转基因植物中基因沉默的机制与解决方法
转基因植物中基因沉默的机制与解决方法组长：费京珂组员：王丹旭，游高平，陈亚冬，郑昕凯
（北京化工大学，生命科学与技术学院）
【摘要】近些年，随着植物基因工程的不断发展，转基因后的基因沉默现象也越来越受到人们的关注，为了使得转入的基因能够高效表达且起到相应的功能作用，我们就基因沉默的机制进行综述，并阐述对解决方法的最新研究。
【关键词】植物，基因沉默，转录沉默，转录后沉默，irna
【正文】转基因植物中，基因沉默主要存在两种机制，转录中水平上基因沉默与转录后水平上的基因沉默。涉及到DNA启动子甲基化，重复序列，同源序列一起的TGS等内容。针对基因沉默的机制，经过查找资料，我们提出了相应的解决方法。最后，我们要运用基因沉默的机理，进而使得转基因能更加高效。
一．转基因植物沉默机制【1】【2】【3】【4】【5】【6】
为了极大的提高和完善在植物中通过导入外源基因使其获得新性状并能稳定遗传是植物基因工程的最终目的,而大量转基因植株不能正常表达,通常并不是由于外源基因的缺失或突变引起,而是基因失活的结果,这种失活现象就是基因沉默。转基因沉默可以发生在染色体DNA、转录和转录后三个不同的层次上。发生在染色体DNA水平上的转基因沉默叫位置效应(effect position),位置效应是指基因在基因组中的位置对基因表达的影响。当导入的外源基因整合到宿主高度甲基化、转录活性低的异染色区域时，外源基因一般表现沉默。位置效应引起的基因沉默不需要基因组中有同源序列,而同源依赖的基因沉默有转录水平上的基因沉默(Transcription-al gene silencing, TGS)和转录后水平上的基因沉默(Post-transcriptional gene silencing, PTGS)两种形式。
转基因沉默的机制是多方面的,转基因的拷贝数、构型及在植物基因组上的结合位点等诸多因素都与沉默有关,外界环境条件如过高的温度、过强的光照也会增加沉默发生的几率。转录水平上的基因沉默是由于某种原因致使启动子失活,mRNA合成受阻,转录后水平基因沉默表现为启动子是活跃的,但mRNA被降解而不能积累。
1.转录水平基因沉默(TGS,DNA-DNA)机制
1.1位置效应的基因沉默机制
位置效应是指基因在基因组中的位置对其表达的影响。外源基因进入细胞核后首先整合到染色质上,其整合位点与表达有密切的关系,若整合到甲基化程度高、转录活性低的异染色质上,一般不能表达;若整合到甲基化程度低、转录活性高的常染色质上,其表达受两侧DNA 序列的影响。目前通用的转染方法是使外源基因在宿主细胞基因组中随机整合,整合位点周围基因组序列与外源基因能否稳定表达密切相关。（1）由于高等生物中存在较高的GC碱基对等容线,即GC碱基在DNA序列中占较高的摩尔比,外源基因整合破坏了这种特征性组成,形成一个宿主细胞易于识别的甲基化位点,使外源基因极易在甲基化酶的作用下发生甲基化而失活。（2）外源基因若插入转录不活跃区域或异染色质区域,通常会融入该区域的染色质结构中,进行较低水平的转录,或发生异染色质化而导致转染的基因沉默。Iglesias等将T-DNA (Transferred DNA)转入烟草基因组时,稳定表达的基因座位于与核基质结合的AT富含区域,且在端粒附近;而不稳定的表达基因座则位于同臂内异染色质区域和中间区域。1.2甲基化作用
从目前的报道看,几乎所有的转基因沉默现象都与转基因及其启动子的甲基化有关,由于宿主细胞基因组DNA中不同位点的甲基化程度存在某种平衡,并形成一定的空间结构特点。一旦转基因的整合破坏了这种平衡及空间特征,这种破坏后的结构便诱导宿主基因组防御系统,使新整合进去的DNA序列发生不同程度的甲基化,DNA甲基化都是从启动子区域开始的,主要发生在基因5'端启动子区域。但也有人发现外源基因的甲基化可延伸至3'端。甲基化通常发生在DNA的GC和CNG序列的C碱基上,C碱基甲基化不是转基因沉默前提,但对维持基因沉默是必需的。甲基化基因序列通过抑制甲基化DNA结合蛋白(MecP2)的结合进而抑制转录,研究还表明,MecP2蛋白结合了包含协同抑制蛋白mSin3A、组蛋白去乙酰基酶HDAC1和HDAC2在内的多蛋白抑制复合物,去乙酰基酶伴随着MecP2结合的mSin3A,通过对组蛋白H3和H4的去乙酰基,阻碍了转基因启动子与转录因子的接触,从而使转录不能够顺利进行。
1.3重复序列、同源序列等引起的TGS
重复序列诱导的基因沉默(repeat induced gene silencing RIGS),重复序列诱导的基因沉默指多拷贝的外源基因以正向或反向串联的形式整合在植物基因组上而导致的外源基因不同程度的失活。它有顺式失活(cis-inactiva-tion)、反式失活(trans-inactivation)两种作用方式。(1)顺式失活(cis-inactivation)指相互串联或紧密连锁的重复基因失活;(2)反式失活(trans-inactivation)指由于基因启动子间同源序列相互作用引发的基因失活现象,也指某一基因的失活状态引起同源的等位或非等位基因的失活。同源的重复序列会产生异位配对(ectopic pairing),导致DNA形成三链或四链结构,使染色体局部构型发生变化,最终导致异染色质化,从空间上阻碍外源基因的转录而导致沉默的发生,同源启动子序列也有可能竞争结合核内转录因子、RNA聚合酶等转录促进因子,由此导致基因间的相互抑制。进行多个基因转化时,基因启动子间同源序列相互作用,而研究表明,启动子区域只要有90 bp的同源性就能引起反式失活，且反式失活抑制基因表达的程度与两个基因在寄主植物染色体中的相对位置有关。
1.4复杂结构基因引起的TGS
在转基因操作中,使用结构相对复杂的完整质粒导入基因组后,产生的是高拷贝数、高重排频率的转基因植株,外源基因转录的活性及稳定性受到严重影响。原因在于组织结构复杂的转基因易形成不规则的结构,拥有更多的断裂热点,在与宿主基因组整合的过程中易产生DNA置换、重排,也更易为宿主防御系统所识别。
2.转录后水平基因沉默机制
2.1 RNA阈值模型
RNA阈值模型(RNA threshold model)是1994年由Dougherty等提出的。他们认为在细胞质中可能存在mRNA的监控系统。监控系统能促使超量表达的mRNA降解,使细胞内转基因转录物不超过一个特定的阈值。但Olivier Voinnet等[19]在研究PTGS在植物中的传递时发现,带有和不带有35S启动子的GFP(Green fluorescent pro-tein)基因都能引起沉默。不带有启动子的GFP基因在植物体中不能进行转录,但也能引起沉默,这对RNA阈值模型提出了质疑,由此可以判断沉默并不一定都是外源基因的过量表达、转录产物的过量积累造成的。
2.2异常RNA模型
鉴于转录后基因沉默并不总是表现出较高的转录水平,而是有不同于正常mRNA的异常RNA存在,这种异常RNA可以作为RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-depended RNA polymerase,RdRp)的模板,从而引发自身及同源序列的降解。异常RNA的产生原因是多方面的。如当病毒或转入的外源基因内部有同源序列,或者外源基因与内源基因之间有同源序列时,往往会导致异位配对(Ectopic pairing),进而转录产生异常RNA(AberrantRNA,aRNA)。外源基因中存在异常结构,如隐秘的旁侧启动子(Cryptic flanking promot-er)或提前终止末端(Premature ter-mination)也可能导致产生aRNA。aRNA一旦产生并进入细胞质后,就会激活依赖于RNA
的RNA聚合酶(RNA-depended RNApolymerase,RdRp)的活性,RdRp再以aRNA为模板合成大量约25 bp的互补RNA(ComplementaryRNA,cRNA)。这些cRNA如果与同源的mRNA相遇就会结合上去形成部分双链结构)))dsRNA,而后被双链特异性的RNase识别、降解。在上述过程中,内源基因的同源转录产物也可能被cRNA结合,并被同时降解。这样外源基因的导入,会最终导致内源和外源基因的表达共同受阻,即出现共抑制(Cosuppression)现象。共抑制是转录后沉默的主要形式。通过生物技术手段已鉴定了部分生物体中与基因沉默有关的基因,如拟南芥中的sgs-2,粗糙链胞霉中的qde-1(Quelling defective)基因等,通过揭示这些基因编码的蛋白质的功能,为异常RNA模型提供了部分证据。但也有实验表明,如果将单拷贝的外源基因转入无同源性基因的单倍体植物中以后,也会导致PTGS现象。这表明,除同源序列之间的异位配对进而产生aRNA外,PTGS的出现可能还另有它因。
2.3 双链RNA模型
Waterhouse认为转基因沉默原因在于外源基因插入受体基因组中的方向不同,会导致正义RNA和反义RNA的合成。这些转录产物将形成dsRNA。核糖核酸酶(Ribonuclease RNA, RNase) III家族中具有特异识别双链RNA的dicer酶,在ATP存在的情况下,逐步切割由外源导入或者由转基因、病毒感染等各种方式引入的dsRNA,并将RNA降解为19-23 bp的双链小分子干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)。siRNA双链结构解旋并与蛋白质形成蛋白-RNA诱导沉默复合物( RNA-induced silencing complex , RISC)。RISC在一个ATP的作用下被激活,激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA上,并在距离siR-NA 3c端12个碱基的位置切割mRNA,进而使转基因不能表达。
2.4未成熟翻译终止模型
未成熟翻译终止模型(prematureterminate translation model)指出由于任何一类生物细胞都对密码子剂量有一定偏爱性(codon bias),即密码子使用频率与细胞内相应tR-NA丰度是相对匹配的。个别基因在细胞内的优势表达将造成稀有tRNA的严重缺失,相应氨酰tR-NA的缺失将造成翻译复合体中核糖体的空载,当空载时间过长将会引起相应mRNA的降解,从而造成相应基因的沉默。降解mRNA片段依然与核糖体相连,此时核糖体A位处于空置状态,并随时准备接受稀有氨酰tRNA,使细胞内稀有氨酰tRNA维持在一个非常低的水平(共抑制状态)。此模型可以合理地解释RNA特异降解和与共抑制相关的其他现象。到目前为止,没有一种通用的模型可以解释所有的转基因沉默现象,但各个模型往往突出解释了转基因机制中的某些方面。
二.消除基因沉默的解决方案【7】【7】【8】【9】【10】【11】【12】
解决方案
1. 消除DNA甲基化
DNA甲基化是基因沉默的直接原因,转基因DNA甲基化的程度与基因沉默程度成正相关,因此消除DAN甲基化将有利于基因的表达。增强子效应:利用具有组织和发育特异性调控作用的增强子能消除DNA甲基化,确保外源基因有效表达.Lichtenstein等人研究发现,免疫球蛋白K链基因的增强子在细胞发育的特定阶段指导该基因区段去甲基化从而启动基因的转录，密码子优化策略:外源DNA序列与植物基因组DNA碱基组成的差异是引发DNA甲基化的重要原因,外源基因由于其碱基组成和整合位点处不同而被识别发生甲基化.因此在遗传转化之前,应对外源基因密码子进行修饰优化,尽量使外源基因组成与受体植物碱基组成相一致,并采用植物偏爱的密码子,以避免被植物的限制修饰系统所识别,当然也可以采用定点插入的方法,将外源基因插入到与其组成相似的染色体区域;3)其他策略:甲基必须在一定的条件下才可以去甲基化,目前人们已经知道,用5-氮胞嘧啶处理植株具有很好的抑制甲基化和脱甲基化作用,但由于其价格昂贵,兼有致癌作用,因此使用价值不大;4)有性杂交也可消除甲基化现象.
2.减少重复或同源序列
由于重复和同源序列是植物基因沉默的普遍诱因,所以在构建表达载体时,应尽量使得所设计的序列与内源序列的同源性较低,以减少或避免配对,不同的基因转化时应尽量使用不同的启动子,应使用不同的选择标记标记不同的基因.而且,选用不同的转基因方法可以减少重复或同源序列,基因枪往往与多拷贝整合位点随机性及沉默现象相连,而农杆菌介导法则多表现为低拷贝或单拷贝,应尽量使用农杆菌介导法,但它易受宿主限制,能利用的宿主范围窄.
3.核基质结合序列(matrix attachment regionMAR)
它是染色质上一段特异DNA序列,长度一般为300～1 000 bp,可以与核骨架结合,也称为核骨架结合序列(scaffold attachment region SAR),两个MAR之间的染色质区域可形成一个约5～200bp的DNA环,利用此特性,可把MAR构建到外源基因的两侧,形成MAR-基因-MAR形式,使之在转基因植物染色质区形成独立的区域,以避免位置效应的影响,且有利于转录因子的结合,能提高外源基因的表达水平和稳定性.
4.合理利用增强子
利用具有组织与发育特异性调控作用的增强子是提高外源基因的表达效果的有效措施之一。现已发现动物免疫球蛋白K链基因的增强子可在细胞发育的特定阶段指导该基因区段去甲基化,从而启动基因转录。1988年,Schwechheimer等用烟草烤烟栽培种“沙姆逊”的叶肉原生质体和BMS(B1ackMex-icanSweet)细胞进行悬浮培养,并进行了富含Gln的转录活性结构域、酵母活性转录因子(GAL4)、疤疹单纯病毒蛋白(VP16)的嵌合结构的瞬间表达。研究结果表明,结构基因上游激活位点的重复序列是强的转录活性所需要的,当GAL4×VPl6嵌合基因的上游激活序列(Up-stream activation sequence,UAS)重复数为8个时,报告基因的活性达到最高水平,在悬浮培养的BMS细胞中插入同源多聚G1n序列能增强转录活性。Sandhu等报道,豌豆质体蓝素基因(petE)启动子的富含A/T的负调控区域(在距转录启始位点-44到-177处)在转基因烟草的叶片和转基因马铃薯的小块茎中增强了GUS基因的表达水平
2.5在构建外源基因载体时使用强启动子
从番茄中获得了亮氨酸氨肽酶(Leucine aminopeptidase,LAP)基因,该基因在转入番茄和马铃暮的过程中嵌入相应的GUS基因5′非编码区。结果发现,该5′非编码区的LAP基因上游-317到-3片段具有启动子功能。因此,在构建外源基因载体时,可先进行预备试验以选择最强的启动子,以利于外源基因在转基因植株中实现高效表达。
5.其他策略
1)为了使植物获得更多的优良性状,人们往往需要一次转入多个基因或进行多次转化,研究表明,多个基因如果要实现共表达,首先要实现共整合,因此,我们应尽量提高共整合的频率来实现共表达,利用特异性重组系统可将外源基因整合到特定位点上,减少外源基因的随机整合,避免位置效应,使用诱导型启动子能够提高外源基因表达,已有人在转基因水稻植株中获得了ABA胁迫诱导的uidA基因的表达;4)消除反义RNA:不正常的通读会形成反义RNA,因此构建载体时最好将DNA序列顺序排列,避免产生反义RNA.
具体实例【13】【14】【15】【16】
SAR 是染色质被限制性内切酶消化仍与核骨架结合的DNA 序列, 位于染色体的端粒附近。长度一般为30～1000bp,属于非编码序列,通常富含AT( A T> 70% )。每个SAR片段中都含有几个序列基元, 如A- bo xes, T-box es。一定数目的重复基元才能保证SAR与核骨架的特定蛋白有效地结合, 而且这种结合是特异性的。SAR使转基因高效表达，1996年,Allen 等人用基因枪法进行烟草转化。他们发现GUS 基因两侧加上SAR,可使其表达活性比对照提高140倍, 但并不能消除转化体间的变异。这个试验是用基因枪直接转化烟草,它涉及到比农杆菌更复杂的转化模式。在转化程中,外源DNA 成簇地整合并以多种方式发生重排,所以转化体中目的基因是多拷贝的。同源序列的相互作用使基因沉默的频率很高,而SAR的加入可使转基因免受异位配对或其他同源序列相互作用的影响, 从而降低同源依赖性基因沉默
的概率。SAR使转基因稳定表达Peter 等人在农杆菌介导的烟草转化试验中发现,SAR可以使转基因表达水平正常化。含有SAR片段的转化体与对照相比,变异幅度降低了20倍, 但基因的表达水平没有显著提高。由此,他们称SAR是一个“绝缘因子”,能够使转基因的表达水平与内源基因一致。
MOM是一种编码核蛋白的基因,参与染色质重构(remodelling) 。已有报道用突变MOM 基因或通过其反义RNA的表达来消除MOM的转录本,可以使几种已经沉默的高度甲基化的位点恢复转录活性,而这些被恢复的位点可以维持9 代。发现新近拟南芥TGS水平沉默的释放有两个水平,一个是依赖甲基化水平,即DDM1突变株表现出的去甲基化,另一个是不依赖甲基化水平,即MOM1 突变株表现出的不影响甲基化。两者的关系是,后者是对前者的加强,尤其在甲基化缺失时,防止外遗传失控的情况出现[。再次证实去除MOM,确实能够消除TGS水平的沉默现象。
在病毒与植物长期的协同进化过程中,植物通过PTGS机制对病毒产生抗性,而病毒也进化出抑制PTGS的蛋白抑制因子,能抑制PTGS的启动和保持以及传导。因此,一些病毒的蛋白因子可以用来抑制植物转基因沉默。烟草蚀刻病毒蛋白(HC - Pro)，Kristin等1998 年发现了这种植物基因沉默抑制子,目前已从多方面的实验证明了其对基因沉默的抑制作用。基因沉默的病毒抑制子包括:烟草蚀刻病毒基因组RNA 编码蛋白P1 的 5 端区域,HC -Pro 蛋白(由马铃薯Y病毒、水稻斑驳病、南方菜豆花叶病毒和非洲木薯花叶双生病毒编码)以及蛋白P3 的一小部分,因此被叫做P1/ HC - Pro序列。黄瓜花叶病毒蛋白(CMV2b)，转GFP烟草实验证实:CMV2b的表达,可以导致GFP基因沉默后的叶片在生长点处有GFP的重新表达。而在旧有的叶片组织中,由于在病毒浸染前已经诱导产生了RNA 沉默,因此不能重新出现GFP的表达。由此可见,CMV2b 作为病毒抑制子,可以有效地抑制系统沉默信号传递到新生组织中,因此抑制新生组织的基因沉默。进一步研究发现,外部信号进入CMV2b表达的细胞内并不能有效地触发对目标RNA 的降解。另外,CMV2b 抑‘D7 制
可影响信号的活性,同时干涉核内aDNA 的甲基化。但是CMV2b 对细胞内基因沉默的抑制是不完全的,它并不阻止转入的GUS基因沉默的产生,它只阻止转录后基因沉默在细胞内的传递和信号的调节
三.基因沉默的应用
RNAi沉默技术在植物抗病性遗传改良中的应用
1.植物真菌病害的抗性改良
通过表达白粉病菌致病因子Avralo的RNA同源序列，转基因植物表现出对白粉病的抗性c23I。其机制是植物dsRNA分子可能进入了病原真菌体内，从而导致了真菌基因的沉默(HIGS)。这一结果提供了一个基于RNAi的植物抗真菌病害遗传改良新策略。
2.植物病毒病害的抗性改良
水稻条纹叶枯病(RSV)CP、SP和CP／SP蛋白、水稻矮缩病毒(RDV)Pnsl2蛋白、玉米矮花叶病毒(MDMV)CP蛋白、菜豆金黄花叶病毒(BGMV)复制起始因子ACl基因沉默／抑制后，转基因植株对病毒病抗性明显提高。不同编码基因沉默导致的病毒抗性是有明显差异的，靶基因的选择至关重要。例如RSV编码蛋白pC3和运动蛋白pⅨ沉默转基因植株表现高抗，而编码糖蛋白pC2和无结构蛋白p4的沉默对抗性没有影响。病毒诱导的基因沉默(vIGS)常受限于病毒的寄主范围。因此，直接喷洒原核表达的siRNAs也可诱导植物基因沉默，如在接种病毒前5 d，喷洒辣椒轻斑驳病毒(PMMoV)和李痘疱病毒(PPV)的dsRNA，可成功诱导相关基因的沉默，产生对病毒侵染的抗性。
3．植物线虫病害的抗性改良
表达根结线虫基因dsRNA序列的烟草对根结线虫的抗性高达95％以上。表达线虫16DlO基因dsRNA序列的拟南芥抑制了线虫虫瘿的形成、减少了虫卵产生；转基因植株对其他种线虫也具有一定的抗性。
【结束语】外源基因沉默阻碍了植物转基因技术在生产上的广泛应用，深入了解外源基因沉默的机制以提高基因表达效率，是顺利开展植物基因工程的迫切需要。随着分子生物学技术的发展，各领域的研究结果均表明，各种基因沉默现象之间有着广泛的联系，并交织融合成为一个完整的、统一的理论体系，尤其是RNAi 技术出现之后，又使基因沉默分子机理
的研究更进一步，RNAi 技术本身又进一步向人们预示了基因沉默机制在整个生物界的普遍性及其深刻的生物学意义和广泛的应用价值。希望通过在能完善的解决基因沉默为我们带来的困扰之上，我们能更多的利用基因沉默，来为我们谋求更多的益处，从而让这一领域能够达到新的层次。
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【小组分工】
费京珂，王丹旭，游高平，陈亚冬，郑昕凯参与资料的查找。
费京珂，游高平，陈亚冬，郑昕凯参与word的制作。
费京珂，王丹旭参与ppt的制作。
王丹旭进行现场讲解。
植物基因转化及转基因植物的分析与鉴定
植物基因转化及转基因植物的分析与鉴定 〖实验目的〗 1．了解创建烟草突变体库的方法； 2．理解每种方法的基本原理； 3．掌握农杆菌介导的转基因方法以及转基因产物筛选和鉴定的基本过程。 〖实验原理〗 随着越来越多植物的全基因组测序工作的完成，在此基础上开展功能基因组的研究是目前的核心研究内容之一。植物插入突变体库的建立是功能基因组研究的一个重要内容，在此基础上也能进行正向遗传学及反向遗传学的研究。在创制突变体的策略上，传统方法是使用物理或化学诱变方法获得，其优点是可在尽可能短的时间内获得饱和突变体。与传统的物理和化学诱变方法相比，生物诱变(T-DNA和转座子插人诱变)通常可标记突变基因，从而较为容易地分离鉴定靶基因。最近数年，通过农杆菌介导的T-DNA插入突变已成为国际公认的植物功能基因组学的主要研究方法之一。 烟草是植物基因组研究的一种模式植物，其突变体库的创建是烟草功能基因组学研究中的重要内容，其目的是通过大规模的突变体库平台快速全方位的了解基因组中各个基因的功能。突变体的创制是遗传学研究的基础，也是分离基因和基因功能鉴定的最要途径。通过诱导培养，使烟草产生愈伤组织，利用土壤农杆菌感染愈伤组织，实现T-DNA标签在烟草愈伤组织基因组中大量随机插人，利用植物细胞的全能性，经过抗性筛选，诱导分化，从抗性愈伤组织获得烟草突变体再生植株，获得各突变体的纯合材料，从而建立烟草突变体的数据库，然后分析突变性状与T-DNA的共分离关系，存在共分离的材料用适当的Tail-PCR克隆技术获得T-DNA的侧翼基因组序列，用其作探针筛选基因文库，获取目标基因或克隆，再进行下一步的分析（图实验4-1）。 T-DNA 载体构建 转化植物（T1，T-DNA杂合子)收获T2种子
真题答案
2011年真题答案 1.T-DNA插入诱变原理及应用？ 原理：T-DNA是农杆菌Ti质粒中的一段DNA序列，可以从农杆菌中转移并稳定整合到植物核基因组中。人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，获得转基因植物。除用于转基因以外，T-DNA插入到植物的基因中，基因由于发生碱基的插入或缺失而发生突变。 应用：T-DNA插入诱变已成为反求遗传学研究的重要手段之一。 1）通过T-DNA插入获得突变植株，通过对突变体与野生型的变化对比，可对植物特定基因的功能进行分析。 2）已广泛应用与拟南芥等模式植物的突变体库构建。 3）T-DNA作为外源基因的载体，可携带外源基因感染植物，获得转基因植物。 2.反向遗传学原理及应用？ 原理：在已知生物体基因组全部序列的基础上,通过DNA重组、RNA干扰、基因沉默等技术对靶基因进行必要的加工和修饰,如定点突变、基因插入\缺失、基因置换等,对生物基因组进行改造，研究生物体基因组的结构与功能,以及这些修饰可能对生物体的表型、性状有何种影响等方面的内容。 应用：1）用于研究高等动植物相关基因功能: 2）利用反向遗传学,可以对病毒的编码基因进行定向突变,从而可以知道该基因的编产物在病毒生命周期中的作用,为药物和疫苗设计奠定结构生物学和细胞生物学的基础。 3)利用反向遗传操作技术对RNA 病毒的cDNA 克隆进行点突变, 降低或消除病毒的活力，可能获得理想的减毒株来研制疫苗。 3.植物转基因沉默的可能原因？ 1）位置效应：因为转基因均是在基因组D N A序列的不同位置随机整合。如果转基因整合位置处于基因异染色质区或转录不活跃区，转基因就会在该区空间结构和成分影响下形成类似结构，导致转录不活跃或异染色质化而失活。 2）转录水平的基因沉默：整合进去的外源基因可能发生了DNA甲基化，抑制其转录。3）转录后和翻译水平的基因沉默：转录后形成的mRNA进入细胞质中，可能被植物细胞质内的RNA酶识别，将其降解；或发生RNA干扰，将mRNA降解。 翻译出的多肽发生了异常的剪接或折叠，失去活性，或被蛋白酶降解。 4.分子标记技术在植物学研究和育种工作的应用？ 分子标记技术主要包括RFLP、VNTR、SNP、染色体原位杂交等技术。 1）植物基因遗传图谱的建立：如通过RFLP技术对植物基因进行限制性片段多态性分析，从而建立植物基因组的遗传图谱，对于研究植物基因的功能有很重要的意义。 2）利用遗传多样性的结果可以对物种进行聚类分析，进而了解其系统发育与亲缘关系。3）标记育种是利用与目标性状基因紧密连锁的遗传标记，对目标性状进行跟踪选择的一项育种技术。
转基因植物的安全性评价.
1转基因植物安全评价的意义 转基因植物育种,是利用遗传工程的手段,有目的地将外源基因或DNA构建导 入植物基因组,通过外源基因的直接表达,或通过对内源基因表达的调控,甚至通过直接调控植物相关生物如病毒的表达使植物获得新的性状的一种品种改良技术,可最大限度地满足人类的需要[1]。 与此同时,转基因技术使物种的进化速度远远超过生物自然变异与选择的速度,对于这种急剧的生物物种变化,自然界能否容纳和承受?自然界的其他组成部分是否会因此受到伤害或破坏?转基因植物及其产品被人们食用时,是否会向人体肠道微生物发生基因转移?是否会出现由于某种新物质的形成对人体健康产生危害或潜在影响?要消除这些疑虑就要进行转基因植物的安全性评价。要经过合理的实验设计和严密科学的实验程序,积累足够的数据,根据这些数据判断转基因植物的大田释放和大规模商业化生产是否安全,对实验证明安全的转基因植物正式用于农业生产,对存在安全隐患的加以限制,避免危及人类生存及破坏生态环境[2]。因此,制定科学完善的安全性评价的原则与方法,对确保人类健康和环境安全及转基因技术的健康发展具有十分重要的意义。 2转基因农产品安全评价的内容 2.1转基因植物的环境安全性 转基因植物的环境安全性评价要解决的核心问题是转基因植物释放到田间后是否会将基因转移到野生植物中;是否会破坏自然生态环境,打破原有生物种群的动态平衡[2]。 转基因植物演变为农田杂草的可能性:转基因植物可通过传粉进行基因转移,可能将一些抗虫、抗病、抗除草剂或对环境胁迫具有耐性的基因转移给近缘种或杂草,如果杂草获得了这些抗性,就会变成超级杂草,使农田杂草难以控制。 基因漂移到近缘野生种的可能性:在自然生态条件下,有些栽培植物会和周围生长的近缘野生种发生天然杂交,从而将栽培植物中的基因转入野生种中。在进行转
植物DNA甲基化与转基因沉默
植物DNA 甲基化与转基因沉默 蒋自立 (贵州省遵义师范学院生物系,贵州遵义563002) 摘要 D N A 甲基化是表观遗传修饰的重要形式之一,植物D N A 甲基化及其引起的转基因沉默现象的研究对植物基因工程领域的发展有着举足轻重的作用。介绍了植物D N A 甲基化作用机理及其过程中至关重要的3种胞嘧啶甲基转移酶:M E T1甲基转移酶家族、染色质甲基化酶(C M T)和结构域重排甲基转移酶(D R M),并阐述了植物D N A 甲基化的相关机制,包括RN A 介导的D N A 甲基化(Rd MD )、组蛋白修饰与D N A 甲基化和D N A 去甲基化。通过分析植物转基因沉默现象与D N A 甲基化的关系,提出了克服由D N A 甲基化引起的转基因沉默的相关对策。关键词 D N A 甲基化;转基因沉默;表观遗传;基因工程 中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2009)12-05386-04 D NA Methylation and T ransgene Silencing in Plants JIA NG Zi 2li (Bio lo g y D epart ment of Z u nyi N ormal Co llege,Z un yi,G uizh ou 563002) Abstract D N A m eth ylati on is one o f the mo st sig nificant epig en etic m odificatio n m od us.A nd the research o f p lan t D N A m eth ylati on and tran sgene si 2lencing has been playin g a vital role in the dev el op ment of genetic engi neeri ng tec hnol og y.The study in tro duces the mo de o f D N A m eth ylati on and the mo st im po rtant D N A meth yltransferase throu g h D N A methy lated process:ME T1,D R M,an d C M T,w hich i ndicates the p ro g ress o f research o n the mechani sms o f D N Amethylation ,such as R N A 2depen dent D N A methy latio n,histo ne meth ylatio n,and D N A dem eth ylati on.Thro ug h analyzin g the relati on ship betw een D N A m ethylati on an d trans gene silencin g,it pu ts forw ard so me relativ e strateg ies to av oid o r reduce the effect o f trans gene silencin g.Key w ords D N A methy latio n;T ransg ene silencin g;E pigenetic in heritance;G enetic en gineerin g tech nol og y 作者简介 蒋自立(1966-),男,贵州遵义人,副教授,从事生物化学 与分子生物学研究。 收稿日期 2009202201 遗传学告诉我们,基因结构的改变会引起生物体表现型的改变,而这种改变是可以遗传的。然而,近年来的研究表明,现代生物从祖先基因组中所获得的生长、发育和进化信息并不仅仅是基因序列。在基因的D NA 序列不发生变化的条件下,基因表达发生的改变也是可以遗传的,导致可遗传的表现型变化。这种表现型变化因没有直接涉及基因的序列信息,因而是/表观0的,称为表观遗传变异,又叫表观遗传修饰。D NA 甲基化作为从细菌到人类最普遍的表观修饰方式,是表观遗传修饰的一种重要方式,对功能基因组时代的研究具有重要的意义。甲基化修饰在基因表达、细胞分化以及系统发育中起着重要的调节作用。如D NA 甲基化与基因的转录失活,尤其是转基因的失活、转座子的转移失活等多种后生遗传基因的失活存在密切的关系[1]。并且,从所报道的转基因沉默例子来看,几乎所有的转基因沉默现象与转基因及其启动子的甲基化都有关。笔者就D NA 甲基化这一表观遗传现象做简要介绍,并分析D N A 甲基化同植物转基因沉默现象之间的联系,借此探讨D N A 甲基化引起的植物转基因沉默的解决对策。 1 DNA 甲基化模式 1.1 D NA 甲基化作用 D N A 甲基化修饰方式为CpG 二核苷酸胞嘧啶第5碳原子的甲基化,是通过甲基转移酶(D NA me thyltransfe rase,M tase)的催化作用,以S 腺苷甲硫氨酸(S A M )为供体,将甲基转移到DN A 分子的腺嘌呤或胞嘧啶碱基上的过程,主要形式有52甲基胞嘧啶,N62甲基腺嘌呤和72甲基鸟嘌呤。在高等植物中,多数D NA 甲基化发生在GC 富集区和高度重复序列处。对于重复序列,甲基化除发生在CpG 二核苷酸中的胞嘧啶第5位碳原子上,还常发生在C AG 、C TG 三核苷酸和C C G 模体中,并且常常是对称的甲基化,但也有非对称序列甲基化的报道[2]。而非重复序列基因 在这些位点常常并不发生甲基化[3]。 D NA 甲基化作为最早被发现,最普遍的表观修饰途径广 泛存在于生物界。研究发现D NA 甲基化在不同生物中发生情况各不相同,在原核生物中CC A/T TG 和C A TC 常会被甲基化;真核生物D NA 中,52甲基胞嘧啶是唯一存在的化学性修饰碱基;植物则分布于5c 2C G 23c 或5c 2C NG 23c 序列中;脊椎动物中,甲基化位点存在于5c 2C G 23c 序列处。真核生物中,大部分GC 序列都处于甲基化状态,而位于管家基因和少量组织特异性基因的5c 端C pG 岛(C pG 成簇出现的区域)则呈非甲基状态。其分布一般与基因的密度有很好的线形对应关系。如,人类基因组中,大小为100~1000bp 的C pG 岛总是处于未甲基化状态,并且与56%的人类基因组编码基因相关。植物基因组的52甲基胞嘧啶水平与基因组的重复序列水平是相关的。如,总共只有120Mb 碱基的拟南芥,其基因组中约有6%的甲基化胞嘧啶;而具有2500M b 的玉米基因组中大约有25%的胞嘧啶被甲基化。在同种生物中D NA 甲基化的程度也不相同。以植物为例,植物中胞嘧啶发生甲基化的比例因植物种类而异,裸子植物比开花植物D NA 包含更少的甲基化胞嘧啶[2],高等植物D NA 的甲基化比例从4.6%~30.0%不等[4]。在同一物种不同组织或同一类型细胞的不同发育阶段,基因组D NA 各CpG 位点甲基化状态也各不相同。玉米中编码胚乳特异性表达的B 2z ip 的O paque 2基因,启动子序列在叶片组织中(非表达组织)D NA 高度甲基化[5]。此外,在不同环境下以及植物特定基因及其启动子区域的甲基化分布也不同。 1.2 胞嘧啶甲基转移酶 在植物D NA 甲基化过程中,D NA 甲基转移酶起着非常重要的作用,它催化D NA 甲基化的完成。根据甲基化作用过程,可将植物细胞中的DN A 甲基转移酶分为结构和功能不同的3类[6],即M E T1甲基转移酶家族、染色质甲基化酶和结构域重排甲基转移酶。 1.2.1 M ET1甲基转移酶家族。该类甲基转移酶的主要功能可能是作为维持性甲基化酶,也可能在重新甲基化中起作用,现已在胡萝卜、豌豆、番茄和玉米中分离得到了M ET1及 安徽农业科学,Jo u rnal of Anh ui Agri.S ci.2009,37(12):5386-5389 责任编辑 孙红忠 责任校对 况玲玲
基因沉默与RNAi技术
基因沉默与RNAi技术 定义：基因沉默双是指链RNA被特异的核酸酶降解，产生干扰小RNA(siRNA)，这些siRNA 与同源的靶RNA互补结合，特异性酶降解靶RNA，从而抑制、下调基因表达。 RNA干扰是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。由双链引发的植物RNA沉默，主要有转录水平的基因沉默(TGS)和转录后水平的基因沉默(PTGS)两类:TGS是指由于DNA修饰或染色体异染色质化等原因使基因不能正常转录;PTGS是启动了细胞质靶mRNA序列特异性的降解机制。有时转基因会同时导致TGS和PTGS。 基因沉默是一种RNA干扰技术。 RNA干扰是由双链RNA 引发的转录后基因静默机制。其原理是：RNaseIII核酶家族的Dicer，与双链RNA结合，将其剪切成21 - 25nt及3'端突出的小干扰RNA (small interfering RNA ，siRNA)，随后siRNA与RNA诱导沉默复合物(RNA - induced silencing complex ，RISC结合，解旋成单链，活化的RISC受已成单链的siRNA引导，序列特异性地结合在靶mRNA上并将其切断，引发靶mRNA的特异性分解，从而阻断相应基因表达的转录后基因沉默机制. 一、基因沉默的分类及其机制 （一）转录水平基因沉默 转录水平基因沉默是指对基因专一的细胞核 ＲＮＡ合成的失活， 它的发生主要是由于基因无法被顺利转录成相应的ＲＮＡ而导致基因沉默。转录水平基因沉默可以通过有性世代传递，表现为减数分裂的可遗传性。引起转录水平基因沉默的机制主要有以下几种： １．基因及其启动子甲基化 甲基化是活体细胞中最常见的一种ＤＮＡ共价修饰形式，通常发生在ＤＮＡ的ＣＧ序列的碱基上，该区碱基甲基化往往导致转录受抑制，该区甲基化的频率 在人类及高等植物中分别可达４％和３６％。［４］ 近来的研究表明，发生在转基因启动子５'端的甲基化是造成转录水平基因沉默的主要原因。虽然转基因的甲基化可延伸至转基因的３'端，但甲基化过程均是从启动子区域开始的。从所报道的转基因沉默例子来看，几乎所有的转基因沉默现象与转基因及其启动子的甲基化有关。 ２．同源基因间的反式失活 反式失活主要是由于拥有同源序列的沉默位点和其他位点的ＤＮＡ的相互作用而引起的基因沉默。通过顺式作用而甲基化并失活的基因能作为一种"沉默子"，对其他与之分离的具有同源性的靶基因施加一种反式作用，使具有同源序列的靶基因发生甲基化并导致失活。反式失活的靶基因既可以与沉默基因是等位基因，也可以是非等位基因。 ３．后成修饰作用导致的基因沉默 后成修饰作用是指转基因的序列和碱基组成不发生改变，但是其功能却在个体发育的某一阶段受到细胞因子的修饰作用后而关闭。这种修饰作用所造成的转基因沉默是可以随着修饰作用的解除而被消除。后成修饰作用导致的转基因沉默与受体植物的核型构成有关。 ４．重复序列 外源基因如果以多拷贝形式整合到同一位点上，形成首尾相连的正向重复或头对头、尾对尾的反向重复，则不能表达，而且拷贝数越多，基因沉默现象越严重。这种重复序列诱导的基
植物转基因沉默的机制及克服方法
植物转基因沉默的机制及克服方法 专业：植物学学号：220100905010 姓名：潘婷 摘要：植物转基因沉默可以发生在染色体DNA、转录和转录后3种不同的层次上，转录水平基因沉默机制涉及DNA甲基化、位置效应、重复序列和同源序列等的作用，转录后水平基因沉默机制常用RNA阈值模型、异常RNA模型、双链RNA模型和未成熟翻译终止模型等解释。使用去甲基化、控制外源基因的拷贝数及结合位点、利用MAR序列、优化使用增强子、启动子等手段可以解除部分转基因沉默。 关键词：转基因沉默；外源基因；DNA甲基化；共抑制 1986年Peerbotte发现转基因烟草中出现转基因沉默(transgene silencing)现象后，研究者对转基因沉默进行了许多深入探索，以期阐明转基因沉默的机制和获得克服手段。 1 转基因沉默机制 转基因沉默可以发生在染色体DNA、转录和转录后3种不同的层次上，现在也把位置效应引起的沉默归到转录水平。 1.1 转录水平基因沉默(TGS)机制 1．1．1 甲基化作用从目前报道看，几乎所有的转基因沉默现象都与转基因及其启动子的甲基化有关，DNA甲基化都是从启动子区域开始的，主要发生在基因5’端启动子区域。甲基化通常发生在DNA的GC 和CNG序列的C碱基上，C碱基甲基化不是转基因沉默前提，但对维持基因沉默是必需的。甲基化基因序列通过抑制甲基化DNA结合蛋白的结合进而抑制转录。 1．1．2 位置效应转基因在宿主细胞基因组中的整合位点往往决定着转基因能否稳定表达。研究发现，转基因烟草中稳定表达的T-DNA
至少有一侧和基因组DNA富含AT的核基质附着区相邻，并且位于端粒附近。而不能稳定表达的T-DNA则位于异染色质及着丝粒旁。1．1．3 重复序列、同源序列等引起的TGS Assaad等对自交转基因(潮霉素抗性基因)植株后代进行分析时发现了重复序列诱导的基因沉默(RIGS)。重复序列诱导的基因沉默指多拷贝的外源基因以正向或反向串联的形式整合在植物基因组上而导致的外源基因不同程度的失活。它有顺式失活和反式失活2种作用方式。进行多个基因转化时，基因启动子间同源序列相互作用也能引起反式失活。 1．2 转录后水平基因沉默(PTGS)机制 1．2．1 RNA阈值模型 1994年Dougherty等提出RNA阈值模型，认为在细胞质中可能存在mRNA的监控系统。监控系统能促使超量表达的mRNA降解，使细胞内转基因转录物不超过一个特定的阈值。 1．2．2 异常RNA模型鉴于转录后基因沉默并不总是表现出较高的转录水平，而是有一种不同于正常mRNA的异常的RNA(aRNA)存在，English等1996年提出了异常RNA模型，该模型认为aRNA一旦产生并进入细胞质后，就会激活依赖于RNA的RNA聚合酶(RdRp)的活性，RdRp 再以aRNA为模板合成大量约25bp的互补RNA (cRNA)。这些cRNA如果与同源的mRNA相遇就会结合上去形成部分双链结构一dsRNA，而后被双链特异性的Rnase识别、降解。在该过程中，内源基因的同源转录产物也可能被cRNA结合，并被同时降解。这样外源基因的导入，会最终导致内源和外源基因的表达共同受阻，即出现共抑制现象。 1．2．3 双链RNA模型 Waterhouse认为转基因沉默原因在于外源基
植物遗传转化方法和转基因植株的鉴定
植物遗传转化方法和转基因植株的鉴定 金万枚 巩振辉 李桂荣 张桂华 (西北农业大学 陕西杨陵 712100) 提 要 对现有主要植物遗传转化方法和转基因植株的鉴定进行了比较分析,并对它们在植物遗传转化中的前景进行了展望。 关键词 植物;遗传转化方法;转基因植株;转基因植株鉴定 人们可通过有性杂交,物理化学诱变或自然变异来创造新物种和新品种。但常常存在着杂交不亲和或杂种不育而造成的生殖隔离,也存在诱变的非定向性。采用遗传转化技术,将所要求的外源目的基因导入受体植株,并通过对转化植株的鉴定选择,从而创造出人类所需要的新品种或新物种。植物遗传转化方法和转基因植株的鉴定是植物遗传转化的重要环节。关 3国家自然科学基金资助,项目编号39770522。 优质小麦品质的决定性因素;其次要有较强的生活力,保证营养生长健壮。 3.3.2 播种 研究表明,适当晚播和增加密度能在稳定产量的基础上提高小麦品质。根据我省实际,关中优质专用小麦播量应控制在每亩6～8kg,渭北应控制在9kg。播期可依据实际情况较当地常规适播期推迟2～3d。提倡机械以精量半精量播种。 3.4 灌水 灌水对小麦品质的影响比较复杂,尤以抽穗至成熟期间影响最大,此期灌水会降低蛋白质含量,对沉淀值等加工品质也不利,但如果氮量充足或灌水与施氮结合则蛋白质含量不下降或下降很慢。因而施肥上的前氮后移也为后期合理灌水提供了条件。中国农业大学曾研究出一套节水高产栽培技术,小麦春季可只灌一次,并将灌水时期移至孕穗期;若特别干旱,可在拔节期和开花期分别灌水。这种灌水制度与前氮后移的施肥方法配合起来,有利于优质专用小麦生产。 3.5 地膜覆盖 地膜覆盖栽培能使小麦产量大幅度提高,对品质的影响这方面研究还较少。陕西省农科院小麦中心的初步研究表明,小麦覆膜后籽粒容重有不同程度提高;蛋白质含量与正常露地播种没有差异;覆膜不影响不同生态类型品种的干、湿面筋值和沉淀值;但不同生态类型品种之间籽粒容重、蛋白质含量、干、湿面筋值和沉淀值存在较大差异。优质专用小麦可以采用地膜栽培,但不应忽视地膜覆盖后对小麦生育期及农艺性状的影响,比如植株增高,应采取化控措施,在小麦返青～起身期,喷施壮丰安防止倒伏;再如部分病虫害发生的提前与危害加重问题,应及时开展病虫防治,减少对产量和品质的影响。同时提供麦收前一个月揭膜,减少地膜污染。 3.6 病虫害防治 优质专用小麦病虫害的防治,应尽量减少化学药品残苗,不要影响食用品质。应坚持综合防治的原则,要采用农业防治、物理防治和生物防治措施,减少化学药剂防治次数;选用高效低毒低残留农药;收获前20d以内严禁施药;使用农药增效剂,提高防治效果。 3.7 收获 收获是优质专用小麦栽培的最后一个环节;也是比较关键的环节。要做到单收、单贮、单独销售,实现优质优价优加工。
转基因植物的安全性评价
１转基因植物安全评价的意义 转基因植物育种，是利用遗传工程的手段，有目的地将外源基因或ＤＮＡ构建导入植物基因组，通过外源基因的直接表达，或通过对内源基因表达的调控，甚至通过直接调控植物相关生物如病毒的表达使植物获得新的性状的一种品种改良技术，可最大限度地满足人类的需要［１］。 与此同时，转基因技术使物种的进化速度远远超过生物自然变异与选择的速度，对于这种急剧的生物物种变化，自然界能否容纳和承受？自然界的其他组成部分是否会因此受到伤害或破坏？转基因植物及其产品被人们食用时，是否会向人体肠道微生物发生基因转移？是否会出现由于某种新物质的形成对人体健康产生危害或潜在影响？要消除这些疑虑就要进行转基因植物的安全性评价。要经过合理的实验设计和严密科学的实验程序，积累足够的数据，根据这些数据判断转基因植物的大田释放和大规模商业化生产是否安全，对实验证明安全的转基因植物正式用于农业生产，对存在安全隐患的加以限制，避免危及人类生存及破坏生态环境［２］。因此，制定科学完善的安全性评价的原则与方法，对确保人类健康和环境安全及转基因技术的健康发展具有十分重要的意义。 ２转基因农产品安全评价的内容 ２．１转基因植物的环境安全性 转基因植物的环境安全性评价要解决的核心问题是转基因植物释放到田间后是否会将基因转移到野生植物中；是否会破坏自然生态环境，打破原有生物种群的动态平衡［２］。 转基因植物演变为农田杂草的可能性：转基因植物可通过传粉进行基因转移，可能将一些抗虫、抗病、抗除草剂或对环境胁迫具有耐性的基因转移给近缘种或杂草，如果杂草获得了这些抗性，就会变成超级杂草，使农田杂草难以控制。 基因漂移到近缘野生种的可能性：在自然生态条件下，有些栽培植物会和周围生长的近缘野生种发生天然杂交，从而将栽培植物中的基因转入野生种中。在进行转基因植物安全评价时应从两个方面考虑，一是转基因植物释放区是否存在近缘野生种，若没有，则基因漂移就不会发生。另一个可能是存在近缘野生种，基因可以从栽培植物转移到野生种中，这就要分析考虑基因转移后会有什么效果。 对自然生物类群的影响：在植物基因工程中所用的许多基因是与抗虫或抗病有关的，其直接作用的对象是生物。如转入ＢＴ杀虫基因的抗虫棉，其目标昆虫是棉铃虫和红铃虫等植物害虫，如大面积和长期种植抗虫棉，昆虫有可能对抗虫棉产生适应性或抗性，这会影响抗虫棉的应用和ＢＴ农药制剂的防虫效果。因此，在抗虫棉推广时一般要求种植一定比例的非抗虫棉，以延缓昆虫产生抗性。 ２．２转基因植物的食品安全性 转基因食品又称基因修饰食品（Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙｍｏｄｉｆｉｅｄｆｏｏｄ，ＧＭＦ），即用转基因生物制造或产生的食品。进行转基因食品安全评价时，应从宿主、载体、插入基因、重组ＤＮＡ、基因表达产物及其对食品营养成分的影响等方面来考虑［３］。主要内容有：转基因食品基因修饰导致的新基因产物的营养学评价、毒理学评价以及过敏效应。 ３转基因植物的安全评价方法 ３．１转基因植物安全性评价等级与原则 中国农业部在２００２年１月５日发布的《农业转基因生物安全评价管理办法》中，按照对人类、动植物、微生物和生态环境的潜在危险程度，由高到低的顺序将农业转基因生物分为４个安全等级（表１）［４］。 表１农业转基因生物安全等级的划分标准 在对农业转基因生物进行安全性评价时一般遵从以下几条原则：（１）促进而不是限制农业转基因生物的发 转基因植物的安全性评价 李茜 （南京农业大学，国家生命科学与技术人才培养基地，南京２１００９５） 摘要：简要论述了转基因植物安全性评价的意义、内容和方法。 关键词：转基因植物；安全性；评价。 安全等级潜在危险程度 Ⅰ尚不存在危险 Ⅱ具有低度危险 Ⅲ具有中度危险 Ⅳ具有高度危险 农业生物技术 ６２ －－ 中国农村小康科技２００８年第１期Ｅ－ｍａｉｌ：ｃｈｉｎａｘｉａｏｋａｎｇ＠１２６．ｃｏｍ地址：１０００２６北京市朝阳区麦子店街２０号农业部北办公区中国农学会
转基因植物的检测与鉴定
收稿日期:2006-09-28转基因植物的检测与鉴定 宫雪超,于丽杰,高金秋 (哈尔滨师范大学环境与生命科学院,黑龙江哈尔滨150025) 摘要:对植物转基因过程中报告基因的种类和应用范围、转基因植物的检测和鉴定方法、转基因植物检测和鉴定方法的评价进行了综述. 关键词:转基因植物;检测;鉴定;评价 [中图分类法]Q943[文献标识码]A[文章编号]1003-6180(2007)01-0015-03 植物转基因实验因受体系统的限制,外源基因的转化频率较低,为了达到转化目的,必然要获得大量的转化材料,如何在数以千万计的转化植株或细胞中,快速、有效地检测出转基因阳性植株或细胞,外源基因是否整合到植物染色体上,整合的方式如何,整合到染色体上的外源基因是否正确表达等问题,就成为重要的研究课题.根据外源基因表达的不同水平,对外源基因的检测和鉴定可以分为三个水平进行:整合水平、转录水平和翻译水平.本文从外源基因表达的不同水平,阐述转基因植物的检测与鉴定. 1外源基因整合水平的鉴定 检测外源基因是否转化成功,首先是对报告基因进行检测,必要时再进行目的基因的检测,检测目的基因需要采用分子杂交方法. 1.1报告基因 报告基因必须具有两大特点:一是表达产物和产物的类似功能在未转化的植物细胞内并不存在;二是便于检测.目前植物基因工程中使用的报告基因一般是编码酶的基因.大致分为两类:抗性基因和编码催化人工底物产生颜色变化的酶基因.现在常用的报告基因主要有:gus基因、cat基因、冠瘿碱合成酶基因、np tò基因、gf p基因、bar 基因[1]、荧光素酶基因、二氢叶酸还原酶基因等.近年来,绿色荧光蛋白基因作为一种新型的报告基因在植物基因转化及基因表达调控中得到应用,并显示出较其他几个报告基因更大的优越性. gf p基因的检测gf p基因具有以下优点:1适用于各种生物的基因转化;o检测方法简便,无需底物、酶、辅因子等物质,只要有紫外光或蓝光照射,其表达产物就可以发出绿色荧光,这对转化细胞的检测极为有利;?便于活体检测,十分有利于活体内基因表达调控的研究;?检测时可获得直观信息,有利于转基因植物安全性问题的研究及防范.若此报告基因通过自然杂交扩散到其他栽培植物或杂草中时,很容易通过光照获得直观信息. gus基因的检测g us基因也是广泛用作转基因植物、细菌和真菌的报告基因,尤其是在研究外源基因瞬时表达的转化试验中,gus基因应用的最多.gus基因3-端与其他结构形成的融合基因能正常表达,所产生的融合蛋白仍具有gus活性,这为研究外源基因表达的具体细胞部位及组织部位提供了条件,这是它的一大优点.但是需要注意的是,有一些植物在胚胎状态时能产生内源gus活性,Sory u[2]在转基因R0和R1代的子叶、花粉和胚珠中检测到g us活性,随着组织的成熟衰老,g us表达逐渐停止.在实验过程中要设定严格的阴性对照.g us活性的检测方法有很多,包括组织化学法、色谱法、荧光法等,其中植物切片gus 组织化学定位分析是分辨组织中不同细胞个体和不同的细胞类型基因表达差异的一种有效方法. 1.2转基因植株的PCR检测 PCR(聚合酶链式反应poly merase chain re-actio n)是首选的转基因产品检测方法.PCR技术能够有效地扩增低拷贝的靶片段DNA,可以检测到每克样品含有20pg~10ng的转化基因成分,对转基因产品大分子量DNA检测的灵敏度可以达到样品含量的0.0001%[3].因为PCR的高度特异性及检测所需的模板量仅为10ng以内,所以为外源基因整合的检测提供了便利条件,尤其是在转化材料少又需及早检测的时候.现在已经利用该技术对欧美杨[4]、番茄[5]、辣椒、葡萄、豆瓣菜、小麦[6]等转基因植物进行鉴定,是转基因植物鉴定中最简单、最常用的方法[7].PCR检测具有DNA用量少,操作简单,成本低,耗时少,不需要同位素等优点,但PCR检测也存在缺点,由于PCR扩增十分灵敏,有时会出现假阳性扩增,因此检测只能作为初步结果. 1.3Southern杂交 证明外源基因在植物染色体上整合情况的最可靠方法是DNA So uther n杂交,只有经过分子杂交鉴定为阳性的植株才可以称为转基因植物. # 15 #
基因沉默
RNA干扰基因沉默 基因沉默（gene silencing）是指生物体中特定基因由于种种原因不表达。一方面，基因沉默是遗传修饰生物（genetically modified organisms）实用化和商品化的巨大障碍，另一方面，基因沉默是植物抗病毒的一个本能反应，为用抗病毒基因植物工程育种提供了具有较大潜在实用价值的策略——RNA介导的病毒抗性（RNA-mediated virus resistance,RMVR）。
转基因植物和转基因动物中往往会遇到这样的情况，外源基因存在于生物体内，并未丢失或损伤，但该基因不表达或表达量极低，这种现象称为基因沉默。 转基因沉默分为转录水平的沉默（TGS）和转录后水平的沉默（PTGS）。TGS是指转基因在细胞核内RNA合成受到了阻止导致基因沉默，PTGS是指 RNAi——基因沉默指南 基因沉寂（Gene Silencing) 也可以被称为“基因沉默”。基因沉寂是真核生物细胞基因表达调节的一种重要手段。在染色体水平，基因沉寂实际上是形成以染色质（Heterochromatin)的过程，被沉寂的基因区段呈高浓缩状态。 基因沉寂需要经历不同的反应过程才能实现，包括组蛋白N端结构域的赖氨酸残基的去乙酰基化加工、甲基化修饰（由甲基转移酶催化，修饰可以是一价、二价和三价甲基化修饰，后者又被称为'过度’甲基化修饰（Hypermethylation) ) 、以及和甲基化修饰的组蛋白结合的蛋白质（MBP）形成“异染色质”，在上述过程中，除了部分组蛋白的N端尾部结构域需要去乙酰化、甲基化修饰之外，有时也许要在其他的组蛋白N端尾部结构域的赖氨酸或精氨酸残基上相应地进行乙酰化修饰，尽管各种修饰的最终结果会导致相应区段的基因“沉寂”失去转录活性。这个“原则”就是目前尚没有真正完全清楚的“组蛋白密码”（Histone Code)。
转基因食品及其安全性(论文啊)
转基因食品及其安全 摘要：转基因食品自从出现以来就一直备受争议，近日转基因水稻、玉米等作物获得农业部农业转基因生物安全管理办公室颁发的安全证书，这一事件更是加剧了群众对于转基因食品的质疑，转基因食品的安全性的疑问又被重新摆上台面。本文对转基因食品的来源、分类以及其安全性做了初步探讨，对于帮助了解转基因食品及转基因食品的安全性都具有一定的理论意义和现实意义。 关键词：转基因食品安全性 一、转基因食品的定义 所谓转基因食品，就是通过基因工程技术将一种或几种外源性基因转移到某种特定的生物体中，并使其有效地表达出相应的产物（多肽或蛋白质），此过程叫转基因。以转基因生物为原料加工生产的食品就是转基因食品。根据转基因食品来源的不同可分为植物性转基因食品，动物性转基因食品和微生物性转基因食品。 转基因食品是具有一定的优点的，例如转基因食品可增加作物产量、降低生产成本；可增强作物抗虫害、抗病毒等的能力；提高农产品耐贮性；缩短作物开发的时间、摆脱四季供应、打破物种界限，不断培植新物种，生产出有利于人类健康的食品。 但是，即便转基因食品的优点非常多，其具有的一些缺点也是不容忽视的：所谓的增产是不受环境影响的情况下得出的，如果遇到雨雪的自然灾害，也有可能减产更厉害。许多转基因食品本身就能产生一定量的有毒物质和某些营养因子以抵抗细菌和害虫的入侵。现有转基因食品中的毒素含量并不一定会引起毒反应，当然如若处理不当，某些食品（如木薯）能引起严重的问题甚至可能引发死亡。 根据《农业转基因生物标识管理办法》规定，我国目前已有5类17种在售转基因生物被列入转基因标识目录并在市场上销售，这17类转基因生物包括：大豆种子、大豆、大豆粉、大豆油、豆粕、玉米种子、玉米、玉米油、玉米粉、油菜种子、油菜籽、油菜籽油、油菜籽粕、棉花种子、番茄种子、鲜番茄、番茄酱。卫生部的《转
引起基因沉默的原因
引起基因沉默的原因 研究表明,引起基因沉默的原因很多,转基因的拷贝数和构型、在植物上的整合位点、转基因的转录水平等都与沉默有关,外界环境如过高的温度、过强的光照也会增加基因沉默发生的几率和产生时间,此外,外源基因的表达还受植物发育因子(如亲本年龄)的影响。因此,植物转基因沉默的作用机制可能不是单一的,而是各种机制共同作用的结果,是植物本身的防御系统和外界环境因素协同作用的产物。转基因沉默可以发生在染色体DNA水平、转录水平和转录后水平三种不同的层次上。 1.染色体DNA水平的转基因沉默 发生在染色体DNA水平的转基因沉默叫做位置效应(positioneffect)。当导入的外源基因随机地插入到宿主基因组时,如果被导入到转录活跃区,就有可能进行高水平的转录,如果外源基因插入转录不活跃区,则只能进行低水平的转录或不能转录。 按照染色质高级结构组织的环状结构模型,核基质结合区(matrixattachmentregions,MARs)作为边界元件与核基质结合,使两个MAR之间的基因片段被界定成一个独立的染色质环(1oop),并作为隔离子(insulator)阻挡邻近染色质区的顺式调控元件对环内基因的影响,使位于染色体环内的基因可作为一独立的表达调控单位而存在。MAR可能使转基因在受体基因组整合
后形成独立的环状结构,从而提高转基因的表达水平并减少转基因在不同株系表达差异 2.转录水平的基因沉默 发生在转录水平上的转基因沉默叫做转录失活。反向重复的基因或转基因可以进行异位配对,配对的DNA作为信号,使DNA异染色质化或从头甲基化,这样转录过程就会受到抑制。此外,DNA-RNA协同(association)也是造成转录水平基因沉默的原因之一。 （1）转移基因及其启动子甲基化甲基化是活细胞中最常见的一种DNA其价修饰形式,它通常发生在DNA的GC和CN G序列的C碱基上,C甲基化的频率在哺乳动物及高等植物中部比较高。甲基化修饰在基因表达、植物细胞分化以及系统发育中起着重要的调节作用。然而,从所报道的转基因沉默的例子来看,几乎所有的转基因沉默现象都与转基因及其启动子的甲基化有关。而发生在DNA的CG和CNG序列上的甲基化并不是植物中转基因转录水平沉默起始的前提,但C碱基甲基化对维持基因沉默是必需的。 （2）多拷贝重复基因多拷贝重复基因序列整合进基因组后,无论正、反都容易形成异位配对,引起基因组防御系统的识别而被甲基化或异染色质化失活。 （3）染色体包装转导基因在染色体上的遗传位点相同,但受染色体包装的影响,产生沉默。当转导基因由染色体区域的正常位点包装到另一区域的位点时,其与转录因子的接触机会就会发
转基因植物及其安全性综述
转基因植物及其安全性综述 一，摘要 介绍目前转基因植物概念、常用的植物转基因方法，就转基因植物的生态安全性进行讨论。 二，正文 转基因植物概念：将人工分离和修饰过的基因导人到生物体基因组中，由于导人基因的表达，引起生物体性状的可遗传的修饰，这一技术称之为转基因技术。转基因植物：通过基因转移技术获得的整合有外源基因的植物个体。在过去十多年来，植物学家们已成功地把具有各种新性状的基因转移到了50多种不同的植物上，为农作物育种创造了一个又一个的新品种。 ?每一个植物都有很多基因。基因的本质，就是我们常说的DNA(去氧核糖核酸)。一个基因，在DNA双螺旋结构中占据着一个限定长度的片段。所以要想从供体植物上获得某个决定遗传性状的基囡，只要我们能从供体植物的DNA结构中取出这个基因片段可以了。这个决定遗传性状的基因也称目的基因，将它转化或转移到受体植物上，使它整合到受体植物的染色体上重新组合并使其(目的基因)在再生植株中表达出来，这样就完成了目的基因的传导操作，达到了转基因植物的合成及改造植物性状的目的。 1983年，植物学家首次完成了将一个容易鉴别的抗卡那霉
素基因转移到烟草上的试验，其后代也具有抗卡那霉素的特征。这一开创性的研究成果，为开拓转基因植物的研究与应用展示了广阔的前景。 自此以后，在水稻，玉米，大豆、番茄，马铃薯，烟草，油菜等很多重要的农作物上又得到了转基因植物。如美国孟山都等公司把杀蠋菌的苏云金杆菌的毒素蛋白基因引入到棉花、烟草、番茄和马铃薯等植物上，产生了杀死吃这些作物的蠋幼虫的毒蛋白，培育出了抗虫的棉花，烟草新品种。将毒壳蛋白基因转入苜蓿、黄瓜，烟草等作物，它们可对致命的病毒产生抗性，从而获得了抗花叶病毒感染的抗病植株。 植物转基因方法大致分成两大类，第一类需要通过组织培养再生植株，常用方法有农杆菌介导转化法、基因枪法；另一类方法不需要通过组织培养，目前技术比较成熟的主要有花粉管通道法。 1.农杆茵介导转化法 农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，分根瘤农杆菌和发根农杆菌两种，其细胞中分别含有Ti质粒和Ri 质粒，其上有一段T-DNA，通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中。因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中，但近年来，农杆菌介导转化在一些单子叶植物(尤其是日益作为模式植物的水稻中也已经得到了广泛应用和认可，这是该领域
转基因植物的类型及安全性问题
转基因植物 班级：10级生物技术及应用 学号：103207031045 姓名：贾丽丽
转基因植物的类型及安全性问题 摘要：植物转基因技术是指把从动物、植物或微生物中分离得到的基因，通过各种方法转移到植物的基因组中，使之稳定遗传并赋予植物新的农艺性状，如抗虫、抗病、抗逆、高产、优质等。随着现代生物技术的迅速发展，植物转基因技术方兴未艾。转基因植物的研究主要在于改进植物的品质，改变生长周期或花期等提高其经济价值或观赏价值；作为某些蛋白质和次生代谢产物的生物反应器，进行大规模生产；研究基因在植物个体发育中，以及正常生理代谢过程中的功能。 关键词：转基因植物；类型；潜在危害；安全性评价 植物转基因技术就是将优良性状的目的基因导入植物细胞或组织，并在其中进行表达，从而使植物获得新的性状。 转基因植物有以下几种类型： 1.抗病转基因植物：如抗病毒转基因烟草 2.抗虫转基因植物：如抗虫棉 3.抗逆转基因植物：如抗旱、抗盐碱 4.抗除草剂转基因植物：如抗除草剂转基因玉米、大豆、棉花、油菜 5.改良品质转基因植物：如转V A水稻 6转基因药品植物：如生产霍乱疫苗的胡萝卜 （一）抗病转基因植物 中国农业科学院生物技术研究所已成功地人工合成和改造了来自天蚕蛾的抗菌肽基因，并导入我国马铃薯主栽品米粒，获得抗病性提高I∽Ⅲ级的抗青枯病的转基因株系，现已经农业部批准在四川省进行环境释放。目前抗菌肽基因已经供给国内10多家研究单位，进行抗水稻白叶枯病、马铃薯软腐病、花生和番茄的青枯病、大白菜软腐病、柑桔细菌性溃疡病、桑树和桉树青枯病、樱桃根肿病等抗细菌病基因工程研究。 白叶枯病也是危害水稻生产的最为严重的病害之一。中国农业科学院生物技术研究所与国外合作研制成功的转Xa21基因抗白叶枯病水稻明恢63株系已分别在安徽省和海南省进行环境释放；华中农业大学和中国科学院遗传所研制的转Xa21基因抗白叶枯病水稻也分别进入中试阶段。 真菌病也是严重影响农作物生产的一类病害。中国农业科学院生物技术研究所与中国科学院上海植物生理研究所等单位合作，成功地克隆和修饰了植物来源的几丁质酶基因和葡萄糖氧化酶基因，通过花粉管通道法分别将这两个基因导入棉花，获得了抗黄萎病和枯萎病和枯萎的转基因棉花，这些株系在病圃中表现良好，现已进入中试阶段。 在抗病毒的基因工程方面，国内也取得了很好进展。北京大学克隆了
植物基因转化及转基因植物的分析与鉴定
植物基因转化及转基因植物的分析与鉴定 Company number：【WTUT-WT88Y-W8BBGB-BWYTT-19998】
植物基因转化及转基因植物的分析与鉴定 〖实验目的〗 1．了解创建烟草突变体库的方法； 2．理解每种方法的基本原理； 3．掌握农杆菌介导的转基因方法以及转基因产物筛选和鉴定的基本过程。〖实验原理〗 随着越来越多植物的全基因组测序工作的完成，在此基础上开展功能基因组的研究是目前的核心研究内容之一。植物插入突变体库的建立是功能基因组研究的一个重要内容，在此基础上也能进行正向遗传学及反向遗传学的研究。在创制突变体的策略上，传统方法是使用物理或化学诱变方法获得，其优点是可在尽可能短的时间内获得饱和突变体。与传统的物理和化学诱变方法相比，生物诱变(T-DNA和转座子插人诱变)通常可标记突变基因，从而较为容易地分离鉴定靶基因。最近数年，通过农杆菌介导的T-DNA插入突变已成为国际公认的植物功能基因组学的主要研究方法之一。 烟草是植物基因组研究的一种模式植物，其突变体库的创建是烟草功能基因组学研究中的重要内容，其目的是通过大规模的突变体库平台快速全方位的了解基因组中各个基因的功能。突变体的创制是遗传学研究的基础，也是分离基因和基因功能鉴定的最要途径。通过诱导培养，使烟草产生愈伤组织，利用土壤农杆菌感染愈伤组织，实现T-DNA标签在烟草愈伤组织基因组中大量随机插人，利用植物细胞的全能性，经过抗性筛选，诱导分化，从抗性愈伤组织获得烟草突变体再生植株，获得各突变体的纯合材料，从而建立烟草突变体的数
据库，然后分析突变性状与T-DNA的共分离关系，存在共分离的材料用适当的Tail-PCR克隆技术获得T-DNA的侧翼基因组序列，用其作探针筛选基因文库，获取目标基因或克隆，再进行下一步的分析（图实验4-1）。 T-DNA 载体构建 转化植物（T1，T-DNA杂合子)收获T2种子 筛选T2，获突变子，应为3:1分离 确定T-DNA与突变型共分离的个体 产生纯合后代 克隆T-DNA两侧的植物DNA（Tail PCR) 利用侧翼DNA序列作探针从该植物的cDNA文库中钓取基因 基因功能的验证（遗传互补测验，分离的野生基因转化突变体，回复功能）图实验4-1 T-DNA标签克隆基因的基本流程 TAIL-PCR分离法是利用多个嵌套的T-DNA插入序列特异性引物（根据T-DNA中靠近右边界处的核苷酸序列设计的引物，Tm值57-62℃和一个短的随机简并引物（AD，Tm值44-46℃）组合，以突变体基因组DNA为模板，进行多次PCR反应，采取高温特异性扩增与低温随机扩增相间进行的方法，最后获得T-DNA插入侧翼区特异性扩增片段（实验图4-2），可作为探针，筛选分离基因。 TAIL-PCR分离法可以降低非侧翼区特异产物的背景，同时它可以产生2个以上嵌套的目的片段，与其它方法相比TAIL-PCR方法具有简便、特异、高效、快速和灵敏等特点，已经在拟南芥和水稻等植物中获得了成功及广泛的应用。