临床诊断中聚合酶链反应(PCR)技术的应用
WS/T 230-2002 临床诊断中聚合酶链反应(PCR)技术的应用
Guidelines for use of polymerase chain reaction
(PCR) technique in clinical diagnosis
1范围
本标准规定了临床诊断中聚合酶链反应(PCR)技术的应用准则。
本标准适用于各级，各类的医疗、卫生、保健机构应用PCR技术进行临床诊断。
2定义
本标准采用下列定义。
2.1引物primer
与待扩增靶DNA片段两端互补的寡核昔酸，其本质是单链DNA(ssDNA)，在DNA聚合酶的作用下能进行延伸，从而合成新的互补链。
2.2模板template
待扩增的靶DNA或RNA链，包括人类基因组DNA、质粒DNA、噬菌体DNA、eDNA和mRNA、
扩增后的DNA产物等几乎所有形式的DNA或RNA。
2.3变性denaturation
DNA或RNA由双链转变为单链状态，加热、提高pH或加入甲酰胺、脲等试剂都可使双链DNA或RNA发生变性。
2.4 退火annealing
引物与互补的核苷酸序列在合适的温度下通过氢键形式相互结合的过程。
2.5 延伸 extension
在合适的条件下，由DNA聚合酶（如：Taq酶）催化引导引物DNA链延伸的合成过程。
2.6 污染 contamination
由来源子非待测样品的核酸所引起的一个样品、一系列样品或试剂的非特异性扩增或扩增后在产物分析过程中造成的样品之间的污染，污染通常引起假阳性结果。
2.7 遗留污染 carry-over contamination
同一类靶序列上一次PCR扩增产物对以后扩增反应的后续污染。
2.8 内对照 internal control
在同一反应混合物体系中与待测靶核酸同时进行扩增反应的已知对照物。
2.9 Taq DNA聚合酶 Taq DNA polymerase
一种耐热的DNA聚合酶，最初是从美国黄石国家公园温泉中存在的水生栖热菌(Thermu$ aquati-cus)中分离获得，Taq酶最适活性温度在70 ℃～80℃，能耐受PCR变性过程中的高温，是目前PCR扩增反应中经常使用的DNA聚合酶。
2.10抑制物／干扰物inhibition/interference
临床样品中能导致假阳性或假阴性扩增的内源性物质（如血液中的某些成分，痰液中的酸性多糖、尿液、体液等）和外源性物质（如滑石粉、抗凝剂等）。
2.11 dNTP deoxynueleotide triphosphate
三磷酸脱氧核苷，包括dATP、dUTP、dCTP、dGTP、dTTP等。在PCR扩增反应中，作为反应底物聚合形成新的DNA链。
2.12热循环仪thermocycler
在PCR或其他需要在反应过程中转换温度的体系中用来保证温度准确快速转换的设备。
3用途
对目前已有稳定、可靠的微生物学和免疫学方法检测的疾病或病原体，不推荐应用PCR进行检测。例如，大多数的细菌感染通过细菌培养3～4天即可报告并明确药敏结果；对甲型肝炎病毒等的感染。通过对其抗原或／和抗体的检测也可明确诊断。对于目前尚无其他实验室诊断技术或现有的诊断技术不成熟、敏感性太低、不能及时准确地反映感染情况的疾病，可推荐应用PCR技术进行检测。如丙型肝炎病毒的感染，检测其抗体不能做到早期诊断、也不能表明血清中有无病毒的存在，又如结核杆菌的感染，培养需2～3个月，耗时太长，影响诊断，对此类病原体，PCR检测有其独到的优点。
PCR临床实验根据其应用的不同可分为三个互相交叉的类型t“过筛实验”，“诊断实验”、“验证实验”。
3.1过筛实验
过筛实验适用于数目较大的群体，可能大部分元症状（疾病的流行性可能很低）。一个阳性结果并不能确定病原微生物的流行或反映某种疾病状态，它只能提示有必要作进一步的检测。较高的诊断敏感性和阴性可信度是过筛实验最重要的特性。
3.2诊断实验
诊断实验用于当地某种疾病流行率很高、疑诊患有某种疾病（或特异性感染）的群体，特异性靶基因（或病原体）的有无对诊断和治疗有重要意义。因此，要求在保证实验特异性的情况下-敏感性尽可能地高。
3.3验证实验
对于过筛实验或诊断实验为阳性的情况，验证实验可作为其补充实验，用于确诊。特异性和阳性可信度是验证实验最重要的特性。
4方法
4.1 引物序列的选择
引物的设计是在模板序列中挑选出两段寡核苷酸片段，使其能有效地扩增模板。模板序列的选择随着检测的不同而不同，但也有一些共同之处，如：1）模板序列应是特异的-即不存在和其他序列同源的序列（尤其是在引物部分），模板序列的选择应避免核苷酸重复片段区I2）模板序列在某些情况下需要的是种属内部的保守区、非保守区（尤其是引物部分）或属内特异区。
选择合适的引物是保证PCR扩增特异性和敏感性的关键。首先，对应用于临床诊断的PCR。在设计引物时，其靶核酸的序列一定是已知的，这些基因序列信息可从基因数据库（如GenBank）中获得。虽然引物的设计在一定程度上依靠经验，尤其是目前已有多种计算机软件可应用于核苷酸的序列分析和PCR引物的设计，但引物的适用性尚需通过实验性研究加以确定。PCR引物设计一般遵循以下基本原则：
a)引物的长度一般为15～30个碱基；
b)两引物相距的距离以100～300核背酸为最优，这样可获得较佳的扩增效果；
c)引物内碱基应尽可能随机分布，避免出现嘌呤或嘧啶堆集现象，引物中G@C含量宜在40%～60%左右；
d)引物内部不应有二级结构，两个引物之间、尤其在3’端的序列不应互补；
e)引物3’端与模板一定要互补，末端碱基不要出现多个A。
4.2常规PCR实验方案
4.2.1材料
模板DNA (102～105拷贝)
上游引物
下游引物
Taq DNA聚合酶和浓缩反应缓冲液
氯化镁(MgCl2)
无DNA酶(DNase)的水
无DNase矿物油
dNTP混合物(含dATP、dCTP、dGTP、dTTP)
4.2.2扩增反应（一般情况下，每50 μL反应体积所含组分如下）：
成分终浓度
无DNase的水将反应体积补足至50μL
浓缩反应缓冲液 1×工作浓度
dNTP混合物各0.2 mmol/L
Taq DNA聚合酶 0.5～1.0 U/50 μL
氯化镁(MgCI2) 1.5 mmol/L
上游引物 1 μmol/L
下游引物1μmol/L
模板102～105拷贝/50μL。
每个反应管加1～2滴(20μL～40μL)无DNase的矿物油，根据适合各个PCR反应的扩增参数，按变性、退火、延伸三步骤的热循环程序进行扩增反应。
4.3 PCR扩增产物的分析
扩增产物的分析，根据研究对象和目的的不同可采用不同的分析方法，琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶电泳等可帮助判断扩增产物的大小，有助于扩增产物的鉴定{点杂交还有助于对扩增产物进行基因分型（如HLA-DQ分型）；Southern杂交分析可从非特异扩增产物中鉴定出特异性产物的大小，因此，可增加检测的特异性和敏感性。其他一些方法，如微孔板杂交、PCR-酶联免疫吸附实验(ELISA)等均有助于产物的精确分析。
4.3.1凝胶电泳
这种方法是根据带负电的DNA可以在pH中性的缓冲液巾向阳极迁移的原理而建立的，凝胶基质可以是琼脂糖或聚丙烯酰胺等，核酸的迁移率与琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶的浓度、电流、离子强度以及温度等因素有关。电泳后，通过溴化乙啶(EB)染色，在紫外下可以清晰地观察到PCR扩增产物条带，但扩增产物的特异性必须用探针杂交等方法加以鉴定。
4.3.2点杂交法
点杂交法的基本过程是t首先将扩增产物固定到尼龙膜或硝酸纤维素膜上，再用核素或非核索标记的探针进行杂交，由于核素有较大的放射危害性，现在多用非核索进行探针标记，如生物寨、荧光素、酶及化学发光剂等州玉可在反应时直接掺入地高辛或生物素标记的单核替酸，然后将扩增产物固定，再用抗地高辛抗体或亲合索进行反应来检设4靶序列。
4.3.3微孔板夹心杂交法
该方法是通过固定子微孔板的捕获探针与PCR产物的某一区域进行特异性杂交，使扩增产物间接地固定于微孔板上，然后，再用生物泵等非核紊标记的检测探针与扩增产物的另一区域杂交，漂洗、显色后即可判断结果。
4.3.4 PCR-ELISA
将引物的5，端用生物素或异硫氰酸荧光素(FITC)等修饰后并不影响其扩增特异性靶核酸的特性，因此，可以通过修饰其中一个引物的5’端使其携带便于PCR产物被捕获、固定的功能基团（如生物紊）。而通过另一引物5，端的修饰(如FITC)使产物便于检测，这样避免了电泳和杂交等步骤，适于常规检测。
4.3.5其他
如限制性内切酶长度多态性分析(Restriction-fragment-length-polymorphism，RFLP)、核苷酸序列分析等。
5样品的收集、运输、处理和存放
正确的样品收集、运送和保存是十分重要的。虽然PCR检测对上述环节的要求与传统的微生物培养和血清学检测基本相同，但在许多情况下仍有其特殊性。即无论在什么情况下都至少应保持靶核酸的完整性，样品中的干扰物应能被充分稀释，使其不致于干扰检测。
5.1样品的收集
实验室对每项特定的PCR检测都应制定并为临床提供详细的样品收集规则。
5.1.1样品收集的时间
在某一疾病的病程中，样品收集过早或过迟都会导致假阳性或假阴性结果，因此。要注意样品收集的时限性或时效性。
5.1.2收集场所的准备
样品的收集场所应要求避免细菌污染并去除可能造成污染的物质，样品的收集需由经过专门培训的工作人员来完成。
5.1.3样品的类型和数量
样品的类型、数量应是一定的，它们可能与常规微生物学、血清学实验的要求相同或不同，这是由疾病病原体的不同特性决定的。一般而亩，如果所收集的样品可以进行培养，那么提取核酸进行扩增分析也是可行的。
5.1.4样品的质量
样品的质量可根据以下一种或几种方法进行评估：肉眼观察、显微镜检查或化学分析。评估其细胞组成、细胞数目、核酸总量等。
5.1.5样品的收集／运输装置
样品的收集需采用一次性材料，样品的收集材料（如拭子、试纸）或试剂（如防腐荆、抗凝剂或其他常规添加剂）必须不会干扰扩增或检测过程，抗凝剂一般采用乙二胺四乙酸盐(EDTA)或枸橼酸盐，肝索对扩增反应有一定的抑制作用而且在以后的靶核酸提取中不易除去，应尽量避免使用l对游离的核酸，需灭活核酸酶使其稳定。靶核酸（如DNA）应能从收集装置中释放出来，另外，收集、运输过程中某些介质可能会稀释样品，因此，必须考虑稀释对测定结果的影响。
5.1.6样品的核对
收到样品后，应对病人姓名、样品类型、收集时间等进行详细核对。
5.2样品的运输
样品收集后应尽快送至实验室进行检测，运输过程中，特别是在需要保持细胞的完整性时，应注意避免样品的过冷或过热，并尽量减少细菌等污染物的生长，而且必须保证样品巾的靶核酸免受内源性或外源性核酸酶的破坏与降解；游离核酸需经稳定化处理，靶核酸为RNA时要求更为严格（如对靶核酸为RNA的样品可加入异硫氰酸胍盐灭活其中的核酸酶），不同的实验对运输方法都有其特殊要求，应明确加以规定。
5.3样品的处理
样品中的许多杂质能抑制Taq DNA聚合酶的活性，从而干扰扩增反应，样品的处理可去除这些干扰杂质，增加PCR扩增的成功率和可重复性，有利于检测的标准化，纯化样品中的核酸(DNA或RNA)，可使待测核酸暴露，有利于与引物的退火。
5.3.1靶核酸的释放
待扩增的靶核酸可能来源于不同的临床样品，如血液、体液、尿液、粪便、游离的细胞或组织块等。靶核酸可有不同的存在形式和存在部位。如病原微生物的靶核酸可存在于宿主细胞内与宿主DNA整合在一起、游离子宿主细胞核中或以各种形式存在于宿主细胞质中。而且，临床样品中常含有蛋白、脂类等干扰物质，因此，在进行PCR扩增前，必须对样品进行预处理，实验中应根据靶核酸不同的存在状态，采取相应的处理方法。
承3.2靶核酸的分离
经典的核酸提取方法包括去垢剂裂解、蛋白酶处理、有机溶剂提取及醇类沉淀等步骤，利用玻璃粉、二氧化硅及硅藻等具有吸附核酸特性的固体颗粒建立的核酸提取方法可以简单、快速、高效地提取适合于PCR扩增的靶核酸，目前已有许多商品化的核酸分离试剂盒可供选择。
5.3.3靶核酸的质量
用于扩增的靶核酸序列必须是完整的，将制备的样品与标准品通过凝胶电泳进行比较即可初步判断靶核酸的完整性和含量，也可通过测定260 nm和280 nm波长下的吸光度确定提取的靶核酸的浓度和纯度。
5.3.4处理过程的复杂性
样品的处理应尽量简化，以减少样品的交叉污染或丢失靶核酸的机会。
5.3.5样品的生物安全性
样品中可能含有对人体有害的生物因子，处理过程中应注意防止其危害操作人员f 对临床样品的处理，可参照实验室对临床样品的常规处理方法进行。
5.4样品的存放
临床用于PCR测定的DNA靶核酸样品应在一定的缓冲液(如1×TE)中4℃保存lRNA 靶核酸样品应在一定缓冲液中—80℃或液氮中存放。用乙醇或异丙醇等沉淀的靶核酸样品存放在—20℃即可。
6污染的预防和控制
由于PCR的扩增高效性和检测的高敏感性，极微量的污染即可导致假阳性结果，因此，必须特别注意避免样品DNA的污染所导致的假阳性结果。PCR的污染途径主要有三个：
a)来自其他待测样品DNA的交叉污染；
b)来自其他实验材料如克隆质粒或菌体DNA的污染；
c)来自同一靶序列上次PCR扩增产物的污染。
其中由同一靶序列上次PCR扩增产物所引起的污染（遗留污染）最为常见，必须制定严格的实验室标准操作规程(standard operation procedure，SOP)以减少污染所致的假阳性结果。
6.1划分不同的操作区
PCR的前处理和后处理应在不同的隔离工作台（生物安全柜）或房间内进行，整个操作流程要在不同的隔离区进行：1）试剂准备和储存区；2）样品处理区；3）PCR扩增区；4）产物分析区。虽然上述操作是分开的，但是还要注意仪器设备和耗材的专用及操作人员、物流的单方向流动。如使用扩增反应和产物检测同时完成的荧光定量PCR方法或全自动PCR 分析仪时，3）、4）两个区可以合并。
6.2分装试剂
试剂的分装是预防、控制PCR污染的一项重要措施。PCR所用的去离子水和缓冲液均应经过高压灭菌，由于引物和dNTP不能高压，一定要用高压过的去离子水进行配制，所有这些试剂均应在无待测样品和PCR扩增产物的试剂准备和储存区进行制备，分装贮存；同样，用于PCR检测的引物也应在以上环境中进行稀释、分装，每管标记批次。
6.3改进实验操作
尽管上次PCR扩增产物的遗留污染是大多数假阳性反应的原因，但样品之间的交叉污染也是污染的原因之一。因此，不仅要在进行扩增反应时谨慎操作，在样品处理的所有环节（从样品收集到靶核酸提取）都应注意，下面几点应格外引起重视：
a)加样器最易受样品核酸或扩增产物气溶胶的污染，试剂准备、样品准备和扩增产物分析等各步骤中的加样器应严格分开使用；
b)戴一次性手套进行操作，在进出不同的隔离区时都要换手套；
c)避免反应液的飞溅，开盖时尤应注意，可予开盖前离心几秒钟使壁上和盖上的反应液集于管底，一旦飞溅，应立即更换手套；
d)用一次性移液器或吸头进行操作，吸头不要暴露于空气，以预防扩增产物气溶胶的污染；
e)在操作多份样品时，要制备反应混合液，先加可混合的组分(dNTP、缓冲液、引物和酶等)，混合后再分装到不同的反应管，这样，可以减少操作，避免污染，增加反应的重复性；
f)最后加入模板，加入后立即益紧反应管；
g)用过的加样器吸头必须放人专门的消毒（如含次氯酸钠溶液）的容器内，实验桌椅表面每次工作后都应进行清洁，实验材料如出现外溅则必须作出记录。
6.4设立阳性与阴性对照
选择阳性对照时，应选择特异性扩增条带较弱、重复性较好的样品；阴性对照应最后配制，这样，可以反映扩增反应的基本状况。此外，每次扩增均应设立包括PCR体系各试剂的空白对照，空白对照中应含有除模板核酸外的所有组分。
6.5环境污染
常见的污染源包括：加样器、离心机、真空瓶、电泳装置、紫外灯箱、水浴锅、冰箱门把手、门把手和实验台面（生物安全柜）、空气气溶胶等，各区的工作台面工作前可先用0.5%次氯酸钠、再用70%乙醇擦拭。
6.6扩增产物的灭活及污染的处理
尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG)法；该法是在PCR反应中用脱氧尿嘧啶碱基(dU)置换脱氧胸腺嘧啶(dT)，这样，扩增产物中含有几十或几百的dU，这种产物与UNG一起孵育后，因UNG可裂艇尿嘧啶碱基和戊糖磷酸骨架间的N。糖苷键，可除去dU，产生数十或数百的无dU 碱基位点，无dU的位点阻止Taq DNA聚合酶的链延伸作用，使其失去再扩增的能力，而且，这样的位点是热不稳定的，在热循环中会发生断裂，防止再次扩增的发生，PCR扩增产物越长，UNG抗污染的效率就越高。UNG对不含dU的模板无任何影响，对RNA中的尿嘧啶和单一尿嘧啶分子也无任何作用。
光化学灭活：灭活PCR扩增产物另一个可选择的方法是应用可溶性的补骨脂素衍生物，这些化合物具有热稳定性，对引物退火和Taq DNA聚合酶的活性无影响。扩增前，将补骨脂素衍生物加入到PCR反应混合液中，扩增后，在打开反应管盏之前，用长波紫外线照射，紫外线能穿透聚丙烯管。激活补骨脂素衍生物，补骨脂素衍生物随后形成环丁烷，与扩增产物DNA上的嘧啶作用，形成带有嘧啶碱基的环戊烷，阻止Taq DNA聚合酶对这一分子的进一步扩增，其效率取决于扩增产物的长度和核苷酸的碱基组成，一般而言，产物长度超过
300bp、碱基G+C含量大于50%时，本法几乎可灭活所有的扩增产物。和酶法灭活不同，该方法不仅可灭活扩增产物，而且可灭活原始的靶核酸。
7质量控制
进行PCR检测的实验室应经过检查并符合国家行政部门的相关认证要求，由经过培训的合格上岗人员进行操作。有条件的实验窒还应积极参加各级质控机构和组织的室间质评活动，这样，有利于对不同实验室之间的检测结果进行同比分析。
7.1 扩增反应的质量控制
7.1.1 样品准备的质量控制
设计一个样品处理方法最先应考虑的问题是：能够最有效地分离出靶核酸并避免导入抑制因子和污染物，避免靶核酸被核酸酶降解并除去干扰检测的物质，设立这部分的对照必须能够反映以下问题，即，在样品中是否有靶核酸以及核酸的分离方式是否影响PCR反应。当验证一个实验系统的样品处理方法时，需要用含靶核酸的整个有机体、以接近预期的检测极限浓度添加至阴性样品基质中，这样，所设立的对照可提供有关靶有机体溶解及靶核酸提取回收是否成功的有关信息，如果靶核酸存在于细胞内（如淋巴细胞），就应以整个细胞作为验证样品加入阴性基质中作为对照。
7.1.2设立外对照
每次实验至少应设有弱阳性对照和一份阴性对照，以确定扩增的有效性。
7.1.3设立内对照
利用内对照可验证每个单份样品中是否含有核酸，例如人类的HLA-DQAI、β-微球蛋白基因和其他一些保守序列，这些基因存在于样品的有核细胞中，可将其与靶核酸扩增体
系一起扩增。在设计扩增和检测基因突变时，可在突变区之外，同时扩增保守区序列作为对照。
7.1.4设立平行组
两份病人样品，其中一份加入已知的核酸作为副本，加入量应临近可检测到的极限浓度，如果正本PCR结果为阴性，而副本为阳性，则可确定其阴性结果是真实的。
7.1.5样品的稀释
对制备的样品进行几个稀释度的稀释，来检测抑制因子的存在，当样品稀释后，检测到的信号持续变强，说明有抑制因子存在，只要样品中存在有抑制因子，就应考虑进行样品稀释。但样品稀释后靶核酸也被同时稀释，因此，必须注意确保稀释过程中靶核酸仍保持在具有临床检测意义的范围之内。
7.2抑制因子和干扰物的质控
在临床样品中有多种成分通过与PCR反应组分发生作用，从而抑制PCR扩增反应。已知血红素及其代谢物可抑制DNA聚合酶的活性，脑脊液、尿液中也含有成分尚未确定的DNA聚合酶的抑制因子，痰液中的酸性多糖、糖蛋白组分是聚合酶的抑制因子；临床样品中含有的核酸酶，会降解靶核酸。另外，许多分子生物学研究巾常用的试剂，如乙二胺四乙酸、去污剂（如十二烷磺酸钠）、破膜荆（如盐酸胍）等对DNA聚合酶的活性也有一定抑制作用，从而导致假阴性结果。
扩增反应的抑制因子可通过应用对照模板来进行检测，必要时，这种对照模板可在样品准备过程中加入（如内对照），因此也可作为靶核酸提取过程的对照（见7.1.3）。设立内对照来监测是否存在抑制反应应根据实际需要而定，因为建立和应用这些内对照有相当的技术难度，并且可能会影响到整个实验。
7.2.1同源内对照
同源内对照基因与扩增的目的靶基因有相似的序列，它们通过分子大小的差别或内部序列的不同相互区别。同源内对照可以与目的靶基因二起应用相同的引物进行扩增，对照模板先加入到反应混合液中，每个反应提供10到1 000个拷贝，用同源引物进行扩增。但必须注意保证同源内对照的存在不能降低扩增体系的敏感性，假如一起扩增的内对照模板量太多的话，往往会降低目的基因扩增的敏感性。含抑制物的样品，如不支持对内对照的扩增，那么很可能也不会支持对靶核酸序列的扩增，样品就应被视为不适于进行PCR扩增，或需要进一步处理以减少或清除抑制因子。通常简单地将样品稀释就会降低，抑制因子的影响，此时要注意样品不能过度稀释，以致靶核酸被稀释到检测限度之下。
7.2.2异源内对照
异源内对照不包含靶序列，需要用另一组独立的引物来扩增对照基因。异源内对照通常采用人类HLA-DQAI和人类β-微球蛋白位点基因，任意靶核酸一般都可满足需要。对照组扩增产物的分子量应与目的靶基因大小相同或更大，以保证更小分子量的任何产物都能被成功扩增。
7.3仪器的质量控制
所有的仪器设备都必须保持清洁并进行定期维护，所有的水浴装置、培养箱都应贴有适当温度范围的质量控制表，记录每天的温度。在实验室的质量保证(Quality Assurance，QA)手册中应有仪器校对的操作方法。
a)加样枪，加样枪必须保证每年校正两次，校正方法可参考生产厂商推荐的方法或采取吸样称重法；
b)水浴箱：实验前用温度计进行校准；
c)离心机：离心机的速度每年应检查两次，离心机可能是污染的重要来源，应注意采取必要的预防措施；
d)酶标仪：每年进行两次校准；
e)热循环仪：目前各实验室使用的热循环仪有许多不同的种类和型号，可根据生产厂商推荐的方法进行校正，一年内至少对仪器校正两次I除仪器的自检功能外，应进一步进行循环参数的校正和功能性扩增实验，对不同部位的加热孔应保证其温度的均一性。
7.4校正测试
校正测试是用来确保临床实验的可重复性和评价临床实验室的操作技能。每一个检测临床样品的实验室都需要作校正测试，并以此来确定实验室能够进行某一特定实验的能力。每年应至少进行两到三次校正测试，每次实验的间隔要相等，每个实验至少5个样品，所提供的样品必须覆盖整个反应范围，从强阳性反应到阴性反应，由实验室日常进行PCR
检测的实验人员按实验室的常规要求进行操作。一般来说，校正实验所用样品与临床实验室常规检测样品的类型应相同或组成成份相似，即全血、血浆、血清、尿、脑脊液或组织样品等。校正测试样品可以从相关部门（如各级室间质评机构和组织）获得，如果没有标准的校正测试样品，已有的商品试剂盒中的对照样品是一个重要来源。
8结果的判读、报告和解释
8.1一般考虑
与其他检测方法相比，PCR的检测下限很低，因此，应当明确如此低的检测限度的临床意义及结果的解释标准，应对该疾病已经做过的其他实验室检测结果与PCR检验结果之间的一致性和差异性进行比较，阐明PCR技术相对于其他实验方法的优越性和PCR技术的合理应用等。例如，临床样品中结核杆菌的直接PCR检测，仍需进行常规的涂片显微镜镜检和细菌培养来确定PCR检测的敏感性，并鉴定不同种群的重叠感染。
8.2不能确定的结果
PCR实验和其他临床实验一样，可能有不能确定的结果，这些结果将反映出样品的质量以及实验方法的影响。因此，对PCR扩增产物的检测应当有一个明确的结果判读方式，并对不能确定结果的样品有适当的鳃释和处理方法，例如，重复取样、重复实验或反向实验等。在任何诊断实验中，都会有很小百分率的健康人群的检验结果表现为阳性或异常，因此，重复实验是一个经常应用的重要策略。
8.3结果的报告
虽然扩增实验有严格的自身控制，但如果没有经过细致的审查，错误结果还是会报告出来，审查人员应仔细检查每一个待报告的结果。实验步骤中必须包括结果的解释标准，包括
对不可确定结果的解释标准，对已商品化的PCR诊断试剂盒，有关信息必须由生产厂商提供。临床实验室负责对本医疗机构内受试人群实验结果的及时报告和解释；临床医生在综合考虑其他可利用的临床信息后，负责对实验结果的临床解释，临床和实验室的沟通对于实验结果合理、有效的应用是十分重要的。
8.4对不合格样品的处理
如果实验室收到的样品不宜用于检测，必须马上通知样品呈送单位，对运送方法不当、送达时间过迟及数量不足的样品应拒绝接收。
8.5结果回报时间
实验室应制定回报时间的规定，并对延误报告的原因进行分析。
附录A
（标准的附录）
定量PCR技术
定量PCR技术是在常规PCR原理的基础上发展起来的新的核酸扩增技术，通过对靶核酸进行量化检测来反映靶核酸量的变化与临床疾病的关系，并可用于检测疾病的发生、发展，考察治疗药物的疗效等。
A1定量PCR技术的方法学
定量PCR技术一般通过定量分析扩增产物的量的多少来判断待测样品中初始靶核酸模板的拷贝数，目前常用以下几种方法对扩增产物进行量化检测。
A1.1竞争性聚合酶链反应量化检测核酸技术
基本原理：具有相同引物结合区的两种模板在同一管中扩增可得到几乎相同的扩增效果。初始含量多的模板，其扩增产物就多，两种PCR扩增产物量与二者初始核酸模板含量的比值有相关性；其中一种核酸为已知含量的内参照模板，而另一种核酸为待测样品，同时进行竞争性聚合酶链反应扩增，因为待测核酸与内参照扩增产物片段的大小或序列不同，因此可通过凝胶电泳或探针杂交等方法进行检测，从而得到两种核酸扩增产物的比值，而初始内参照的模板量是已知的。根据这些数据可以推算出待测核酸的初始含量。本方法将内参照模板与样品靶核酸模板放在同一个试管内同时进行扩增，保证两者在同等的反应条件下，避免了管与管之间的差异，是一种灵敏度较高、能比较客观反映样品初始状态时靶核酸模板含量的方法；但该方法由于存在内参照模板与样品模板长度的差异以及最小二级结构不完全相同
等影响因素，因此二者的扩增效率不可能完全一致。
A1.2自动化荧光检测法
扩增体系所采用的引物除具有退火、延伸功能外，还包含有两段额外基因，一段为信号基因(re-porter)，单独存在时可以发光；另一段为抑制基因(quencher)，其存在时可抑制信号基因的功能，不产生发光现象，在进行核酸扩增反应时，由于Taq酶具有一定的5’端外切酶活性，可将引物上的信号基因切下、失去抑制基因的抑制作用而产生荧光，每当一次扩增中一条引物被退火、延伸后，整个体系就会增加一个单位的荧光。该扩增仪在每一次扩增循环结束后都要通过荧光光度计进行扫描，由此可得出每一次扩增循环结束后产物的量。
A1.3固相杂交酶免疫法量化检测核酸扩增产物
使用酶免疫法(EIA)量化检测核酸的扩增产物，是目前应用较为普遍的核酸量化检测手段，如应用生物素标记引物，这样在PCR反应结束后，扩增产物带有生物素成分，随后通过包被子酶标微孔板上的链亲和素（包被蛋白）将PCR扩增产物捕获到固相载体上，解链变性后加入FITC标记的特异性探针杂交成DNA双链，再加入辣根酶标记的FITC抗体使底物显色，通过显色反应颜色的深浅来量化反映样品中核酸模板的情况。或将特异性探针包被子固相载体上（包被探针）。通过杂交反应将标记有生物素的产物固定在酶标微孔板上，再加入辣根酶标记的链亲和素-利用显色反应显示待测样品中核酸模板的情况。这两种方法灵敏度较高、特异性好、可以避免因PCR非特异扩增引起的假阳性，结果准确可靠、成本不高，更有利于推广和普及。但由于PCR体系不同管之间不同的模板提取效率、逆转录效率、扩增效率
等因素的影响，酶标结果并不能完全客观地表示模板含量，而且酶免疫显色反应的线性测定范围狭窄，也会影响真正的量化检测结果。
A1.4液相杂交酶免疫法量化检测核酸扩增产物
这种方法同固相杂交量化检测核酸扩增产物的原理大致相同，只是将反应体系换为液相环境。在PCR扩增时通过掺人法使产物上挂有地高辛分子，再通过液相杂交与标记有生物索的探针结合后。被包被有链亲和索的酶标微孔板捕获，利用辣根酶标记的地高辛抗体使底物显色，据报道，核酸扩增产物与特异性探针在液相中的杂交效率要高于在酶标微孔板上的结合，液相杂交的灵敏度通常是固相杂交的10～20倍，可以检测到Pg水平。
A2方法的优化
应用PCR扩增技术，大大提高了对靶核酸的检测灵敏度，但由于存在提取、扩增过程中的效率不同，而且扩增过程中产物的累积并非以单纯指数的形式增长，从而导致这类方法并不能很客观准确地反映待测模板的真实情况；而且在这类方法中还存在这样一个问题：为了提高灵敏度，人们普遍象常规PCR一样尽可能使用较多的循环数（30或35个循环），但循环数过多，随着dNTP、引物的消耗以及Taq酶的损耗，很可能使扩增反应进入“平台期效应”，因而产物不再以指数形式增长，这样也就无法通过产物的量化检测准确反映初始模板的含量。因此，应该对所选择的扩增条件进行优化，选择合适的扩增参数，只有这样，才能使检测结果更加准确可靠。
附录B
（标准的附录）
对生产厂商的要求和建议
B1对PCR试剂盒研究和生产厂商的要求
每一个商品化PCR试剂盒的操作说明书应包括以下几方面的内容：
a)说明书应明确指出实验的应用方向，明确实验的特异性和灵敏性，说明待检测群体的性质，明确阳性结果和阴性结果的预期值。包括疾病在受试人群中的流行情况等；
b)说明书应明确待测样品的性质，在不侵犯专利的情况下，应尽可能多地提供靶核酸的有关信息和该试荆盒的技术信息；
c)实验步骤应清楚、明了。以便实验时不再需要参考其他资料，实验过程中的关键步骤应重点强调，详细说明；
d)实验步骤中应清楚地标明实验前如何处理标本，包括：采集、运输，储存、温度的影响以及必要时用稀释液进行稀释的条件和方法等；
e)实验步骤中要确定某些巳知或可能的物质或实验条件对实验方法的干扰，并提出避免或检测这些干扰物质和实验条件的方法；
f)实验步骤中应包括对实验结果的解释标准和说明，以及对结果尤其是不可确定结果的重复实验和补充实验的建议；
g)说明书应清楚地表明待测样品是否可一次性获得可靠结果，还是需要重复实验来保证实验结果的准确性和精确性；
h)说明书应提供该方法与标准实验或其他实验进行比较实验的结果，与标准方法进行比较评估时，应说明对不可确定结果的处理，包括不可确定结果的百分率；
i)当改变实验步骤时，应以适当的方式通知试剂盒的使用者，这些改变应在包装说明上清楚标明。
B2对PCR试剂盆研究和生产厂商的建议
a)为了确保PCR在临床诊断中的正确应用。生产厂商应及时与试剂盒的使用人员进行技术交流，协助使用者解决操作中的技术问题，同时不断改进产品；
b)生产厂商应在试剂盒中尽可能多地应用各种新发展的技术，如核酸分子杂交、内对照、抗污染等，以提高PCR检测的灵敏度和特异性，同时，尽量避免假阴性和假阳性扩增反应。
如有侵权请联系告知删除，感谢你们的配合！
聚合酶链式反应
实验9 聚合酶链式反应（PCR）技术 【实验目的】 掌握PCR反应的原理及操作技术。 【实验原理】 PCR 技术实际上是在模板DNA、引物和4 种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于耐高温DNA 聚合酶的体外酶促合成反应。PCR 技术的特异性取决于引物和模板DNA 结合的特异性。反应分为三步：1 热变性：在高温条件下，DNA 双链解离形成单链DNA；2 退火：当温度突然降低时引物与其互补的模板在局部形成杂交链；3 延伸：在DNA 聚合酶、dNTPs 和Mg2+存在的条件下，聚合酶催化以引物为起始点的DNA 链延伸反应。以上三步为一个循环，每一循环的产物可以作为下一个循环的模板，几十个循环之后，介于两个引物之间的特异性DNA 片段得到了大量复制，数量可达到10 6~7个拷贝。 【器材与试剂】 1．器材 DNA 扩增仪（PCR 仪）、台式离心机、微量取液器、硅烷化的PCR 小管、琼脂糖凝胶电泳系统 2．材料 模板DNA，单、双链DNA均可作为PCR的样品。 3．试剂 (1) 10×PCR 缓冲液 (2) MgCl2 15mmol/L (3) dNTP 混合物：每种2.5mmol/L (4) Taq DNA 聚合酶：5U/μl (5) 引物1和引物2：2 μmol/L (6) 琼脂糖凝胶电泳试剂 【操作步骤】 1. 在0.2ml Eppendorf 管内依次混匀下列试剂，配制20μl 反应体系。
ddH2O 7.8 μl 10×PCR 缓冲液 2 μl MgCl2（15mmol/L） 2 μl dNTP（2.5mmol/L） 2 μl 引物1 (2μmol/L) 2 μl 引物2 (2μmol/L) 2 μl 模板DNA 2 μl Taq DNA 聚合酶（5U/μL）0.2 μl 总体积20 μl 2．按下述循环程序进行扩增 程序阶段程序名称温度时间循环数 1 预变性94℃ 3 min 1 变性94℃30 sec 2 退火52℃30 sec 30 延伸72℃30 sec 3 保温4℃∞ 1 3．扩增结束后，取10μl 扩增产物进行电泳检测。 【要点提示】 1．在90~95℃下可使整个基因组的DNA变性为单链。一般94~95℃下30~60sec。时间过长使TaqDNA聚合酶失活。 2．退火温度一般在45~55℃。退火温度低，PCR特异性差；退火温度高，PCR特异性高，但扩增产量低。。 3．延伸温度一般在70~75℃。此温度下TaqDNA聚合酶活性最高。一般扩增产物长度小于1 kb，延伸时间30 sec即可。当扩增产物长度大于1 kb时，可适当延长延伸时间。
聚合酶链式反应
聚合酶链式反应 聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。 PCR(聚合酶链式反应）是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。 PCR原理 DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。 但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶 耐热DNA聚合酶--Taq酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶 PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。 PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：
①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； ②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； ③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在72℃、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 反应准备 其中dNTP、引物、模板DNA、Taq DNA聚合酶以及Mg2+的加量（或浓度）可根据实验调整。 PCR反应五要素： 引物(PCR引物为DNA片段，细胞内DNA复制的引物为一段RNA链）、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2+）。 PCR所用的酶主要有两种来源：Taq和Pfu，分别来自两种不同的噬热菌。其中Taq扩增效率高但易发生错配。Pfu扩增效率弱但有纠错功能。 模板即扩增用的DNA，可以是任何来源，但有两个原则，第一纯度必须较高，第二浓度不能太高以免抑制
PCR(聚合酶链式反应)原理
PCR(聚合酶链式反应)原理 PCR 是体外酶促合成特异DNA片段的方法，主要由高温变性、低温退火和适温延伸三个步骤反复的热循环构成：即在高温（95℃）下，待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板；而后在低温（37～55℃）情况下，两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合，形成部分双链；在T aq酶的最适温度（72℃）下，以引物3’端为合成的起点，以单核苷酸为原料，沿模板以5’→3’方向延伸，合成DNA新链。这样，每一双链的DNA模板，经过一次解链、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链DNA分子。如此反复进行，每一次循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍，PCR产物得以2n的批数形式迅速扩增，经过25～30个循环后，理论上可使基因扩增109倍以上，实际上一般可达106～107倍。 1971年Kleppe等人在Journal of molecular biology上发表文章首次准确、精炼、客观的阐述了PCR方法，1976年一种从嗜热水生菌(Thermus aquaticus)分离得到的热稳定的DNA依赖的DNA聚合酶的应用大大增加了PCR的效率。而现今所发展出来的PCR则是源于由Saiki和Mullis等人于1988年发表在Science上的一篇论文，Mullis当时服务于Perkin Elmer（PE）公司，因此PE公司在PCR界有着特殊的地位。后来PE被Applied Biosystems Inc.（ABI）公司收购、分拆、再转卖，而PCR的专利和倍受信赖的PCR仪器生产和销售就留在ABI名下。到如今，PCR方法愈发趋向自动化，并从中衍生出更多的新技术方法，可以说，PCR技术是支撑现代分子生物学发展的一块重要基石。这种技术的广泛应用催生了一个庞大的市场，多个公司均有各种类型的商品化PCR仪出售。PCR 的专利目前依然掌握在ABI和Roche（罗氏）两大公司手中，去年业界颇为引人瞩目ABI 诉MJ公司侵犯侵犯PCR仪知识产权案最终以MJ败诉并宣布破产、最终被Bio-rad收购暂告一段落。其后还会不会有后继的故事还需拭目以待。 PCR原理 DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶的作用下，以单链为模版，根据碱基互补配对原则复制成新的单链，与模版配对成为双链分子挎贝。在体外实验中发现，DNA 在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计与模板DNA的5’端结合的两条引物，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制，多次重复“变性解链—退火—合成延伸”的循环就可以以几何级数大量扩增特定的基因。 发现耐热DNA聚合酶对于PCR的应用有里程碑的意义，该类酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。 从PCR原理可以看出，PCR仪的关键是升降温的步骤。现在偶尔还能听到一些前辈们笑谈早年的PCR实验如何在3个水浴锅中完成的趣闻。经过不断改进，今天的PCR 已经越来越完善和智能化。出于市场推广的战略需要，各厂家的PCR仪型号不同，着力宣传的技术指标和参数也不尽统一，编者在这里简单列出选购时我们认为应该考虑的常用指标，希望有助于大家选购PCR仪的选购技巧。 PCR仪介绍及其选购 P CR仪的种类总体来说可以分为两大类：PCR扩增仪和实时荧光定量PCR仪，普通的PCR扩增仪又衍生出带梯度PCR功能的梯度PCR仪、和带原位扩增功能的原位PCR仪等等。1996年由ABI公司首先推出将扩增和检测融为一体的实时荧光定量
1聚合酶链式反应PCR技术
实验1 聚合酶链式反应（PCR）技术 【实验目的】 掌握PCR反应的原理及操作技术。 【实验原理】 PCR 技术实际上是在模板DNA、引物和4 种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于耐高温DNA 聚合酶的体外酶促合成反应。PCR 技术的特异性取决于引物和模板DNA 结合的特异性。反应分为三步：1 热变性：在高温条件下，DNA 双链解离形成单链DNA；2 退火：当温度突然降低时引物与其互补的模板在局部形成杂交链；3 延伸：在DNA 聚合酶、dNTPs 和Mg2+存在的条件下，聚合酶催化以引物为起始点的DNA 链延伸反应。以上三步为一个循环，每一循环的产物可以作为下一个循环的模板，几十个循环之后，介于两个引物之间的特异性DNA 片段得到了大量复制，数量可达到10 6~7个拷贝。 【器材与试剂】 1．器材 DNA 扩增仪（PCR 仪）、台式离心机、微量取液器、硅烷化的PCR 小管、琼脂糖凝胶电泳系统 2．材料 模板DNA，单、双链DNA均可作为PCR的样品。 3．试剂 (1) 10×PCR 缓冲液 (2) MgCl2 15mmol/L (3) dNTP 混合物：每种2.5mmol/L (4) Taq DNA 聚合酶：5U/μl (5) 引物1和引物2：2 μmol/L (6) 琼脂糖凝胶电泳试剂 【操作步骤】 1. 在0.2ml Eppendorf 管内依次混匀下列试剂，配制20μl 反应体系。
ddH2O 7.8 μl 10×PCR 缓冲液 2 μl MgCl2（15mmol/L） 2 μl dNTP（2.5mmol/L） 2 μl 引物1 (2μmol/L) 2 μl 引物2 (2μmol/L) 2 μl 模板DNA 2 μl Taq DNA 聚合酶（5U/μL）0.2 μl 总体积20 μl 2．按下述循环程序进行扩增 程序阶段程序名称温度时间循环数 1 预变性94℃ 3 min 1 变性94℃30 sec 2 退火52℃30 sec 30 延伸72℃30 sec 3 保温4℃∞ 1 3．扩增结束后，取10μl 扩增产物进行电泳检测。 【要点提示】 1．在90~95℃下可使整个基因组的DNA变性为单链。一般94~95℃下30~60sec。时间过长使TaqDNA聚合酶失活。 2．退火温度一般在45~55℃。退火温度低，PCR特异性差；退火温度高，PCR特异性高，但扩增产量低。。 3．延伸温度一般在70~75℃。此温度下TaqDNA聚合酶活性最高。一般扩增产物长度小于1 kb，延伸时间30 sec即可。当扩增产物长度大于1 kb时，可适当延长延伸时间。
聚合酶链式反应及其在基因诊断中的应用
聚合酶链式反应及其在基因诊断中的应用 聚合酶链式反应于1983年由美国Cetus公司的发明，并和定点突变的发明者一起荣获1993年度诺贝尔化学奖，为生命科学领域的研究开创了崭新时代。 一、PCR反应原理和反应过程 DNA的体外复制包括3个步骤： 变性（denaturation）:94 ?C ~95 ?C 退火（annealing）:40 ?C ~70 ?C 延伸（extension）:72 ?C 3个步骤作为PCR的一个循环，每当完成一个循环，一个分子的模板被复制为二个，产物量以指数形式增长。 二、PCR的反应体系和反应条件 （一）PCR反应体系 参与PCR反应的主要成份: 模板、引物、dNTP、Taq DNA聚合酶和缓冲液等。 1 模板 包括基因组DNA、RNA、质粒DNA、线粒体DNA等。RNA作为模板时，须先将RNA 逆转录为cDNA，再以 cDNA作为扩增的模板。模板量：1000ng、500ng、100ng、50ng? 2、引物（Primers） 引物决定PCR扩增产物的特异性和长度，是化学合成的寡核苷酸片段。引物的 合成可以采用化学方法。引物设计时必须遵循一些原则。 设计引物的原则： 1）二条引物分别位于被扩增片段的两端，与模板正负链序列互补 2）长度为18 ~ 25个核苷酸 3）二条引物之间避免形成引物二聚体 4）引物的碱基组成应平衡 5）引物退火温度计算：Tm=2（A+T）+（C+G）
6）引物的5`端可被修饰（引入酶切位点、引入突变位点、生物素等标记） 3、脱氧核苷三磷酸（dNTP） 是dATP、dCTP、dGTP和dTTP4种脱氧核苷三磷酸的混合物。反应体系中各种核苷酸的浓度必须一致，浓度过高虽能加快反应速度，但非特异性扩增也随之增加 dNTP浓度：20 ~ 200umol/L,浓度升高增加非特异性扩增。 4、DNA聚合酶 从一种生活在热泉（80℃~90℃）中的水栖噬热菌（Thermus aquaticus, Taq）中提取，有很高的耐热稳定性。 Taq 酶的作用:模板指导下，以dNTP为原料，在引物3’-OH末端加上脱氧单核苷酸，形成3’, 5’ -磷酸二酯键，使DNA链沿5’→3’方向延伸，催化DNA合成。 最适酶量：（酶量过多，导致非特异性扩增） Taq DNA聚合酶复制的保真性，Taq DNA聚合酶无3’→5’外切酶活性，因而无校正功能，在复制新链的过程中会发生碱基错配。Taq DNA聚合酶在每次循环中产生的移码突变率为1/30000，碱基替换率为1/8000，故扩增的片段越长，错配的机率越高。 耐热的 DNA多聚酶有Pwo DNA polymerase、Tth DNA polymerase、Pfu DNA polymerase具有较高的热稳定性，较高的保真性，降低碱基错配率2 ~ 10倍。 5、镁离子浓度 镁离子浓度是一个至为关键的因素，对于反应系统本身、稳定核苷酸和提高Taq 酶的活性有直接影响。虽然Taq 酶的活性只与游离的Mg2+浓度有关，但PCR反应体系中dNTP、引物、模板DNA及鳌合剂的存在均可与Mg2+结合而降低游离Mg2+的浓度从而影响酶的活性。 当dNTP浓度为200umol/L时，MgCl2的浓度为L较宜。 6、其它反应因素 pH：调节至酶反应所需的最适pH（ pH =左右） 盐：合适的盐浓度有利于稳定杂交体，有利于引物与模板杂交 基质：BSA、gelatin 、Tween20、DTT等（牛血清白蛋白或明胶等基质可以保护Taq 酶的活性） （二）PCR的反应条件 反应温度（变性、退火、延伸） 反应时间（变性、退火、延伸）
聚合酶链式反应技术
聚合酶链式反应技术 引言：聚合酶链式反应（PCR）是20世纪80年代后期由K.Mullis 等建立的一种体外酶促扩增特异DNA片段的技术。PCR是利用针对目的基因所设计的一对特异寡核苷酸引物，以目的基因为模板进行的DNA体外合成反应。由于反应循环可进行一定次数，所以在短时间内即可扩增获得大量目的基因。PCR技术具有灵敏度高、特异性性强、操作简便等特点。虽然PCR技术也存在出错倾向高、产物大小受到限制和必须预先有目标DNA序列等缺点，但仍被誉为20世纪分子生物学研究领域最重大的发明之一。Mullis也因贡献卓著而获得1993年度诺贝尔奖。目前，PCR技术已广泛应用于分子生物学的各个领域，在分子克隆、法医学鉴定、DNA序列分析、致病基因的检测及考古学等方面都发挥着重要作用。 操作过程： 聚合酶链式反应用于扩增一小段已知的DNA片断，可能是单个基因，或者仅仅是某个基因的一部分。与活体生物不同的是，PCR 只能复制很短的DNA片断，通常不超过10kbp。DNA是双链分子，因此用互补DNA双链的构造单位（核苷酸）来度量其大小，单位为碱基对（base pair, bp）。某些特定的方法可以扩增40kbp左右的片断，但是这种大小与真核细胞的染色体DNA相比仍然是很少的。例如，人的体细胞DNA含有大约30亿个碱基对。目前应用的聚合酶链式反应需要几个基本组成： 1、DNA模板（template），含有需要扩增的DNA片断。
2、2个引物（primer），决定了需要扩增的起始和终止位置。（见下面引物一节） 3、DNA聚合酶（polymerase），复制需要扩增的区域。 4、脱氧核苷三磷酸（dNTP），用于构造新的互补链。 5、缓冲体系，提供适合聚合酶行使功能的化学环境。 聚合酶链式反应在热循环设备中进行。PCR仪可以将反应管加热或冷却到每步反应所需的精确的温度。为防止反应体系中液体产生蒸气，通常在反应管上加盖加热的盖子（比加热板温度来的高），或者在反应体系表面加入一层石蜡油。 引物 特定的引物决定了所扩增的DNA片断。引物是人工合成的短DNA片断，一般不超过50个碱基（通常18－25个），它们与所要扩增的DNA片断的起始和终止区域完全互补。在“黏合”时引物结合于DNA模板的起始和终止点，DNA聚合酶结合到这两个位置，开始合成新的DNA链。 选择引物的长度和熔点（Tm）要考虑许多条件。引物的熔点与聚合酶链式反应第一步中DNA的熔点不同，是指50％的引物与模板结合的温度，高于这个温度引物与模板就不能有效结合。这个温度随着引物长度的增加而升高。如果引物长度太短，就有可能与DNA模板的几个位置结合，造成非特异性复制。另一方面，引物长度也受限于Tm。如果Tm太高，即高于80℃，也会导致问题，因为DNA聚合酶在此温度下活性较低。引物最优长度通常为20到40个碱基，熔
聚合酶链式反应PCR实验报告
实验二聚合酶链式反应（PCR） 一、实验原理 聚合酶链式反应（PCR）是利用DNA片段旁侧两个短的单链引物，在体外快速扩增特异DNA片段的技术。它应用热稳定的聚合酶，通过双链DNA模板的热变性、引物退火和引物延伸的重复循环，DNA片段以指数方式增加了百万倍。从非常微量的DNA甚至单个细胞所含有的DNA起始，可产生ug量的PCR产物。 二、器材与试剂 1.器材：移液器，EP管，热盖PCR仪，电泳仪，量筒，锥形瓶，微波炉，电子天平，紫外照色仪 2.试剂：引物，模板，Taq DNA聚合酶，原料（dNTPs），缓冲液与Mg2+，H2O, 2*PCRmix 溶液，DNA染料 三、实验步骤 PCR反应体系的建立 取离心管，依次加入试剂混匀 1．H2O 12μl 2．模板 1μl 3．引物T7 1μl 4．引物 sp6 1μl 5．2*PCRmix 15μl PCR仪的热循环反应 把离心管放入PCR仪中，由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成 1.模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链 或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； 2.模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至56℃ 左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； 3.引物的延伸：经加热至72℃左右DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的 作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。重复该循环30次，每次需要2-3分钟。 电泳检测结果 扩增产物在琼脂糖凝胶电泳中，电泳结束后，放到紫外照射仪中进行透射，电泳明胶显示清晰的条带，如下图所示加入的为1号样，出现在500bp左右条带，而预算结果为扩增出492bp条带，故实验成功。
高中生物聚合酶链式反应技术
高中生物聚合酶链式反应技术2019年3月21日 （考试总分：100 分考试时长： 120 分钟） 一、单选题（本题共计 20 小题，共计 100 分） 1、（5分）下列对于相关实验共性的叙述，错误的是 A．“分离绿叶中的色素”和“胡萝卜素粗品的鉴定”都要用到纸层析法 B．“分离土壤中分解尿素的细菌”和“菊花的组织培养”都要使用琼脂 C．“果酒制作”和“探究酵母菌细胞呼吸方式”都用重铬酸钾检测酒精 D．“分离纯化大肠杆菌”和“分离纯化血红蛋白”都要使用差速离心法 2、（5分）下列关于生物技术应用的叙述，正确的是 A．从酶的固定方式看，物理吸附法比化学结合法对酶活性影响小 B．作为消化酶使用时，蛋白酶制剂只能以注射的方式给药 C．加酶洗衣粉中酶制剂可以被重复利用，提高了酶的利用率 D．将海藻酸钠凝胶珠用自来水冲洗，可洗去多余的CaCl2和杂菌 3、（5分）下列关于PCR技术的叙述，错误 ．．的是 A．PCR技术的基本原理是DNA双链复制 B．每次循环可分为变性、复性和延伸三步 C．参与PCR的物质有引物、酶、脱氧核糖、模板等 D．一个模板DNA分子第n次循环需要2n-1对引物 4、（5分）平板划线法和稀释涂布平板法是接种微生物的两种常用方法，下列描述正确的是 A．采用平板计数法获得的菌落数往往多于实际的活菌数 B．平板划线法是将不同稀释度的菌液通过接种环连续划在固体培养基表面 C．稀释涂布平板法是将不同稀释度的菌液倒入液体培养基中进行培养 D．与平板划线法相比，稀释涂布平板法形成单菌落的效果更好 5、（5分）关于电泳的说法不．正确的是 A．电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程 B．带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动 C．蛋白质在醋酸纤维薄膜上的移动速度取决于它所带净电荷的多少 D．电泳后需经染色、漂洗和脱色，才可长期保存 6、（5分）下列关于“DNA粗提取和鉴定”实验的叙述，正确的是 A．酵母菌、菜花和猪的成熟红细胞都可作为提取DNA的材料 B．在酒精溶液中，某些蛋白质的溶解度比DNA大 C．在研磨植物细胞时加入洗涤剂是为了溶解DNA D．在50～60 ℃的水浴中，DNA遇二苯胺试剂后即呈蓝色 7、（5分）PCR(多聚酶链式反应)技术是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术，如图表示合成过程。下列说法错误的是 A．甲过程高温使DNA变性解旋，该过程不需要解旋酶的作用 B．丙过程用到的酶在高温下失活，因此在PCR扩增时需要再添加 C．如果把模板DNA的两条链用15N标记，游离的脱氧核苷酸不做标记，循环3次后，在形成的子代DNA 中含有15N标记的DNA占25% D．PCR中由碱基错配引起的变异属于基因突变 8、（5分）下列哪些是进行PCR扩增所必需的条件 A．限制酶 B．DNA连接酶 C．Taq酶 D．解旋酶 9、（5分）下列关于生物工程中常见的几种酶的叙述，正确的是 A．DNA连接酶可把目的基因与载体的黏性末端的碱基黏合，形成重组DNA B．纤维素酶是细胞工程中常用的工具酶，可获得单个动物细胞 C．Taq酶是用PCR仪对DNA分子扩增过程中常用的一种耐高温的DNA聚合酶 D．纤维素酶和果胶酶处理植物细胞获得原生质体，便于植物杂交育种 10、（5分）“X基因”是DNA分子上一个有遗传效应的片段，若要用PCR技术特异性地拷贝“X基因”，需在P CR反应中加入两种引物，两种引物及其与模板链的结合位置如图1所示。经4轮循环后产物中有五种不同的DNA分子，如图2所示，其中第⑤种DNA分子有几个： A．2 B．4 C．6 D．8 11、（5分）生物产品的分离、纯化是现代生物技术中一种常见的技术。下列关于物质提取、纯化原理的叙述中，不正确的是 A．采用凝胶色谱法分离果胶酶的原理是蛋白质分子的相对分子质量不同，在色谱柱中的移动速度不同B．使用透析法可以去除样品中相对分子质量较大的杂质 C．电泳法是利用样品中各种分子带电性质和数量以及样品分子大小不同，产生的迁移速度不同而实现样品中各种分子的分离 D．离心法分离蛋白质的依据是不同大小的分子离心时沉降速度不同 12、（5分）要将菊花茎段细胞培养成完整的植株，无需 A．选用生长旺盛的嫩枝 B．离体状态并且具有完整细胞核的细胞 C．导入外源基因
临床诊断中聚合酶链反应(PCR)技术的应用
WS/T 230-2002 临床诊断中聚合酶链反应(PCR)技术的应用 Guidelines for use of polymerase chain reaction (PCR) technique in clinical diagnosis 1范围 本标准规定了临床诊断中聚合酶链反应(PCR)技术的应用准则。 本标准适用于各级，各类的医疗、卫生、保健机构应用PCR技术进行临床诊断。 2定义 本标准采用下列定义。 2.1引物primer 与待扩增靶DNA片段两端互补的寡核昔酸，其本质是单链DNA(ssDNA)，在DNA聚合酶的作用下能进行延伸，从而合成新的互补链。 2.2模板template 待扩增的靶DNA或RNA链，包括人类基因组DNA、质粒DNA、噬菌体DNA、eDNA和mRNA、 扩增后的DNA产物等几乎所有形式的DNA或RNA。 2.3变性denaturation DNA或RNA由双链转变为单链状态，加热、提高pH或加入甲酰胺、脲等试剂都可使双链DNA或RNA发生变性。 2.4 退火annealing 引物与互补的核苷酸序列在合适的温度下通过氢键形式相互结合的过程。 2.5 延伸 extension 在合适的条件下，由DNA聚合酶（如：Taq酶）催化引导引物DNA链延伸的合成过程。 2.6 污染 contamination 由来源子非待测样品的核酸所引起的一个样品、一系列样品或试剂的非特异性扩增或扩增后在产物分析过程中造成的样品之间的污染，污染通常引起假阳性结果。 2.7 遗留污染 carry-over contamination 同一类靶序列上一次PCR扩增产物对以后扩增反应的后续污染。 2.8 内对照 internal control 在同一反应混合物体系中与待测靶核酸同时进行扩增反应的已知对照物。 2.9 Taq DNA聚合酶 Taq DNA polymerase
聚合酶链式反应(PCR)
聚合酶链式反应（PCR） 第一节PCR扩增反应的基本原理 一、聚合酶链式反应（PCR）的基本构成 PCR是聚合酶链式反应的简称，指在引物指导下由酶催化的对特定模板（克隆或基因组DNA）的扩增反应，是模拟体内DNA复制过程，在体外特异性扩增DNA片段的一种技术，在分子生物学中有广泛的应用，包括用于DNA作图、DNA测序、分子系统遗传学等。 PCR基本原理是以单链DNA为模板，4种dNTP为底物，在模板3’末端有引物存在的情况下，用酶进行互补链的延伸，多次反复的循环能使微量的模板DNA得到极大程度的扩增。在微量离心管中，加入与待扩增的DNA片段两端已知序列分别互补的两个引物、适量的缓冲液、微量的DNA模板、四种dNTP溶液、耐热Taq DNA聚合酶、Mg2+等。反应时先将上述溶液加热，使模板DNA在高温下变性，双链解开为单链状态；然后降低溶液温度，使合成引物在低温下与其靶序列配对，形成部分双链，称为退火；再将温度升至合适温度，在Taq DNA聚合酶的催化下，以dNTP为原料，引物沿5’→3’方向延伸，形成新的DNA片段，该片段又可作为下一轮反应的模板，如此重复改变温度，由高温变性、低温复性和适温延伸组成一个周期，反复循环，使目的基因得以迅速扩增。因此PCR循环过程为三部分构成：模板变性、引物退火、热稳定DNA聚合酶在适当温度下催化DNA链延伸合成（见图）。 1．模板DNA的变性 模板DNA加热到90~95℃时，双螺旋结构的氢键断裂，双链解开成为单链，称为DNA的变性，以便它与引物结合为下轮反应作准备。变性温度与DNA中G-C含量有关，G-C间由三个氢键连接，而A-T间只有两个氢键相连，所以G-C含量较高的模板，其解链温度相对要高些，故PCR中DNA变性需要的温度和时间与模板DNA的二级结构的复杂性、G-C含量高低等均有关。对于高G-C含量的模板DNA在实验中需添加一定量二甲基亚砜（DMSO），并且在PCR循环中起始阶段热变性温度可以采用97℃，时间适当延长，即所谓的热启动。