呼吸道九联检sop

呼吸道九联检操作程序

一、呼吸道感染概述

呼吸道感染是指病原体感染人体的鼻腔、咽喉、气管和支气管等呼吸系统。分为上呼吸道感染和下呼吸道感染，上呼吸道感染常见的是急性上呼吸道感染（acute upper respir tract infection），指鼻腔、咽或喉部急性炎症的概称，是呼吸道最常见的一种传染病。常见病因为病毒，少数由细菌引起。患者不分年龄、性别、职业和地区。不仅具有较强的传染性，而且可引起严重并发症。下呼吸道感染是最常见的感染性疾患，包括急性气管——支气管炎、慢性支气管炎、肺炎、支气管扩张等，由病毒、细菌、支原体、衣原体、军团菌等微生物引起，其防治应遵循预防为主、准确诊断、及时治疗的原则，治疗时必须明确引起感染的病原体以选择有效的抗生素。

二、免疫荧光法介绍

免疫荧光技术（Immunofluorescence technique ）又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展最早的一种。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。Coons等于1941年首次采用荧光素进行标记而获得成功。这种以荧光物质标记抗体而进行抗原定位的技术称为荧光抗体技术（fluorescent antibody technique）。用荧光抗体示踪或检查相应抗原的方法称荧光抗体法；用已

知的荧光抗原标记物示踪或检查相应抗体的方法称荧光抗原法。这两种方法总称免疫荧光技术，因为荧光色素不但能与抗体球蛋白结合，用于检测或定位各种抗原，也可以与其他蛋白质结合，用于检测或定位抗体，但是在实际工作中荧光抗原技术很少应用，所以人们习惯称为荧光抗体技术，或称为免疫荧光技术。用免疫荧光技术显示和检查细胞或组织内抗原或半抗原物质等方法称为免疫荧光细胞（或组织）化学技术。

荧光免疫法按反应体系及定量方法不同，还可进一步分做若干种。与放射免疫法相比，荧光免疫法无放射性污染，并且大多操作简便，便于推广。该技术的主要特点是：特异性强、敏感性高、速度快。主要缺点是：非特异性染色问题尚未完全解决，结果判定的客观性不足，技术程序也还比较复杂。但近年来发展了几种特殊的荧光免疫测定，已经很好改善了这些缺点，与酶免疫测定和放射免疫分析一样，应用在临床检验中。

1．原理

免疫学的基本反应是抗原-抗体反应。由于抗原抗体反应具有高度的特异性，所以当抗原抗体发生反应时，只要知道其中的一个因素，就可以查出另一个因素。免疫荧光技术就是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。其根据反应体系的不同可分为：直接法：将标记的特异性荧光抗体，直接加在抗原标本上，经一定的温度和时间的染色，用水洗去未参加反应的多余荧光抗体，室温下干燥后封片、镜检。间接法：如检查未知抗原，先用已知未标记的特异抗体（第一抗体）与抗原标本进行

反应，用水洗去未反应的抗体，再用标记的抗抗体（第二抗体）与抗原标本反应，使之形成抗原—抗体—抗体复合物，再用水洗去未反应的标记抗体，干燥、封片后镜检。如果检查未知抗体，则表明抗原标本是已知的，待检血清为第一抗体，其它步骤的抗原检查相同。根据抗原抗体反应后定量方法的不同可分为：荧光抗体技术(荧光显微镜技术)：抗原抗体反应后，利用荧光显微镜判定结果的检测方法。免疫荧光测定技术：抗原抗体反应后，利用特殊仪器测定荧光强度而推算被测物浓度的检测方法。

2.荧光物质

许多物质都可产生荧光现象，但并非都可用作荧光色素。只有那些能产生明显的荧光并能作为染料使用的有机化合物才能称为免疫荧光色素或荧光染料。所用荧光物质介绍：

异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate，FITC）：为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水或酒精等溶剂。分子量为389.4，最大吸收光波长为490～495nm，最大发射光波长520～530nm，呈现明亮的黄绿色荧光，有两种同分异结构，其中异构体Ⅰ型在效率、稳定性、与蛋白质结合能力等方面都更好，在冷暗干燥处可保存多年，是应用最广泛的荧光素。其主要优点是：①人眼对黄绿色较为敏感，②通常切片标本中的绿色荧光少于红色。

三、呼吸道九联检产品介绍

九项呼吸道感染病原体IgM抗体检测试剂盒，采用间接免疫荧光法（IFA），同时检测人血清中呼吸道感染主要病原体的IgM抗体，可检的病原体包括：嗜肺军团菌血清1型、肺炎支原体、Q热立克次体、

肺炎衣原体、腺病毒、呼吸道合胞病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒和副流感病毒1、2和3型。用于呼吸道感染疾病的辅助诊断。

1.检测原理

间接免疫荧光法（IFA）（图1）是基于待测样本中的抗体与吸附在载玻片上的抗原发生的反应。样本中存在的特异性抗体和抗原反应，未与抗原结合的免疫球蛋白在洗涤步骤中除去。在下一步骤中，抗原-抗体复合物与荧光素标记的抗人球蛋白反应，用免疫荧光显微镜观察结果。

图1

图1：九项呼吸道感染病原体IgM抗体检测试剂盒检测原理

3. 操作步骤

3.1 实验前准备

1）实验所需物品准备：1000ml量筒、1000ml烧杯、离心管、微量移液器、温育湿盒、洗瓶、水平摇床、恒温箱、盖玻片、荧光显微镜。2）PBS洗液的准备：将1瓶PBS粉末倒入烧杯中，加入1L蒸馏水中，摇匀直至完全溶解，配好后储存在2-8oC备用。

3）使用前，将所有试剂平衡至室温，将恒温箱调至37℃。

3.2 实验步骤

1）样本的稀释：按1:1比例稀释血清标本，即15μL血清加入15μL PBS 中。阴阳性对照不需要稀释。

2）用吸附剂处理稀释后的血清：将30μL稀释后的血清加入150μL 吸附剂中，彻底混匀。阴阳性对照不需吸附剂处理。处理后的血清要离心10-15分钟除去沉淀，以防干扰检测。

3）在载玻片的每孔中加15μL吸附剂处理过的血清。在一个载玻片的每孔中加入15μL不稀释的阳性对照，在另一个载玻片的每孔中加入15μL不稀释的阴性对照。

4）将载玻片放入湿盒中，37℃温育90分钟。

5）用PBS洗液的缓慢水流冲洗载玻片（避免直接冲入孔内）后，浸泡在PBS中并放置在水平摇床上轻轻摇动10分钟。将载玻片用蒸馏水缓慢水流冲洗（避免直接冲入孔内）。

6）载玻片自然晾干。

7）每孔加入15μL FITC结合物溶液（不需稀释）。

8）将载玻片放入湿盒，37℃温育30分钟。

9）重复6和7的洗涤步骤。

10）加几小滴封闭介质，小心盖上盖玻片。

11）尽快用荧光显微镜在400倍放大率下观察结果。如果不能立即观察，可将其避光放置于2-8oC不超过24小时。

4．结果判断

4.1有效性判断

每一次试验都应设立阳性和阴性对照，以确认试验和试剂盒的有效性。观察到的荧光模式应为：

阳性对照：腺病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒或副流感病毒对阳性质控的1-15%细胞出现苹果绿细胞核、胞浆或胞膜荧

光（在副流感病毒和呼吸道合胞病毒中能同时观察到着

色的合胞）；军团菌、衣原体或立克次体中所有的细菌

呈现出苹果绿荧光；支原体对阳性质控在细胞外围呈现

苹果绿色荧光。

阴性对照：军团菌、肺炎衣原体和立克次体无荧光，支原体、腺病毒、甲型和乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒和副流感病

毒的细胞呈现红色。

4.2样本结果判断

阳性结果：可以观察到腺病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒或副流感病毒对阳性血清的1-15%细胞的细胞核、胞浆或胞膜出现

苹果绿色荧光（在副流感病毒和呼吸道合胞病毒中能同时观

察到着色的合胞）；军团菌、衣原体或立克次体中所有的细

菌呈现出苹果绿色荧光；支原体对阳性血清在细胞外围呈现

苹果绿色荧光。

阴性结果：可观察到军团菌、肺炎衣原体和立克次体无荧光，支原体、腺病毒、甲型和乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒和副流感

病毒的细胞呈现红色。

4.3检验结果的解释

1)每一批产品在放行前都要经过严格的内部质量控制（Q.C.）检验。质控品科溯源到经过内部确认的参考血清盘。

2）如果所有细胞或第十孔出现荧光表明存在抗核和抗细胞抗体，不能判断为阳性，应用其他方法进行检验。当质控孔中吴荧光时一定要查明原因。

3）由于非军团菌感染的病人中经常出现交叉抗体，军团菌阳性的结果需结合临床症状综合评价。建议做较高稀释度的检测来提高阳性预测值。

4）与说明书中所列结果不同不能判为阳性。

5）在初次感染和再次感染的过程中。IgG和IgM抗体有不同的表现方式：初次感染时，几乎在所有的情况下IgM和IgG均出现（IgM早于IgG出现）；而再次感染时，可能会出现IgM。在许多疾病中病人的一生都可能存在高低度的IgG，而IgM一般情况下在感染后2-3个月存在血清中，因此IgM是近期感染的有效标志物。

6）九种病原体IgM抗体阴性及阳性结果的荧光染色图谱：阳性结果荧光图谱：

阴性结果荧光图谱：

5.在使用本

产品中所需

注意事项如

下：

1）本产品用于体外诊断，仅限专业人员使用。

2）在使用前，建议用户仔细阅读和理解说明书，严格按照程序进行操作才能获得可靠的检测结果。特别是样本和试剂的正确吸取以及仔细的洗板、温育的时间控制对获得准确结果都很重要。另外使用前，应将所有试剂平衡至室温，载玻片要平衡至室温后再打开。

3）每一次试验都应设立阳性和阴性对照，以确认试验和试剂盒的有效性。观察到的荧光模式应与说明书要求相符合，否则检验

无效。

4）洗涤时注意不要直接对着孔直接冲洗，以免冲洗掉已经固化反的应复合物。

5）单一样本抗体检测结果不能帮助作出近期感染的诊断。应采集双份样本（急性期和康复期）同时检测来观察血清转化或抗体

水平的明显升高。

6）仅使用试剂盒内的组分，不要混用不同试剂盒或不同厂家的试剂组分。只有PBS、吸附剂、封闭介质和载玻片可与其他批次

VIRCELL IFA试剂盒通用，其它组分同批次可以混用。使用时，

最好在无菌条件下操作试剂以防微生物污染。仅使用试验所需

量的吸附剂、PBS、质控血清和结合物，剩余的试剂不要倒回

瓶中。PBS溶解后储存在2～8 oC一般为4个月，使用前需

检查，如出现浑浊请勿使用。

7）每步操作必须使用干净吸头，仅使用干净的耗材，最好是一次性使用的耗材。

8）包装如有损坏请勿使用。

9）切勿用嘴吸移液管加样。

10）本试剂盒中的吸附剂、结合物和质控血清含有动物源性物质，质控血清还含有人源性物质。尽管本试剂盒中的人血清质控品

已经测试为HBsAg、HCV抗体和HIV抗体阴性,质控血清和病

人样本仍应作为潜在感染性物质进行处理。孔内包被的经灭活

的嗜肺军团菌血清1型、肺炎支原体、Q热立克次体、肺炎衣

原体、腺病毒、呼吸道合胞病毒、甲型流感病毒、乙型流感病

毒和副流感病毒1、2和3型，也仍应视为具有潜在感染性并

小心处置。目前没有方法可以确保这些或其他感染性物质不存

在，因此所

有的材料应视为具有潜在感染性进行处置，应遵守当地关于临床

废弃物处理的法规。

11）结合物、吸附剂、封闭介质和质控品含有叠氮钠（浓度＜0.1%），避免接触酸和重金

属。

12）封闭介质含有甘油，请勿接触酸和暴露在高温下。

13）伊文斯蓝（浓度＜0.1%）是一种致癌物。请勿接触皮肤和眼睛。万一接触到该溶液，用水彻底冲洗并到医院检查。

14）仅按本说明书进行操作，不遵守规定的温育时间和温度会导致错误的结果。

15）载玻片上病人样本交叉污染会导致错误结果，要小心操作防止发生。

16）显微镜光学系统、光源条件和类型会影响荧光质量。

17）不要将试剂不必要地放置在室温下过长的时间。

18）每个载玻片只能使用一次。不要分割，也不要再使用没有用过的孔。

19）试剂盒里的玻璃组分破碎时可能伤及身体，小心处理。

20）吸附剂加入样本后要注意观察是否有明显的沉淀出现。

呼吸道九联检sop

呼吸道九联检操作程序 一、呼吸道感染概述 呼吸道感染是指病原体感染人体的鼻腔、咽喉、气管和支气管等呼吸系统。分为上呼吸道感染和下呼吸道感染，上呼吸道感染常见的是急性上呼吸道感染（acute upper respir tract infection），指鼻腔、咽或喉部急性炎症的概称，是呼吸道最常见的一种传染病。常见病因为病毒，少数由细菌引起。患者不分年龄、性别、职业和地区。不仅具有较强的传染性，而且可引起严重并发症。下呼吸道感染是最常见的感染性疾患，包括急性气管——支气管炎、慢性支气管炎、肺炎、支气管扩张等，由病毒、细菌、支原体、衣原体、军团菌等微生物引起，其防治应遵循预防为主、准确诊断、及时治疗的原则，治疗时必须明确引起感染的病原体以选择有效的抗生素。 二、免疫荧光法介绍 免疫荧光技术（Immunofluorescence technique ）又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展最早的一种。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。Coons等于1941年首次采用荧光素进行标记而获得成功。这种以荧光物质标记抗体而进行抗原定位的技术称为荧光抗体技术（fluorescent antibody technique）。用荧光抗体示踪或检查相应抗原的方法称荧光抗体法；用已 知的荧光抗原标记物示踪或检查相应抗体的方法称荧光抗原法。这两种方法总称免疫荧光技术，因为荧光色素不但能与抗体球蛋白结合，用于检测或定位各种抗原，也可以与其他蛋白质结合，用于检测或定

位抗体，但是在实际工作中荧光抗原技术很少应用，所以人们习惯称为荧光抗体技术，或称为免疫荧光技术。用免疫荧光技术显示和检查细胞或组织内抗原或半抗原物质等方法称为免疫荧光细胞（或组织）化学技术。 荧光免疫法按反应体系及定量方法不同，还可进一步分做若干种。与放射免疫法相比，荧光免疫法无放射性污染，并且大多操作简便，便于推广。该技术的主要特点是：特异性强、敏感性高、速度快。主要缺点是：非特异性染色问题尚未完全解决，结果判定的客观性不足，技术程序也还比较复杂。但近年来发展了几种特殊的荧光免疫测定，已经很好改善了这些缺点，与酶免疫测定和放射免疫分析一样，应用在临床检验中。 1．原理 免疫学的基本反应是抗原-抗体反应。由于抗原抗体反应具有高度的特异性，所以当抗原抗体发生反应时，只要知道其中的一个因素，就可以查出另一个因素。免疫荧光技术就是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。其根据反应体系的不同可分为：直接法：将标记的特异性荧光抗体，直接加在抗原标本上，经一定的温度和时间的染色，用水洗去未参加反应的多余荧光抗体，室温下干燥后封片、镜检。间接法：如检查未知抗原，先用已知未标记的特异抗体（第一抗体）与抗原标本进行 反应，用水洗去未反应的抗体，再用标记的抗抗体（第二抗体）与抗原标本反应，使之形成抗原—抗体—抗体复合物，再用水洗去未反应的标记抗体，干燥、封片后镜检。如果检查未知抗体，则表明抗原标

呼吸道九联检sop

呼吸道九联检操作程序 呼吸道感染概述一、 气管和支气管等咽喉呼吸道感染是指病原体感染人体的鼻腔、、 上呼吸道感染常见的分为上呼吸道感染和下呼吸道感染呼吸系统，。指鼻腔是急性上呼吸道感染、），tract infectionupper（acute respir 常见病因是呼吸道最常见的一种传染病咽或喉部急性炎症的概称。，不仅性别职业和地区为病毒少数由细菌引起患者不分年龄。、，、。 下呼吸道感染是最常见具有较强的传染性而且可引起严重并发症。，肺炎支气管炎慢性支气管炎的感染性疾患包括急性气管——、，、、 军团菌等微生物引衣原体由病毒支气管扩张等细菌支原体、、、，、 治疗时必及时治疗的原则起其防治应遵循预防为主准确诊断，，、、 须明确引起感染的病原体以选择有效的抗生素。 免疫荧光法介绍一、 又称荧光抗体免疫荧光技术）technique（Immunofluorescence 生物化学是标记免疫技术中发展最早的一种它是在免疫学技术、。，

很早以来就有一些学者和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。利用抗原抗体反应进行组织或试图将抗体分子与一些示踪物质结合，年首次采用荧光素进行标等于细胞内抗原物质的定位1941。Coons 这种以荧光物质标记抗体而进行抗原定位的技术称为记而获得成功。用荧光抗体示踪荧光抗体技术technique）。fluorescent（antibody 用已或检查相应抗原的方法称荧光抗体法； 这两知的荧光抗原标记物示踪或检查相应抗体的方法称荧光抗原法。因为荧光色素不但能与抗体球蛋白结合种方法总称免疫荧光技术，，用于检测或定也可以与其他蛋白质结合用于检测或定位各种抗原，， 位抗体但是在实际工作中荧光抗原技术很少应用所以人们习惯称，，为荧光抗体技术或称为免疫荧光技术用免疫荧光技术显示和检查。，细胞或组织内抗原或半抗原物质等方法称为免疫荧光细胞或组织）（化学技术。 荧光免疫法按反应体系及定量方法不同还可进一步分做若干种。， 与放射免疫法相比荧光免疫法无放射性污染并且大多操作简便，，， 便于推广该技术的主要特点是特异性强敏感性高速度快主。：、、。

呼吸道九联检

关于开展呼吸道病原体九联检的通知 为满足临床要求，给临床和病患提供更好的检验服务，检验科开展了呼吸道九项病原体的检测，在免疫项目中开呼吸道九联检（收费375元）即可，医保项目，抽血当日即可出报告。抽血：血清2-3ml（红盖试管）。 呼吸道九项病原体的临床意义 ??? 采用西班牙VIRCELL公司生产的间接免疫荧光法检测试剂，同时检测人血清中呼吸道感染主要病原体的IgM 抗体，可检测的病原体包含：1、嗜肺军团菌? 2、肺炎支原体? 3、Q热立克次体? 4、肺炎衣原体? 5、腺病毒? 6、呼吸道合包病毒? 7、甲型流感病毒?? 8、乙型流感病毒?? 9、副流感病毒1、2、3型。 ?1、嗜肺军团菌 人最易感染的是嗜肺军团菌血清I型，非典型性肺炎常伴随有全身症状，10%的肺炎是由嗜肺军团菌血清I型引起的。在血清学诊断中，间接免疫荧光法是唯一的标准技术。临床上军团菌感染主要有两种表现形：肺炎型和庞蒂亚克热型。前驱症状：乏力、头痛、全身肌肉酸痛，于1～2日内突然发热，可达40℃以上，多呈稽留热。病程早期即可出现多系统受累症状，为本病的突出特点。绝大多数患者有咳嗽，起初为干咳，半数患者转成非脓性粘稠痰或略带脓性痰，痰中常含少量血丝，个别可咯血。少数患者有胸痛，呼吸困难较为多见。肺部可闻及细湿罗音。继之可出现明显肺实变体征。约25%有恶心、呕吐及腹泻等消化道症状，有的腹泻为唯一首发症状。神经症状多见于极期，有时非常突出，包括不同程度意识障碍、肌张力增强或阵颤、步态不稳等，可有暂时性肢体软瘫; 个别可有腹泻、清水样便。或者失眠、眩晕、记忆力减退、意识朦胧、项强、震颤等神经系统表现. 2、肺炎支原体 肺炎支原体引起的肺炎在儿童和青少年中最为常见，肺炎支原体可在呼吸道黏膜上皮潜伏，部分患者无明显症状；但大部分患者为显性感染。3岁以下儿童以上呼吸道感染多见，成人以肺炎表现为主。发病初期有咽痛、头痛、发热、乏力、肌肉酸痛、食欲减退、恶心、呕吐等症状。发热一般为中等热度，2~3天后出现明显的呼吸道症状，突出表现为阵发性刺激性咳嗽，以夜间为重，咳少量黏痰或黏液脓性痰，有时痰中带血，也可有呼吸困难、胸痛。发热可持续2~3周，体温正常后仍可遗有咳嗽。支原体肺炎突出表现为阵发性刺激性咳嗽，支原体肺炎可伴发多系统、多器官损害。皮肤损害可表现为斑丘疹、结节性红斑、水疱疹等。胃肠道系统可见呕吐、腹泻和肝功损害。血液系统损害较常见溶血性贫血。中枢神经系统损害可见多发性神经根炎、脑膜脑炎及小脑损伤等。心血管系统病变偶有心肌炎及心包炎。 3、Q热立克次体

呼吸道联检操作规程 -SOP

生效日期: 2007年1月1日责任科室: _________________ 页码: 第1页共 2页 ________________医院检验科_____室（SOP）文件 撰写人： 审核人： 批准人： 批准日期：2007年7月31日 启用日期：2007年8月 1 日 二零零七年七月一日制 编写修改内容及修改人批准人生效日期

生效日期: 2007年1月1日责任科室: _________________ 页码: 第1页共 2页 批准页 根据《临床检验操作规程》(2006年,第三版)，化学放光仪（Anthos lucy）, 洗板机（Anthos fluido）使用说明书；免疫检验有关试剂盒、质控品的使用操作说明书；《消毒技术规范》以及医院内部有关管理制度、生物安全制度的规定和要求，临床免疫检验操作规程文件NO.2版经实际运行，现予以批准通过，于 2007年 8月 1日起生效并开始实施。免疫室和检验科有关工作人员必须认真学习，严格遵照执行。（NO.2版依据检验技术和我科工作发展及管理工作的需求进行的补充完善和改进另行通知）。任何个人不得更改，实际工作中如发现不妥之处，请按程序以文字形式向审核人汇报；在未经批准人同意/批准新文件之前，仍执行此文。 _____________医院检验科 2007年7月31日 编写修改内容及修改人批准人生效日期

生效日期: 2007年1月1日责任科室: _________________ 页码: 第1页共 2页 呼吸道九联检操作规程 1.项目中文名称：九项呼吸道感染病原体IgM抗体检测（间接免疫荧光法） 项目英文名称：PNEUMOSLIDE IgM 2.实验原理与方法： 2.1 原理：间接免疫荧光法（IFA）是基于待测样本中的抗体与吸附在载玻片上的抗原发生的反应。样本中存在的特异性抗体和抗原反应，未与抗原结合的免疫球蛋白在洗涤步骤中除去。在下一步骤中，抗原-抗体复合物与荧光素标记的抗人球蛋白反应。用免疫荧光显微镜观察结果。 2.2 方法：间接免疫荧光法 3.设备性能参数： 4.标本的要求： 需由专业人员无菌静脉穿刺采集血液。使用消毒或无菌技术能保持样本的完整性。血清样本采集后如不在8小时内检测应2~8 oC冷藏，如7天内不检测，则应冷冻（-20oC）保存。不要反复冻融以防止免疫球蛋白滴度降低，特别是IgM。不要使用高血脂或污染的血清。若样本中含有微粒要离心使之澄清。 4.仪器：荧光显微镜 5.试剂厂家及名称：西班牙VIRCELL公司 6.操作步骤： 1. 使用前，将所有试剂平衡至室温。载玻片平衡至室温后再打开。 2. 样本的稀释：按1:1比例稀释血清样本，即25μL血清加入25μL PBS2中。阴阳性对照34不需要稀释。 3. 用抗人IgG吸附剂7处理稀释后的血清：将30μL稀释后的血清加入150μL吸附剂中，彻底混匀。阴阳性对照3和4不需吸附剂处理。处理后的血清要离心10-15分钟除去沉淀，以防干扰检测。 4. 在载玻片1的每孔中加15μL吸附剂处理过的血清（一份样本对应一个载玻片）。在一个载玻片的每孔中加入15μL不稀释的阳性对照3，在另一个载玻片的每孔中加入15μL不稀释的阴性对照4。 5. 将载玻片放入湿盒中，37℃温育90分钟。 6. 用PBS 2的缓慢水流冲洗载玻片1（避免直接冲入孔内）后，浸泡在PBS中并放置在水平摇床上轻轻摇动10分钟。再用蒸馏水缓慢水流冲洗（避免直接冲入孔内）。 7. 载玻片1自然晾干。 8. 每孔加入15μL抗人IgM FITC结合物溶液5M（不需稀释）。 9. 将载玻片放入湿盒，37℃温育30分钟。 10. 重复6和7的洗涤步骤。 11. 加几小滴封闭介质6，小心盖上盖玻片。 编写修改内容及修改人批准人生效日期

九项呼吸道病毒检查及临床意义

九项呼吸道病毒检查 一、呼吸道九联检主要检测病原体的IgM抗体,包括嗜肺军团菌(LP)、肺炎支原体(MP)、Q热立克次体(COX)、肺炎衣原体(CP)、腺病毒(ADV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、甲型流感病毒(IFA)、乙型流感病毒(IFB)和副流感病毒1、2和3型(PIVS)。 二、采用间接免疫荧光法，主要针对九项病原体的IgM 检测。由于机体受到抗原刺激后最早产生的抗体是IgM，但是IgM的半衰期短（约5天）若血清中特异性IgM类抗体含量增高，表明有近期感染，这有助于感染性疾病的早期诊断。以下是关于九项病原体名称及其潜伏期和产生IgM的时间。 九项病原体IgM抗体产生时间

三、临床意义 嗜肺军团菌 是社区获得性肺炎的重要致病菌。在欧洲和北美军团军肺炎占社区获得性肺炎前3,4位，ICU重症社区获得性肺炎的第三位，而医院获得性肺炎的1～5 %也由嗜肺军团菌所致。对人致病的嗜肺军团菌有16个血清型，80%军团菌肺炎有嗜肺军团菌血清Ⅰ型引起。然而军团菌细菌培养检出率低, 只有50%左右, 目前临床上血清特异性抗体检查是常用的诊断军团菌感染的主要手段。

肺炎支原体 是目前儿童呼吸道感染的重要病原体之一，占儿童肺炎感染病原体的15%左右，由于肺炎支原体传统培养难度大，单纯凭借患儿的临床症状不易确诊是否感染，支原体抗体于感染后7～9d出现，3～4周达高峰，可持续4～6月，采用血清特异性抗体检查是常用的诊断肺炎支原体感染的主要手段。 Q热立克次体 可引起Q热等全身疾病，会造成发热、非典型性肺炎、肝炎或心内膜炎等。血清学诊断中，IFA检测是最灵敏和最具指示性的血清学诊断方法。 肺炎衣原体 广泛存在于世界范围内，人类是其唯一的宿主，仅1个血清型。实验室检测方法有分离培养、血清学检测、核酸扩增技术等，目前临床主要使用血清学检测方法。肺炎衣原体是呼吸道感染主要病原之一，人与人之间的传

呼吸道九联检操作规程-SOP

广州市医院检验科 免疫室（SOP）文件 撰写人： 审核人： 批准人： 批准日期：2011年8月8日启用日期：2011年8月8日 二零一一年八月八日制

文件编号: HDHY-MYJY-P001-2011 版序：第 2 版第 1 次修订 生效日期: 2011年8月8日 责任科室: 免疫室页码: 第1页共 1页 批准页 根据《临床检验操作规程》(2006年,第三版)，九项呼吸道病原体IgM抗体检测试剂盒使用说明书；免疫检验有关试剂盒、质控品的使用操作说明书；《消毒技术规范》以及医院内部有关管理制度、生物安全制度的规定和要求，临床免疫检验操作规程文件NO.2版经实际运行，现予以批准通过，于 2011年 8月8日起生效并开始实施。免疫室和检验科有关工作人员必须认真学习，严格遵照执行。（NO.2版依据检验技术和我科工作发展及管理工作的需求进行的补充完善和改进另行通知）。任何个人不得更改，实际工作中如发现不妥之处，请按程序以文字形式向审核人汇报；在未经批准人同意/批准新文件之前，仍执行此文。 2011年8月8日 编写人修改内容及修改人批准人生效日期 文件编号: HDHY-MYJY-P003-2011

版序：第 2 版第 1 次修订 生效日期: 2011年8月8日 责任科室: 免疫室页码: 第1页共 2页 呼吸道九联检操作规程 1.项目中英文名称：九项呼吸道感染病原体IgM抗体检测试剂盒（间接免疫荧光法） 2.实验原理与方法： 2.1 原理：间接免疫荧光法（IFA）是基于待测样本中的抗体与吸附在载玻片上的抗原发生的反应。样本中存在的特异性抗体和抗原反应，未与抗原结合的免疫球蛋白在洗涤步骤中除去。在下一步骤中，抗原-抗体复合物与荧光素标记的抗人球蛋白反应。用免疫荧光显微镜观察结果。 2.2 方法：间接免疫荧光法 3.标本的要求： 需由专业人员无菌静脉穿刺采集血液。使用消毒或无菌技术能保持样本的完整性。血清样本采集后如不在8小时内检测应2~8 oC冷藏，如7天内不检测，则应冷冻（-20oC）保存。不要反复冻融以防止免疫球蛋白滴度降低，特别是IgM。不要使用高血脂或污染的血清。若样本中含有微粒要离心使之澄清。 4.仪器：荧光显微镜 5.试剂厂家及名称：郑州安图绿科生物工程有限公司 6.操作步骤： 1. 使用前，将所有试剂平衡至室温。载玻片平衡至室温后再打开。 2. 样本的稀释：按1:1比例稀释血清样本，即25μL血清加入25μL PBS2中。阴阳性对照34不需要稀释。 3. 用抗人IgG吸附剂7处理稀释后的血清：将30μL稀释后的血清加入150μL吸附剂中，彻底混匀。阴阳性对照3和4不需吸附剂处理。处理后的血清要离心10-15分钟除去沉淀，以防干扰检测。 4. 在载玻片1的每孔中加15μL吸附剂处理过的血清（一份样本对应一个载玻片）。在一个载玻片的每孔中加入15μL不稀释的阳性对照3，在另一个载玻片的每孔中加入15μL不稀释的阴性对照4。 5. 将载玻片放入湿盒中，37℃温育90分钟。 6. 用PBS 2的缓慢水流冲洗载玻片1（避免直接冲入孔内）后，浸泡在PBS中并放置在水平摇床上轻轻摇动10分钟。再用蒸馏水缓慢水流冲洗（避免直接冲入孔内）。 7. 载玻片1自然晾干。 8. 每孔加入15μL抗人IgM FITC结合物溶液5M（不需稀释）。 9. 将载玻片放入湿盒，37℃温育30分钟。 10. 重复6和7的洗涤步骤。 11. 加几小滴封闭介质6，小心盖上盖玻片。 12. 尽快用荧光显微镜在400倍放大率下观察结果。如果不能立即观察，可将其避光放置于2-8oC不超过24小时。 编写人修改内容及修改人批准人生效日期 文件编号: HDHY-MYJY-P004-2011

呼吸道九联检

---------------------------------------------------------------最新资料推荐------------------------------------------------------ 呼吸道九联检 呼吸道病原体检测探讨 1/ 42

主要内容? 呼吸道感染的概况? 常见非典型病原体? 实验室检测方法学? 间接免疫荧光法—IgM抗体检测

---------------------------------------------------------------最新资料推荐------------------------------------------------------ 呼吸道病原体感染概况?上呼吸道感染鼻腔、咽、喉部 ----- 常见病因病毒，少数为细菌；?下呼吸道感染(最常见的感染性疾患)气管、支气管、肺部----由病毒、细菌、支原体、衣原体、军团菌等微生物引起。 以社区获得性肺炎(CAP)多见 3/ 42

呼吸道病原体感染概况一、典型“致病菌”细菌：肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌等症状：典型，咳嗽、脓性痰、胸膜炎性胸痛，一般都伴有发热，或有脓血痰病史：①悠久，古代的“瘟疫”很多细菌性肺炎②重症致死性肺炎很多是细菌性③上世纪50年代以前的肺炎90%以上为细菌性肺炎，现在报道约在40%左右④肺炎链球菌大约占在60%

---------------------------------------------------------------最新资料推荐------------------------------------------------------ 呼吸道病原体感染概况二、非典型病原体非典型肺炎：泛指所有由某种未知的病原体引起的肺炎。 病原体可能是病毒、肺炎支原体、肺炎衣原体或军团菌、真菌等1、20世纪60年代首次发现了非典型的病原体——肺炎支原体 2、临床症状差异大 3、在CAP中感染的比例逐年增加，据报道大约占4060% 5/ 42

呼吸道感染IgM九项联检试剂说明书终稿

呼吸道感染IgM九项联检试剂盒（间接免疫荧光法） 说明书 【产品名称】 通用名称：呼吸道感染IgM九项联检试剂盒（间接免疫荧光法） 英文名称：PNEUMOSLIDE IgM 商品名称：PNEUMOSLIDE IgM 【包装规格】 10人份/盒 【预期用途】 采用间接免疫荧光法（IFA），同时检测人血清中呼吸道感染主要病原体的IgM 抗体，可检的病原体包括：嗜肺军团菌血清1型、肺炎支原体、Q热立克次体、肺炎衣原体、腺病毒、呼吸道合胞病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒和副流感病毒1、2和3型。 已报道的非典型性肺炎的病原体有很多，其中最常见的有： 嗜肺军团菌 人最易感染的是嗜肺军团菌血清1型，非典型性肺炎常伴随有全身症状。10%的肺炎是由嗜肺军团菌血清1型引起的。在血清学诊断中，间接免疫荧光法（IFA）是唯一的标准技术。 肺炎支原体 肺炎支原体引起的肺炎在儿童和青少年中最为常见，由于很难将其固定在载玻片上，因此先将肺炎支原体抗原固定在细胞中。 Q热立克次体 Q热是由Q热立克次体引起的全身疾病，会造成发热、非典型性肺炎、肝炎或心内膜炎。血清学诊断中，IFA检测是最灵敏和最具指示性的血清学诊断方法。 肺炎衣原体 肺炎衣原体极易造成呼吸系统感染，特别是支气管炎和肺炎。在老年人中发病率较高，它所引起的肺炎占所有肺炎病例的10%。微量免疫荧光法（MIF）是最灵敏和最特异的诊断方法。 腺病毒

腺病毒是一种重要的呼吸道病原体，能引起上呼吸道疾病，伴随有急骤发热和轻度呼吸道感染。 呼吸道合胞病毒 呼吸道合胞病毒（RSV）是两岁以下幼儿呼吸道感染的主要病原体，在冬季爆发流行。 流感病毒 它是流感的病原体，在具有潜在病理学的患者中会产生严重的并发症。由于它易于与其它呼吸道疾病混淆，所以在流行期临床诊断很困难。因此，实验室诊断就显得非常重要。 副流感病毒 副流感病毒1、2和3型在2-4岁儿童中能引起喉气管支气管炎（哮吼）。3型具有流行性，1和2型具有地域性。 【检测原理】 间接免疫荧光法（IFA）是基于待测样本中的抗体与吸附在载玻片上的抗原发生的反应。样本中存在的特异性抗体和抗原反应，未与抗原结合的免疫球蛋白在洗涤步骤中除去。在下一步骤中，抗原-抗体复合物与荧光素标记的抗人球蛋白反应。用免疫荧光显微镜观察结果。 【主要组成成份】 除PBS外，所有试剂均可直接使用。为了易于识别，所有试剂均有一个给定的编号。在操作骤中，写明了每一步所使用试剂的编号。 1载玻片：10片（10孔/片），含有下列抗原： 1. 嗜肺军团菌血清1型（悬浮于0.5%正常鸡卵黄囊中以增强抗原吸附性和避免细 菌聚集）

呼吸道九联检简要操作规程

呼吸道九联检简要操作规程 一采血要求 1. 静脉血，指尖血（儿童） 2. 拒收溶血标本。脂血标本不影响检测。 二所需实验仪器和设备 1. 荧光显微镜 2. 洗盒，湿盒 3. 摇床 4. 15微升和150微升量程的移液器 5. 1000毫升量筒，1000毫升玻璃容器 三准备工作： 提前30分钟取出试剂盒恢复至室温，同时将试剂②中的成分加入1L蒸馏水，摇匀直至完全融化。 四试验步骤： 25ul血清+25 ul PBS溶液 ↓混匀 取混合后的液体30ul ↓ 加150ul吸附剂[⑦] ↓混匀，静置1分钟 离心4000转10-15分钟 ↓ 在载玻片上每孔加15ul上清液 ↓ 放入湿盒37度温育60分钟 ↓ 用PBS洗液冲洗载玻片后，浸泡在PBS洗液中并 放在摇床上摇动10分钟，再用蒸馏水冲洗↓ 自然晾干或吹干，每孔加入15ul结合物[⑤] ↓ 放入湿盒37度温育30分钟 ↓ 用PBS洗液冲洗载玻片，浸泡在PBS洗液中并 放在摇床上摇动10分钟，再用蒸馏水冲洗自然晾干或吹干 ↓ 加封闭介质盖上盖玻片观察结果

注意事项： 1，加样时，移液器不要触碰离心管底部的沉淀和九联检包被孔 2，实验结束后，九联检片子最好在2-3小时内观察，第二天观察不影响结果判断。若需保存，需冷冻避光。 3，结果判断 第2,5,6,7,8,9包被孔的阳性细胞为荧光均匀分布在包被细胞上，并且为明显的绿色；阳性细胞数占3%以上时，报阳性，其余阴性。 4，PBS常温放置一星期不影响实验结果，但要保证在此期间不被污染 5.若实验室没有摇床，洗涤过程中中间换一次PBS，同样能达到洗涤效果， 而不需要震摇 郑州安图绿科生物有限公司

呼吸道九联检sop

呼吸道九联检操作程序 一、呼吸道感染概述呼吸道感染是指病原体感染人体的鼻腔、咽喉、气管和支气管等呼吸系统。分为上呼吸道感染和下呼吸道感染，上呼吸道感染常见的是急性上呼吸道感染 (acute upper respir tract infection )，指鼻腔、 咽或喉部急性炎症的概称，是呼吸道最常见的一种传染病。常见病因为病毒，少数由细菌引起。患者不分年龄、性别、职业和地区。不仅具有较强的传染性，而且可引起严重并发症。下呼吸道感染是最常见的感染性疾患，包括急性气管——支气管炎、慢性支气管炎、肺炎、支气管扩张等，由病毒、细菌、支原体、衣原体、军团菌等微生物引起，其防治应遵循预防为主、准确诊断、及时治疗的原则，治疗时必须明确引起感染的病原体以选择有效的抗生素。 二、免疫荧光法介绍 免疫荧光技术 ( Immunofluorescence technique )又称荧光抗 体技术，是标记免疫技术中发展最早的一种。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。Coons 等于1941 年首次采用荧光素进行标记而获得成功。这种以荧光物质标记抗体而进行抗原定位的技术称为荧光抗体技术( fluorescent antibody technique )。用荧光抗体示踪或检查相应抗原的方法称荧光抗体法；用已知的荧光抗原标记物示踪或检查相应抗体的方法称荧光抗原法。这两种方法总称免疫荧光技术，因为荧光色素不但能与抗体球蛋白结合，用于检测或定位各种抗原，也可以与其他蛋白质结合，用于检测或定位抗体，但是在实际工作中荧光抗原技术很少应用，所以人们习惯称为荧光抗体技术，或称为免疫荧光技术。用免疫荧光技术显示和检查细胞或组织内抗原或半抗原物质等方法称为免疫荧光细胞(或组织) 化学技术。 荧光免疫法按反应体系及定量方法不同，还可进一步分做若干种。与放 射免疫法相比，荧光免疫法无放射性污染，并且大多操作简便，便于推广。该 技术的主要特点是：特异性强、敏感性高、速度快。主要缺点是：非特异性染 色问题尚未完全解决，结果判定的客观性不足，技术程序也还比较复杂。但近 年来发展了几种特殊的荧光免疫测定，已经很好改善了这些缺点，与酶免疫测

呼吸道联检操作规程SOP资料

________________医院检验科_____室（SOP）文件 撰写人： 审核人： 批准人： 批准日期：2007年7月31日启用日期：2007年8月 1 日 二零零七年七月一日制

批准页 根据《临床检验操作规程》(2006年,第三版)，化学放光仪（Anthos lucy）, 洗板机（Anthos fluido）使用说明书；免疫检验有关试剂盒、质控品的使用操作说明书；《消毒技术规范》以及医院内部有关管理制度、生物安全制度的规定和要求，临床免疫检验操作规程文件NO.2版经实际运行，现予以批准通过，于 2007年 8月 1日起生效并开始实施。免疫室和检验科有关工作人员必须认真学习，严格遵照执行。（NO.2版依据检验技术和我科工作发展及管理工作的需求进行的补充完善和改进另行通知）。任何个人不得更改，实际工作中如发现不妥之处，请按程序以文字形式向审核人汇报；在未经批准人同意/批准新文件之前，仍执行此文。 _____________医院检验科 2007年7月31日 呼吸道九联检操作规程 1.项目中文名称：九项呼吸道感染病原体IgM抗体检测（间接免疫荧光法） 项目英文名称：PNEUMOSLIDE IgM 2.实验原理与方法： 2.1 原理：间接免疫荧光法（IFA）是基于待测样本中的抗体与吸附在载玻片上的抗原发生的反应。样本中存在的特异性抗体和抗原反应，未与抗原结合的免疫球蛋白在洗涤步骤中除去。在下一步骤中，抗原-抗体复合物与荧光素标记的抗人球蛋白反应。用免疫荧光显微镜观察结果。 2.2 方法：间接免疫荧光法 3.设备性能参数：

4.标本的要求： 需由专业人员无菌静脉穿刺采集血液。使用消毒或无菌技术能保持样本的完整性。血清样本采集后如不在8小时内检测应2~8 oC冷藏，如7天内不检测，则应冷冻（-20oC）保存。不要反复冻融以防止免疫球蛋白滴度降低，特别是IgM。不要使用高血脂或污染的血清。若样本中含有微粒要离心使之澄清。 4.仪器：荧光显微镜 5.试剂厂家及名称：西班牙VIRCELL公司 6.操作步骤： 1. 使用前，将所有试剂平衡至室温。载玻片平衡至室温后再打开。 2. 样本的稀释：按1:1比例稀释血清样本，即25μL血清加入25μL PBS2中。阴阳性对照34不需要稀释。 3. 用抗人IgG吸附剂7处理稀释后的血清：将30μL稀释后的血清加入150μL吸附剂中，彻底混匀。阴阳性对照3和4不需吸附剂处理。处理后的血清要离心10-15分钟除去沉淀，以防干扰检测。 4. 在载玻片1的每孔中加15μL吸附剂处理过的血清（一份样本对应一个载玻片）。在一个载玻片的每孔中加入15μL不稀释的阳性对照3，在另一个载玻片的每孔中加入15μL不稀释的阴性对照4。 5. 将载玻片放入湿盒中，37℃温育90分钟。 6. 用PBS 2的缓慢水流冲洗载玻片1（避免直接冲入孔内）后，浸泡在PBS中并放置在水平摇床上轻轻摇动10分钟。再用蒸馏水缓慢水流冲洗（避免直接冲入孔内）。 7. 载玻片1自然晾干。 8. 每孔加入15μL抗人IgM FITC结合物溶液5M（不需稀释）。 9. 将载玻片放入湿盒，37℃温育30分钟。 10. 重复6和7的洗涤步骤。 11. 加几小滴封闭介质6，小心盖上盖玻片。 12. 尽快用荧光显微镜在400倍放大率下观察结果。如果不能立即观察，可将其避光放置于2-8oC 不超过24小时。 * 简明操作程序（将风干改成晾干）