅰ） 3-5min (18) 95%乙醇（Ⅱ） 3-5 min (19) 无水乙醇 5-10 min (20) 无水乙醇 5-10 min (21) 二甲苯（Ⅰ） 3-5 min (22) 二甲苯（Ⅱ） 2-5 min (23) 二甲苯（Ⅲ） 3-5 min (24) 中性树胶封固 结果：细胞浆红色，细胞核蓝紫色。 转：常规HE染色步骤 （1）二甲苯（Ⅰ） 5-10 min (2) 二甲苯（Ⅱ） 5-10 min (3) 95%乙醇（Ⅰ） 1-3 min （4）95%乙醇（Ⅱ） 1-3 min （5）80%乙醇 1 min （6）蒸馏水 1 min （7）苏木精液染色 5-15 min

(8 ) 流水稍洗去苏木精液 1-3 s (9) 1%盐酸乙醇 1-3 s (12) 流水冲洗20-30min （13）蒸馏水过洗 1-2 s (14) 0.5%曙红液染色 1-3 min (15) 蒸馏水稍洗 1-2 s (16) 80%乙醇稍洗 1-2 s (17) 95%乙醇（Ⅰ） 2-3 s (18) 95%乙醇（Ⅱ） 3-5 s (19) 无水乙醇 5-10 min (20) 石炭酸二甲苯无水乙醇 5-10 min (21) 二甲苯（Ⅰ） 2 min (22) 二甲苯（Ⅱ） 2 min (23) 二甲苯（Ⅲ） 2 min (24) 中性树胶封固 注：①第（10）、（11）步可省去，（12）步冲水时间需延长至20-30min。 ②第（20）步如果不用石炭酸二甲苯，可改用无水乙醇。 1．取材组织块，经固定后，常规石蜡包埋，4μm切片。 2．切片常规用二甲苯脱蜡，经各级乙醇至水洗：二甲苯（I）5min→二甲苯（Ⅱ）5min （各→100％乙醇2min→95％的乙醇1min→80％乙醇1min→75％乙醇1min→蒸馏水洗2min。 两次，然后把水吸干） 3．苏木素染色5min，自来水冲洗。（吸干水） 4．盐酸乙醇分化30s（提插数下）。 5．自来水浸泡15min或温水（约50℃）5min。（吸干水） 6．置伊红液2min。 7．常规脱水，透明，封片：95％乙醇（I）min→95％乙醇（Ⅱ）1min→100％乙醇（I）1min→100％乙醇（Ⅱ）1min→二甲苯石碳酸（3：1）1min（省略）→二甲苯（I）1min→二甲苯（Ⅱ）1min→中性树脂封固。

病理片HE染色步骤

病理片 HE染色步骤： 烤片80度半小时 (1)二甲苯（Ⅰ）5min (2)二甲苯（Ⅱ）5 min (3)二甲苯（III）5min (4)100%乙醇（Ⅰ）2min (5)90%乙醇（Ⅱ） 2 min (6)80%乙醇（III）2min (7)70%乙醇（IV）2 min (8) 流水冲洗5min (9) 苏木精液染色5 min (10) 流水稍洗去苏木精液1-3 s (11) 1%盐酸乙醇1-3 s (12)流水过洗至返蓝 (13) 0.5%伊红液染色1-3 min (14) 蒸馏水稍洗1-2 s (15) 80%乙醇稍洗1-2 s (16) 95%乙醇（Ⅰ）2-3 s (17) 100%乙醇（Ⅱ）3-5 s (18) 二甲苯（Ⅰ）2 min (19) 二甲苯（Ⅱ）2 min (20) 二甲苯（Ⅲ）2 min (21) 中性树胶封固

* 冷冻切片HE染色步骤： （1）冰冻切片固定10～30 s （2）水洗1～2 s （3）苏木精液染色（60℃）30～60 s （4）流水洗去苏木精液5～10 s （5）1%盐酸乙醇1～3 s （6）稍水洗1～2 s （7）促蓝液返蓝 （8）流水冲洗15～30 s （9）0.5%曙红液染色30～60 s （10）蒸馏水洗1～2 s （11）80%乙醇1～2 s （12）95%乙醇1～2 s （13）无水乙醇1～2 s （14）石炭酸二甲苯2～3 s （15）二甲苯（Ⅰ）2～3 s （16）二甲苯（Ⅱ）2～3 s （17）中性树胶封固。 H-E染色评定标准： （1）切片完整，厚度4-6微米，厚薄均匀，无皱褶无刀痕；（2）染色核浆分明，红蓝适度，透明洁净，封裱美观。

HE染色步骤

HE染色法是苏木精（hematoxylin）和伊红（eosin）的首个字母缩写。苏木精是碱性染料，使细胞核染色质和胞质内的核糖体呈紫蓝色。伊红是酸性染料，使细胞质和细胞外基质中带较强碱基的蛋白质成份着红色。 常规he染色步骤： (1)二甲苯（Ⅰ）15min (2) 二甲苯（Ⅱ）15 min （3）二甲苯：无水乙醇=1:1 2min (4)100%乙醇（Ⅰ）5min (5)100%乙醇（Ⅱ）5 min (6)80%乙醇5min (7)蒸馏水5 min (8)苏木精液染色5 min (9) 流水稍洗去苏木精液1-3 s (10) 1%盐酸乙醇1-3 s (11) 稍水洗10-30 s (12)蒸馏水过洗1-2 s (13) 0.5%伊红液染色1-3 min

(14) 蒸馏水稍洗1-2 s (15) 80%乙醇稍洗1-2 s (16) 95%乙醇（Ⅰ）2-3 s (17) 95%乙醇（Ⅱ）3-5 s (18) 无水乙醇5-10 min (19) 石炭酸二甲苯5-10 min (20) 二甲苯（Ⅰ）2 min (21) 二甲苯（Ⅱ）2 min (22) 二甲苯（Ⅲ）2 min (23) 中性树胶封固 注：①第（11）、（12）步可省去，（13）步冲水时间需延长至20-30min。 ②第（21）步如果不用石炭酸二甲苯，可改用无水乙醇。 冷冻切片HE染色步骤： （1）冰冻切片固定10～30 s （2）稍水洗1～2 s （3）苏木精液染色（60℃）30～60 s

（4）流水洗去苏木精液5～10 s （5）1%盐酸乙醇1～3 s （6）稍水洗1～2 s （7）促蓝液返蓝5～10 s （8）流水冲洗15～30 s （9）0.5%曙红液染色30～60 s （10）蒸馏水稍洗1～2 s （11）80%乙醇1～2 s （12）95%乙醇1～2 s （13）无水乙醇1～2 s （14）石炭酸二甲苯2～3 s （15）二甲苯（Ⅰ）2～3 s （16）二甲苯（Ⅱ）2～3 s （17）中性树胶封固。

石蜡切片和HE染色详细步骤

石蜡切片和HE染色详细步骤 石蜡切片和HE染色 方法与步骤 1(取材 颈椎脱臼法处死小鼠，打开腹腔，剪取肝组织(或其他组织)。切取的组织块不宜太大，以利于固定剂穿透，通常以5mm×5mm×2mm或10 mm×10 mm×2 mm为宜。取下所需要的肝组织，切成一小块2,3mm厚。 注意事项: (1)取材动作要迅速，不宜作太久的拖延以免组织细胞的成分、结构等发生变化。 (2)切片材料应根据需要观察的部位进行选择，尽可能不要损伤所需要的部分。 2(固定 将切好的肝组织用生理盐水组织洗一下，立即投入中性福尔马林固定液中固定，固定30,50min。 注意事项: (1)一般固定液，都以新配为好，配好后应贮存在阴凉处，不宜放在日光下，以免引起化学变化，失去固定作用。 (2)有些混合固定液的成份之间会发生氧化还原作用，一定要在使用前才混合，如果混合太早，固定时就没有作用了。 (3)固定材料时，固定液必须充足，一般为材料块的20~30倍，有些水分多的材料，中间应更换1-2次新液。 (4)材料固定完毕后，保存于严密紧塞或加盖的容器里，同时在容器外上标签，并随同材料在溶液中投入相应的标签，以免相互混淆。标签上注明固定液、材料来源、日期等。标签上的文字，应用黑色铅笔或绘图黑墨水书写。

3. 脱水 50%酒精?70%酒精?80%酒精?95%酒精?100%酒精?100%酒精。每级0.5h。 注意事项: (1)脱水必须在有盖的玻璃品中进行，防止吸收空气中的水分。 (2)在更换高一级的脱水剂时，最好不要移动材料以免损坏，可用吸管吸出器皿中的脱水剂，再用吸水吸尽器皿内剩余液，然后于皿中加入高一级脱水剂。 (3)在低浓度酒精中，每级停留不宜太长，否则易使组织变软，助长材料的解体。 (4)在高浓度或纯酒精中，每级停留的时间也不宜太长，否则会使组织变脆，影响切片。 (5)如需过夜，应停留在70%酒精中。 (6)脱水必须彻底，否则不易透明，甚至使透明剂内出现白色混浊现象 4. 透明 1/2二甲苯+1/2无水乙醇 (2h) ?纯二甲苯(1.5h) ?纯二甲苯(1.5h)。由于乙醇与石蜡不相溶，而二甲苯既能溶于乙醇又能溶于石蜡，所以脱水后还要经过二甲苯以过渡。当组织中全部被二甲苯占有时，光线可以透过，组织呈现出不同程度的透明状态。 注意事项 (1)使用透明剂时，要随时盖紧盖子，以免空气中的水分进入。 (2)更换每级透明剂，动作要迅速，一方面为了不使材料块干涸，另一方面能避免吸收湿气。 3)在透明过程中，如果材料周围出现白色雾状，说明材料中的水未被脱净，应退回纯酒精中重新脱( 水，然后再透明。 5. 浸蜡

HE染色步骤

1 HE染色结果(横切) NC组毛细血管管壁光滑、管腔形状规则; 坐骨神经纤维排列紧密, 分布均匀, 单个纤维饱满, 髓鞘着色均匀粉染, 可见半月形的施万氏细胞 (见图1)。 DM组( 1)成模即刻( 0w)组: 与NC组类似, 毛细血管管壁光滑、管腔形状规则; 坐骨神经纤维排列紧密, 分布均匀, 单个纤维饱满, 髓鞘着色均匀粉染, 可见半月形的施万氏细胞。( 2) 4w组: 4w时毛细血管管壁轻度增厚、毛细血管内皮细胞略有肿胀; 坐骨神经纤维排列略松散、髓鞘开始变薄, 密度略有不均匀, 偶有斑块状密度减低区。( 3)8w组: 8w时神经纤维的改变比4w时明显, 毛细血管管壁明显增厚、毛细血管内皮细胞明显肿胀、变形, 毛细血管的管腔开始出现不规则; 坐骨神经纤维排列松散、髓鞘变薄, 密度明显不均匀, 可见斑块状密度减低区。( 4) 12w组: 病变随着时间推移而逐渐加重, 12w时比DM8w时更明显。毛细血管管壁异常增厚、毛细血管内皮细胞明显肿胀、高度变形,毛细血管的管腔非常不规则, 甚至发生闭塞。坐骨神经纤维排列异常松散、髓鞘变薄, 密度明显不均匀, 甚至完全消失; 轴索变细, 甚至完全闭锁。(见图2~图4)。 2 HE 染色结果（横切） 光学显微镜下观察坐骨神经切片，可见NC 组大鼠的坐骨神经有髓神经纤维形态正常。而DM4 周组坐骨神经纤维排列略松散，髓鞘开始变薄，密度略不均匀。DM8 周组神经纤维髓鞘呈空泡变性，施旺细胞增殖，神经纤维紊乱、结构不清晰，轴突萎缩。 1.烤箱烤片60min(化腊) 2.石蜡切片用二甲苯脱蜡。(二甲苯各10min/次，2次) 3.梯度酒精水化（100%以乙醇，90%乙醇，50%乙醇，50%乙醇， 各8min）后，在蒸馏水中浸泡5分钟（自来水冲洗）。 4.苏木素染色3min。 5.流水稍洗去苏木精液，洗3s。 6.1%盐酸乙醇分化1-3s。 盐酸1份 70%乙醇99份 7.水洗15s。 8.0.5%氨水返蓝15s（自来水冲洗返蓝）。??

He染色切片制作(各动物、全过程、操作要点、注意事项)

石蜡切片制备基本步骤 一、准备工作 （一）洗涤实验所需器皿：（玻璃器皿的清洗） 1、用洗衣粉将玻璃器皿表里擦洗干净反复洗刷 2、将器皿在自来水下冲洗干净 3、将器皿倒扣在铺有吸水纸或纱布的桌子上控干 注：一般情况下，经以上步骤后，用蒸馏水洗过1~3次即可烘干备用，如果做特殊染色还需浸泡在酸性清洁液内12~24小时，再经自来水彻底冲洗，再用蒸馏水过洗1~3次烘干备用。 （二）配制：硫酸洗液的配制 清洁液（洗液）的配制： 成分强酸液次强酸液弱酸液 浓硫酸（ml） 1000 200 100 重铬酸钾（mg） 63 120 100 蒸馏水（ml） 200 200 1000 重铬酸钾1200g 蒸馏水 2000ml 将2000ml浓硫酸缓缓倒入上述溶液中，边倒边用木棒轻轻搅拌 （三）载玻片与盖玻片的处理 1. 将所需载玻片与盖玻片清洗后，放入硫酸重铬酸钾溶液中浸泡24小时 2. 流水冲洗，再用蒸馏水冲洗3遍 3. 95%~100%酒精浸泡24小时，用绸布擦干备用 注：在将载玻片与盖玻片放入清洁液中时，要一片片地投入，使其不致重叠。 二、常用液体的配制 （一）缓冲溶液： 1．磷酸盐缓冲液 A液：0.1mol/L磷酸二氢钠 B液：0.1mol/L磷酸氢二钠 A液与B液按比例混合调整到所需的PH值（3：7≈PH7.0） 2．枸椽酸缓冲溶液 A液：0.1mol/L枸椽酸 B液：0.1mol/L枸椽酸钠 A液与B液按比例混合调整到所需的PH值（6.2：42.8≈PH6.2） （二）固定剂： 1．甲醛：10%甲醛 福尔马林 100ml 蒸馏水 900ml 注：实际甲醛含量只有3.6~4.0%但习惯上都将其视为10%。 2．10％中性福尔马林钙固定液

he染色步骤HE实验步骤

he染色步骤 HE实验步骤 动物病理切片小结 [样本处理] 动物麻醉后，开胸，暴露心脏，头皮针插入左心室尖，打开37?生理盐水输液装置，从右心耳下沿剪开右心房，灌洗至流出的生理盐水无血(20min)，换4%多聚甲醛固定液灌注(约5min) [固定] 4%多聚甲醛固定。 [石蜡切片] ? 取样从固定中取出待切组织，用手术刀切成2mm厚度的小样，装入脱 水小盒中，铅笔标号纸条同放入小盒后流水洗30min，蒸馏水浸洗 ? 处理 Mice: 脱水 50%乙醇 2-3h 1 70%乙醇 1-2h 80%乙醇 1h 95%乙醇 2h(1h+1h) 100%乙醇 2h(1h+1h) 透明二甲苯 35min+35min 浸蜡 1h+1h+1h (62?蜡) [HE染色]

脱蜡二甲苯? 15min 二甲苯? 15min 二甲苯:无水乙醇(1:1) 2min 无水乙醇? 2min 无水乙醇? 2min 95%乙醇 2min 85%乙醇 2min 70%乙醇 2min 50%乙醇 2min 蒸馏水 5min (如果是DAB染色要抗原修复) HE染色 ? 苏木素 6-8min (时间可以延长，现在10-30min) ? 冲洗 1min(反向将载玻片反向冲洗，注意不要脱 片) 2 ? 含1%盐酸的乙醇进行分色(用75%乙醇配)2-3s动作要快? 氨水反蓝 >10min ? 伊红 10s ? 冲洗 固定 脱水95%乙醇 2min 100%乙醇? 2min 100%乙醇? 2min

二甲苯? 2min 二甲苯? 2min 树胶封片 组织浸蜡- 常规石蜡切片制作 组织经过透明剂的完全透明后，被移放于65?左右熔化的石蜡中，于65?的电热恒温箱中浸渍的过程称为浸蜡。 组织在脱水时，组织中的脂类和类脂等物质在脱水剂的作用下被溶解掉，留下了许多腔隙，许多管腔组织和血管，也有许多腔隙，这些都严重地影响了切片。组织浸蜡时，由于诱导剂(二甲苯)的作用，石蜡进入到组织的各个角落，并在各个角落中保存下来。当石蜡包埋后冷却时，这浸入到里 3 面的石蜡便可起到支撑的作用，而且使组织不致于变形，塌陷等现象，使切片能完整的切出，便于镜下观察。 组织浸蜡据多次文献报到必须换几次不同熔点的石蜡。石蜡有软蜡和硬蜡之分，软蜡的熔点有45?、52~54?。硬蜡的熔有56~58?，58~60?、60~62?。浸蜡的顺序是先软蜡，后硬蜡，浸蜡的时间根据组织不同而确定不同的时间。有的人指出组织浸蜡先放入二甲苯与石蜡等份混合的液体中浸渍然后再放入软蜡、硬蜡。根据使用经验我认为不必要这样做。因为组织经二甲苯或其它透明剂透明后，在组织进入石蜡时，自己还带着残存的透明液，如为手工操作，可将组织块控干，尽量减少残存液的存在，而自动脱水机则不然，组织可存留一定量的透明剂，经使用次数多次后，残存的透明剂可把石蜡稀释。因此机器程序处理的次数较多时，应注意换石蜡，以防组织浸蜡效果不好。 一、石蜡的性质

HE染色操作流程

H E染色操作流程 公司内部编号：（GOOD-TMMT-MMUT-UUPTY-UUYY-DTTI-

H E染色操作流程 HE染色，即是苏木精-伊红染色法，是最常用的染色方法，在质量较佳的HE染色切片上，各种组织或细胞的一般形态结特点都可以观察到。苏木精染液为碱性，主要使细胞核内的染色质与胞质内的核糖体着紫蓝色；伊红为酸性染料，主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色。[试剂材料] 1.试剂：0.5%醇溶性伊红染液，改良的哈瑞（Harris）苏木素，0.5%盐酸酒精溶液 1.1 伊红： 配制方法：中性红 0.5g，80%酒精100ml,将伊红溶于酒精内搅拌，全部溶解后即可使用。 1.2苏木精： 配制方法：A液：苏木素1g，无水酒精10ml B液：硫酸铝钾20g，蒸馏水200ml 两液分别溶解后混合，加热煮沸后，慢慢加入红色氧化汞0.5g，此时有大量气泡产生，故容器要大，以防液体溢出，然后将染液迅速冷却，冷却后过滤，并每100ml加入冰醋酸6ml，甘油10ml。 1.3 0.7%盐酸酒精溶液 配制方法：盐酸0.7ml，70%酒精100ml 2.材料：石蜡切片 [操作流程]

1.将石蜡切片置于烘箱中60℃烤1～2h； 2.石蜡切片常规二甲苯，乙醇脱蜡至水， 3.苏木素染10分钟， 4.流水冲洗，去余色， 5.0.7%盐酸乙醇分化数秒钟， 6.流水冲洗，切片变蓝约15分钟， 7.95%乙醇30秒钟， 8.酒精性伊红染30秒， 9.I 95%乙醇30秒钟， 10.II 95%乙醇30秒钟， 11.I 100%乙醇30秒钟， 12.II100%乙醇30秒钟， 13.石碳酸二甲苯30秒钟，（1： 4石碳酸1-二甲苯4） 14.I二甲苯30秒钟， 15.II二甲苯30秒钟， 16.中性树胶封片。 [实验结果]： 镜下观察细胞核呈蓝色；细胞浆一般呈红色；胶原纤维呈不同程度的红色，红细胞呈亮红色；粘蛋白呈浅蓝色；钙化组织呈深蓝色等。 [实验中所需试剂的生产商，货号及产地]：

he染色

苏木素-伊红染色液(H-E)说明书 【产品名称】 苏木素-伊红染色液(H-E） 【型号】 苏木素染色液分别为：Mayer型、改良Harris型、型改良Lillie-Mayer型； 伊红染色液分别为：水溶型、醇溶型。 【包装规格】 货号：DH0006 单瓶包装规格分别为：100ml、250ml、500ml、5000ml； 每套/盒包装规格分别为：2×100ml/盒、2×250ml/盒、2×500ml/盒、2×5000ml/盒。 【预期用途】 主要用于对细胞组织进行染色。 【检验原理】 苏木素(Hematoxylin)和伊红(Eosin)联合主要用于对细胞组织进行染色，简称HE染色，是病理学常规制片中最基本的染色方法，应用极其广泛，苏木素-伊红染色是生物学、组织学、病理学及细胞学等学科必不可少的最基本的染色方法，在病理诊断、教学与科研中广泛应用，具有重要价值，细胞中的细胞核是由酸性物质组成，它与碱性染料(苏木素)的亲和力较强；细胞浆则相反，它所含的碱性物质与酸性染料(伊红)的亲和力较大。因此细胞或组织切片经苏木素-伊红染色液染色后，细胞核被苏木素染成鲜明的蓝紫色，细胞浆、肌纤维、胶元纤维等呈不同程度的红色，红细胞则呈橙红色。 【主要组成成分】 试剂组成主要成分苏木素染色液(改良Lillie-Mayer)或苏木素染色液(改良Harris)或木素染色液(Mayer) 苏木色精伊红染色液(水溶)或伊红染色液(醇溶) 伊红 【储存条件及有效期】 5℃～35℃保存，原包装未开封染色液的有效期为18个月，在有效期内的已开封染色建议在开封后6个月内使用完，每次用后及时拧紧瓶盖，以免挥发或变质。 【样本要求】 涂片和切片必须充分固定，石蜡切片要充分脱蜡。 【检验方法】 l、石蜡切片于二甲苯I、II中脱蜡； 2、经无水乙醇和95%乙醇，经8O%乙醇，自来水冲洗； 3、苏木素染色液(改良Lillie-Mayer或改良Harris)染色，自来水洗；或苏木素染色液(Mayer)染色； 4、苏木素染色后用l%盐酸乙醇溶液分化数秒(l%盐酸乙醇溶液配制：99m1 75%乙醇加1ml浓盐酸）；若用苏木素染色液(Mayer)染色后则不需分化； 5、自来水冲洗返蓝；亦可用碳酸锂水溶液返蓝，自来水洗； 6、入伊红染色液(水溶)染色，稍洗；若用伊红染液(醇溶），切片应先经80%乙醇脱水后，再入伊红染液(醇溶)染色(忌水洗）； 7、95%乙醇I、II中调色； 8、无水乙醇I、II中脱水，二甲苯I、II中透明； 9、封片胶封片，镜检。 【检验方法的局限性】 仅供细胞和组织形态学观察染色使用。 【注意事项】 1、温度较低时苏木素染色液不易着色，可适当延长染色时间。

HE染色操作流程

HE 染色操作流程 HE染色，即是苏木精-伊红染色法，是最常用的染色方法，在质量较佳的HE染色切片上，各种组织或细胞的一般形态结特点都可以观察到。苏木精染液为碱性，主要使细胞核 内的染色质与胞质内的核糖体着紫蓝色；伊红为酸性染料，主要使细胞质和细胞外基质中的 成分着红色。 ［试剂材料］1?试剂：%醇溶性伊红染液，改良的哈瑞（Harris ）苏木素，%盐酸酒精溶液 伊红： 配制方法：中性红0.5g, 80%酒精100ml,将伊红溶于酒精内搅拌，全部溶解后即可使用。 苏木精： 配制方法： A 液: 苏木素1g,无水酒精10ml B 液: 硫酸铝钾20g,蒸馏水200ml 两液分别溶解后混合，加热煮沸后，慢慢加入红色氧化汞，此时有大量气泡产生，故容器要大，以防液体溢出，然后将染液迅速冷却，冷却后过滤，并每100ml加入冰醋酸6ml，甘油 10ml。 %盐酸酒精溶液 配制方法：盐酸，70%酒精100ml 2?材料：石蜡切片 ［操作流程］ 1?将石蜡切片置于烘箱中60 C烤1?2h; 2?石蜡切片常规二甲苯，乙醇脱蜡至水， 3.苏木素染10分钟， 4?流水冲洗，去余色， 5.0.7%盐酸乙醇分化数秒钟， 6.流水冲洗，切片变蓝约15分钟， %乙醇30秒钟， 8.酒精性伊红染30秒， 95%乙醇30秒钟， 95%乙醇30秒钟， 100%乙醇30秒钟， %乙醇30秒钟， 13.石碳酸二甲苯30秒钟，（1: 4石碳酸1-二甲苯4） 二甲苯30秒钟， 二甲苯30秒钟， 16.中性树胶封片。 ［实验结果］: 镜下观察细胞核呈蓝色；细胞浆一般呈红色；胶原纤维呈不同程度的红色，红细胞呈亮红色； 粘蛋白呈浅蓝色；钙化组织呈深蓝色等。 ［实验中所需试剂的生产商，货号及产地］:

HE染色和免疫组化步骤

二十四、HE染色： 1?伊红染液配方： 称取伊红2 g，溶于5 ml 蒸馏水，逐滴加入冰醋酸，边加边搅拌至糊状，再加入数毫升蒸馏水，继续滴加冰醋酸至沉淀不再增加，过滤，将沉淀和滤纸一起置于50-60℃温箱中烘干，溶于400 ml 95%的酒精中。 2?苏木精染液配方： A液：苏木精2 g ；无水乙醇250 ml 。B液：钾矾（硫酸铝钾）17.6 g；水750mL 。 具体步骤： 分别按以上配方配好A液和B液，并混合后加入碘酸钠0.2g，冰醋酸20mL染液配好后，将瓶口用裹着棉花的纱布塞紧，放在暗处通风的地方，并经常摇动以促进它的成熟。成熟时间约1个月。此染液需要提前1个月配置好，备用，如果想要促进它的成熟，可在染液里加入0.2 g碘酸钠。此染液染核效果良好，染色均匀，不会发生沉淀，而且可以长期稳定保存。此染液可同时与伊红等进行细胞的染色。 整个染色过程包括五个内容：脱蜡复水、染色、脱水、透明和封片。1?脱蜡复水：a. 65℃温箱烤片30min后, 石蜡切片经二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡各5~10min, b. 石蜡切片依次各级浓度酒精复水：经100%酒精→100%酒精→95%酒精→80%酒精→70%酒精→50%酒精→蒸馏水，各1-2 min。2?染色：a. 苏木精染色约4min。染色时间主要根据染色剂的成熟

度以及室温高低，可以适当缩短或延长（现在的成熟度4min左右）。 b. 水洗5-10min c. 脱水Ⅰ切片经50%乙醇→70%乙醇→80%乙醇→95%乙醇，各1-2 min。 d. 复染伊红染色10s-20s ，着色以较浅为宜。 3?脱水Ⅱ：用95%乙醇洗去切片多余的红色，然后放入100%无水乙醇两次各1.5 min，共3min。 4?透明：切片依次经乙醇-二甲苯等量混合液1.5min、纯二甲苯Ⅰ5min、Ⅱ5min。二甲苯要定期更换，切片如在二甲苯中出现白雾现象，说明脱水未尽，应退回乙醇中重新脱水，否则切片难以镜检。 5?封片滴加中性树胶，注意组织不能有气泡。轻压盖玻片可赶走气泡。 二十六、免疫组化 1?脱蜡复水a. 65℃温箱烤片30min后, 石蜡切片经二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡各5~10min, b. 石蜡切片依次各级浓度酒精复水：经50%酒精+50%二甲苯→100%酒精→100%酒精→95%酒精→80%酒精→70%酒精→50%酒精→蒸馏水，各90s。 2?抗原修复：10 mM柠檬酸钠微波炉高火保持沸腾不少于20 min，沸腾需要8-10分钟，大约共30min。一般每次7min，四次。 3?PBS清洗2-3次，每次2 min，注意力度，你可用力过大，组织不能干。

HE染色步骤

HE染色石蜡切片制作的基本过程 作者：未知来源：生物秀时间：2007-12-7 1、取材与固定： 从人或动物新鲜尸体上取下组织块(一般厚度不超过0．5厘米)投入预先配好的固定液中(10％福尔马林，Bouin氏固定液等)使组织、细胞的蛋白质变性凝固，以防止细胞死后的自溶或细菌的分解，从而保持细胞本来的形态结构。 2、脱水透明： 一般用由低浓度到高浓度酒精作脱水剂，逐渐脱去组织块中的水份。再将组织块置于既溶于酒精，又溶于石蜡的透明剂二甲苯中透明，以二甲苯替换出组织块的中酒精，才能浸蜡包埋。 3、浸蜡包埋： 将已透明的组织块置于已溶化的石蜡中，放入溶蜡箱保温。待石蜡完全浸入组织块后进行包埋：先制备好容器(如折叠一小纸盒)，倒入已溶化的石蜡，迅速夹取已浸透石蜡的组织块放入其中。冷却凝固成块即成。包埋好的组织块变硬，才能在切片机上切成很薄的切片。 4、切片与贴片： 将包埋好的蜡块固定于切片机上，切成薄片，一般为5—8微米厚。切下的薄片往往皱折，要放到加热的水中烫平，再贴到载玻片上，放45℃恒温箱中烘干。 5、脱蜡染色： 常用HE染色，以增加组织细胞结构各部分的色彩差异，利于观察。苏木精(Hematoxylin，H)是一种碱性染料，可将细胞核和细胞内核糖体染成蓝紫色，被碱性染料染色的结构具有嗜碱性。伊红(Eosin，E)是一种酸性染料，能将细胞质染成红色或淡红色，被酸性染料染色的结构具有嗜酸性。染色前，须用二甲苯脱去切片中的石蜡，再经由高浓度到低浓度酒精，最后入蒸馏水，就可染色。 HE染色过程是： ①将已入蒸馏水后的切片放入苏木精水溶液中染色数分钟。 ②酸水及氨水中分色，各数秒钟。 ③流水冲洗1小时后入蒸馏水片刻。 ④入70％和90％酒精中脱水各10分钟。 ⑤入酒精伊红染色液染色2—3分钟。 6、脱水透明： 染色后的切片经纯酒精脱水，再经二甲苯使切片透明。 7、封固： 将已透明的切片滴上加拿大树胶，盖上盖玻片封固。待树胶略干后，贴上标笺，切片标本就可使用。 .甲苯胺蓝液染色方法: (一)1.甲苯胺蓝液甲苯胺蓝0.5g 蒸馏水定容至100ml 2.冰醋酸液冰醋酸0.5ml蒸馏水定容至100ml 染色步骤 1.组织切片常规脱蜡

HE染色步骤

HE染色步骤 （1）切片在二甲苯中脱蜡5～10分钟。 （2）移入二甲苯和纯酒精（1∶1）混合液中5分钟左右（如经二次二甲苯脱蜡，此步可略）。 （3）入100％、95％、85％、70％酒精，各级为2～5分钟。最后经蒸馏水转入染液。 （4）苏木精染液染色5～15分钟。 （5）水洗玻片上多余染液，0.5～1％盐酸酒精（70％酒精配制）分色片刻。镜检控制，直至细胞核及核内染色质清晰为止，约数10秒钟。 （6）流水冲洗15～30分钟，或者在碳酸锂饱和液中短时间碱化或蓝化，即细胞核呈蓝色。 （7）蒸馏水短洗。 （8）0.1～0.5％伊红染液染色1～5分钟，若着色困难，可在每100毫升染液中加入1～2滴冰醋酸，使易着色且不易脱色。 （9）依次经70％、85％、95％、100％酒精脱水，各级为2～3分钟，在95％以下浓度的酒精中伊红易脱色，应适当缩短时间。 （10）二甲苯透明（二次），共约10分钟。 （11）封片：擦去切片周围多余二甲苯，切勿干涸，迅速滴加适量中性树胶，再加盖玻片封固。 4.9 苏木精染液配制配好苏木精染液是HE染色的关键。苏木精配制有多种配方，关键在于氧化。如加氧化汞作氧化剂时，要防止氧化过度，同时注意形成的氧化膜污染切片。加碘酸钠作氧化剂时，就无需把苏木精液煮沸。要配制自然成熟的苏木精则不需加氧化剂，但要较长时间才能氧化成熟。不同苏木精染液的染色时间为5～20分钟，自然氧化成熟的苏木精液染色时间可以更长。 * 苏木精染液的配制方法： （1）Harri’s苏木精 苏木精 1 g 无水乙醇 10 ml 硫酸铝钾 20 g 蒸馏水 200 ml 氧化汞 0.5 g 冰醋酸 8 ml 分别用无水乙醇溶解苏木精，蒸馏水加热溶解硫酸铝钾，然后两液混合并煮沸，加入氧化汞，继续加热和搅拌至溶液为深紫色，立即用冰水冷却，恢复至室温后过滤备用。 （2）改良Lillie-M ayer’s苏木精 苏木精 2.5 g 无水乙醇 20 ml 硫酸铝钾 5 g 蒸馏水 330 ml 碘酸钠 250 mg 甘油 150 ml 冰醋酸 10 ml 分别用无水乙醇溶解苏木素，蒸馏水溶解硫酸铝钾，然后两液混合后，依次加入碘酸钠、甘油和冰醋酸。（3）Mayer’s苏木精 苏木精 100 mg 蒸馏水 100 ml 碘酸钠 20 mg