蛋白纯化步骤

纤溶（溶栓）酶的分离及其性质研究

血栓是一种严重危害人类尤其是中老年人身体健康和生命的疾病，近年来发病率逐年增加，已成为常见病和多发病，是造成死亡和病残的首要原因。纤溶酶对纤维蛋白（原）具有专一水解活性，纤溶酶作为溶栓药物可以降解血栓骨架结构——纤维蛋白多聚体，从而达到溶解血栓栓子的目的，因此，药物溶栓是目前临床上治疗血栓性疾病的首选策略。

对“理想”溶栓药物的要求是：快速溶栓，对纤维蛋白特异，只作用于血栓而全身反应低，效力持久；出血危险性低；无全身性副反应，无抗原性，避免全身性纤溶、价廉等。目前对溶栓药物研究工作主要从两方面开展，一是应用基因工程和单克隆抗体技术对现有药物进行改造使之更理想；另一方面是开发新型天然来源的溶栓药物。

近几年，寻找天然来源的纤溶酶也成了一个研究热点。在动物、植物、海洋生物、微生物中都发现了天然的溶栓物质。在动物来源的纤溶酶中，人们研究较多的是从蚯蚓、蛇毒和蝙蝠的唾液及吸血动物中提取的纤溶酶；植物来源的纤溶酶主要是从丹参和蒲黄中提取；微生物更是纤溶酶的一种重要来源，如目前临床应用的溶栓药物链激酶、葡激酶、纳豆激酶等；在细菌、真菌、藻类中还发现了多种新型纤溶酶。

从作用机理上纤溶酶分成两类：一类是纤溶酶原激活剂，能将纤溶酶原激活为纤溶酶而降解纤维蛋白（原）；另一类是纤溶酶类活性物质，直接可以降解纤维蛋白（原）；都具有溶解血栓的作用（见下图）。

发现和筛选新型来源的纤溶酶是研发溶栓药物的基础，利用基因工程技术或蛋白质工程技术改造天然纤溶酶制成变异体、嵌合体或导向药物，是提高纤溶酶的选择性溶栓效果，延长半衰期，减少用药剂量和变态反应，降低成本的重要手段。制药工程研究室已从土壤中筛选出70多株纤溶酶产生菌，上学期的毕业生对其中9株菌进行了鉴定，并提取了外泌蛋白，检测后其中6（30—60） ，6（60—90） ，15（20—90） ，31（30—60） ，31（60—90） ，45（20—90） ，50（20—90） ，55（20—90） ，70（30—60） ，70（60—90） ，72（20—90）（菌号（硫酸铵沉淀浓度））具有纤溶活性。本学期主要工作有：

1. 纤溶酶活性测定：琼脂糖—纤维蛋白平板法

2. 蛋白含量测定：考马斯亮蓝法 →比活力测定

3. 分离和纯化：离子交换层析DEAE Sepharose 或CM-Sepharose

4. SDS-PAGE 电泳：硝酸银染色和考马斯亮蓝G-250染色, 检测分子量大小和分离效果。

5. 活性电泳：检测活性带位置，

6. 等电聚焦电泳：分离纤溶蛋白、测定等电点

7. 转膜、测序

纤溶酶原激活剂

纤溶酶原 纤溶酶

纤维蛋白原或纤维蛋白

（血栓栓子）

纤维蛋白原降解物(FgDP)或纤维蛋白降解物(FDP)

（血栓溶解）

血栓的溶解过程

8. 性质鉴定：包括Km值测定；激酶活性；最适作用温度和温度对活性的影响；最适作用pH和pH对活性的影响；金属螯合剂、酶抑制剂、蛋白变性剂、蛋白酶对活性影响；体外对小鼠血凝块的溶解作用；

1 分离和纯化：DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析(或CM-Sepharose Fast Flow阳离子交换层析) 1.1 试剂

1.Tris-HCl平衡液的配制：

用超纯水配置0.01mol/L的Tris，然后用HCl调pH至8.0（或7.8），记为0.01mol/LTris-HCl。

2.NaCl洗脱液的配制：

用配好的0.01mol/L的Tris-HCl液当溶剂，配制不同浓度的NaCl溶液，即为含0.01mol/L的平衡液的NaCl溶液。

1.2DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换树脂的处理：

（1）先用0.5mol/L NaOH 100mL浸泡30min，倒掉NaOH，加超纯水，每半小时轻轻搅拌一次，每小时换水一次，洗至中性为止。

（2）再用0.5mol/L HCl100mL浸泡30min，倒掉HCl，同前方法洗至中性。

（3）最后用0.5mol/L NaOH 100mL浸泡30min，倒掉NaOH，加超纯水，每半小时轻轻搅拌一次，每小时换水一次，洗至中性，加0.01mol/L的Tris-HCl平衡液浸泡。

1.3装柱：

先在层析柱中装入4-5cm超纯水，打开柱下边的出水口，让水自然流下，以赶走柱下部的气泡，待柱中的水留有一部分时，用塑料吸管将树脂和水的混合物绕柱内壁缓缓加入柱中，使树脂达柱长的2/3。柱上部留一部分水，不能使柱子干裂。

注意加入树脂时不要产生气泡，或出现断层，柱面一定要平，以防止样品不均匀的下降。

1.4平衡柱子

用0.01mol/L的平衡液平衡柱子，打开紫外检测仪，先在0.1A下细调，平衡至0，然后在1.0A下粗调，再平衡至0。平衡体积大约150-200ml。

1.5上样

关闭柱下出水口，用塑料吸管吸取蛋白溶液7-8ml均匀的加入到树脂中。

样品的配制：用0.01mol/L平衡液溶解粗蛋白，配成30-40mg/ml。

12000rpm，离心10min。

1.5树脂再平衡

待样品快要进入树脂时，向树脂中加入平衡液，待紫外吸收值上升到10以上时，用灭菌的三角瓶收集此峰，即为未结合到树脂上的蛋白。直至平衡至A280为不在变化，大约150-200ml。

1.7洗脱

平衡好树脂后，先用0.1mol/L的含0.01mol/L平衡液的NaCl洗脱，打开记录仪，紫外吸收值上升到10以上时，收集洗脱峰，并在瓶上做好标记。待紫外吸收值在一段时间内不再下降时，换0. 3 mol/L的含0.01mol/L 平衡液的NaCl洗脱。重复上述步骤，依次用0.5mol/L、0.7mol/L、1mol/L NaCl洗脱。

待蛋白完全洗脱后，用平衡液再平衡树脂，以备下次使用。

1.8洗脱的蛋白装透析袋透析（24h），然后冻干。

1.9检测活性，跑SDS-PAGE电泳检测纯度。

2 SDS-PAGE电泳

2.1 试剂

1. 30%胶：丙烯酰胺(Acr)15.2g ，甲叉双丙烯酰胺(Bis)0.4g，水定容至50mL。

2. PH8.9buffer：Tris9.2g,1N Hcl 12mL，水定容至50mL。

3. PH6.7buffer：Tris3g,1N Hcl 24mL，水定容至50mL。

4. APS：过硫酸铵5g，水定容至50mL。

5.10% SDS：SDS 5g,，水定容至50mL。

6.电泳液：Tris 3g，Gly 14.4g，SDS 1g，水定容至1000mL。

7.染色液：0.2g G-250溶于甲醇中，过滤，加冰乙酸10mL，水定容至100mL。

8.脱色液：甲醇10mL，乙酸7.5 mL，水定容至100mL。

9.还原样品液：PH6.7buffer2.5mL+甘油1mL+10%SDS1mL+巯基乙醇100uL+少量溴酚蓝，定容至5mL。

10.非还原样品液：PH6.7buffer2.5mL+甘油1mL+10%SDS1mL+少量溴酚蓝，定容至5mL。

11.12%胶的配置

2.2 操作步骤

2.2.1 灌胶

按照上面分离胶12%的浓度像玻璃槽中现灌入分离胶，大约灌3.2mL，然后用水压平，待分离胶凝固后倒掉水，然后灌入浓缩胶，迅速把梳子插入浓缩胶中，凝固后迅速拔下梳子，用吸水纸吸掉胶孔里的水。

2.2 样品处理

在加样之前把样品蛋白水煮10min，然后加入还原样品液（如果还原样品液是5倍，则两者比例为4比1）在12000rpm下离心10min，用进样器把上述蛋白注入胶孔内，用煮过的蛋白maker注入一个胶孔内作对比。机上样品加入顺序和胶版正反面。

2.3 接电源

插上电源，先用90v，等样品跑过分离胶后改用150v。

2.4 后处理

电泳跑完后，用考马斯亮蓝G-250染色10min，脱色液脱色，摇晃过夜，观察出现的条带。

3活性电泳

3.1 试剂

1. 30%胶：丙烯酰胺(Acr)15.2g ，甲叉双丙烯酰胺(Bis)0.4g，水定容至50mL。

2. PH8.9buffer：Tris9.2g,1N Hcl 12mL，水定容至50mL。

3. PH6.7buffer：Tris3g,1N Hcl 24mL，水定容至50mL。

4. APS：过硫酸铵5g，水定容至50mL。

5.10% SDS：SDS 5g,，水定容至50mL。

6.电泳液：Tris 3g，Gly 14.4g，水定容至1000mL。

7.染色液：0.2g G-250溶于甲醇中，过滤，加冰乙酸10mL，水定容至100mL。

8.脱色液：甲醇10mL，乙酸7.5 mL，水定容至100mL。

9.天然样品液：PH6.7buffer2.5 mL，甘油1mL，少量溴酚蓝，水定容至5mL。

10.凝血酶：20mg/mL,PBS配制。

11.纤维蛋白原：20mg/mL，PH8.9buffer配制。

12.12%胶的配置

3.2 步骤

Fibrin-PAGE参照Kim SH等方法，在制备分离胶时，加入十二烷基硫酸钠（SDS），使其终浓度为0.1%；加入用pH8.9的Tris-HCl缓冲液配制的20 mg·mL-1的纤维蛋白原，使其终浓度为0.4 mg·mL-1；加入适量凝血酶，以催化纤维蛋白原形成纤维蛋白；进行SDS-PAGE电泳。电泳结束后，将凝胶置于2%TritonX-100溶液中浸泡1h，而后放入PBS（pH7.2）溶液中浸泡，于37℃保温1h，用考马斯亮蓝G-250染色10min，脱色液脱色，观察透明带是否出现以及出现的位置。

4 转膜步骤：

按常规条件进行SDS－PAGE，对于分子量大于20KD的蛋白质，可采用Tris－苷氨酸缓冲系统；而Tris －Tricine系统，既可用于低分子量蛋白，也可用于高分子量蛋白。

a)配制CAPS电印迹缓冲液。方法如下：

10×CAPS（100mmol/L）

CAPS 22.13g

加去离子水至900ml

用2mol/L NaOH （约20ml）将pH值调至11.0，然后定容至1L，贮存于4ºC。

b) CAPS电印迹缓冲液（含10％甲醇的1×CAPS）

10×CAPS 200ml

甲醇200ml

去离子水1600ml

c)CAPS电印迹缓冲液中的甲醇浓度范围是0-20％，一般甲醇浓度高的缓冲液对低分子量蛋白的转移效果好，而甲醇浓度低甚至不含甲醇的缓冲液则有利于高分子量蛋白的转移。

d)取出PVDF膜，用甲醇浸泡数秒钟，然后放入CAPS电印迹缓冲液中。（注：以后的操作须防止PVDF 膜干涸。如果膜变干，须重复本步骤的操作。

e)取出电泳凝胶，在CAPS缓冲液中浸泡5-10分钟。（注：转移某些强碱性蛋白pI>9.0时，可省略本步骤。）

f)将用于电印迹实验的滤纸和海绵放入电印迹缓冲液中浸泡一下，然后按海绵、滤纸、PVDF膜、凝胶、滤纸、海绵的次序将电印迹夹层装好，并放入小型电转槽中，在50V恒压条件下（100-170mA）于室温下进行电印迹转移，转移时间为0.5-2小时。（注：务必小心排尽凝胶和PVDF膜之间的气泡。上述转移条件适用于Bio-Rad小型电转槽和分子量不太大的蛋白。在不同的实验中，应根据具体的电转移装置和具体蛋白适当调整电转移条件。例如对70kD以上的蛋白质须延长转移时间。

g)取出PVDF膜并用去离子水略为漂洗，用甲醇浸泡数秒钟，然后进行染色。

h)考马斯亮蓝染色，可将0.1％考马斯亮蓝R-250溶于40％甲醇/1％乙酸，染色30-50秒（切勿超过1分钟），用50％甲醇脱色（注意勤换脱色液），并用去离子水充分洗涤，然后即可剪下待测序的条带。

蛋白表达纯化实验步骤

蛋白表达纯化实验步骤（待改进) 1、取适当相应蛋白高表达的动物组织提total—RNA. 2、设计蛋白表达引物。引物要去除信号肽，要加上适当的酶切位点和保护碱基。 3、RT-PCR，KOD酶扩增获取目的基因c DNA。 4、双酶切，将cDNA.克隆入PET28/32等表达载体。 5、转化到DH5α感受态细菌中扩增，提质粒. 6、将质粒转化入表达菌株，挑菌检测并保种。表达菌株如Bl21（DE3)、Rosetta gami（DE3)、Bl21 codon(DE3)等。 7、蛋白的诱导表达。 1）将表达菌株在3ml LB培养基中摇至OD=0。6左右，加入IPTG,浓度梯度从25μM 到1m M。37度诱导过夜(一般3h以上即有大量表达）。 2)SDS—PAGE电泳检测目的蛋白的表达。注:目的蛋白包涵体表达量一般会达到菌体 蛋白的50％以上,在胶上可以看到明显的粗大的条带. 3）将有表达的菌株10%甘油保种，保存1ml左右就足够了,并记录IPTG浓度范围. 甘油是用0。22μm过滤除菌的,储存浓度一般是30％—60％，使用时自己计算用量. 4）用上述IPTG浓度范围的最低值诱导10ml表达菌，18度,低转速(140-180rpm）， 诱导过夜作为包涵体检测样品。 注意:1.如果表达的蛋白对菌体有毒性，可以在加IPTG之前的培养基中加入1%的葡萄糖用来抑制本底表达。葡萄糖会随着细菌的繁殖消耗殆尽,不会影响后面的表达。2. 保种可以取一部分分成50μl一管,每次用一管,避免反复冻融. 8、包涵体检测。方案见附件2 9、如有上清表达,则扩大摇菌。 1)取保种的表达菌株先摇10ml,37度，300rpm摇至OD>=1。5，约5h左右，视菌种 的活性而异,也可过夜摇菌。 2）将上一步中的8ml加入300ml培养基中37度,250rpm摇至OD= 1.0左右(约 2。5h～3h)，然后加IPTG（浓度同包涵体检测中使用的浓度。)注:菌液浓度要适当 的浓一些,否则第二天收集不到足够的菌体，因为低温低转速细菌生长非常缓慢。 拿起锥形瓶对光摇动，看到有大量云雾状菌体即可。另一方法是，将手指放在瓶底晃动,看不清手指为宜,不过此法宜受气泡影响。 3）过夜摇菌,使用包涵体检测的温度（18°左右)，转速140rpm左右. 4）将菌液6000rpm,4min，4度离心收集菌体。加入20mM PBS，洗一遍后用平衡缓 冲液重悬。每250ml菌液用30 ml到50ml 平衡缓冲液,视菌液的浓度而定。可用4支50ml 的离心管同时离心，但是,离心管要重复使用，用完后洗净保存。 10、超声波裂解. 1）用6mm变幅杆,35%功率,3.5s工作，7s休息，50min即可. 注意：1.要冰浴。2.要随时观察裂解情况以防意外。3.要将探头探入到溶液中下部,尽量不要打出大量气泡。一般溶液量比较大的时候不会出现大量气泡. 4.正常声音为:孜孜声，尖锐刺耳的声音表明探头位置不对或者功率太大或者探头 松动等原因,要及时调整.溶液由浑浊变清透,由粘稠变不粘稠表明裂解完成（后面3000转离心时，如果沉淀少说明裂解的好）。5.超声波破碎仪工作30分min要休息5min(即关闭总电源开关）。 注意：1。如果纯化的蛋白较易被蛋白酶降解,在超声裂解之前要加蛋白酶抑制剂(PMSF），PMSF工作浓度为1%。2.如不能判断是否裂解完全，就按上述条件裂解 60分钟，60分钟足够裂解.

蛋白纯化步骤

蛋白纯化步骤 引言： 蛋白质是生物体内重要的生物大分子，其结构和功能对于维持生命活动至关重要。为了研究蛋白质的性质和功能，科学家们需要将蛋白质从复杂的混合物中纯化出来。蛋白纯化是一项复杂而重要的实验步骤，本文将介绍常用的蛋白纯化步骤。 一、细胞裂解和收集 蛋白纯化的第一步是将含有目标蛋白质的细胞裂解，并将目标蛋白质收集起来。常用的细胞裂解方法包括机械破碎、超声波破碎和渗透破碎等。裂解后，通过离心等方法将蛋白质从其他细胞组分中分离出来。 二、沉淀和上清液分离 细胞裂解后蛋白质溶液中可能存在大量杂质，需要通过沉淀与上清液分离的方法去除。常用的方法包括盐析法、有机溶剂沉淀法和凝胶渗析法等。这些方法可以根据蛋白质的特性选择合适的杂质去除方法。 三、蛋白质分子量筛选 蛋白质纯化过程中，通常需要对蛋白质进行分子量筛选。这样可以去除低分子量的杂质和蛋白质降解产物。常用的方法包括凝胶过滤法、凝胶电泳法和离子交换色谱法等。

四、亲和纯化 亲和纯化是一种常用的蛋白纯化方法，该方法利用蛋白质与亲和基质之间的特异性相互作用进行纯化。亲和基质可以是抗体、金属离子、亲和标签等。通过将亲和基质与目标蛋白质结合，再通过洗脱等步骤将目标蛋白质从杂质中分离出来。 五、离子交换层析 离子交换层析是一种基于蛋白质与离子交换基质之间的静电作用力进行纯化的方法。根据蛋白质的电荷性质，可以选择合适的离子交换基质和缓冲液条件，使目标蛋白质与基质发生相互作用。通过调整离子浓度和pH值，可以实现目标蛋白质与基质的分离。 六、凝胶过滤层析 凝胶过滤层析是一种根据蛋白质的分子量进行纯化的方法。通过选择合适的凝胶基质和孔径，可以使目标蛋白质从较大分子量的杂质中分离出来。这种方法适用于蛋白质的富集和浓缩。 七、逆流层析 逆流层析是一种根据蛋白质的亲和性进行纯化的方法。该方法利用逆流层析柱中填充的亲和基质与目标蛋白质之间的特异性相互作用进行纯化。通过调整流动相的条件，可以实现蛋白质的吸附和洗脱，从而分离目标蛋白质。

四种蛋白纯化方法

四种蛋白纯化方法 1. 溶液沉淀法 溶液沉淀法是一种常用的蛋白纯化方法，适用于从复杂的混合物中分离目标蛋白。该方法基于蛋白质在不同条件下的溶解度差异，通过添加盐类或有机溶剂来诱导蛋白质的沉淀。 步骤： 1.样品制备：将待纯化的样品经过初步处理，如细胞破碎、组织切割等，得到 含有目标蛋白的混合物。 2.溶解度测试：在不同条件下（如pH、温度、盐浓度等）测试目标蛋白质的 溶解度，并确定最适合其沉淀的条件。 3.沉淀：根据前一步骤确定的最佳条件，向样品中添加盐类或有机溶剂，使目 标蛋白质发生沉淀。可以通过离心将沉淀物与上清液分离。 4.溶解：将沉淀物重新溶解在适当的缓冲液中，得到纯化后的目标蛋白。 优点： •简单易行，不需要复杂的设备和操作。 •适用于从复杂混合物中纯化目标蛋白。 缺点： •可能会导致非特异性沉淀，使得纯化后的蛋白含有杂质。 •沉淀方法对蛋白质的溶解度要求较高，不适用于所有蛋白。 2. 凝胶过滤法 凝胶过滤法是一种基于分子大小的蛋白纯化方法，适用于分离不同分子量范围的蛋白。该方法利用孔径可调的凝胶柱或膜来分离目标蛋白和其他小分子。 步骤： 1.样品制备：将待纯化的样品经过初步处理，如细胞破碎、组织切割等，得到 含有目标蛋白的混合物。 2.凝胶柱选择：根据目标蛋白的分子量范围选择合适孔径的凝胶柱或膜。 3.样品加载：将样品加载到凝胶柱上，并使用缓冲液进行洗涤，以去除小分子。

4.蛋白洗脱：通过改变缓冲液的组成或pH值，使目标蛋白从凝胶柱上洗脱下 来。 5.收集纯化蛋白：将洗脱得到的蛋白收集起来，即可得到纯化后的目标蛋白。 优点： •可以根据分子量范围选择合适的凝胶柱，实现高效分离。 •纯化后的蛋白质纯度较高。 缺点： •操作相对复杂，需要一定的专业知识和技术。 •只适用于分子量差异较大的目标蛋白。 3. 亲和层析法 亲和层析法是一种基于生物分子间特异性相互作用的蛋白纯化方法，适用于富含目标蛋白的混合物。该方法利用目标蛋白与特定配体之间的亲和力进行分离和纯化。 步骤： 1.配体固定：将具有亲和力的配体固定在石英珠、琼脂糖等载体上，并填充在 层析柱中。 2.样品加载：将待纯化的样品加载到层析柱中，目标蛋白与配体发生特异性结 合。 3.洗脱：通过改变缓冲液的组成或pH值，使目标蛋白与配体解离，从而洗脱 下来。 4.收集纯化蛋白：将洗脱得到的蛋白收集起来，即可得到纯化后的目标蛋白。 优点： •可以实现高选择性的分离和纯化。 •纯化后的蛋白质纯度较高。 缺点： •需要特定的配体和载体进行固定，成本较高。 •需要对目标蛋白和配体之间的亲和力进行研究和优化。 4. 离子交换层析法 离子交换层析法是一种基于生物分子电荷差异的蛋白纯化方法，适用于具有不同电荷特性的目标蛋白。该方法利用离子交换树脂对样品中带电物质进行吸附和洗脱。

大量纯化蛋白的简易步骤

纯化蛋白的简易步骤 纯化 1.配制培养基LB, 挑取菌种至含有抗生素的LB液体培养基中(50ml+1管菌种)，37 ℃ 220 rpm培养。 2.取10mL培养的菌液转接到1000 mL新鲜的LB抗性培养基中，37 ℃220 rpm培养至 OD600≈0.4-0.5。 3.将培养箱温度调至20℃，转速调至180rpm，继续培养约0.5h-1h（取出1mL菌液作为诱 导前对照）。之后加入1 M IPTG至终浓度为0.1-1 mM（本次实验的浓度为0.1mM），继续诱导培养大约9-10小时（取出1mL菌液作为诱导后对照）。 4.4℃，4000rpm离心，15min收集菌体。沉淀可冻于-80℃保存（做蛋白结晶尽量不要冻 存）。 5.配制buffer A，如下 6.加入适当的buffer A （含有100mM PMSF 1：100、10mg/mL Dnase 1: 1000、2M MgCl2 1:2000）。1000mL菌液收的菌，加入30mL即可，太少超声时容易起泡。 7.混匀后冰上放置20Min，期间不时的震荡。混合物使用液压破碎（比超声破碎好）。 8.离心10000rpm，4℃，45min，彻底去除菌体碎片，取上清备用。（一定不要菌体碎片！ 取4ul+4ulLB 作为binding前的对照） 9.Ni beads的预处理：取适量beads，加入适量的buffer A，如800uL beads（1000mL菌液 沉淀）加入1mL buffer A，800rpm，2.5min，洗3次。 10.将步骤6所得的上清与预处理好的beads加入50mL的离心管中，封口膜封口后，静音 混匀器4℃binding1-2h（时间过长蛋白易降解）。 11.将binding后的溶液过柱（取4ul+4ulLB 作为binding后的对照），加入10CV wash buffer， 放置10min后冲洗（取4ul+4ulLB 作为wash后的对照）。

凝胶过滤层析进行蛋白纯化的流程

凝胶过滤层析进行蛋白纯化的流程 引言： 蛋白纯化是研究蛋白质结构和功能的关键步骤之一。凝胶过滤层析是一种常用的蛋白纯化方法，通过分子大小的差异来分离和纯化目标蛋白。本文将介绍凝胶过滤层析的流程及其应用。 一、凝胶过滤层析的原理 凝胶过滤层析是基于分子大小的差异来分离蛋白的一种方法。该方法利用特定的凝胶材料，通过将待纯化的蛋白溶液加入凝胶柱中，较大分子的蛋白无法渗透进入凝胶内部，而较小分子的蛋白则可以通过凝胶孔道进入凝胶内部。通过这种方式，可以实现对蛋白的分离和纯化。 二、凝胶过滤层析的步骤 1. 准备凝胶柱：选择适当的凝胶材料和柱子，根据待纯化蛋白的分子大小选择合适的孔径。 2. 杂质去除：使用缓冲液预先洗脱凝胶，去除其中的杂质和阻塞物。 3. 样品加载：将待纯化的蛋白溶液加载到凝胶柱中，注意保持柱子的垂直姿势，防止样品泄漏。 4. 洗脱：使用缓冲液进行洗脱，以去除非目标蛋白和杂质。 5. 收集纯化蛋白：将目标蛋白收集，可以使用分级洗脱或直接洗脱的方法。

三、凝胶过滤层析的优势和应用 凝胶过滤层析具有以下优势： 1. 无需特殊设备：相较于其他蛋白纯化方法，凝胶过滤层析不需要昂贵的设备，操作简单方便。 2. 高分辨率：凝胶过滤层析可以实现对不同分子大小的蛋白进行高效分离，得到高纯度的目标蛋白。 3. 适用范围广：凝胶过滤层析适用于各种类型的蛋白，包括酶、抗体、细胞因子等。 凝胶过滤层析在生物学研究中有广泛的应用，主要包括以下方面：1. 蛋白纯化：凝胶过滤层析是常用的蛋白纯化方法之一，可以用于从复杂的混合物中纯化目标蛋白。 2. 质量控制：凝胶过滤层析可以用于检测蛋白样品的分子大小和纯度，对蛋白质的质量进行评估。 3. 蛋白互作研究：凝胶过滤层析可以用于研究蛋白与其他分子（如核酸或小分子化合物）的相互作用。 4. 蛋白结构分析：凝胶过滤层析可以为蛋白的结构分析提供高纯度的样品。 结论： 凝胶过滤层析是一种简单、快速且高效的蛋白纯化方法，通过分子大小的差异实现对目标蛋白的分离和纯化。该方法在生物学研究中有广泛的应用，可以用于蛋白纯化、质量控制、蛋白互作研究和蛋

蛋白表达纯化实验步骤

蛋白表达纯化实验步骤(待改进) 1、取适当相应蛋白高表达的动物组织提total-RNA。 2、设计蛋白表达引物。引物要去除信号肽,要加上适当的酶切位点和保护碱基。 3、RT-PCR,KOD酶扩增获取目的基因c DNA. 4、双酶切,将cDNA.克隆入PET28/32等表达载体。 5、转化到DH5α感受态细菌中扩增,提质粒。 6、将质粒转化入表达菌株,挑菌检测并保种。表达菌株如Bl21(DE3)、Rosetta gami(DE3)、Bl21 codon(DE3)等。 7、蛋白的诱导表达。 1)将表达菌株在3ml LB培养基中摇至OD=0.6左右,加入IPTG,浓度梯度从25μM 到1m M。37度诱导过夜(一般3h以上即有大量表达)。 2)SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达。注:目的蛋白包涵体表达量一般会达到菌体 蛋白的50%以上,在胶上可以看到明显的粗大的条带。 3)将有表达的菌株10%甘油保种,保存1ml左右就足够了,并记录IPTG浓度范围。 甘油是用0.22μm过滤除菌的,储存浓度一般是30%-60%,使用时自己计算用量。 4)用上述IPTG浓度范围的最低值诱导10ml表达菌,18度,低转速(140-180rpm), 诱导过夜作为包涵体检测样品。 注意:1.如果表达的蛋白对菌体有毒性,可以在加IPTG之前的培养基中加入1%的葡萄糖用来抑制本底表达。葡萄糖会随着细菌的繁殖消耗殆尽,不会影响后面的表达。2. 保种可以取一部分分成50μl一管,每次用一管,避免反复冻融。 8、包涵体检测。方案见附件2 9、如有上清表达,则扩大摇菌。 1)取保种的表达菌株先摇10ml,37度,300rpm摇至OD>=1.5,约5h左右,视菌种

天然蛋白纯化的基本流程

天然蛋白纯化的基本流程 一、引言 天然蛋白纯化是生物化学和生物技术领域中的重要研究内容之一。蛋白质作为生物体内功能性分子的基本组成部分，其纯化和分离对于研究蛋白质的结构、功能和生物学特性具有重要意义。本文将介绍天然蛋白纯化的基本流程。 二、样品制备 天然蛋白纯化的第一步是样品制备。通常，我们需要从生物体中提取蛋白质样品。提取方法的选择取决于样品的来源和特性。常见的提取方法包括机械破碎、超声波破碎、化学法和生物法等。在提取过程中，需要注意保持样品的完整性和稳定性，以确保蛋白质的纯度和活性。 三、初步分离 在样品制备之后，需要进行初步分离。初步分离的目的是将蛋白质与其他生物大分子（如核酸、多糖等）分离开来。常用的初步分离方法包括离心、过滤、电泳和层析等。离心通过调节离心力和离心时间，可以将蛋白质从细胞碎片、细胞核和细胞器中分离出来。过滤则是利用孔隙大小的差异，将蛋白质和其他生物大分子分开。电泳是利用蛋白质在电场中的迁移速度差异进行分离，常见的电泳方法有SDS-PAGE和等电聚焦。层析则是利用不同蛋白质在固定相和

流动相之间的亲和性差异进行分离。初步分离后，可以得到蛋白质的粗提物。 四、纯化策略 在初步分离得到蛋白质的粗提物之后，需要根据具体的研究目的和蛋白质的特性选择合适的纯化策略。常见的纯化策略包括亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析、逆流层析和高效液相色谱等。亲和层析是利用蛋白质与某种配体之间的特异性相互作用进行分离，常见的亲和层析方法有金属螯合层析、免疫亲和层析和亲和吸附层析等。离子交换层析是利用蛋白质与固定相之间的电荷差异进行分离。凝胶过滤层析则是根据蛋白质的分子大小进行分离。逆流层析则是利用溶剂的逆向流动和蛋白质与固定相之间的亲和性差异进行分离。高效液相色谱则是利用溶液在固定相上的流动和蛋白质与固定相之间的亲和性差异进行分离。 五、纯化步骤 根据选择的纯化策略，进行相应的纯化步骤。在进行纯化步骤时，需要注意控制条件，如pH值、离子浓度、温度等。同时，也需要监测纯化过程中的蛋白质含量和纯度，常用的检测方法有紫外吸收光谱、蛋白质浓度测定、SDS-PAGE电泳和Western blot等。通过逐步纯化，最终可以得到目标蛋白质的高纯度样品。 六、纯化评估

蛋白质分离纯化步骤

蛋白质分离纯化步骤

一、蛋白质分离纯化的一般原则 大多数蛋白质在组织细胞中都是和核酸等生物分子结合在一起，而且每种类型的细胞都含有成千上万种不同的蛋白质。许多蛋白质在结构、性质上有许多相似之处，所以蛋白质的分离提纯是一项复杂的工作。到目前为止，还没有一套现成的方法能把任何一种蛋白质从复杂的混合物中提取出来。但是对于任何一种蛋白质都有可能选择一种较合适的分离纯化程序以获得高纯度的制品。且分离的关键步骤、基本手段还是共同的。 蛋白质提纯的目的是增加产品的纯度和产量，同时又要保持和提高产品的生物活性。因此，要分离纯化某一种蛋白质，首先应选择一种含目的蛋白质较丰富的材料。其次，应设法避免蛋白质变性，以制备有活性的蛋白质。对于大多数蛋白质来说，纯化操作都是在0～4℃的低温下进行的。同时也应避免过酸、过碱的条件以及剧烈的搅拌和振荡。另外，还要设法除去变性的蛋白质和其它杂蛋白，从而达到增加纯度和提高产量的目的。

力不均而使细胞破碎。 5. 酶法 如用溶菌酶破坏微生物细胞等。(二) 蛋白质的抽提 通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠、tritonX-100等），使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。 (三）蛋白质粗制品的获得 选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。常用的有下列几种方法： 1. 等电点沉淀法 不同蛋白质的等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分离。 2. 盐析法 不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度

蛋白纯化步骤

纤溶（溶栓）酶的分离及其性质研究 血栓是一种严重危害人类尤其是中老年人身体健康和生命的疾病，近年来发病率逐年增加，已成为常见病和多发病，是造成死亡和病残的首要原因。纤溶酶对纤维蛋白（原）具有专一水解活性，纤溶酶作为溶栓药物可以降解血栓骨架结构——纤维蛋白多聚体，从而达到溶解血栓栓子的目的，因此，药物溶栓是目前临床上治疗血栓性疾病的首选策略。 对“理想”溶栓药物的要求是：快速溶栓，对纤维蛋白特异，只作用于血栓而全身反应低，效力持久；出血危险性低；无全身性副反应，无抗原性，避免全身性纤溶、价廉等。目前对溶栓药物研究工作主要从两方面开展，一是应用基因工程和单克隆抗体技术对现有药物进行改造使之更理想；另一方面是开发新型天然来源的溶栓药物。 近几年，寻找天然来源的纤溶酶也成了一个研究热点。在动物、植物、海洋生物、微生物中都发现了天然的溶栓物质。在动物来源的纤溶酶中，人们研究较多的是从蚯蚓、蛇毒和蝙蝠的唾液及吸血动物中提取的纤溶酶；植物来源的纤溶酶主要是从丹参和蒲黄中提取；微生物更是纤溶酶的一种重要来源，如目前临床应用的溶栓药物链激酶、葡激酶、纳豆激酶等；在细菌、真菌、藻类中还发现了多种新型纤溶酶。 从作用机理上纤溶酶分成两类：一类是纤溶酶原激活剂，能将纤溶酶原激活为纤溶酶而降解纤维蛋白（原）；另一类是纤溶酶类活性物质，直接可以降解纤维蛋白（原）；都具有溶解血栓的作用（见下图）。 发现和筛选新型来源的纤溶酶是研发溶栓药物的基础，利用基因工程技术或蛋白质工程技术改造天然纤溶酶制成变异体、嵌合体或导向药物，是提高纤溶酶的选择性溶栓效果，延长半衰期，减少用药剂量和变态反应，降低成本的重要手段。制药工程研究室已从土壤中筛选出70多株纤溶酶产生菌，上学期的毕业生对其中9株菌进行了鉴定，并提取了外泌蛋白，检测后其中6（30—60） ，6（60—90） ，15（20—90） ，31（30—60） ，31（60—90） ，45（20—90） ，50（20—90） ，55（20—90） ，70（30—60） ，70（60—90） ，72（20—90）（菌号（硫酸铵沉淀浓度））具有纤溶活性。本学期主要工作有： 1. 纤溶酶活性测定：琼脂糖—纤维蛋白平板法 2. 蛋白含量测定：考马斯亮蓝法 →比活力测定 3. 分离和纯化：离子交换层析DEAE Sepharose 或CM-Sepharose 4. SDS-PAGE 电泳：硝酸银染色和考马斯亮蓝G-250染色, 检测分子量大小和分离效果。 5. 活性电泳：检测活性带位置， 6. 等电聚焦电泳：分离纤溶蛋白、测定等电点 7. 转膜、测序 纤溶酶原激活剂 纤溶酶原 纤溶酶 纤维蛋白原或纤维蛋白 （血栓栓子） 纤维蛋白原降解物(FgDP)或纤维蛋白降解物(FDP) （血栓溶解） 血栓的溶解过程

四种蛋白纯化的有效方法

四种蛋白纯化的有效方法 四种蛋白纯化的有效方法 在进行蛋白质研究和酶工程等领域的实验过程中，常常需要将目标蛋 白从复杂的混合物中纯化出来。蛋白纯化的目的是获取高纯度的目标 蛋白样品，以便进一步进行结构和功能研究。然而，由于蛋白质的复 杂性以及其在混合物中的低浓度，蛋白纯化常常面临一系列的挑战。 为了克服这些挑战，科学家们开发了多种蛋白纯化的方法。在本文中，我们将介绍四种常见而高效的蛋白纯化方法，并探讨其原理和适用性。 1. 亲和层析法： 亲和层析法是一种利用目标蛋白与配体之间的特异性结合进行纯化的 方法。这种方法基于目标蛋白与配体之间的亲和力，通过设计具有高 亲和性的配体来选择性地结合目标蛋白。在实验中，我们可以将配体 固定于固相材料上，例如琼脂糖或石蜡烃树脂，并将载有目标蛋白的 混合物与这些固定化的亲和基质进行接触。随后，非特异性蛋白质被 洗脱，而目标蛋白则被保留下来。目标蛋白可以通过改变条件（例如 改变pH值或添加竞争性配体）来洗脱。 亲和层析法的优点在于具有高选择性和高纯度的优势。然而，由于亲 和剂的设计和合成需要具有相关专业知识，并且选择适当的配体是关

键。亲和层析法在不同的纯化过程中的适用性会有所不同。 2. 凝胶过滤层析法（Gel Filtration Chromatography）： 凝胶过滤层析法是通过分子量的差异将混合物中的蛋白质分离的一种方法。凝胶过滤层析法是利用凝胶材料，例如琼脂糖或琼脂糖-聚丙烯酰胺凝胶，通过分子在凝胶孔隙中的渗透性而将蛋白分离开来。较大的蛋白分子无法进入凝胶孔隙，因此会在凝胶的表面留下。较小的蛋白分子则能够渗透进入凝胶孔隙中，因此会相对于较大的蛋白分子更早地溢出。 凝胶过滤层析法的优点在于操作简单、速度快，且可以对蛋白进行某种程度的分离。然而，该方法的分离效果受到蛋白质在凝胶中的体积效应的限制，因此对于体积较大的蛋白分子，凝胶过滤层析可能无法实现理想的分离效果。 3. 离子交换层析法： 离子交换层析法是一种基于蛋白与离子交换材料之间的电荷相互作用进行纯化的方法。离子交换材料是一种能够与具有相反电荷的蛋白质分子发生相互作用的固相材料。在实验中，当我们将载有目标蛋白的混合物与带有相反电荷的离子交换材料进行接触时，目标蛋白会与离子交换材料发生吸附。之后，我们可以通过改变洗脱条件，例如改变pH值或离子浓度，来使目标蛋白从离子交换材料中洗脱。

蛋白质分离纯化的步骤

蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤： （一）材料的预处理及细胞破碎 分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法有： 1.机械破碎法 这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。 2.渗透破碎法 这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。 3.反复冻融法 生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。这种方法简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。 4.超声波法 使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。 5.酶法 如用溶菌酶破坏微生物细胞等。 （―）蛋白质的抽提 通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠、tritonX-100等），使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。 （三）蛋白质粗制品的获得选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。常用的有下列几种方法： 1.等电点沉淀法不同蛋白质的等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分离。 2.盐析法 不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同，所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质，并能再度溶解而不变性。 3.有机溶剂沉淀法 中性有机溶剂如乙醇、丙酮，它们的介电常数比水低。能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低，进而从溶液中沉淀出来，因此可用来沉淀蛋白质。此外，有机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层，促使蛋白质分子变得不稳定而析出。由于有机溶剂会使蛋白质变性，使

蛋白纯化相关原理及方法

蛋白纯化相关原理及方法 蛋白纯化是生物科学研究中常用的一项技术，它可以分离纯化出目标蛋白质，从而方便后续的研究和应用。本文将介绍蛋白纯化的原理和方法。 一、蛋白纯化的原理 蛋白纯化的原理是基于不同蛋白质的特性差异，通过采用不同的分离技术，将目标蛋白质从复杂的混合物中分离出来，并且使其达到纯度较高的状态。 蛋白质的特性差异主要包括以下几个方面： 1. 分子质量：蛋白质的分子质量不同，可以通过分子大小的差异进行分离。常用的方法包括凝胶过滤层析和超速离心。 2. 电荷性质：蛋白质具有不同的电荷性质，可以通过离子交换层析、电泳等方法进行分离。离子交换层析是利用蛋白质与固定在固相上的离子交换基团之间的相互作用进行分离。 3. 亲和性：蛋白质与其他分子之间可能存在特异的结合，可以通过亲和层析进行分离。亲和层析是利用蛋白质与特定配体之间的结合进行分离。 4. 疏水性：蛋白质的疏水性不同，可以通过逆向相层析等方法进行

分离。逆向相层析是利用溶剂的极性进行分离，疏水性较高的蛋白质会更早洗脱。 二、蛋白纯化的方法 1. 直接纯化法：直接从生物样品中纯化目标蛋白质，可以通过分离离心、沉淀和过滤等简单的操作步骤进行。这种方法适用于目标蛋白质含量较高的样品。 2. 柱层析法：柱层析是一种常用的蛋白纯化方法，可以根据目标蛋白质的特性选择不同的层析柱进行分离。常用的柱层析方法包括凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析等。 3. 电泳法：电泳是利用蛋白质的电荷性质进行分离的方法，常用的电泳方法包括聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）和等电聚焦电泳（IEF）等。 4. 超滤法：超滤是利用膜的孔径大小对蛋白质进行分离的方法，常用的超滤方法包括凝胶过滤和离心浓缩等。 5. 亲和纯化法：亲和纯化是利用蛋白质与特定配体之间的结合进行分离的方法，常用的亲和纯化方法包括亲和层析、亲和吸附、亲和沉淀等。 6. 水相两相法：水相两相法是利用两相体系的差异进行蛋白质的分

胶原蛋白纯化有哪几种方法

胶原蛋白纯化有哪几种方法 胶原蛋白是一种重要的结构蛋白质，广泛存在于人体组织中，具有维持组织形态稳定、提供力学支持、参与细胞信号传导等功能。胶原蛋白的纯化是研究其结构和功能的关键步骤之一，以下介绍几种常用的胶原蛋白纯化方法。 1.酸解法：胶原蛋白易于在强酸条件下溶解，可以通过酸解纯化来提取。常用的酸解剂包括盐酸、硝酸、硫酸等，其中酸度和时间的控制非常重要，过高的酸度或过长的酸解时间都会导致胶原蛋白的降解和损失。 2.盐析法：盐析法是利用不同胶原蛋白与溶液中的盐形成络合物，在适当的盐浓度下使胶原蛋白发生溶液沉淀。一般先用胶原蛋白溶液进行盐析，然后通过超离心等方法分离和纯化。 3.凝胶过滤法：凝胶过滤法是利用胶原蛋白对凝胶的亲和力来分离和纯化。胶原蛋白溶液通过凝胶柱或凝胶膜时，胶原蛋白分子会受到凝胶孔隙的限制，大分子胶原蛋白会在凝胶中停留，而小分子杂质则能通过凝胶孔隙流出。 4. 离子交换层析法：离子交换层析法是利用胶原蛋白与固相上带电离子交换基团的亲和性进行纯化。常见的固相包括强阳离子交换基团（如强阳离子交换树脂Sephacryl S100）和强阴离子交换基团（如DEAE纤维素）。通过调节溶液的pH以及离子强度等条件，使胶原蛋白与基质发生相互作用，从而实现纯化。 5.亲和层析法：亲和层析法是利用特定的配体与胶原蛋白结合，通过配体固定于固相上来实现分离和纯化。例如，可以使用葡聚糖和明胶等与

胶原蛋白发生特异性亲和作用的配体。亲和层析一般需要优化结合和洗脱 条件，以提高选择性和纯化效果。 6.电泳法：电泳法是利用电场在凝胶中将胶原蛋白分离的方法。电泳 可分为平板电泳、垂直电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳等。通过调节凝胶成分、电场强度和时间等因素，可以分离不同大小和电荷的胶原蛋白。 这里只列举了几种常见的胶原蛋白纯化方法，每种方法都有其优缺点 和适用场景。在实际研究中，通常需要根据具体目的和样品特点来选择合 适的方法。同时，多种纯化方法的结合使用也能提高纯化效果。

strep标签纯化蛋白步骤

strep标签纯化蛋白步骤 一、引言 蛋白纯化是生物学研究中非常重要的一个步骤，通过对目标蛋白进行分离和纯化，可以获得高纯度的蛋白样品，为后续的结构和功能研究提供可靠的基础。strep标签是一种常用的蛋白纯化标签，具有高亲和力和高特异性，被广泛应用于蛋白纯化领域。本文将介绍strep标签纯化蛋白的步骤和技术。 二、strep标签纯化蛋白的步骤 1. 基因工程构建含有strep标签的目标蛋白表达载体 需要将目标蛋白的编码序列与strep标签的编码序列进行连接，构建含有strep标签的目标蛋白表达载体。通常使用重组DNA技术，在目标蛋白的N端或C端引入strep标签的编码序列，使其与目标蛋白融合表达。这样，在细胞内合成的目标蛋白就会带有strep标签。 2. 目标蛋白的表达与细胞培养 将构建好的目标蛋白表达载体转化至适合的宿主细胞中，如大肠杆菌。经过培养和诱导，目标蛋白将在细胞内得到高效表达。细胞培养过程中，需要注意选择适当的培养条件，如温度、培养基组成等，以确保目标蛋白的表达量和质量。 3. 细胞破碎与裂解

经过培养和诱导后，细菌细胞中含有大量的目标蛋白。为了获得目标蛋白，需要对细胞进行破碎和裂解。常用的方法有超声波破碎、高压融菌等。破碎后，目标蛋白被释放到裂解液中。 4. 蛋白裂解液的预处理 裂解液中通常含有大量的杂质蛋白、核酸、小分子化合物等。为了提高后续纯化步骤的效果，需要对裂解液进行预处理。可以通过离心、滤过等方法去除细胞碎片、沉淀杂质等。 5. strep标签亲和层析纯化 将预处理后的裂解液加载到含有strep标签亲和树脂的层析柱中。strep标签与亲和树脂之间形成特异性的结合，目标蛋白会与亲和树脂特异结合，而其他杂质蛋白则流经。接着，通过洗脱缓冲液将目标蛋白从亲和树脂上洗脱下来。 6. 洗脱产物的后续处理 洗脱得到的产物中仍可能含有一些杂质，需要进行进一步的处理。可以通过柱洗脱、凝胶电泳等方法进行杂质去除。最终得到的产物即为纯化后的目标蛋白。 三、strep标签纯化蛋白的优势和应用 strep标签具有高亲和力和高特异性，使得蛋白纯化更加简便和高效。与传统的纯化方法相比，strep标签纯化蛋白具有以下优势： 1. 高纯度：strep标签亲和层析纯化可以获得高纯度的目标蛋白样