土壤微生物的分离纯化与鉴定
微生物学实验报告
题目：土壤微生物的分离纯化与鉴定
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一、目的要求
1．通过从土壤中分离纯化细菌，掌握培养基的制备与灭菌技术、微生物的分离纯化方法和无菌操作技术。
2．掌握常用的微生物鉴定方法，复习以前学过的各种染色方法，掌握生理生化试验的原理与方法。
3．掌握微生物的鉴定技术、菌种保藏技术。
二、基本原理
1．培养基的配制与灭菌。
培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、鉴定、保存各种微生物或积累代谢产物。在自然界中，微生物种类繁多，营养类型多样，加之实验和研究的目的不同，所以培养基的种类很多。但是，不同种类的培养基中，一般应含有水分、碳源、氮源、能源、无机盐、生长因素等。不同微生物对 pH 要求不一样，霉菌和酵母的培养基的 pH 一般是偏酸性的，而细菌和放线菌的培养基的 pH 一般为中性或微碱性的 ( 嗜碱细菌和嗜酸细菌例外 ) 。所以配制培养基时，都要根据不同微生物的要求将培养基的 pH 调到合适的范围。
此外，由于配制培养的各类营养物质和容器等含有各种微生物，因此，已配制好的培养基必须立即灭菌，如果来不及灭菌，应暂存冰箱内，以防止其中的微生物生长繁殖而消耗养分和改变培养的酸碱度所带来不利的影响。2．微生物的分离与纯化。
自然界中各种微生物混杂生活在一起，要研究某种微生物的特性，首先须使该微生物处于纯培养状态。从混杂的微生物群体中获得只含有某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。土壤是微生物生活的大本营，可以从中分离到很多有价值的菌株。本实验将采用平板划线分离法。
3．分离菌株的鉴定。
微生物的分类鉴定是微生物的重要内容，一般从菌落特征、细菌特点及生理生化、分子生物学等方面进行鉴定。
各种细菌在代谢类型上表现了很大的差异。不同的细菌分解大分子碳水化合物、蛋白质和脂肪的能力不同，所能发酵的类型和最终产物也不一样。
不同细菌对营养的要求不同也说明了它们有不同的合成能力。所有这些都反映了它们是有不同的酶系统。
细菌的这种生化反应的多样性在自然界产生了两种结果：第一、使自然界所有的有机分子都有可能得到分解；第二、使不同细菌之间有了互相作用和互相依赖的基础。另一方面，微生物生化反应是微生物分类鉴定中的重要依据之一，细菌的生化反应的多样性也被人们作为细菌的鉴定和分类方法来利用，可以鉴别一些在形态和其它方面不易区别的微生物。
三、实验器材
1．菌种：
大肠杆菌，金黄色葡萄球菌。
2．培养基：
牛肉膏蛋白胨培养基，马铃薯培养基，固体油脂培养基，固体淀粉培养基，葡萄糖发酵培养基试管，乳糖培养基试管（内装有倒置的德汉氏小管），蛋白胨水培养基，葡萄糖蛋白胨水培养基。
3．溶液和试剂：
50%乙醇，20%的甘油，硝酸银染色液、香柏油、二甲苯、0.01％美兰水溶液，卢戈氏碘液，甲基红指示剂，5%孔雀绿水溶液、0.5%番红水溶液，革兰氏染液，草酸铵结晶紫染液，卢戈式（Lugol）碘液，95%乙醇，番红复染液，香柏油，二甲醇等。
4．土样：
于山东大学中心校区图书馆前光草坪内地表10cm下取得土样。
5．仪器和其他用品：
普通光学显微镜，擦镜纸，酒精灯，载玻片，双层瓶，接种环，试管架，镊子，滴管，二甲苯，香柏油，蒸馏水，盖玻片，吸水纸，无菌平板，无菌试
管，U型玻棒，解剖刀，无菌吸管等。
四、操作步骤
1．培养基的制备与分装。
（1）称量：按培养基配方比例依次准确地称取药品。
（2）熔化：在沸水浴锅中或电炉上加热熔化。
（3）调pH ：用1mol/L NaOH或1mol/L HCl调pH至培养基所需pH。
（4）分装：将溶化的固体培养基趁热加至漏斗上，装试管时，注意管口不要沾上培养基。液体分装装量不超过试管的1/4，固体分装装量不超过试管的1/5，分装三角瓶的量不超过三角瓶容积的一半，半固体分装装量为试管的1/3，灭菌后垂直待凝。
（5）加棉塞：培养基分装完毕后，在试管口或三角瓶口塞上棉塞，以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能，然后包扎一层牛皮纸。试管应先捆成一捆后再于棉塞外包扎牛皮纸，贴上标签，注明培养基名称、日期、组别。
2．无菌水的制备。
（1）用量筒量取90ml水于带玻璃珠三角瓶中，塞上棉塞，包扎牛皮纸。（2）用10ml吸管取9ml水于试管中，塞上棉塞，包扎牛皮纸。
3．器皿的准备。
（1）培养皿的包装：每10套一包，用旧报纸或牛皮纸包扎（或放在特制铁皮圆筒里，加盖扣严）。
（2）吸管的包装：首先在吸管的上端塞上一小段棉花，用长纸条包扎、打结。（3）玻璃涂布棒的包装：方法同吸管的包装。
（4）枪尖的包装：放入枪尖盒，牛皮纸包装。
4．高压灭菌。
（1）将所要灭菌物品放入高压蒸汽灭菌锅内，根据需要设定灭菌温度和时间（一般121℃，20min灭菌，若培养基中含有葡萄糖等成分时，113 ℃，30min 灭菌）。如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入冰箱内暂存。
（2）灭菌完毕，将试管培养基搁成斜面，搁置的斜面长度以不超过试管总长度的一半为宜。培养基冷至50℃左右，倒平板。
5．微生物的分离与纯化。
（1）制备土壤稀释液：称取10g土壤，放入灭好菌的无菌水中用玻璃珠打碎土壤，放置30min以上。然后取10mL土壤原液于1支试管中，再从该试管中取1mL浸液于装有9mL无菌水的试管中，依次操作，分别将土壤浸液稀
释10倍、102倍、103倍、104倍、105倍、106倍，将7支试管按稀释倍数分别记作0，-1，-2，-3，-4，-5，-6号试管。
（2）涂布平板：分别取各稀释度试管中0.2mL浸液于准备好的细菌培养基平板上，用刮刀分别涂布。再分别取各稀释度试管中0.2mL浸液于准备好的霉菌培养基平板上，用刮刀分别涂布。每个稀释度的浸液涂布3个平板。（3）培养：将细菌培养基平板置于37℃恒温箱培养24h，将霉菌培养基平板置于27℃恒温箱培养3d。
（4）平板计数及菌落描述：将培养好的细菌进行平板计数，计算1g土壤中细菌数；并观察其菌落形态特征，记录结果。
（5）平板划线分离：分别将培养好的细菌、霉菌进行平板划线分离。分别在适宜温度培养。
（6）菌种保藏（留作鉴定）：将分离得到的菌种进行斜面保藏。每株菌保存3支斜面。
6．分离菌株的鉴定。
（1）记录菌种的培养特征。
（2）细菌的革兰氏染色，记录菌体特征与染色特性。
<1>制片：制片方法与简单染色相同。
<2>初染：加适量（以刚好覆盖菌为宜）的结晶紫染色液染色1.5min，水洗。
<3>媒染：碘液媒染1min，水洗。
<4>脱色：连续滴加95%乙醇脱色20—30s至流出液无色，立即水洗。
<5>复染：滴加番红复染1.5min，水洗。
<6>镜检：干燥后，油镜镜检观察。
（3）细菌的芽孢染色。
<1>制片：按常规方法涂片、干燥及固定。
<2>加热染色：向载玻片滴加数滴5%孔雀绿水溶液覆盖涂菌部位，用夹子夹
住载玻片在微火上加热染液冒蒸气计时并维持5min，加热时注意补充染
液，切勿让涂片干涸。
<3>脱色：待玻片冷却后，用缓流自来水冲洗至流出水无色为止。
<4>复染：用0.5%番红水溶液复染2min。
<5>水洗：用缓流自来水冲洗至流出水无色为止。
<6>镜检：将载玻片晾干后油镜镜检。
（4）细菌的鞭毛染色。
<1>载玻片制备：将载玻片用洗涤剂清洗干净，置于95%乙醇中浸泡5min，
使用时用镊子取出在火焰上烧去乙醇及可能残留的油迹。
<2>制片：在载玻片一端滴一滴清水，用接种环从斜面培养物种蘸一两下，
再在清水中蘸一两下，然后倾斜玻片，使液体缓慢流向载玻片另一端，
用吸水纸洗去多余液体，自然干燥。
<3>染色：滴加硝酸银染液A液覆盖菌面3~5min后用蒸馏水充分洗去A液。
用硝酸银染液B液洗去残留水分后，再滴加B液覆盖菌面40~50秒，其
间可用微火加热，当菌面出现明显褐色时，立即用蒸馏水冲洗，自然干
燥。
<4>镜检：用油镜镜检观察。
（5）细菌的半固体穿刺试验。
<1>培养基试管的制备：将半固体培养基倒入试管中灭菌后，垂直放置待凝。
<2>接种：将各菌种用接种针分别穿刺接种于半固体培养基中，37℃恒温箱
中培养24h。
<3>观察：观察细菌生长范围并记录，判断细菌是否有运动性。
（6）查伯杰氏手册，初步对细菌菌种进行鉴定。
（7）进行以下细菌的生理生化试验：
<1>淀粉水解试验
①将固体淀粉培养基溶化后冷却至50℃左右，无菌操作制成平板。
②用记号笔在平板底部划成4个部分。
③将选取的各菌分别在不同的部分点一下，在平板的反面分别在4个
部分标明所接种细菌。
④将平板倒置在37℃温箱中培养24h。
⑤观察各种细菌的生长情况，打开平板盖子，滴入少量卢戈氏碘液于
平板中，轻轻旋转平板，使碘液均匀铺满整个平板。
如菌苔周围出现无色透明圈，说明淀粉已被水解，为阳性。根据透
明圈的大小可初步判断该菌水解淀粉能力的强弱，即产生胞外淀粉
酶活力的高低。
<2>油脂水解实验
①将熔化的固体油脂培养基冷却至50℃左右时，充分摇荡，使油脂均
匀分布，无菌操作倒入平板，待凝。
②用记号笔在平板底部划成4部分，分别在4部分标明所接种细菌。
③用无菌操作将选取的各菌分别划十字线接种于平板的相对应部分的
中心。
④将平板倒置，37℃温箱中培养24h。
⑤取出平板，观察菌苔颜色。
如出现红色斑点，说明脂肪水解，为阳性反应。
<3>糖发酵试验
①用记号笔在各试管外壁上分别标明发酵培养基的名称和所接种细
菌。
②取数支葡萄糖发酵培养基试管，分别接入所选菌种，另取一支葡萄
糖发酵培养基试管不接种，作为对照。取数支乳糖发酵培养基试管，
同样分别接入所选菌种，另取一支乳糖发酵培养基试管不接种，作
为对照。
在接种后，轻缓摇动试管，使其均匀，防止倒置的小管进入气泡。
③将接过种和作为对照的试管均置37℃中培养24~48h。
④观察各试管颜色变化及德汉氏小管中有无气泡。
<4>吲哚试验
①将所选菌种分别接入数支蛋白胨水培养基中，置37℃培养48h。
②向培养基内加入3~4滴乙醚，摇动数次，静置1min，待乙醚上升后，
沿试管壁徐徐加入2滴吲哚试剂。在乙醚和培养物之间产生红色环
状物为阳性反应。
<5>甲基红试验
①将所选菌种分别接入数支葡萄糖蛋白胨水培养基中，置37℃培养
48h。
②将1支葡萄糖蛋白胨水培养基培养物内加入甲基红试剂2滴，培养
基变为红色者为阳性，变为黄色者为阴性。
（8）霉菌的形态观察。
<1>培养小室的灭菌：在平皿皿底铺一张略小于皿底的圆滤纸片，再放一U
形玻棒，其上放一洁净载玻片和两块盖玻片，盖上皿盖、包扎后于110℃
灭菌20~30min，烘干备用。
<2>琼脂块制备：通过无菌操作，用解剖刀由马铃薯琼脂薄层平板上切下1cm2
左右的琼脂块，将其移至培养小室的载玻片上，每片两块。
<3>接种：通过无菌操作，用接种针分别从各霉菌马铃薯琼脂平板培养物中
挑取很少量孢子，接种于小室中琼脂块边缘上，将盖玻片覆盖在琼脂块
上。
<4>培养：通过无菌操作，在培养小室中圆滤纸片上加3~5mL灭菌的20%甘
油（用于保持湿度），盖上皿盖，于28℃培养7天。
<5>镜检：取出载玻片用低倍镜和高倍镜镜检。
（9）对照霉菌图谱，对霉菌菌种进行鉴定。
五、实验结果
1．细菌的平板计数：
【表1 】细菌的平板计数结果
1g土壤中细菌数：6.7×106个
2．细菌的形态观察：
【表2 】细菌菌落的形态特征记录
3．细菌的染色半固体穿刺实验结果
（1）表格：【表3】细菌的染色半固体穿刺实验结果记录
（2）图片：细菌的染色实验结果
<1>革兰氏染色
【图1】 1号菌革兰氏染色（10×100）【图2】 2号菌革兰氏染色（10×100）
【图3】3号菌革兰氏染色（10×100）【图4】4号革兰氏染色（10×100）
【图5】5号菌革兰氏染色（10×100）【图6】金黄色葡萄球菌革兰氏染色（10×100）
【图7】大肠杆菌革兰氏染色（10×100）
【图8】1号菌芽孢染色（10×100）【图9】2号菌芽孢染色（10×100）
【图10】3号菌芽孢染色（10×100）【图11】4号菌芽孢染色（10×100）
【图12】5号菌芽孢染色（10×100）
【图13】1号菌鞭毛染色（10×100）【图14】2号菌鞭毛染色（10×100无鞭毛）
【图15】3号菌鞭毛染色（10×100无鞭毛）【图16】4号菌鞭毛染色（10×100）
【图17】5号菌鞭毛染色（10×100）
查伯杰氏手册得知，各菌所属类群如下：【表4】各菌所属类群
4．细菌的生理生化试验：
【表5 】细菌的生理生化试验结果记录
（注：“+”表示在淀粉水解试验、油脂水解试验、甲基红试验、吲哚试验中呈阳性以及在葡萄糖发酵试验、乳糖发酵试验中产酸或产气；“-”表示在淀粉水解试验、油脂水解试验、甲基红试验、吲哚试验中呈阴性以及在葡萄糖发酵试验、乳糖发酵试验中不产酸不产气）
5.霉菌的形态观察：
（1）形态特征：
【表6】霉菌形态特征
（2）图片：
【图18】1号霉菌（10×40）【图19】2号霉菌（10×40）
【图20】1号霉菌孢子梗【图21】2号霉菌孢子梗
（3）对照霉菌图谱，得知：1号菌和2号菌均属于青霉属。
六、附：本实验用到的各种培养基配方。
（注：半固体培养基中琼脂用量减半）
1.牛肉膏蛋白胨培养基
牛肉膏 1.5g
蛋白胨 5g
NaCl 2.5g
琼脂 10g
水 500mL
pH 7.0~7.2
121°C灭菌20min
2.马铃薯培养基
马铃薯 200g
蔗糖（或葡萄糖） 20g
琼脂 22~25g
水 1000mL
pH 自然
马铃薯去皮，切成块煮沸半小时，然后用纱布过滤，再加糖及琼脂，溶
化后补足水至1000mL。110℃灭菌30min。
3.固体油脂培养基
蛋白胨 10g
牛肉膏 5g
NaCl 5g
香油或花生油 10g
1.6%中性红水溶液 1mL
琼脂 15~20g
蒸馏水 1000mL
pH 7.2
121℃灭菌20min。
注：（1）不能使用变质油。
（2）油和琼脂及水先加热。
（3）调好pH后再加入中性红。
（4）分装时，需不断搅拌，使油均匀分布于培养基中。
4.固体淀粉培养基
蛋白胨 10g
NaCl 5g
牛肉膏 5g
可溶性淀粉 2g
蒸馏水 1000mL
琼脂 15~20g
121℃灭菌20min。
5.葡萄糖发酵培养基试管
蛋白胨 10g
NaCl 5g
葡萄糖 12.5g
1.6%溴甲酚紫乙醇溶液 1~2mL
蒸馏水 1000mL
pH 7.6
110℃灭菌30min。
6.乳糖培养基
蛋白胨 10g
NaCl 5g
乳糖 12.5g
1.6%溴甲酚紫乙醇溶液 1~2mL
蒸馏水 1000mL
pH 7.6
110℃灭菌30min。
7.蛋白胨水培养基
蛋白胨 10g
NaCl 5g
蒸馏水 1000mL
pH 7.6
121℃灭菌20min。
8.葡萄糖蛋白胨水培养基
蛋白胨 5g
葡萄糖 5g
K 2HPO
4
2g
蒸馏水 1000mL
将上述各成分溶于1000mL水中，调pH 7.0~7.2，过滤。分装试管，每
管10mL，112℃灭菌30min。
七、参考资料
1.《伯杰细菌鉴定手册》第八版，R.E.布坎南、N.E.吉本斯等编，科学出版社。
2.《微生物学实验》第4版，沈萍、陈向东主编，高等教育出版社。
3.霉菌图谱
土壤微生物的分离纯化与鉴定
土壤微生物的分离纯化 与鉴定 Company number：【0089WT-8898YT-W8CCB-BUUT-202108】
目录
摘要 利用分离纯化微生物的基本操作技术以及选择培养基对土壤中的微生物进行分离与纯化，得到能够产生果胶水解酶的细菌以及能够分解几丁质的霉菌。根据菌落形态观察，革兰氏染色结果，芽孢有无及位置，运动性以及一系列的生理生化试验的结果，对照种属特征初步鉴定分离纯化的微生物所属的类群。 关键词 土壤微生物、细菌、果胶、霉菌、几丁质、划线分离、纯培养 前言 在自然条件下，微生物常常在各种生态系统中群居杂聚。群落是不同种类微物的混和体。为了生产和科研的需要，人们往往需要从自然界混杂的微生物群体中分离出具有特殊功能的纯种微生物；或重新分离被其他微生物污染或因自发突变而丧失原有优良性状的菌株；或通过诱变及遗传改造后选出优良性状的突变株及重组株。这种获得单一菌株纯培养的方法称为微生物的分离纯化技术。纯培养是指一株菌种或一个培养物中所有的细胞或孢子都是由一个细胞分裂、繁殖而产生的后代。 分离纯化技术主要由采集样品、富集培养、纯种分离和性能测定等几个基本环节组成。 实验目的 1.学习利用选择培养基从土壤中分离能够产生特殊水解酶的细菌以及霉菌的 方法； 2.学习运用划线分离法纯化分得的细菌以及真菌的方法； 3.学习测定土壤中细菌数目，种类的方法； 4.根据菌落形态，染色结果，运动性以及生理生化试验鉴定未知细菌；小室 培养法观察鉴定未知真菌。
实验原理 一、经典分类鉴定方法 以上便是在微生物鉴定过程中的经典思路及流程，因此我们可以针对以上各项指标设计一系列试验包括形态学观察，染色，生理生化试验，免疫学试验等对其进行逐步定位。 二、现代分类鉴定方法 1．微生物遗传型的鉴定 （1） DNA碱基比例的测定（G+C）mol%以下为该方法的关键因素： *解链温度法（Tm值） *(G+C)mol%值只能做否定判断； *（G+C）mol%值差别>5，属不同的种； 差别>10，属不同的属。 （2）核酸分子杂交法 *DNA-DNA分子杂交原理：DNA分子解链的可逆性和碱基配对的专 一性。 结论： I DNA同源性≥ 60% （同种） II DNA同源性≥ 70% （同亚种） III DNA同源性60~ 70% （不同亚种） IV DNA同源性20~ 60% （同属） （3）16s rRNA作为细菌进化的计时器 本次实验中由于实验性质以及仪器试剂限制，主要以微生物形态鉴定以及生理生化指标鉴定为主。 实验整体思路： 在确定取样环境之后，对微生物原样进行梯度稀释，产生合适的浓度在选择培养基上进行涂板用于微生物的选择与计数； 通过检测得到有特定功能的细菌以及霉菌进行菌种的分离纯化，用平板划线法多次划线得到纯种；
从土壤中分离分解纤维素的微生物
从土壤中分离分解纤维素的微生物 实验目的 1、利用特定的选择培养基和鉴定培养基从土壤中分离分解纤维素的微生物； 2、掌握刚果红染色的机理和操作。 实验原理 1、以纤维素喂唯一碳源的选择培养基能选择分离分解纤维素的微生物； 2、刚果红可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，而不与水解后的纤维二塘和葡萄糖发生这种反应。 实验仪器与用具 除实验五中用到的外，还需要恒温振荡培养箱 实验材料和试剂 取自湿地或原生林地的土样（大于20g） 羧甲基纤维素钠，酵母粉，磷酸二氢钾，蛋白胨，琼脂粉，氯化钠，刚果红，硝酸钠，硫酸亚铁，硫酸镁，磷酸氢二钠，纤维素粉，蔗糖（也可以用廉价的秸秆磨成粉末代替纤维素粉） 实验步骤 将称量好的0.1g蔗糖，0.002g硫酸亚铁，0.1g硫酸镁，0.2g磷酸氢二钠，0.2g硝酸钠，2g纤维素粉（秸秆粉）倒入500ml锥形瓶内，再加入200ml蒸馏水，给锥形瓶封口，充分振荡摇匀，得选择培养基，备用。
讲称量好的1.5g羧甲基纤维素钠，0.2g蛋白胨，0.1g酵母粉，0.25g 氯化钠，0.2g磷酸二氢钾，0.1g硫酸镁，4g琼脂粉加入另一个500ml 锥形瓶内，再加入200ml蒸馏水，给锥形瓶封口，充分振荡摇匀，得鉴定培养基，备用。 用5ml微量可调移液器向编号为1--5号的试管内分别加入9ml蒸馏水，塞上棉塞，备用。 讲配制好的选择培养基，鉴定培养基，5支装有蒸馏水的试管，包好的培养皿（最少9个），枪头放入灭菌锅内在121度下灭菌20min。灭菌后，取出灭菌锅内物品，放入超净台内，用酒精棉球擦拭超净台面和实验者的双手，点燃酒精灯，在酒精灯火焰附近将称量好的20g 土样加入到选择培养基中，给锥形瓶封口，充分振荡摇匀。 将选择培养基放入恒温振荡培养箱内培养48h（震动培养箱转速为200r/min，控制温度为30度）。 等鉴定培养基冷却到不烫手时，在超净台内酒精灯火焰附近往每个培养皿内倒入20ml左右鉴定培养基，在超净台面轻轻摇匀，熄灭酒精灯，等培养基凝固后，将培养基平板倒置于超净台上。 48h后从恒温振荡培养箱中取出选择培养基，置于超净台上点燃酒精灯，再用1ml微量可调移液器移取1ml选择培养基的菌液到1号试管内，得到稀释10-1的稀释液，并用此方法依次稀释10倍，在5号试管内得到10-5的菌液稀释液，再用1ml微量可调移液器移取3号试管中的菌液，滴加2滴到平板上，用涂布器在平板上均匀涂布（注意
微生物菌种的分离和纯化方法
从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。在分子生物学的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”，防止其他微生物的混入。 1、用固体培养基分离和纯化 单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体，称为菌落。当固体培养基表面众多菌落连成一片时，便成为菌苔。不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征，可以成为对该微生物进行分类、鉴定的重要依据。大多数细菌、酵母菌、以及许多真菌和单细胞藻类能在固体培养基上形成孤立的菌落，采用适宜的平板分离法很容易得到纯培养。所谓平板，即培养平板的简称，它是指固体培养基倒入无菌平皿，冷却凝固后，盛固体培养基的平皿。这方法包括将单个微生物分离和固定在固体培养基表面或里面。固体培养基用琼脂或其它凝胶物质固化的培养基，每个孤立的活微生物体生长、繁殖形成菌落，形成的菌落便于移植。最常用的分离、培养微生物的固体培养基是琼脂固体培养基平板。这种由Kock建立的采用平板分离微生物纯培养的技术简便易行，100多年来一直是各种菌种分离的最常用手段。1.1 稀释倒平板法 首先把微生物悬液作一系列的稀释（如1:10、1:100、1:1000、1:10000），然后分别取不同稀释液少许，与已熔化并冷却至50℃左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平板，保温培养一定时间即可出现菌落。如果稀释得当，在平板表面或琼脂培养基中就可出现分散的单个菌落，这个菌落可能就是由一个细菌细胞繁殖形成的。随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。 1.2 涂布平板法 因为将微生物悬液先加到较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究中常用的纯种分离方法是涂布平板法。其做法是先将已熔化的培养基倒入无菌平皿，
微生物的分离和纯化
实验十四微生物的分离和纯化 一、目的要求 掌握倒平板的方法和几种分离纯化微生物的基本操作技术。 二、基本原理 在土壤、水、空气或人及动、植物体中，不同种类的微生物绝大多数都是混杂生活在一起，当我们希望获得某一种微生物时，就必须从混杂的微生物类群中分离它，以得到只含有这一种微生物的纯培养，这种获得纯培养的方法称为微生物的分离与纯化。 为了获得某种微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧等条件要求不同，而供给它适宜的培养条件，或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长，而抑制其他菌生长的环境，从而淘汰其他一些不需要的微生物，再用稀释涂布平板法或稀释混合平板法或平板划线分离法等分离、纯化该微生物，直至得到纯菌株。 土壤是微生物生活的大本营，在这里生活的微生物无论是数量和种类都是极其多样的，因此，土壤是我们开发利用微生物资源的重要基地，可以从其中分离、纯化到许多有用的菌株。 三、器材 高氏1号琼脂培养基，肉膏蛋白胨琼脂培养基，马丁氏琼脂培养基，盛9ml无菌水的试管，盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶，无菌玻璃涂棒，无菌吸管，接种环，10％酚，无菌培养皿，链霉素，土样等。 四、操作步骤 1．稀释涂布平板法 （1）倒平板将肉膏蛋白胨培养基、高氏1号琼脂培养基、马丁氏琼脂培养基溶化，待冷至55—60℃时，向高氏1号琼脂培养基中加入10％酚数滴，向马丁氏培养基中加入链霉素溶液，使每毫升培养基中含链霉素30μg。然后分别倒平板，每种培养基倒三皿，其方法是右手持盛培养基的试管或三角烧瓶，置火焰旁边，左手拿平皿并松动试管塞或瓶塞，用手掌边缘和小指、无名指夹住拔出，如果试管内或三角烧瓶内的培养基一次可用完，则管塞或瓶塞不必夹在手指中。试管（瓶）口在火焰上灭菌，然后左手将培养皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基约15ml，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布，平置于桌面上，待凝后即成平板。也可将平皿放在火焰附近的桌面上，用左手的食指和中指夹住管塞并打开培养皿，再注入培养基，摇匀后制成平板，如图Ⅶ-1所示。最好是将平板放室温2—3天，或 37℃培养24小时，检查无菌落及皿盖无冷凝水后再使用。 （2）制备土壤稀释液称取土样10g，放入盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，振摇约20分钟，使土样与水充分混合，将菌分散。用一支1ml无菌吸管从中吸取1ml土壤悬液注入盛有9ml无菌水的试管中，吹吸三次，使充分混匀。然后再用一支1ml无菌吸管从
微生物--土壤放线菌的分离与鉴定
土壤放线菌的分离与鉴定实验设计报告 学院：生命科学学院 班级： 2013级生科2班 组长：刘瑜 2013506076 组员：汤界世 2013506070 李宇秀 2013506071 于淑婷 2013506075 陈洁作 2013506079
郑国梁 2013506083 2015年10月15日 一、实验目的 1、了解采集土样的要求和方法。 2、掌握由土壤中分离稀有放线菌的基本原理和操作技术。 3、学习并掌握土壤稀释法和微生物的纯培养技术。 4、学习并掌握抗生菌的鉴别方法。 二、实验原理 土壤是微生物的大本营，其中的放线菌多以链霉菌为主，因此人们通常将除链霉菌以外的其它放线菌统称为稀有放线菌。一般地，放线菌在比较干燥、偏碱性、含有机质丰富的土壤中数量居多。若以常规方法进行分离，得到的几乎全部是链霉菌。然而，当采用加热处理土样、选用特殊培养基或添加某种抗生素等方法时，均可提高稀有放线菌的获得率。由土壤中分离放线菌的方法很多，其中包括稀释法、弹土法、混土法和喷土法等，本实验主要采用稀释法，并通过选用特
殊培养基的方法，来获得放线菌。
放线菌菌丝由基内菌丝，气生菌丝和孢子丝组成。其菌丝体在培养基内，即基内菌丝或称营养菌丝体。基内菌丝体一般没有横隔，由于菌丝体长入培养基内和培养基表面，并纠缠在一起形成密集的菌落，所以用接种针将整个菌落培养基挑起而不破裂。基内菌丝体大部分呈黄、橙、蓝、紫、绿、徽，但也有无色在显微镜下观察时，气生菌丝体颜色较深，且较基内菌丝体粗两倍左右。气生菌丝体发育到一定阶段，在它上面形成孢子丝。孢子丝形状有直、波曲、螺旋、轮生之分。螺旋有松、紧、大、小之分，其螺旋的方向也有左旋与右旋之分，大多数种为左旋，少数为右旋。孢子具有不同的形状，有球形、椭球形、杆状、柱状，在光学显微镜下就能看清楚。根据菌体基内菌丝，气生菌丝和孢子丝的这些特征即可判断出分离出的菌体为放线菌。 三、实验材料试剂与仪器设备 1、材料：土壤样品（采集生科院门前草地土壤、16号楼内花圃土壤各500g） 2、试剂：1）培养基（高氏一号培养基）：可溶性淀粉（20.0g）、硝酸钾（1.0g）、磷酸氢二钾（0.5g）、硫酸镁（0.5g）、氯化钠（0.5g）、硫酸亚铁（0.01g）、水1000ml、pH7.2-7.4
模板土壤微生物的分离培养技术实验报告.doc
重庆大学研究生专业实验教学 实验报告书 实验课程名称： 实验指导教师： 学院： 专业及类别： 学号： 姓名： 实验日期： 成绩： 重庆大学研究生院制
一、实验目的 1、了解分离与纯化微生物的基本原理及方法； 2、了解倒平板配制土豆培养基的方法与平板划线分离的基本操作技术；； 3、学习平板菌落计数的基本原理和方法，并掌握其基本技能； 4、初步观察来自土壤中的几类微生物的菌落形态特征，并能判断菌的类型。 二、实验原理 1、培养基的种类 培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、鉴别、保存各种微生物或积累代谢产物。一般的培养基应包含适合微生物生长的6大营养素即水分、碳源、氮源、能源、无机盐和生长因子。培养基的种类很多，根据培养成分的不同可分为天然培养基、合成培养基与半合成培养基；根据物理状态的不同又可分为液体培养基和固体培养基。微生物的分离、纯化、记数等方面的研究常常使用的就是固体培养基。本实验就是使用的固体培养基。 已配制好的培养基必须立即灭菌，如来不及灭菌，应暂存冰箱，以防止其中微生物生长繁殖而消耗养分和改变培养基酸碱度所带来不利影响。 培养基的原材料来源十分广泛，本实验采用的原材料为土豆。 2、接种方法与无菌接种 将微生物的培养物或含有微生物的样品移植到培养基上的操作技术称之为接种。接种是微生物实验及科学研究中的一项最基本的操作技术。接种的关键是要严格的进行无菌操作。微生物的接种方法很多，划线接种、三点接种、穿刺接种、混浇接种与涂布接种是几种常用的接种方法。 划线接种是最常用的接种方法，即在固体培养基表面作来回直线形的移动，就可以达到接种的目的。常用的接种工具为接种环、针等。在斜面接种和平板划线中就常用此法。
大学土壤微生物分离实验报告
从土壤中分离纯化培养微生物并作初步观察鉴定 【摘要】利用分离纯化微生物的基本操作技术对土壤中的微生物进行分离与纯化，根据细菌在选择培养基的存活情况，确定该菌种的固氮解磷解钾属性。 【关键词】细菌芽孢杆菌培养基、选择培养基的配制高压蒸汽灭菌 前言： 在自然条件下，微生物常常在各种生态系统中群居杂聚。群落是不同种类微物的混和体。为了生产和科研的需要，人们往往需要从自然界混杂的微生物群体中分离出具有特殊功能的纯种微生物；或重新分离被其他微生物污染或因自发突变而丧失原有优良性状的菌株；或通过诱变及遗传改造后选出优良性状的突变株及重组株。这种获得单一菌株纯培养的方法称为微生物的分离纯化技术。 分离纯化技术主要由采集样品、富集培养、纯种分离和性能测定等几个基本环节组成。 实验目的： 1、学习从土壤中分离、纯化微生物的原理与方法。 2、学习、掌握微生物的鉴定方法。 3、对提取的土样进行微生物选择培养、分离、纯化，根据菌落的存活状况来判断未知 菌的属性。 实验原理： 菌种来源:选择无机磷农药含量较高的土壤,有机磷农药化工厂 旁边的土壤和排污口区的污水. 培养基的选取：五组选择培养基，分别以辛硫磷、甲胺磷、敌敌畏、草甘膦及五种有机磷农药混合为微生物生长的唯一氮源磷源。 分离纯化微生物：稀释倒平板法、涂布平板法、稀释摇管法、平板划线分离法。 此次实验采取的是平板分离法，该方法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化，其基本原理主要包括两个方面：（一）选择适合于待分离微生物的生长条件或加入某种抑制剂造成只利于待分离微生物生长，而抑制其它微生物生长的环境，从而淘汰大部
分不需要的微生物。（二）微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个细胞繁殖而成的集合体，因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。获得单菌落的方法可通过稀释涂布平板法或平板划线法等技术来完成。 微生物的观察可以用显微镜观察其细胞形态，也可以用肉眼观察其菌落形态。前者是微生物的显微镜观察技术，后者是微生物的肉眼观察技术。 1. 实验器材、试剂与实验方法： 1.1器材： 试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、天平、牛角匙、pH试纸、棉花、牛皮纸、记号笔、线绳、纱布、培养皿、自动立式压力蒸汽灭菌器、烘箱、玻璃珠、移液枪、枪头、称量纸、药匙、试管架、接种环、酒精灯、超净工作台, 粉碎机，接种环，移液枪配枪头。 1.2试剂： 牛肉膏、蛋白胨、琼脂、可溶性淀粉、葡萄糖、1mol/L NaOH、1mol/LHCl、NaCl、95%乙醇、75%酒精，草甘膦，甲甘磷，敌敌畏，辛硫磷。 1.3土样、样品： 取自二十三冶草莓园的土壤，建设北路的大棚蔬菜菜地土壤，化工厂污水口。 1.4 实验方法 1.4.1配制培养基： (一）配制牛肉膏蛋白胨琼脂培养基200ml(用2个100ml三角瓶和2支试管分装）牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普遍的细菌基础培养基。 配方如下：牛肉膏 0.6g 蛋白胨 2g NaCl 1g 琼脂 3~4g 水 200ml pH 7.4-7.6 1、称药品按实际用量计算后，按配方称取各种药品放入大烧杯中。牛肉膏和蛋白 胨可分别放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶解后倒入大烧杯。蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。 2、加热溶解在烧杯中加入少于所需的水量，然后放在石棉网上，小火加热，并用 玻璃棒搅拌，待药品完全溶解后再补充水分至所需量。若配制固体培养基，则将称好的琼脂放入已溶解的药品中，再加热融化，在此过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，最后补充所失水分。 3、调pH 用pH试纸或酸碱度计检测培养基的pH值，若pH偏酸，可滴加1mol/L NaoH， 边加边搅拌，并随时检测，直至达到所需pH范围。若偏碱，则用１mol/l HCL进行调节。 pH调节通常放在加琼脂之前。注意pH值不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的
土壤微生物的分离、培养、鉴定及菌落数的测定
吉林化工学院 科技性论文 题目：土壤微生物的分离、培养、鉴定及菌落数的 测定 学号：12130117 姓名：张金磊 年级：2012级 学院：化工与生物技术学院 专业：生物工程 指导教师：谢莹，许崇利（讲师） 完成日期：2014年3月20 日
摘要 土壤是矿物质、有机质和活的有机体以及水分和空气等的混合体。按重量计，矿物质占到固相部分（土壤干重）的90~95%或更多，有机质约占1~10%，可见土壤成分以矿物质为主。土壤有机质就是土壤中以各种形态存在的有机化合物。除此之外还有土壤溶液，它是土壤水分及其所含的溶解物质和悬浮物质的总称。土壤溶液是植物和微生物从土壤中吸收营养物的媒介。土壤微生物就是土壤中主要的有机生命体，土壤微生物是指生活在土壤中的细菌、真菌、放线菌、藻类的总称。其个体微小，一般以微米或毫微米来计算，通常1克土壤中有106～109个，其种类和数量随成土环境及其土层深度的不同而变化。它们在土壤中进行氧化、硝化、氨化、固氮、硫化等过程，促进土壤有机质的分解和养分的转化。 本次实验是研究土壤中细菌、真菌、放线菌的数目。我们利用选择培养基，以便在土壤水溶液中选出目的菌种，在用分浓度梯度法在选择培养基上培养出但菌落，以便计数。计数时可以根据不同菌种的不同形态学特征来分辨，如果出现与上述三种以外特性的菌种可以用革兰氏染色鉴别。 关键词：土壤微生物选择培养计数
Abstract Soil is a mixture of minerals, organic matter and living organisms as well as water and air. By weight, for solid mineral (soil dry weight) of 90~95% or more, organic matter accounted for about 1~10%, visible in mineral soil composition. Organic compounds in soil organic matter is the soil in various forms. In addition to the soil solution, it is the floorboard of soil moisture and the contained dissolved substances and suspended substances. Soil solution is to absorb the nutrients in plants and microorganisms in soil medium. Organic life is the main soil microorganism, soil microbial refers to live in soil bacteria, fungi, actinomycetes, algae. The individual small, general with micron or nanometer to calculate, usually 1 grams of soil in 106 ~ 109, its species and quantity as soil environment and soil depth varies. They are oxidation, nitration, ammoniation, nitrogen fixation, curing process in the soil, promote the transformation of soil organic matter decomposition and nutrient. This experiment is to study the number of soil bacteria, fungi, actinomycetes. We use the selective culture medium, in order to choose to bacteria in the soil solution in the culture medium, but colonies on selection by density gradient method,
土壤中微生物的分离纯化(电子版实验报告)
微生物实验报告 土壤中微生物的分离与纯化 指导教师：李海花 周四晚第四组 实验成员: 杜玉琪180112010009 董天涵180112010008 蒋怡菲180112010018 逄颖180112010035
【摘要】利用分离纯化微生物的基本操作技术对土壤中的微生物进行分离和 纯化，通过观察微生物的菌落形态特征判断菌的类型并通过平板划线进行分离纯化 【关键词】土壤、微生物、菌落观察、分离纯化 1.实验目的 （1）通过对几种培养基的配制，掌握配制培养基的一般方法和步骤。 （2）掌握倒平板的方法、接种和无菌操作技术。 （3）初步观察来自土壤中的几类微生物的菌落形态特征，并能判断菌的类型。（4）学习平板菌落计数的基本原理和方法，并掌握其基本技能。 2.实验原理 （1）培养基的配制与灭菌 培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、鉴别、保存各种微生物或积累代谢产物。一般的培养基应包含适合微生物生长的6大营养素即水分、碳源、氮源、能源、无机盐和生长因子。不同微生物对pH要求不一样，霉菌和酵母菌的培养基的pH一般是偏酸的，而细菌和放线菌培养基的pH一般为中性或微碱性。所以配制培养基时还要根据不同微生物的要求将培养基的pH调到合适的范围。已配制好的培养基必须立即灭菌，如来不及灭菌，应暂存冰箱，以防止其中微生物生长繁殖而消耗养分和改变培养基酸碱度所带来不利影响。 （2）微生物的培养及鉴定 接种：将微生物的培养物或含有微生物的样品移植到培养基上的操作技术称之为接种。接种是微生物实验及科学研究中的一项最基本的操作技术。接种的关键是要严格的进行无菌操作。 鉴定：常见与常用的微生物中,根据它们的主要形态可分为细菌、放线菌、酵母菌和霉菌四大类。细菌菌落光滑，易于基质脱离；放线菌菌落质地致密，菌落较小，广泛延伸；酵母菌菌落较细菌菌落大而厚；霉菌形成的菌落较稀松，多成绒毛状，絮状。 （3）平板分离与活菌计数 倒平板：按稀释涂布平板法倒平板，并用记号笔标明培养基名称、土样编号和实验日期等。 划线：在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，菌种在平板上划线。通过划线将样品在平板上稀释，培养后能形成单独的菌落。平板计数法是将测菌液经适当稀释，涂布在平板上，经过培养后在平板上形成肉眼可见的菌落。统计并记录菌落数。 （4）细菌的分离与纯化 为了得到单一菌种，要对培养的菌分离和纯化。用接种环挑起培养基里少量菌在无菌条件下接种到新的培养基上，划线，继续进行培养，从而得到新的单一菌落。 3.实验器材 （1）器材： 培养皿、载玻片、量筒、滴管、吸水纸、烧杯、三角瓶、酒精灯、玻璃棒、接种
土壤微生物数量测定方法整理
土壤微生物的分离鉴定及数量测定 （一）培养基的制备 Ⅰ测定微生物总量培养基： 1. 细菌培养基（牛肉膏蛋白胨琼脂培养基） 牛肉膏Beefextract 5.0g 蛋白胨Peptone 10.0g NaCI 5.0g 蒸馏水H20 1000m1 琼脂15～20g PH 7.2~7.4 制备步骤： ⑴在100 mL小烧杯中称取牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，加50 mL蒸馏水，置电炉搅拌加热至牛肉膏，蛋白胨完全溶解. ⑵向小铝锅中加入500 mL蒸馏水，将溶解的牛肉膏，蛋白胨倒入铝锅中并用自来水洗2～3次.加入 5.0gNaC1，在电炉上边加热边搅拌. ⑶加入洗净的琼脂条，继续搅拌，加热至琼脂完全熔化，补足水量至1000 mL. ⑷用NaOH或HC1调至pH7.0. 用酸度计或用玻棒沾少许液体用精密pH试纸测定其pH值，并用10％NaOH 调至所需pH值，必要时用滤纸或脱脂棉过滤。一般比要求的pH高出0.2，因为高压蒸汽灭菌后，pH常降低。 ⑸根据不同需要，可将配好的培养基分装入配有棉塞的试管或三角瓶内。注意分装时避免培养基挂在瓶口或管口上引起杂菌污染。如液体培养基，应装试管高度的1/4左右；固体培养基装试管高度的1/5左右；装入三角瓶的量以三角瓶容量的一半为限。，塞好棉塞，装入小铁丝筐，然后用旧报纸将棉塞部分包好. 标签表明培养基的名称、配制日期等。 ⑹高压蒸汽灭菌，用0.1Mpa（15lb/in2）121℃灭菌（15-20）30min. 2. 放线菌培养基（改良高氏1号琼脂培养基） 可溶性淀粉20g KNO3 1g K2HPO40.5g MgSO4? 7H2O 0.5g NaCl 0.5g原0.05g FeSO4? 7H2O 0.01g pH 7.2-7.4 制备步骤： （1）计算根据配方计算各种药品所需要的量，然后再分别称量。 （2）称量准确称量各种成分。 （3）溶化配制时，先用少量冷水将淀粉调成糊状，倒入少许沸水中，在火上加热，边搅拌边依次逐一溶化其他成分，溶化后，补足水分到1000ml，调PH（可不调）。 （4）分装、包扎、灭菌。
土壤微生物的分离和纯化
土壤微生物的分离和纯化 一、实验目的 1、掌握从土壤中分离、纯化微生物的原理与方法。 2、学会根据微生物培养特征初步判断未知菌的类别。 3、练习微生物接种、移植和培养的基本技术，掌握无菌操作技术。 二、实验原理 土壤是微生物生长和栖息的良好基地。土壤具有绝大多数微生物生活所需的各种条件，是自然界微生物生长繁殖的良好基地。因此，土壤是微生物资源的巨大宝库。 牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，可用于培养细菌。链霉素可以抑制细菌和放线菌的生长，对酵母菌和霉菌不起作用。加入一定量链霉素的培养基可以从混杂的微生物群体中分离出酵母菌和霉菌。重铬酸钾或苯酚对土壤真菌、细菌有明显的抑制作用，可用于选择分离放线菌。 三、实验器材 1、材料：10cm左右深层土壤。 2、培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、马丁氏培养基、高氏Ⅰ号培养基 3、其他物品：试管、三角瓶、烧杯、量筒、电子天平、精密pH试纸、培养皿、高压蒸汽灭菌锅、移液枪、枪头、接种环、酒精灯、链霉素(1万单位/ml) 、10%苯酚、无菌水。 四、实验步骤 1、土样采集：取10cm左右深层土壤10g备用。 2、制备土壤稀释液：称取土壤1g，放入有99mL无菌水的三角瓶中，振荡均匀，即为稀释10－2的土壤悬液。然后进行十倍梯度稀释，依次制备10－ 3、10－ 4、10－ 5、10－ 6、10－7 稀释度的土壤稀释液。 3、培养基平板制备：按培养基配方各配置牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、马丁氏培养基、高氏Ⅰ号培养基各100ml。灭菌后分别倒3个平板。（高氏Ⅰ号培养基灭菌前加入10滴10%苯酚；马丁氏培养基倒平板前加入2ml去氧胆酸钠(2%)和0.4ml 1万单位/ml链霉素） 4、接种：用无菌吸管吸取0.1ml相应浓度土壤稀释液，以无菌操作技术接种在平板上，涂布均匀。细菌选用10－4、10－ 5、10－6 三个稀释度接种于牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，放线菌与霉菌选用10－2 、10－3、10－4三个稀释度，分别接种于高氏Ⅰ号培养基、马丁氏培养基。（一个稀释度一个平板） 5、培养：细菌平板于37℃恒温培养1～2d，放线菌于30℃培养2～3d，霉菌于30℃培养3～5d ，观察。 6、计数：用稀释水样检测平板的菌落计数方法进行计数，报告细菌总数/(CFU·ml-1) 7、纯化：挑取典型菌落接种于相应平板，培养条件同上，培养纯化。 五、思考题
土壤微生物的分离鉴定
土壤微生物的分离鉴定 实验报告 09级生科一班（周一下午组） 安明玉 同组者：陈汶灿、程彬、陈肖然、高琳璐、秦瑶 一、实验摘要 利用分离纯化微生物的基本操作技术对土壤中的微生物进行分离与纯化，根据菌落形态观察、染色鉴定以及一系列的生理生化试验的结果通过查阅《伯杰氏系统细菌学手册》对照种属特征最终判断所分离纯化的细菌所属的属。 二、实验目的 1.学会设计实验方案，分离目的菌，并通过后续实验做出初步鉴定。掌握倒平板和几种常用的分离纯化微生物的基本操作技术。 2.巩固练习显微镜使用方法。 3.明确培养基的配制原理，复习配制培养基及消毒灭菌的一般原理和操作步骤。 4.复习掌握细菌稀释分离和划线分离技术，平板倾注法和斜面接种技术，了解培养细菌的培养条件和培养时间，复习平板菌落计数法。 5.复习掌握细菌的简单染色、鞭毛染色、革兰氏染色的基本原理和操作方法。 6.学习并掌握过氧化氢酶测定、细胞色素氧化酶测定和糖发酵与氧化试验的实验原理及其操作方法。 三、实验原理 1.对土壤中微生物的分离筛选及鉴定 从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程成为微生物的分离与纯化，常用的方法有简易的细胞挑取法和平板分离法。 本实验采用平板分离法，该方法操作简单，普遍用于微生物的分离与纯化，其原理包括以下两个方面： (1)在适合于待分离微生物的生长条件（如营养、酸碱度、温度与氧等）下培养微生物，或加入某种抑制剂形成只利于待分离微生物的生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物； (2)微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个细胞繁殖而成的集合体，因此可通过挑取单菌落而获得纯培养，获得单菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等方法完成。 但是从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。因此，纯培养的确定除观察其菌落的特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定。有的微生物的纯培养要经过一系列分离与纯化过程和多种特征鉴定才能得到。 土壤是微生物生活的大本营，它所含有的微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。土壤是微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地，可以从中分离纯化得到许多有价值的微生物菌株。 2. 显微镜的使用及细胞的简单染色和革兰氏染色 现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，故又常称为复试显微镜。 在显微镜的光学系统中，物镜的性能最为关键，对微生物学研究最为重要，直接影响显微镜的分辨率。 与其他物镜相比，油镜的使用方法比较特殊，需要在载玻片和镜头之间滴加香柏油。这样做
大学土壤微生物分离实验报告
从土壤中分离纯培养微生物并作初步观察鉴定 实验报告 生物科学与技术系 09食品（2）班 姓名：xxx 学号：xxx
从土壤中分离纯培养微生物并作初步观察鉴定 【摘要】利用分离纯化微生物的基本操作技术对土壤中的微生物进行分离与纯化，根据菌落形态观察及一系列的生理生化试验的结果，对照种属特征初步鉴定分离纯化的微生物所属的类群。 【关键词】细菌放线菌霉菌划线分离培养基的配制高压蒸汽灭菌 前言： 在自然条件下，微生物常常在各种生态系统中群居杂聚。群落是不同种类微物的混和体。为了生产和科研的需要，人们往往需要从自然界混杂的微生物群体中分离出 具有特殊功能的纯种微生物；或重新分离被其他微生物污染或因自发突变而丧失原 有优良性状的菌株；或通过诱变及遗传改造后选出优良性状的突变株及重组株。这种获得单一菌株纯培养的方法称为微生物的分离纯化技术。纯培养是指一株菌种或一个培养物中所有的细胞或孢子都是由一个细胞分裂、繁殖而产生的后代。 分离纯化技术主要由采集样品、富集培养、纯种分离和性能测定等几个基本环节组成。 实验目的： 1、学习从土壤中分离、纯化微生物的原理与方法。 2、学习、掌握微生物的鉴定方法。 3、对提取的土样进行微生物分离、纯化培养，根据菌落的形态特征判断未知菌的类别。实验原理： 从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。通过如下几种方法可以分离纯化微生物：稀释倒平板法(pour plate method)、涂布平板法(spread plate method)、稀释摇管法(dilution shake culture method)、平板划线分离法（stesak plate method）。 此次实验采取的是平板分离法，该方法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化，其基本原理主要包括两个方面：（一）选择适合于待分离微生物的生长条件或加入某种抑制剂造成只利于待分离微生物生长，而抑制其它微生物生长的环境，从而淘汰大部分不需要的微生物。（二）微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个细
从土壤中分离微生物
从土壤中分离微生物 环境工程（1）班 一、试验目的 1..学会土壤微生物的检测方法，了解土壤中微生物的数量和组成。 2初步掌握从土壤中分离细菌的基本技术。 二、实验原理 土壤是微生物生活最适宜的环境、它具有微生物所需要为一切营养物质和微生物进行生长繁殖及生存的各种条件．所以土壤中微生物的数量和种类都很多。它们参与土壤的氮、碳、硫、磷等元素的循环作用。此外，土壤中微生物的活动对土壤形成、土壤肥力和作物生产都有非常重要的作用。因此，查明土壤中微生物的数量和组成情况，对发掘土壤微生物资源和对土壤微生物实行定向控制无疑是十分必要的。 三、实验器材 (—)培养基 肉膏蛋白胨琼脂培养基（培养细菌） 高氏一号琼脂培养基（培养放线菌） 查氏培养基（培养霉菌） (二)灭菌稀释水、灭菌吸管、灭菌培养皿。 (三)土壤样品、天平、称旦纸。 （四）恒温箱、气体流量计 四、试验程序 1、倒平板 将培养基加热融化，待冷至55—60℃时，混合均匀后倒平板； 2、制备土壤稀释液 准确称取土样10g，加入装有90ml无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中，振荡约20min，使土样与水充分混匀，将细胞分散。用一支无菌吸管从中吸取1ml土壤悬液加入装有9ml无菌水的试管中，吹吸3次，让菌液混合均匀，即成10-2稀释液；再换一支无菌吸管吸取10-2稀释液1 ml，移入装有9ml无菌水的试管中，也吹吸三次，即成l0-3稀释液；以此类推，连续稀释，制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、等一系列稀释菌液
3、涂布 将无菌平板编上10-4、10-5、10-6号码，每一号码设置三个重复，用无菌吸管按无菌操作要求吸取10-6稀释液各1ml放入编号10-6的3个平板中，同法吸取10-5稀释液各lml放入编号10-5的3个平板中，再吸取10-4稀释液各lml放入编号10-4的3个平板中（由低浓度向高浓度时，吸管可不必更换）。再用无菌玻璃涂棒将菌液在平板上涂抹均匀，每个稀释度用一个灭菌玻璃涂棒，更换稀释度时需将玻璃涂棒灼烧灭菌。在由低浓度向高浓度涂抹时，也可以不更换涂棒。 4、培养 在28℃条件下倒置培养3—5天。 5、挑菌落 将培养后生长出的单个菌落分别挑取少量细胞划线接种到平板上。28℃条件下培养3—5天后，再次挑单菌落划线并培养，检查其特征是否一致，同时将细胞涂片染色后用显微镜检查是否为单一的微生物，如果发现有杂菌，需要进一步分离、纯化，直到获得纯培养。 五、注意事项 1.制备混合液平板时，不要再注入培养基前让链霉素液与土壤稀释液相混。 2.制备混合液平板时，倾注的培养基温度不能太高，过高的温度会烫死微生物。 六、培养过程及革兰氏染色观察成果 1.培养24h后的情况：马铃薯葡萄糖培养基长出菌种，经判断为细菌，马铃薯蔗糖培养基长出菌种，为酵母菌。其他培养基没长菌种，拍照如下
微生物的土壤分离实验报告材料山东大学的
山东大学实验报告2012年12 月 姓名系年级2011级生科2班组别四同组者 科目微生物学实验题目微生物的土壤分离 一、【实验题目】 微生物的土壤分离 二、【实验目的】 1. 从各地区的土样中筛选含果胶酶的菌株和产几丁质酶的菌株。 2.熟悉菌株筛选的具体操作流程。 3. 根据菌落形态，染色结果，运动性等来鉴定未知细菌；小室培养法观察未 定未知真菌。 4.掌握菌株筛选、分离纯化、鉴定等具体操作流程。 5．复习本学期所学的微生物实验的相关的操作步骤，并进一步强化无菌操作的概念。 三、【实验试剂与器材】 1.土样：7号土样 2.菌种： 革兰氏染色：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌 3.试剂及培养基 培养基：几丁质酶筛选培养基；液体PDA培养基；固体PDA斜面培养基； 几丁质酶发酵培养基；果胶酶筛选培养基；果胶酶液体种子培养基、
发酵产酶培养基；固体斜面培养基、半固体牛肉膏蛋白胨培养基、淀 粉培养基、葡萄糖发酵培养基、乳糖发酵培养基、吲哚培养基、甲基 红培养基 试剂：草酸铵结晶紫染液、番红复染液等各种染料以及卢戈氏碘液、95% 乙醇5%孔雀绿水溶液、氯化钠、刚果红、吲哚试剂、甲基红试剂、蒸 馏水 4.仪器 显微镜、锥形瓶、培养皿、试管、试管架、移液管、移液枪、烧杯、玻璃棒、载玻片、盖玻片、刮刀、U型管、德汉氏小管、酒精灯、漏斗、接种环、滤纸、棉塞、牛皮纸、无菌操作台、灭菌锅、纱布、双层瓶等 四、【实验原理】 1．微生物的分离和纯化 在土壤、水、空气或人及动、植物体中，不同种类的微生物绝大多数都是混杂生活在一起，当我们希望获得某一种微生物时，就必须从混杂的微生物类群中分离它，以得到只含有这一种微生物的纯培养，这种获得纯培养的方法称为微生物的分离与纯化。 为了获得某种微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧等条件要求不同，而供给它适宜的培养条件，或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长，而抑制其他菌生长的环境，从而淘汰其他一些不需要的微生物，再用稀释涂布平板法或稀释混合平板法或平板划线分离法等分离、纯化该微生物，直至得到纯菌株。 土壤是微生物生活的大本营，在这里生活的微生物无论是数量和种类都是极
土壤微生物的分离纯化与鉴定
土壤微生物的分离纯化与鉴定 一、实验目的 1、通过从土壤中分离纯化细菌，掌握培养基的制备与灭菌技术、微生物的分离纯化方法和无菌操作技术。 8、根据菌落形态，染色结果，运动性以及生理生化试验鉴定未知细菌；小室培养法观察鉴定未知真菌。 2、复习以前学过的各种染色方法，掌握生理生化试验的原理与方法。 4、巩固练习显微镜使用方法。 5、明确培养基的配制原理，复习配制培养基及消毒灭菌的一般原理和操作步骤。 6、学习利用选择培养基从土壤中分离能够产生特殊水解酶的细菌以及霉菌的方法； 7、学习测定土壤中细菌数目，种类的方法； 二、基本原理 1、培养基的配制与灭菌 培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、鉴定、保存各种微生物或积累代谢产物。在自然界中，微生物种类繁多，营养类型多样，加之实验和研究的目的不同，所以培养基的种类很多。但是，不同种类的培养基中，一般应含有水分、碳源、氮源、能源、无机盐、生长因素等。不同微生物对 pH 要求不一样，霉菌和酵母的培养基的 pH 一般是偏酸性的，而细菌和放线菌的培养基的 pH 一般为中性或微碱性的 ( 嗜碱细菌和嗜酸细菌例外 )。所以配制培养基时，都要根据不同微生物的要求将培养基的 pH 调到合适的范围。 此外，由于配制培养的各类营养物质和容器等含有各种微生物，因此，已配制好的培养基必须立即灭菌，如果来不及灭菌，应暂存冰箱内，以防止其中的微生物生长繁殖而消耗养分和改变培养的酸碱度所带来不利的影响。 2、微生物的分离与纯化 自然界中各种微生物混杂生活在一起，要研究某种微生物的特性，首先须使该微生物处于纯培养状态。从混杂的微生物群体中获得只含有某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。土壤是微生物生活的大本营，可以从中分离到很多有价值的菌株。本实验将采用平板划线分离法。 3、分离菌株的鉴定 微生物的分类鉴定是微生物的重要内容，一般从菌落特征、细菌特点及生理生化、分子生物学等方面进行鉴定。 各种细菌在代谢类型上表现了很大的差异。不同的细菌分解大分子碳水化合物、蛋白质和脂肪的能力不同，所能发酵的类型和最终产物也不一样。不同细菌对营养的要求不同也说明了它们有不同的合成能力。所有这些都反映了它们是有不同的酶系统。
如何从土壤中分离出微生物
如何从土壤（污水）中分离出微生物 把污水加蒸馏水分别稀释10，100，1000倍，然后加入培养基中培养，如果培养出来菌落重合，菌非常多，无法分离，就加大稀释倍数，直至获得清晰可分离的菌落，有时甚至是非常小的菌落，要用倒置显微镜操作。而培养基则根据要分离的菌的营养类型进行配置，若要获得多种微生物就要配置多种培养基进行如上操作。对于土壤加水溶解，对溶解液进行如上操作，不溶的部分就不用管了 1.取以少许土壤（一地表以下10cm处为宜）与适量无菌水混匀备用 2.做浸出液的梯度稀释 3 .涂平板 4.划线分离 5.接平板，接斜面 6.检测 从土壤中分离微生物 环境工程（1）班 一、试验目的 1..学会土壤微生物的检测方法，了解土壤中微生物的数量和组成。 2初步掌握从土壤中分离细菌的基本技术。 二、实验原理土壤是微生物生活最适宜的环境、它具有微生物所需要为一切营养物质和微生物进行生长繁殖及生存的各种条件．所以土壤中微生物的数量和种类都很多。它们参与土壤的氮、碳、硫、磷等元素的循环作用。此外，土壤中微生物的活动对土壤形成、土壤肥力和作物生产都有非常重要的作用。因此，查明土壤中微生物的数量和组成情况，对发掘土壤微生物资源和对土壤微生物实行定向控制无疑
是十分必要的。 三、实验器材 (—)培养基肉膏蛋白胨琼脂培养基（培养细菌）高氏一号琼脂培养基（培养放线菌）查氏培养基（培养霉菌） (二)灭菌稀释水、灭菌吸管、灭菌培养皿。 (三)土壤样品、天平、称旦纸。 （四）恒温箱、气体流量计 四、试验程序 1、倒平板将培养基加热融化，待冷至55—60℃时，混合均匀后倒平板； 2、制备土壤稀释液准确称取土样10g，加入装有90ml 无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中，振荡约20min，使土样与水充分混匀，将细胞分散。用一支无菌吸管从中吸取1ml土壤悬液加入装有9ml无菌水的试管中，吹吸3次，让菌液混合均匀，即成10-2稀释液；再换一支无菌吸管吸取10-2稀释液1 ml，移入装有9ml无菌水的试管中，也吹吸三次，即成l0-3稀释液；以此类推，连续稀释，制成10-1、10-2、10- 3、10- 4、10- 5、10- 6、等一系列稀释菌液 3、涂布将无菌平板编上10- 4、10- 5、10-6号码，每一号码设置三个重复，用无菌吸管按无菌操作要求吸取10-6稀释液各1ml放入编号10-6的3个平板中，同法吸取10-5稀释液各lml放入编号10-5的3个平板中，再吸取10-4稀释液